KR20080077625A

KR20080077625A - 상처 치유 방법

Info

Publication number: KR20080077625A
Application number: KR1020087014376A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 마틴 옥부른; 데이비드 토마스; 라이언 모슬리
Original assignee: 페플린 리서치 피티이 리미티드
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2008-08-25
Also published as: EP1965818A1; CA2629899A1; JP2009517345A; CN101360506A; WO2007059584A1; BRPI0618926A2; NZ568168A; EP1965818A4; US20160317486A1; US20090215884A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 대상에서 상처 치유를 촉진하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상처 치유에 있어서 인게놀(ingenol) 화합물, 특히 인게놀 안젤레이트의 용도 및 이러한 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

상처 치유, 반흔, 촉진, 인게놀 화합물, 사이토킨

Description

상처 치유 방법{METHODS FOR WOUND HEALING}

본 명세서에서 발명자들이 참조로 한 문헌의 상세 목록은 설명 뒷 부분에 모아 놓았다.

본 명세서에서 참조로 하고 있는 임의의 선행 문헌(또는 이로부터 도출할 수 있는 정보) 또는 임의의 공지 사항은, 선행 문헌(또는 이로부터 도출할 수 있는 정보) 또는 공지 사항이 본 명세서와 결부된 활동 분야에서 통상적인 일반 지식의 대상이 된다고 인정 또는 용인하거나, 어떠한 형태로든 제안하는 것으로 간주되지 않고, 간주되어서도 안된다.

상처는 특히, 기계, 화학, 열 또는 병원성 수단으로 초래되어 구조적인 조직 완전성이 물리적으로 파괴되는 외부 또는 내부 손상이다.

상처 치유, 즉 조직(특히 피부 조직) 완전성의 수복은, 세포 성장, 세포 이동, 세포 분화 및 세포 증식을 조절하는 다양한 성장 인자 및 사이토킨으로 조정된다(Werner and Grose, 2003; Bryan et al, 2005). 이는 편의상 (i) 염증, (ii) 증 식 및 (iii) 성숙과 같은 세가지 과정으로 일어나는 것으로 설명할 수 있는데, 이들 과정의 어떤 것도 명확히 규정된 시기에 해당하지 않고 어떤 면에서는 중복될 수 있기도 하며, 각각 보다 특이적인 단계로 세분화될 수 있다(Baum and Arpey, 2005). 여러가지 인자가 손상 후 상처 치유의 복잡한 과정에 관여하며, 사이토킨은 전체 과정의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(Hubner and Werner, 1996).

(i) 염증(0-6 일)

상처, 예컨대 피부 상처가 가해진 후 즉시 일어나는 제1 단계는 지혈로 일컬어지며, 피브린 및 혈소판에 의해 매개되는 혈관 수축 및 응고가 출혈을 억제하기 위해 개시된다. 혈괴가 상처에 섬유아세포 및 염증성 세포가 유입되도록 하는 임시 기질 및 사이토킨과 성장 인자의 저장소로 추가 제공된다.

지혈 후, 염증성 세포가 상처에 유입되어 염증성 과정을 진행시키게 된다(홍반, 열, 팽화 및 통증 발현). 이중 시초는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 IL-8과 같은 성장 인자 및 사이토킨에 연루되는 다형핵 세포(PMN)이다. IL-8은 PMN에 대한 주요 화학 유인물질(Werner and Grose, 2003)이고, 그의 신속한 일시적 발현은 염증성 과정에서 절대적이지 않다. PMN은 세포 잔해, 이물질 및 박테리아를 제거함으로써 상처를 정화하기 시작하며, 비교적 짧은 시간(1 내지 2 일)동안 상처에 체류한다. 이때에는, PMN이 IL-1α, IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 사이토킨의 주요 공급원이다. 손상 후 약 3 일째에, PMN은 단핵 세포로 대체되며, 상처 정화제 및 IL-1α, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 추가 공급원으로 작용하나 상처 부위에 장기간 남아 있으려고 하는 대식 세포로 변형된다. IL-1β, IL-6 및 TNF-α 발현은 염증 단계동안 강력히 상향조절되고(Grellner et al, 2000; Grose et al, 2002, Hubner et al, 1996), 그의 협조적 발현은 정상적인 복구에 중요할 것으로 생각된다(Hubner et al, 1996). 섬유세포는 염증성 과정에서 중요한 역할을 담당하고, 특히 콜라겐 및 사이토킨 생산에 관여하며, 이들은 일부 IL-1β 및 TNF-α에 의해 조절된다.

(ii) 증식(3 일-수 주)

육아는 염증에서 증식으로 이어지는 중요한 연결 단계이다. 육아 조직 형성은 손상 후 3 내지 4 일 정도에서 개시되며 주로 섬유아세포 및 대식 세포를 함유한다. 섬유아세포 이동은 영구적인 콜라겐을 기반으로 한 세포외 기질(ECM)를 생성하며, 대식 세포는 IL-1 및 TNF-α와 같은 각종 성장 인자 및 사이토킨을 생성하여 성장 인자의 생성을 촉진하게 된다.

섬유아세포 표현형은 상처 치유 반응 및 임상적 결과 모두에 중요한 영향을 미치는 것으로 판명되었다(Stephens et al, 1996, 2001, 2004). 연구에 따르면, 생체내(즉 구강 점막 조직)에서 우선적인 상처 치유를 나타내는 조직으로부터의 섬유아세포는 상이한 시험관내 표현형 반응을 나타낸다고 보고되었다(al-Khateeb et al, 1997). 또한, 기질 금속단백 분해효소 및 세린 단백 분해효소는 손상 후 세포 이동 및 ECM 재형성의 조절에 중요한 역할을 하며, ECM 재구성 감소 및 상처(즉 만성적인 상처) 치유는 섬유아세포 MMP 생산 및 활성화 감소와 관련이 있음이 입증되었다(Cook et al, 2000). 구강 점막 및 태아 피부 섬유아세포는 I형 콜라겐 격자 재구성 및 수축이 증가된 것으로 나타났고, 이는 이들 세포 타입이 정상적인 피부 섬유아세포에 비해 ECM을 통한 이동능 및 시험관내 실험 상처 모델의 재밀집능의 우수성과 관련이 있음을 보여주는 것이다(Stephens et al, 1996; al-Khateeb et al, 1997; Enoch, 2006). 이에 반해, 만성적인 상처 섬유아세포는 I형 콜라겐 격자 재구성 및 수축의 감소를 수반하였고, 이는 정상적인 피부 섬유아세포에 비해 세포 ECM 이동 및 시험관내 상처 재밀집능의 지연 또는 손상과 연계되었음을 보여준다(Cook et al, 2000; Stephens et al, 2003; Wall, 2006). MMP-2 수준 및 활성의 증가는 구강 점막 및 태아 피부 상처 부위로부터의 섬유아세포와 관련이 있는데, 만성적인 상처 섬유아세포는 MMP-2 수준 및 활성이 감소되었다.

재상피화가 상처 치유 과정에서 그 다음으로 주요한 과정이며, 주로 각질세포의 이동으로 개시된다. 재상피화는 육아 조직을 통해 이동하는 각질세포의 성장 인자 및 사이토킨 촉진 증식을 통해 이루어진다. 이들 세포는 이동중에 분화 세포 표현형에 연루되는 단백질을 발현하는 다수의 표현형 변화를 겪는 것으로 나타났다. 이동이 진행함에 따라, 각질세포는 세린 단백 분해효소 및 MMP를 생성하는 단백질 분해 표현형을 얻게 된다. 각질세포는 완료될 때까지 상처 공간으로 이동을 계속하게 되며, 유사분열적으로 활성인 각질세포가 추가의 표현형 변경을 겪게 되는 경우, 상피의 분화 및 층화와 기저막의 재형성이 일어나 재상피화 과정이 완료된다.

세포 ECM 부착, 단백 분해효소에 의한 ECM 분해 및 사이토킨 및 성장 인자에 의한 이들 과정의 전체 조절이 세포 인테그린-ECM 상호작용을 통해 세포 이동 및 상처 수축과 같은 세포 기능을 조정하는 상처 재형성 및 치유의 그밖의 다른 중요한 일면이다. 이러한 상호작용은 Rho 패밀리 및 액틴 결합 단백질을 통해 세포 골격 재구성 및 새로운 인테그린-ECM 상호작용을 조절하는 반면, 단백 분해효소는 기존의 인테그린 상호작용을 제거함으로써 후(rear) 탈부착 및 세포 이동을 허용한다(Martin, 1997; Stephens and Thomas, 2002; Kirfel et al, 2004). 후 탈부착 부재하에 세포 수축성은 콜라겐 격자 재구성/수축에 의해 실험적으로 정량된 바와 같이, 피부 재구성으로 이어진다.

IL-6은 상처 주변부 각질세포에 대한 그의 분열 촉진 효과 및 중성구에 대한 그의 화학적-유도 효과를 통해 상기 측면의 치유 반응을 "시동(kick start)"하는데 중요할 것으로 판단된다(Werner & Grosse, 2003; Galluci et al, 2000). IL-6의 일시적 발현은 무반흔 상처 형성에 중요할 것으로 판단된다(Liechty et al, 2000).

(iii) 성숙(4 일-수 주 또는 수 개월)

상처 성숙(또는 재형성)은 수 일 또는 수 주간으로 짧을 수 있으나, 완결 과정은 수 년간으로 지속될 수 있다. 이 단계동안 수축, 홍화 감소, 두께 감소, 경화 감소 및 상처 강도의 증가가 관찰된다. 상처가 근섬유아세포의 영향하에 수축하고, 육아 조직내 콜라겐 생산이 감소되며, 혈관이 감소한다. 이어서, 추가의 재상피화에 의해 상처 치유가 완료된다(Werner and Grose, 2003; Baum and Arpey, 2005).

손상 및 조직 특성에 따라, 조직 완전성의 파괴가 대상을 감염, 혈액 상실, 조직 기능 상실 또는 반흔 형성에 취약한 상태로 만들 수 있다. 따라서, 효과적이면서 완전한 상처 치유가 대상의 건강을 지속시키고 삶의 질을 높이는데 필수적이 다. 많은 요인들이 상처 치유 과정에 불리하게 작용하여 만성적이거나 더디게 치유되는 상처 및/또는 반흔 형성을 남길 수 있는데, 이러한 요인으로는 다친 대상의 연령 및 일반적인 건강상태, 영양실조, 질환, 가압력, 순환 장애, 약물 처치(예: 항암제 및 스테로이드제 처치), 감염, 이조직 및 괴사 조직의 존재 뿐 아니라 상처 종류가 포함된다.

또한, 상처가 치유되었더라도, 반흔 조직이 남는 경우가 빈번하다. 반흔 조직은 상처를 입지 않은 정상 피부에 비해 기능적으로나 미용적인 면에서 떨어진다. 이러한 열화는 새로운 조직 형성동안 발생된 신생 진피내 콜라겐 다발의 배열 결과인 것으로 보여진다. 정상 피부내 콜라겐 다발은 복잡한 3-차원 직조 배열("바스켓-직조" 배열로 칭해지는 경우가 종종 있음)로 구성되어 고 수준의 피부 탄력성 및 상처 복원성을 제공한다. 반흔 조직내 콜라겐 다발은 다발이 피부 표면에 평행하게 배향되어 보다 평면적인 방식으로 배열된다. 3-차원 직조 구조가 상실되어 평행한 콜라겐 다발 배열로 교체되는 것이 조직 반흔 형성 부위에 미용적인 상실을 초래할 것으로 판단된다.

상처 치유를 촉진하는데 집중적인 조사 및 연구의 초점이 맞추어져 있으며, 현재 수 많은 피동 및 능동적인 드레싱 및 붕대, 및 국소적 약물 처치 뿐 아니라 괴사 조직의 물리적 및/또는 화학적인 죽은 조직 제거술을 비롯하여, 상처를 치유하고 상처 치유를 촉진하기 위해 이용할 수 있는 다수의 방법 및 조성물이 존재한다. 상처 치유는 또한 괴사, 세포자멸사 및 비변형 조직의 세포 성장 변경을 포함할 수 있다.

상기 노력에도 불구하고, 결과들은 다소 일치하지 않았으며, 만성적이거나 더디게 치유되는 상처의 치료는 의사회에 심도있는 과제를 지속적으로 부과하고 있다. 따라서, 상처를 치료하고 상처 치유를 촉진하기 위한 추가의 약제 및 방법이 요구되고 있다. 또한, 보다 정상적인 콜라겐 구조의 발생을 촉진할 수 있는 방식으로 조직 복구 과정을 조절할 수 있는 약제가 반흔 조직의 질을 개선할 것으로 기대된다.

대극과(Euphorbiaceae) 식물은 유포르비아(Euphorbia) 종 잡초를 비롯하여 각종 다양한 식물을 포함하고 있다. 인게난(ingenane), 특히 인게놀 화합물이 이들 종으로부터 분리될 수 있음은 널리 보고되었다. 이 그룹중 심도있게 연구된 종 중의 하나가 유포르비아 필루리페라 엘(Euphorbia pilulifera L)(이명 E. hirta L., E. capitata Lam.)이며, 그의 속명으로는 필-베어링 스퍼지(pill-bearing spurge), 뱀꼬리(snakeweed), 캣츠 헤어(cat's hair), 퀸즈랜드 아스마 위드(Queensland asthma weed) 및 플라우어리-헤디드 스퍼지(flowery-headed spurge)를 들 수 있다. 이 식물은 인도를 포함한 열대 국가 및 퀸즈랜드를 포함한 호주 북부에 널리 분포되어 있다. 유포르비아 페플루스(Euphorbia peplus)는 항암성을 지닌 인게놀 안젤레이트가 분리되는 다른 종이다(미국 특허 제6,432,452호, 6,787,161호 및 6,844,013호 참조). 인게놀-3-안젤레이트는 유포르비아 페플루스로부터 추출되어 정제된 인게놀 안젤레이트이며, 특히, 단기간 국소 투여로 광선 각화증 및 비흑색종 피부암(NMSC)을 치료하는데에 유용하다. 인게놀-3-안젤레이트의 세포독성은 시험관내에서 많은 세포주에서 밝혀졌으며, 생체내 그의 효능은 임상적으로 확립되었 다.

발명의 개요

이하, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 달리 언급이 없으면, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 그의 변형어는 지정된 수 또는 단계, 또는 수나 단계의 군들을 포함하고, 임의의 다른 수 또는 단계, 또는 수나 단계의 군들을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 할 것이다.

상처 치유 과정에서 성장 인자 및 사이토킨 뿐 아니라 섬유아세포 및 각질세포에 의해 수행되는 중요한 역할이 제시되면, 각각 그의 생산 또는 표현형 반응을 조절할 수 있는 약제는 상처 치유 과정을 촉진, 자극, 개시, 증진 또는 진행시키고/시키거나 반흔 형성을 감소 또는 최소화, 즉 미용성을 개선함으로써 상처를 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명에 따라, 인게놀 화합물은 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 면역자극 활성을 조절할 수 있고, 상처 치유시 역할을 수행할 수 있는 특정 사이토킨의 발현 또는 생산을 상향 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따라, 피부 섬유아세포 및 각질세포의 표현형 및 중추적인 상처 치유 반응이 이러한 화합물을 사용하여 조절될 수 있음도 밝혀졌다. 이렇게 조절된 변경은, 특히 피부 상처에 대한 상처 치유 결과에 유익할 수 있다. 유리하게도, 이는 또한 반흔 형성이 감소된 상처 치유 결과를 제공할 수도 있다. 본 발명은 상처 치유에 관여하는 사이토킨 생산과 섬유아세포 및 각질세포의 표현형 반응을 조절하는 신규 방법을 제공한다. 요컨대, 이를테면 PMN 및 대식 세포 이동을 증가시키고, 염증성 사이토킨(pro-inflammatory cytokine) 수준을 증가시키는 것 등에 의해 급성 염증성 반응을 촉진함으로써, 상처 치유가 촉진될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상처 치유 및 상처 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 보다 정상적인 콜라겐 구조의 발생을 촉진함에 따라 치유된 상처의 반흔 조직의 질을 유익하게 개선할 수 있는 약제도 제공한다.

따라서, 제1 측면으로, 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상에서 하나 이상의 사이토킨의 생산을 조절하는 방법이 제공된다.

다른 측면으로, 본 발명은 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는, 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상의 상처 부위에서 하나 이상의 사이토킨의 생산을 조절하는 방법을 제공한다. 일례로, 투여는 상처 부위에 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 국소 적용하는 것을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 조절은 사이토킨 생산의 증가를 포함한다.

다른 구체예에 있어서, 하나 이상의 사이토킨은 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 및 TNF-α로 구성된 군중에서 선택된다.

다른 측면으로, 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는, 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상에서 피부 섬유아세포 및/또는 각질세포의 표현형 반응을 조절하는 방법이 제공된다.

다른 측면으로, 본 발명은 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는, 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상의 상처 부위에서 피부 섬유아세포 및/또는 각질세포의 표현형 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 일례로, 투여는 상처 부위에 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 국소적으로 적용하는 것을 포함한다.

다른 측면으로, 본 발명은 상처 치유 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 상기 대상에서 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 상처 치유 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 상처에 국소적으로 적용하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상에서 상처 치유를 촉진함으로써 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상처는 진피 또는 표피 상처 등의 피부 상처이다.

일부 구체예에 있어서, 인게놀 화합물은 인게놀-3-안젤레이트, 20-O-아세틸-인게놀-3-안젤레이트 및 20-데옥시-인게놀-3-안젤레이트, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 프로드럭중에서 선택된다.

본 발명에서 대상으로 하는 화합물은 바람직하게는 정상 콜라겐 구조의 복원, 발생 또는 촉진에 도움이 될 수 있으며, 따라서 반흔 형성을 감소 또는 최소화하거나, 또 다른 한편으로는 강도 또는 탄성 향상, 상처의 홍화, 두께, 경화, 저 색소침착 또는 고 색소침착의 감소와 같은 미용 또는 기능적 결과를 개선하는 방법을 제공할 수 있다. 이에 따라, 화합물은 특히, 만성적인 상처의 경우에 상기 달성 속도를 향상시키거나 가속화함으로써 치유가 촉진되도록 염증성 반응을 "시동(kick-started)"할 수 있다.

따라서, 또 다른 측면으로, 본 발명은 반흔을 감소시키거나 최소화하는 양 또는 미용적이거나 기능적 개선량의 인게놀 안젤레이트 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 대상의 상처에 투여하는 것을 포함하여, 상처에서 반흔 조직을 감소 또는 최소화하거나, 상처의 미용 또는 기능적 결과를 개선하는 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 0.01%, 0.028%, 0.05% PEP005를 적용한 후, 급성(외과적) 래트 전층 절개 상처에서 (A) 4 주 및 (B) 12 주째에 얻은 평균 장력학적 데이터를 DMSO/이소프로판올 비히클(대조군) 및 비처리 상처 대조군과 비교하여 도표화한 것이다. N-NT = PEP005-"비처치(

)", 비처리; N-V = PEP005-"비처치", 비히클-처리; V = PEP005-노출, 비히클-처리.

발명의 상세한 설명

본 발명을 상세하게 기술하기에 앞서, 달리 명시되지 않으면, 변경될 수도 있기 때문에, 본 발명이 특정 성분 제제, 제조방법, 용법 등으로 한정되는 것으로 이해하여서는 안된다. 본 원에 이용된 기술도 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이지 제한하고자 하는 의도는 없는 것으로도 이해하여야 한다.

단수 형태는 달리 명확하게 제시되지 않으면 복수의 개념도 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들어 "안젤로일 치환된 인게난" 또는 "인게놀 안젤레이트"를 언급하는 경우에는 단일 화합물뿐 아니라, 필요에 따라 2 이상의 화합물도 포함하는 것이다.

본 원에 사용된 "상처"란 조직 구조의 연속성 또는 완전성의 물리적인 파열을 의미한다. "상처 치유"란 조직 완전성의 복원을 의미한다. 이는 조직 완전성의 부분적 또는 완전 복원을 의미할 수 있는 것으로 이해하여야 할 것이다. 따라서, 상처 치료란 상처 치유 과정에 관여하는 하나 이상의 단계 또는 과정의 촉진, 개선, 진행, 가속 또는 진전을 의미한다.

상처는 급성 또는 만성적인 것일 수 있다. 욕창, 정맥성 다리 궤양 및 당뇨성 족부 궤양을 포함한 만성적인 상처는 단순히 치료되지 않는 상처로 일컬을 수 있다. 만성적인 상처의 정확한 분자론적 병인론을 완전히 이해하고 있지 못하지만, 이것이 다인성이라는 것은 알고 있다. 급성 손상동안 상주 및 이동 세포의 정상적인 반응이 손상을 입으면, 이 상처는 지속성 염증성 반응, 상처 세포외 기질(ECM) 재형성 결손 및 재상피화 기능상실의 특징을 갖게 된다.

상처는, 예컨대 타박상 또는 내부 궤양화에서와 같이, 피부의 외부 구조적 완전성이 유지되는 임의의 내부 상처이거나 외부 상처, 특히 피부 상처일 수 있으며, 따라서 조직은 내부 또는 외부 신체 조직일 수 있다. 일례로, 조직은 피부(예컨대 인간 피부)이며, 즉 상처는 진피 또는 표피 상처와 같은 피부 상처이다.

사람의 피부는 표피 및 진피의 두개의 상이한 층으로 구성되며, 이들 아래에 피하 조직이 존재한다. 피부의 주요 기능은 내부 기관 및 조직을 외상 및 병원균 감염으로부터 보호하고, 감각 및 체온 조절을 제공하는 것이다.

피부의 최외층인 표피는 두께가 약 0.04 mm이고, 무혈관이며, 네가지 세포 타입(각질세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포 및 메르켈 세포)으로 구성되고, 수개의 상피 세포층으로 층화되어 있다. 표피의 가장 안쪽에 있는 상피층은 진피와 집적 접촉하여 있고, 표피를 진피에 고정시키는 기저막이다. 피부에서 일어나는 모든 상피 세포 분열은 기저막에서 발생한다. 세포 분열 후, 상피 세포는 표피의 외면쪽으로 이동한다. 이러한 이동중에, 세포는 각질화라고 알려진 과정을 겪게 되며, 이에 따라 핵이 소실되고, 세포는 단단하면서 편평한 저항성 비 생세포로 변형된다. 세포가 하부 조직이 건조되지 않도록 도와주는 가장 바깥쪽에 있는 표피 구조의 각질층내 건조 방수 편평 세포층에 도달하면 이동은 완료된다. 이러한 사멸 상피 세포층은 계속해서 벗겨지고, 기저막으로부터 표면으로 이동하는 각화 세포로 교체된다. 표피 상피는 무혈관이기 때문에, 기저막은 그의 영양 공급을 위해 진피에 의존한다.

진피는 영양분을 표피로 공급하는 고도로 혈관화된 조직층이다. 또한, 진피는 신경 종말, 림프관, 콜라겐 단백질 및 결합 조직을 갖고 있다. 진피는 두께가 약 0.5 mm이고, 주로 섬유아세포 및 대식 세포로 이루어져 있다. 이들 세포 타입은 주로 피부를 포함하여 모든 동물의 결합 조직에 발견되는 단백질인 콜라겐의 생산 및 유지에 관여한다. 콜라겐은 주로 피부의 원상적인 탄력성에 관여한다. 콜라겐이 풍부한 진피 밑에서 발견되는 피하 조직은 그 위에 있는 조직에 피부 이동, 분리, 칼로리 저장 및 혈액을 제공한다.

상처는 부분층 상처 또는 전층 상처의 두가지 일반 범주중 하나로 분류될 수 있다. 부분층 상처는 피부 혈관의 손상없이 표피 및 표재성 진피로 제한된다. 전층 상처는 진피 파괴를 포함하며, 피부 혈관 파열을 비롯하여 보다 깊은 조직층으로 확장된다. 부분층 상처의 치유는 상피 조직의 단순 재생으로 일어난다. 전층 상처의 상처 치유는 보다 복잡하다. 본 발명에서 대상으로 하는 피부 상처는 부분층 상처 또는 전층 상처일 수 있다.

본 발명에서 대상으로 하는 상처는 베인 상처 및 열상, 외과적 절개 또는 상처, 천자, 찰과상(graze), 긁힌 상처, 압박 상처, 찰과상(abrasion), 마찰 상처(예: 기저귀 발진, 마찰 수포), 욕창 궤양(예: 욕창 또는 와창); 열 작용에 의한 상처(직접, 또는 전도, 대류 또는 복사선을 통한 냉원 및 열원 및 전기 공급원으로부터의 화상), 화학적 상처(예: 산 또는 알칼리 화상) 또는 개방 또는 무손상 종기, 피부 발진, 흠집 및 여드름을 비롯한 병원성 감염(예: 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염), 궤양, 만성적인 상처(당뇨병-관련 상처, 예컨대 하퇴 및 족부 궤양, 정맥성 다리 궤양 및 욕창 포함), 피부 이식편/이식 제공자 및 수용자 부위, 면역 반응 이상, 예를 들어 건선 및 습진, 위 또는 장 궤양, 구강 궤양을 비롯한 구강 상처, 손상된 연골 또는 뼈, 절단 상처 및 각막 병변을 포함한다.

"인게놀"은 C3, C4, C5-트리옥시 트랜스 비사이클로[4.4.1]-운데칸 인게난 골격을 갖는 화합물을 포함한다. 이 화합물은 문헌에 널리 보고되고 공지되었으며, 대극과(Euphorbiaceae) 종 등의 식물로부터 분리할 수 있을 뿐만 아니라 화학적으로 합성할 수도 있다(참조예: Winkler et al, 2002 및 Tanino et al, 2003). 이 화합물은 일반적으로 대극과 식물의 추출물에서 발견된다. 그에 따라, 추출물은 잎, 줄기, 꽃, 종자, 나무 껍질 또는 나무 껍질과 줄기 사이로부터 삼출되거나 이중에 존재하는 수액 또는 액체 또는 반액체 물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 추출물은 수액으로부터 유래된다. 또한, 추출물은 대극과 식물의 수액, 잎, 줄기, 꽃, 나무 껍질 또는 다른 식물 물질로부터 추출된 분획에 들어 있는 액체 또는 반액체 물질을 포함할 수도 있다. 예를 들어 식물 물질은 식물 섬유 및 세포외 기질 물질의 파괴와, 수성 환경을 포함하는 용매에서 조직간 및 조직내 추출을 위해 물리적으로 조작될 수 있다. 화학적 합성 경로를 통하여 수득한 화합물을 비롯하여 화합물의 이러한 모든 공급원은 본 발명에 포함된다.

본 원에서 대극과 식물의 구성원으로는 아칼리파(Acalypha), 아시도톤(Acidoton), 액티노스테몬(Actinostemon), 아델리아(Adelia), 아데노클리네(Adenocline), 아데노크레피스(Adenocrepis), 아데오파에드라(Adenophaedra), 아디스카(Adisca), 아그로스티스타키스(Agrostistachys), 알코르네아(Alchornea), 알코르네옵시스(Alchorneopsis), 알시나에안투스(Alcinaeanthus), 알코세리아(Alcoceria), 알레우리테스(Aleurites), 아마노아(Amanoa), 안드라크네(Andrachne), 안고스틸레스(Angostyles), 아니소필룸(Anisophyllum), 안티데스마(Antidesma), 아포라(Aphora), 아포로사(Aporosa), 아포로셀라(Aporosella), 아그리탐니아(Argythamnia), 아스트로코쿠스(Astrococcus), 아스트로기네(Astrogyne), 바칸레아(Baccanrea), 발리오스퍼뭄(Baliospermum), 베르나르디아(Bernardia), 베예리옵시스(Beyeriopsis), 비스코피아(Bischofia), 블라치아(Blachia), 블루메오돈드론(Blumeodondron), 보나니아(Bonania), 브라들레이아(Bradleia), 브레이니아(Breynia), 브레이니옵시스(Breyniopsis), 브리에델리아(Briedelia), 부라에아비아(Buraeavia), 카페로니아(Caperonia), 카리오덴드론(Caryodendron), 셀리아넬라(Celianella), 세팔로크로톤(Cephalocroton), 카에노테카(Chaenotheca), 카에토카르푸스(Chaetocarpus), 카마에시세(Chamaesyce), 체일로사(Cheilosa), 치로페탈룸(Chiropetalum), 코리오필룸(Choriophyllum), 시카(Cicca), 카옥실론(Chaoxylon), 클레이돈(Cleidon), 클레이스탄투스(Cleistanthus), 클루이티아(Cluytia), 크네스모네(Cnesmone), 크니도스콜루스(Cnidoscolus), 코코세라스(Coccoceras), 코디아에움(Codiaeum), 코엘로디스쿠스(Coelodiscus), 코나미(Conami), 콘세베이바(Conceveiba), 콘세베이바스트룸(Conceveibastrum), 콘세베이붐(Conceveibum), 코리테아(Corythea), 크로이자티아(Croizatia), 크로톤(Croton), 크로토놉시스(Crotonopsis), 크로조포라(Crozophora), 쿠반투스(Cubanthus), 쿠누리아(Cunuria), 닥틸로스테몬(Dactylostemon), 달레캄피아(Dalechampia), 덴드로코우신시아(Dendrocousinsia), 디아스페르수스(Diaspersus), 디디모시스투스(Didymocistus), 디모르포칼릭스(Dimorphocalyx), 디스코카르푸스(Discocarpus), 디탁티스(Ditaxis), 도데카스팅그마(Dodecastingma), 드리페테스(Drypetes), 디솝시스(Dysopsis), 엘라테리오스페르뭄(Elateriospermum), 엔다데니움(Endadenium), 엔도스페르뭄(Endospermum), 에리스만투스(Erismanthus), 에리스로카르푸스(Erythrocarpus), 에리스로칠루스(Erythrochilus), 유메칸투스(Eumecanthus), 유포르비아(Euphorbia), 유포르비오덴드론(Euphorbiodendron), 엑스코에카리아(Excoecaria), 플루에게아(Flueggea), 칼레아리아(Calearia), 가르시아(Garcia), 가바레티아(Gavarretia), 겔로늄(Gelonium), 기아라(Giara), 기보티아(Givotia), 클로키디온(Glochidion), 클로키디오놉시스(Clochidionopsis), 글리시덴드론(Glycydendron), 김난테스(Gymnanthes), 김노스파리아(Gymnosparia), 하에마토스페르툼(Haematospermum), 헨데칸드라(Hendecandra), 헤베아(Hevea), 히에로니마(Hieronima), 히에로나이마(Hieronyma), 힙포크레판드라(Hippocrepandra), 호말란투스(Homalanthus), 히메오카르디아(Hymenocardia), 자니파(Janipha), 자트로파(Jatropha), 줄로크로톤(Julocroton), 라시오크로톤(Lasiocroton), 레이오카르푸스(Leiocarpus), 레오나르디아(Leonardia), 레피단투스(Lepidanthus), 류코크로톤(Leucocroton), 마베아(Mabea), 마카란가(Macaranga), 말로투스(Mallotus), 마니호트(Manihot), 마파(Mappa), 마프로우네아(Maprounea), 멜란테사(Melanthesa), 메르쿠리알리스(Mercurialis), 메테니아(Mettenia), 미크란드라(Micrandra), 미크로데스미스(Microdesmis), 미크로엘루스(Microelus), 미크로스타치(Microstachy), 마오크로톤(Maocroton), 모나데니움(Monadenium), 모지나(Mozinna), 네오스코르테치니아(Neoscortechinia), 오말란투스(Omalanthus), 옴팔레아(Omphalea), 오펠란타(Ophellantha), 오르비쿨라리아(Orbicularia), 오스토데스(Ostodes), 옥시덱테스(Oxydectes), 팔렌가(Palenga), 판타데니아(Pantadenia), 파라드리펩테스(Paradrypeptes), 파우산드라(Pausandra), 페딜란투스(Pedilanthus), 페라(Pera), 페리디움(Peridium), 페탈로스티그마(Petalostigma), 필란투스(Phyllanthus), 피크로덴드로(Picrodendro), 피에라르디아(Pierardia), 필리노피툼(Pilinophytum), 피멜레오덴드론(Pimeleodendron), 피라네아(Piranhea), 플라티기나(Platygyna), 플루케네티아(Plukenetia), 포도칼릭스(Podocalyx), 포인세티아(Poinsettia), 포라레시아(Poraresia), 프로사르테마(Prosartema), 슈도단투스(Pseudanthus), 피크노코마(Pycnocoma), 콰드라시아(Quadrasia), 레베르코니아(Reverchonia), 리체리아(Richeria), 리체리엘라(Richeriella), 리시넬라(Ricinella), 리시노카르푸스(Ricinocarpus), 로트렐라(Rottlera), 사코티아(Sagotia), 산위티아(Sanwithia), 사피움(Sapium), 사비아(Savia), 스클레로크로톤(Sclerocroton), 세바스티아나(Sebastiana), 세쿠리네가(Securinega), 세네펠데라(Senefeldera), 세네필데롭시스(Senefilderopsis), 세로피톤(Serophyton), 시포니아(Siphonia), 스파티오스테몬(Spathiostemon), 스픽시아(Spixia), 스틸린기아(Stillingia), 스트로피오블라치아(Strophioblachia), 시나데니움(Synadenium), 테트라코쿠스(Tetracoccus), 테트라플란드라(Tetraplandra), 테트로르치디움(Tetrorchidium), 티르산테라(Thyrsanthera), 티티말루스(Tithymalus), 트라게이아(Trageia), 트레위아(Trewia), 크리고노스테몬(Trigonostemon), 티리아(Tyria) 및 크실로필라(Xylophylla) 속으로부터의 종들이 포함된다.

본 발명을 실시하는데 바람직한 특히 적합한 속은 유포르비아(Euphorbia) 속이다. 이 속중 특히 유용한 종은 유포르비아 아아론로시이(Euphorbia aaronrossii), 유포르비아 아브레비아타(Euphorbia abbreviata), 유포르비아 아쿠타(Euphorbia acuta), 유포르비아 알라토카울리스(Euphorbia alatocaulis), 유포르비아 알비카울리스(Euphorbia albicaulis), 유포르비아 알고마르기나타(Euphorbia algomarginata), 유포르비아 알리세아에(Euphorbia aliceae), 유포르비아 알타(Euphorbia alta), 유포르비아 아나캄프세로스(Euphorbia anacampseros), 유포르비아 안드로메다에(Euphorbia andromedae), 유포르비아 안구스타(Euphorbia angusta), 유포르비아 안토니이(Euphorbia anthonyi), 유포르비아 안티구엔시스(Euphorbia antiguensis), 유포르비아 아포시니폴리아(Euphorbia apocynifolia), 유포르비아 아라비카(Euphorbia arabica), 유포르비아 아리엔시스(Euphorbia ariensis), 유포르비아 아리조니카(Euphorbia arizonica), 유포르비아 아르칸사나(Euphorbia arkansana), 유포르비아 아르테아가에(Euphorbia arteagae), 유포르비아 아룬델라나(Euphorbia arundelana), 유포르비아 아스트로이테스(Euphorbia astroites), 유포르비아 아트로코카(Euphorbia atrococca), 유포르비아 바셀리시스(Euphorbia baselicis), 유포르비아 바타바넨시스(Euphorbia batabanensis), 유포르비아 베르게리(Euphorbia bergeri), 유포르비아 베르무디아나(Euphorbia bermudiana), 유포르비아 비콜로르(Euphorbia bicolor), 유포르비아 비포르미스(Euphorbia biformis), 유포르비아 비푸르카타(Euphorbia bifurcata), 유포르비아 빌로바타(Euphorbia bilobata), 유포르비아 비라멘시스(Euphorbia biramensis), 유포르비아 비운시알리스(Euphorbia biuncialis), 유포르비아 블레파로스티풀라(Euphorbia blepharostipula), 유포르비아 블로드게티(Euphorbia blodgetti), 유포르비아 보에라아비오이데스(Euphorbia boerhaavioides), 유포르비아 볼리비아나(Euphorbia boliviana), 유포르비아 브라세이(Euphorbia bracei), 유포르비아 브라키아타(Euphorbia brachiata), 유포르비아 브라키세라(Euphorbia brachycera), 유포르비아 브란데게(Euphorbia brandegee), 유포르비아 브리토니(Euphorbia brittonii), 유포르비아 카에시아(Euphorbia caesia), 유포르비아 칼시콜라(Euphorbia calcicola), 유포르비아 캄페스트리스(Euphorbia campestris), 유포르비아 칸델라브룸(Euphorbia candelabrum), 유포르비아 카피텔라타(Euphorbia capitellata), 유포르비아 카르메넨시스(Euphorbia carmenensis), 유포르비아 카룬쿨라타(Euphorbia carunculata), 유포르비아 카옌시스(Euphorbia cayensis), 유포르비아 셀라스트로이데스(Euphorbia celastroides), 유포르비아 칼리코필라(Euphorbia chalicophila), 유포르비아 차마에로도스(Euphorbia chamaerrhodos), 유포르비아 차마에술라(Euphorbia chamaesula), 유포르비아 치아펜시스(Euphorbia chiapensis), 유포르비아 치오게노이데스(Euphorbia chiogenoides), 유포르비아 시네라센스(Euphorbia cinerascens), 유포르비아 클라리오넨시스(Euphorbia clarionensis), 유포르비아 콜리마에(Euphorbia colimae), 유포르비아 콜로라타(Euphorbia colorata), 유포르비아 코무타타(Euphorbia commutata), 유포르비아 콘소퀴틀라에(Euphorbia consoquitlae), 유포르비아 콘볼불로이데스(Euphorbia convolvuloides), 유포르비아 코랄리페라(Euphorbia corallifera), 유포르비아 크레베리마(Euphorbia creberrima), 유포르비아 크레눌라타(Euphorbia crenulata), 유포르비아 쿠벤시스(Euphorbia cubensis), 유포르비아 쿠스피다타(Euphorbia cuspidata), 유포르비아 심비포르미스(Euphorbia cymbiformis), 유포르비아 다를링토니(Euphorbia darlingtonii), 유포르비아 데폴리아타(Euphorbia defoliata), 유포르비아 데게네리(Euphorbia degeneri), 유포르비아 델토이데아(Euphorbia deltoidea), 유포르비아 덴타타(Euphorbia dentata), 유포르비아 데프레사(Euphorbia depressa), 유포르비아 딕티오스페르마(Euphorbia dictyosperma), 유포르비아 딕티오스페르마(Euphorbia dictyosperma), 유포르비아 디오에카(Euphorbia dioeca), 유포르비아 디스코이달리스(Euphorbia discoidalis), 유포르비아 도르시벤트랄리스(Euphorbia dorsiventralis), 유포르비아 드루몬디이(Euphorbia drumondii), 유포르비아 듀클로욱시이(Euphorbia duclouxii), 유포르비아 두시이(Euphorbia dussii), 유포르비아 에아노필라(Euphorbia eanophylla), 유포르비아 에게르시이(Euphorbia eggersii), 유포르비아 에글란둘로사(Euphorbia eglandulosa), 유포르비아 엘라타(Euphorbia elata), 유포르비아 에날라(Euphorbia enalla), 유포르비아 에리오고노이데스(Euphorbia eriogonoides), 유포르비아 에리오필라(Euphorbia eriophylla), 유포르비아 에스쿨라에포르미스(Euphorbia esculaeformis), 유포르비아 에스피리투엔시스(Euphorbia espirituensis), 유포르비아 에술라(Euphorbia esula), 유포르비아 엑스시사(Euphorbia excisa), 유포르비아 엑스클루사(Euphorbia exclusa), 유포르비아 엑스스티피타타(Euphorbia exstipitata), 유포르비아 엑스스티풀라타(Euphorbia exstipulata), 유포르비아 펜들레리(Euphorbia fendleri), 유포르비아 필리카울리스(Euphorbia filicaulis), 유포르비아 필리포르미스(Euphorbia filiformis), 유포르비아 플로리다(Euphorbia florida), 유포르비아 프루티쿨로사(Euphorbia fruticulosa), 유포르비아 가르베르(Euphorbia garber), 유포르비아 가우메리이(Euphorbia gaumerii), 유포르비아 게라르디에나(Euphorbia gerardiana), 유포르비아 게예리(Euphorbia geyeri), 유포르비아 글립토스페르마(Euphorbia glyptosperma), 유포르비아 고르고니스(Euphorbia gorgonis), 유포르비아 그라실리오르(Euphorbia gracilior), 유포르비아 글라실리마(Euphorbia gracillima), 유포르비아 그라디이(Euphorbia gradyi), 유포르비아 그라미네아(Euphorbia graminea), 유포르비아 그라미니에아(Euphorbia graminiea), 유포르비아 그리세아(Euphorbia grisea), 유포르비아 구아달라자라나(Euphorbia guadalajarana), 유포르비아 구아나렌시스(Euphorbia guanarensis), 유포르비아 김나데니아(Euphorbia gymnadenia), 유포르비아 하에마탄타(Euphorbia haematantha), 유포르비아 헤디오토이데스(Euphorbia hedyotoides), 유포르비아 헬드리치이(Euphorbia heldrichii), 유포르비아 헬레나에(Euphorbia helenae), 유포르비아 헬레리(Euphorbia helleri), 유포르비아 헬위기이(Euphorbia helwigii), 유포르비아 헨릭소니이(Euphorbia henricksonii), 유포르비아 헤테로필라(Euphorbia heterophylla), 유포르비 헥사고나(Euphorbia hexagona), 유포르비아 헥사고노이데스(Euphorbia hexagonoides), 유포르비아 힌클레요룸(Euphorbia hinkleyorum), 유포르비아 힌토니이(Euphorbia hintonii), 유포르비아 히르툴라(Euphorbia hirtula), 유포르비아 히르타(Euphorbia hirta), 유포르비아 후베리(Euphorbia hooveri), 유포르비아 후미스트라타(Euphorbia humistrata), 유포르비아 히페리시폴리아(Euphorbia hypericifolia), 유포르비아 이눈다타(Euphorbia inundata), 유포르비아 인볼루타(Euphorbia involuta), 유포르비아 잘리센시스(Euphorbia jaliscensis), 유포르비아 제누다(Euphorbia jejuna), 유포르비아 존스톤(Euphorbia Johnston), 유포르비아 주타에(Euphorbia juttae), 유포르비아 크누티이(Euphorbia knuthii), 유포르비아 라시오카르파(Euphorbia lasiocarpa), 유포르비아 라타(Euphorbia lata), 유포르비아 라타지(Euphorbia latazi), 유포르비아 라테리콜로르(Euphorbia latericolor), 유포르비아 락시플로라(Euphorbia laxiflora), 유포르비아 레케오이데스(Euphorbia lecheoides), 유포르비아 레디에니이(Euphorbia ledienii), 유포르비아 류코필라(Euphorbia leucophylla), 유포르비아 리네아타(Euphorbia lineata), 유포르비아 링구이포르미스(Euphorbia linguiformis), 유포르비아 롱게코르누타(Euphorbia longecornuta), 유포르비아 롱게페티올라타(Euphorbia longepetiolata), 유포르비아 롱게라모사(Euphorbia longeramosa), 유포르비아 롱긴술리콜라(Euphorbia longinsulicola), 유포르비아 롱기필라(Euphorbia longipila), 유포르비아 루풀리나(Euphorbia lupulina), 유포르비아 루리다(Euphorbia lurida), 유포르비아 리시오이데스(Euphorbia lycioides), 유포르비아 마크로포도이데스(Euphorbia macropodoides), 유포르비아 마크바우기아나(Euphorbia macvaughiana), 유포르비아 만카(Euphorbia manca), 유포르비아 만도니아나(Euphorbia mandoniana), 유포르비아 망글레티(Euphorbia mangleti), 유포르비아 망고(Euphorbia mango), 유포르비아 마릴란디카(Euphorbia marylandica), 유포르비아 마야나(Euphorbia mayana), 유포르비아 멜라나데니아(Euphorbia melanadenia), 유포르비아 멜라노카르파(Euphorbia melanocarpa), 유포르비아 메리덴시스(Euphorbia meridensis), 유포르비아 메르토니이(Euphorbia mertonii), 유포르비아 멕시아에(Euphorbia mexiae), 유포르비아 미크로세팔라(Euphorbia microcephala), 유포르비아 미크로클라다(Euphorbia microclada), 유포르비아 미크로메라(Euphorbia micromera), 유포르비아 미셀라(Euphorbia misella), 유포르비아 미수리카(Euphorbia missurica), 유포르비아 몬타나(Euphorbia montana), 유포르비아 몬테레야나(Euphorbia montereyana), 유포르비아 물티카울리스(Euphorbia multicaulis), 유포르비아 물티포르미스(Euphorbia multiformis), 유포르비아 물티노디스(Euphorbia multinodis), 유포르비아 물티세타(Euphorbia multiseta), 유포르비아 무스시콜라(Euphorbia muscicola), 유포르비아 네오멕시카나(Euphorbia neomexicana), 유포르비아 네프라데니아(Euphorbia nephradenia), 유포르비아 니쿠에로아나(Euphorbia niqueroana), 유포르비아 오악사카나(Euphorbia oaxacana), 유포르비아 옥시덴탈리스(Euphorbia occidentalis), 유포르비아 오돈토데니아(Euphorbia odontodenia), 유포르비아 올리바세아(Euphorbia olivacea), 유포르비아 올로왈루아나(Euphorbia olowaluana), 유포르비아 옵탈미카(Euphorbia opthalmica), 유포르비아 오바타(Euphorbia ovata), 유포르비아 파키포다(Euphorbia pachypoda), 유포르비아 파키리자(Euphorbia pachyrhiza), 유포르비아 파디폴리아(Euphorbia padifolia), 유포르비아 팔메리(Euphorbia palmeri), 유포르비아 팔루디콜라(Euphorbia paludicola), 유포르비아 파르시플로라(Euphorbia parciflora), 유포르비아 파리시이(Euphorbia parishii), 유포르비아 파리이(Euphorbia parryi), 유포르비아 팍시아나(Euphorbia paxiana), 유포르비아 페디쿨리페라(Euphorbia pediculifera), 유포르비아 페플리디온(Euphorbia peplidion), 유포르비아 페플로이데스(Euphorbia peploides), 유포르비아 페플루스(Euphorbia peplus), 유포르비아 페르가메나(Euphorbia pergamena), 유포르비아 페를리그네아(Euphorbia perlignea), 유포르비아 페탈로이데아(Euphorbia petaloidea), 유포르비아 페탈로이데아(Euphorbia petaloidea), 유포르비아 페트리나(Euphorbia petrina), 유포르비아 피카켄시스(Euphorbia picachensis), 유포르비아 필로술라(Euphorbia pilosula), 유포르비아 필루리페라(Euphorbia pilulifera), 유포르비아 피나리오나(Euphorbia pinariona), 유포르비아 피네토룸(Euphorbia pinetorum), 유포르비아 피오노스페르마(Euphorbia pionosperma), 유포르비아 플라티스페르마(Euphorbia platysperma), 유포르비아 플리카타(Euphorbia plicata), 유포르비아 포에피기이(Euphorbia poeppigii), 유포르비아 폴리오스페르마(Euphorbia poliosperma), 유포르비아 폴리카르파(Euphorbia polycarpa), 유포르비아 폴리크네모이데스(Euphorbia polycnemoides), 유포르비아 폴리필라(Euphorbia polyphylla), 유포르비아 포르토리센시스(Euphorbia portoricensis), 유포르비아 포르툴라코이데스(Euphorbia portulacoides), 유포르비아 포르툴라나(Euphorbia portulana), 유포르비아 프레슬리이(Euphorbia preslii), 유포르비아 프로스트라타(Euphorbia prostrata), 유포르비아 프테로뉴라(Euphorbia pteroneura), 유포르비아 피크난테마(Euphorbia pycnanthema), 유포르비아 라모사(Euphorbia ramosa), 유포르비아 라풀룸(Euphorbia rapulum), 유포르비아 레미이(Euphorbia remyi), 유포르비아 레트로스카브라(Euphorbia retroscabra), 유포르비아 레볼루타(Euphorbia revoluta), 유포르비아 리부랄리스(Euphorbia rivularis), 유포르비아 로부스타(Euphorbia robusta), 유포르비아 로모사(Euphorbia romosa), 유포르비아 루비다(Euphorbia rubida), 유포르비아 루브로스페르마(Euphorbia rubrosperma), 유포르비아 루피콜라(Euphorbia rupicola), 유포르비아 산마르텐시스(Euphorbia sanmartensis), 유포르비아 삭사틸리스 엠. 비에브(Euphorbia saxatilis M. Bieb), 유포르비아 쉬졸로바(Euphorbia schizoloba), 유포르비아 스클레로시아티움(Euphorbia sclerocyathium), 유포르비아 스코풀로룸(Euphorbia scopulorum), 유포르비아 세닐리스(Euphorbia senilis), 유포르비아 세르필리폴리아(Euphorbia serpyllifolia), 유포르비아 세룰라(Euphorbia serrula), 유포르비아 세틸로바 엔겔름(Euphorbia setiloba Engelm), 유포르비아 소노라에(Euphorbia sonorae), 유포르비아 수비이(Euphorbia soobyi), 유포르비아 스파르시플로라(Euphorbia sparsiflora), 유포르비아 스파에로스페르마(Euphorbia sphaerosperma), 유포르비아 시필리티카(Euphorbia syphilitica), 유포르비아 스프루세아나(Euphorbia spruceana), 유포르비아 수브코에룰레아(Euphorbia subcoerulea), 유포르비아 스텔라타(Euphorbia stellata), 유포르비아 수브맘밀라리스(Euphorbia submammilaris), 유포르비아 수브펠타타(Euphorbia subpeltata), 유포르비아 수브푸벤스(Euphorbia subpubens), 유포르비아 수브레니포르메(Euphorbia subreniforme), 유포르비아 수브트리폴리아타(Euphorbia subtrifoliata), 유포르비아 숙세다네아(Euphorbia succedanea), 유포르비아 타마울리파사나(Euphorbia tamaulipasana), 유포르비아 텔레피오이데스(Euphorbia telephioides), 유포르비아 테누이시마(Euphorbia tenuissima), 유포르비아 테트라포라(Euphorbia tetrapora), 유포르비아 티루칼리(Euphorbia tirucalli), 유포르비아 토멘텔라(Euphorbia tomentella), 유포르비아 토멘토사(Euphorbia tomentosa), 유포르비아 토랄바시이(Euphorbia torralbasii), 유포르비아 토바리엔시스(Euphorbia tovariensis), 유포르비아 트라키스페르마(Euphorbia trachysperma), 유포르비아 트리콜로르(Euphorbia tricolor), 유포르비아 트로야나(Euphorbia troyana), 유포르비아 투에르크헤이미이(Euphorbia tuerckheimii), 유포르비아 투르크자니노위이(Euphorbia turczaninowii), 유포르비아 움벨룰라타(Euphorbia umbellulata), 유포르비아 운둘라타(Euphorbia undulata), 유포르비아 베르미포르미스(Euphorbia vermiformis), 유포르비아 베리스콜로르(Euphorbia versicolor), 유포르비아 빌리페라(Euphorbia villifera), 유포르비아 비올라세아(Euphorbia violacea), 유포르비아 휘테이(Euphorbia whitei), 유포르비아 크산티 엔겔름(Euphorbia xanti Engelm), 유포르비아 크실로포다 그린엠.(Euphorbia xylopoda Greenm.), 유포르비아 야얄레시아 유알비.(Euphorbia yayalesia Urb.), 유포르비아 융가센시스(Euphorbia yungasensis), 유포르비아 제라브샤니카(Euphorbia zeravschanica) 및 유포르비아 진니이플로라(Euphorbia zinniiflora)를 포함한다.

시나데니움(Synadenium) 속의 특히 바람직한 종은 시나데니움 그란티이(Synadenium grantii) 및 시나데니움 콤파크툼(Synadenium compactum)을 포함한다.

모나데니움(Monadenium) 속의 특히 바람직한 종은 모나데니움 루가르데아(Monadenium lugardae) 및 모나데니움 구엔테리(Monadenium guentheri)를 포함한다.

엔다데니움(Endadenium) 속의 바람직한 종은 엔다데니움 고스웨일레니(Endadenium gossweileni)이다.

본 발명을 실시하는데 유용한 유포르비아 페플루스(Euphorbia peplus)가 인게놀 안젤레이트의 공급면에 있어 특히 유용하다. 본 원에서 "유포르비아 페플루스(Euphorbia peplus)" 또는 그의 약칭 "E. peplus"는 이 식물의 다양한 품종, 변종, 계통, 잡종 또는 유도체 뿐 아니라 식물학적 또는 원예학적 관련물을 의미한다. 또한, 본 발명은 전체 대극과 식물 또는 수액 또는 종자를 포함한 이들의 부분을 사용하여서 실시할 수 있거나, 기타 생식 물질이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 종자 또는 생식 물질이 사용될 경우, 식물 또는 묘목이 먼저 번식될 필요가 있다.

본 원에서 대극과 식물, 유포르비아 종 또는 E. peplus는 유전자 변형된 식물을 더 포함한다. 유전자 변형된 식물은 형질전환(trangenic) 식물, 또는 형질이 제거되었거나, 또는 내인성 유전자 서열이 하향 조절, 돌연변이 또는 다르게 변형된 식물, 이를테면 특정 유전자에 조절 효과를 발휘하는 유전자 물질이 도입 또는 변형된 것을 포함한다. 따라서, 대극과 식물, 유포르비아 종 또는 E. peplus에 자연적으로 존재하지 않는 특성을 나타내는 식물도 본 발명에 포함되며, 상기 언급된 용어의 범주에 속한다.

본 발명의 일 구체예로, 인게놀 화합물은 하기 화학식을 가진다:

상기 식에서,

R¹내지 R³은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 아릴알킬, S(O)₂R', S(O)₂OR', P(O)(OR')₂ (여기에서, R'는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬임) 및 글리코실 중에서 선택되고;

R⁴는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 알켄옥시, 임의로 치환된 알킨옥시, 임의로 치환된 아실옥시, 임의로 치환된 아릴알콕시, OS(O)₂R', OS(O)₂OR', OP(O)(OR')₂ (여기에서, R'는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬임) 및 글리콕시 중에서 선택된다.

본 발명의 일 구체예로, R¹내지 R⁴중 적어도 하나는 수소가 아니다. 그의 바람직한 형태로, R¹은 수소가 아니다.

본 발명의 특정한 일 구체예로, R¹은 임의로 치환된 아실기 C(O)-R이다. 그의 추가의 구체예로, R은 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다. 그의 보다 바람직한 구체예로, R은 직쇄 또는 분지형일 수 있으며, 6개 이하 또는 10개 이하의 탄소원자를 가질 수 있다. 그의 일례로, R은 분지형이다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, R¹ 내지 R³중 하나는 하기 예시되는 바와 같은 안젤로일기이거나, R⁴는 O-안젤로일기이다. 이 화합물은 본 원에서 인게놀 안젤레이트로 언급된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, R¹은 안젤로일기이다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, R² 및 R³중 하나 또는 둘 다는 수소이다. R² 및 R³은 또한 메틸렌 또는 에틸렌 디옥시기를 형성할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, R⁴는 수소, 하이드록시 또는 아실옥시, 예컨대 아세톡시이다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, 예시된 방법에 사용하기 위한 화합물은 인게놀-3-안젤레이트, 20-O-아세틸-인게놀-3-안젤레이트 및 20-데옥시-인게놀-3-안젤레이트, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 프로드럭이다.

R⁴ = OH, 인게놀-3-안젤레이트

R⁴ = OAc, 20-O-아세틸-인게놀-3-안젤레이트

R⁴ = H, 20-데옥시-인게놀-3-안젤레이트.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, 화합물은 인게놀-3-안젤레이트(본 원에서 "PEP005"로 칭해짐)이다. 본 원에서 "인게놀-3-안젤레이트" 또는 "PEP005"는 자연 발생적인 형태 뿐 아니라 화학적으로 합성된 형태도 포함한다.

알킬화, 알케닐화, 알키닐화, 아릴알킬화 또는 아실화는, 유리 하이드록시기를 알킬화, 알케닐화, 알키닐화, 아릴알킬화 또는 아실화하는 것에 대해 합성 화학업계에 공지된 방법을 이용하여 인게놀 화합물 상에서 수행될 수 있다[참조예: Greene and Wutz, 1999; March, 5^th Edition; Larock, 1999; 이들의 전체 내용은 본 원에 참고로 포함된다]. 예를 들어, 하이드록시기는 알킬(또는 아릴알킬) 할라이드, 예컨대 메틸 요오다이드(또는 벤질 브로마이드), 또는 디알킬 설페이트, 예컨대 디메틸 또는 디에틸 설페이트를 사용하여 알킬화(또는 아릴알킬화)될 수 있다. 아실화는 염기 또는 커플링제의 존재하에서 적절한 카복실산, 산 할라이드 및 산 무수물로 처리하여 수행될 수 있다. 글리코시드 형성은, 예를 들어 인게놀 화합물을 보호된 당 화합물과 반응시켜 화학적으로 수행할 수 있다[여기에서, C-1은 하이드록실 또는 카복실기와의 커플링을 위해 할로겐화로 활성화되고, 당 하이드록실기는 보호기로 차단된다]. 별법으로, 글리코시드 형성은, 예컨대 UDP-갈락토스 의존성 갈락토실트랜스퍼라제 및 UDP-글루코스 의존성 글리코트랜스퍼라제 등의 적절한 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 효소적으로 수행될 수 있다. 바람직한 C-1 연결 사카라이드는 사카라이드의 C-1(일반적인 넘버링)을 통해 인게놀 안젤레이트 구조에 연결되어 아세틸 결합을 형성하는 푸라노스 또는 피라노스 사카라이드(당) 치환체이다. 예시적인 사카라이드기로는 환원당, 예컨대 글루코스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 만노스 및 갈락토스가 포함되며, 이들은 각각 인게놀 화합물의 산소 원자에 결합한다.

설페이트, 설포네이트 및 포스페이트 기는 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. R'의 예로서 수소, C₁ _- ₆알킬, 페닐 및 벤질을 들 수 있다.

본 원에 사용된 용어 "알킬"이란 직쇄, 분지형 또는 환식 알킬, 바람직하게는 C_1-20알킬, 예를 들어 C_1-10또는 C_1-6알킬을 의미한다. 직쇄 및 분지형 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1 ,2-디메틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 헥실, 4-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 1,2,2-트리메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 헵틸, 5-메틸헥실, 1-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 4,4-디메틸펜틸, 1,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,4-디메틸펜틸, 1,2,3-트리메틸부틸, 1,1,2-트리메틸부틸, 1,1,3-트리메틸부틸, 옥틸, 6-메틸헵틸, 1-메틸헵틸, 1,1,3,3-테트라메틸부틸, 노닐, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-메틸옥틸, 1-, 2-, 3-, 4- 또는 5-에틸헵틸, 1-, 2- 또는 3-프로필헥실, 데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8-메틸노닐, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-에틸옥틸, 1-, 2-, 3- 또는 4-프로필헵틸, 운데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-메틸데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-에틸노닐, 1-, 2-, 3-, 4- 또는 5-프로필옥틸, 1-, 2- 또는 3-부틸헵틸, 1-펜틸헥실, 도데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-메틸운데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-에틸데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-프로필노닐, 1-, 2-, 3- 또는 4-부틸옥틸, 1-2-펜틸헵틸 등을 들 수 있다. 환식 알킬(또한 "사이클로알킬"로도 칭해짐)은 단환식 또는 다환식 알킬기, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실 등을 포함한다. 알킬기가 일반적으로 "프로필", "부틸" 등으로 언급될 경우, 이는 경우에 따라 직쇄, 분지형 및 환식 이성체중 임의의 것을 의미할 수 있다고 이해하여야 할 것이다. 알킬기는 본 원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 임의적인 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본 원에 사용된 용어 "알케닐"은 에틸렌적으로 모노-, 디- 또는 폴리-불포화된 전술한 바와 같은 알킬 또는 사이클로알킬기를 비롯하여, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 함유하는 직쇄, 분지형 또는 환식 탄화수소 잔기로부터 형성된 기, 바람직하게는 C_2-20알케닐(예: C_2-10 또는 C_2-6)을 의미한다. 알케닐의 예로는 비닐, 알릴, 1-메틸비닐, 부테닐, 이소부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-펜테닐, 사이클로펜테닐, 1-메틸사이클로펜테닐, 1-헥세닐, 3-헥세닐, 사이클로헥세닐, 1-헵테닐, 3-헵테닐, 1-옥테닐, 사이클로옥테닐, 1-노네닐, 2-노네닐, 3-노네닐, 1-데세닐, 3-데세닐, 1,3-부타디에닐, 1,4-펜타디에닐, 1,3-사이클로펜타디에닐, 1,3-헥사디에닐, 1,4- 헥사디에닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 1,4-사이클로헥사디에닐, 1,3-사이클로헵타디에닐, 1,3,5-사이클로헵타트리에닐 및 1,3,5,7-사이클로옥타테트라에닐을 들 수 있다. 알케닐기는 본 원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 임의적인 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본 원에 사용된 용어 "알키닐"은 에틸렌적으로 모노-, 디- 또는 폴리-불포화된 전술한 바와 같은 알킬 또는 사이클로알킬기를 비롯하여, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 함유하는 직쇄, 분지형 또는 환식 탄화수소 잔기로부터 형성된 기를 의미한다. 탄소원자수가 구체적으로 명시되지 않았으면, 이 용어는 바람직하게는 C_2-20알키닐(예: C_2-10 또는 C_2-6)을 의미한다. 알키닐의 예로는 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 부티닐 이성체 및 펜티닐 이성체를 들 수 있다. 알키닐기는 본 원에 예시된 바와 같은 하나 이상의 임의적인 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

용어 "아릴"은 방향족 탄화수소 환계의 임의의 단일, 다핵, 콘쥬게이션 및 융합 잔기를 의미한다. 아릴의 예로는 페닐, 비페닐, 터페닐, 쿼터페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 안트라세닐, 디하이드로안트라세닐, 벤즈안트라세닐, 디벤즈안트라세닐, 페난트레닐, 플루오레닐, 피레닐, 인데닐, 아줄레닐, 크리세닐을 들 수 있다. 바람직한 아릴은 페닐 및 나프틸을 포함한다. 아릴기는 본 원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 임의적인 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

용어 "아실"은 C(O)-R(여기에서, R은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬 또는 아릴 잔기임) 기를 나타낸다. 아실의 예로는 포르밀, 직쇄 또는 분지형 알카노일(예: C_1-20), 예컨대 아세틸, 프로파노일, 부타노일, 2-메틸프로파노일, 펜타노일, 2,2-디메틸프로파노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 운데카노일, 도데카노일, 트리데카노일, 테트라데카노일, 펜타데카노일, 헥사데카노일, 헵타데카노일, 옥타데카노일, 노나데카노일 및 이코사노일; 사이클로알킬카보닐, 예컨대 사이클로프로필카보닐, 사이클로부틸카보닐, 사이클로펜틸카보닐 및 사이클로헥실카보닐; 직쇄 또는 분지형 알케노일(녜: C_2-20), 예컨대 안젤로일; 및 아로일, 예컨대 벤조일, 톨루오일 및 나프토일을 들 수 있다. R 잔기는 본 원에 기술된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다.

아릴알킬기는 본 원에 정의된 바와 같은 아릴기로 치환된 본 원에 정의된 바와 같은 알킬기이다. 일 구체예에 있어서, 알킬기는 말단상에서 아릴기로 치환될 수 있다. 아릴알킬의 예로는 페닐C_1-C₂₀알킬, 예컨대 벤질, 페닐에틸, 페닐프로필, 페닐부틸, 페닐펜틸 및 페닐헥실을 들 수 있다. 알킬 및 아릴기중 어느 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 본 원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 임의적인 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴알킬, 아릴 및 아실에 대한 임의적인 치환체로는 할로(클로로, 브로모, 요오도 및 플루오로), 하이드록시, C_1-6알콕시, C_1-6알킬, 페닐, 니트로, 할로메틸(예: 트리브로모메틸, 트리클로로메틸, 트리플루오로메틸), 할로메톡시(예: 트리플루오로메톡시, 트리브로모메톡시), C(O)C_1-6알킬, 아미노(NH₂), C_1-6알킬아미노(예: 메틸아미노, 에틸아미노 및 프로필아미노), 디C_1-6알킬아미노(예: 디메틸아미노, 디에틸아미노 및 디프로필아미노), CO₂H, CO₂C_1-6알킬, 티오(SH) 및 C_1-6알킬티오가 포함된다. 임의적인 치환체는 또한 CH₂ 기를 카보닐(C=O)기로 대체한 것을 포함하거나, 메틸렌 또는 에틸렌 디옥시기일 수 있다.

본 발명에 의해 구상되는 인게놀 화합물을 제조하기 위한 합성 또는 반합성 공정중에, 제시된 반응 또는 변환 조건에 반응성이거나 민감할 수 있는 다른 작용기를 보호하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이러한 작용기에 적합한 보호기는 당업계에 공지되었으며, 표준적 기법에 따라 사용될 수 있다. 본 원에 사용된 용어 "보호기"란 특정 작용기를 일시적으로 불활성으로 만들기 위해 도입된 작용기를 의미한다. 이러한 보호기와, 그의 도입 및 후속한 적절한 단계에서의 제거 방법은 주지되어 있다(Greene and Wutz, 1999).

본 발명은 또한 인게놀 화합물의 프로드럭에 관한 것이다. 인게놀 화합물의 프로드럭인 임의의 화합물은 본 발명의 영역 및 취지에 속한다. 용어 "프로드럭"은 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 생체내에서 효소적으로 또는 가수분해적으로 본 발명의 화합물로 전환되는 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 당업자들이 용이하게 알 수 있으며, 예를 들어 자유 하이드록시기가 에스테르 또는 무수물로 전환되는 화합물을 포함한다. 예를 들어 에스테르 프로드럭을 제조하기 위한 본 발명의 화합물의 아실화 절차는 당업계에 주지의 사실이며, 화합물을 적합한 촉매 또는 염기의 존재하에서 적절한 카복실산, 무수물 또는 클로라이드로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 프로드럭을 선택 및 제조하는데 통상적인 그밖의 절차는 당업계에 공지되었으며, 예를 들어 그의 내용이 본 원에 참고로 포함되는 WO 00/23419호, [Design of Produgs, Hans Bundgaard, Ed., Elsevier Science Publishers, 1985] 및 [The Organic Chemistry of Drug Desig and Drug Action, Chapter 8, pp352-401, Academic press, Inc., 1992]에 기술되어 있다.

화합물의 약학적으로 허용가능한 적합한 염으로는 약학적으로 허용가능한 무기산, 예컨대 염산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 설팜산 및 하이드로브롬산의 염, 또는 약학적으로 허용가능한 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 타르타르산, 말레산, 하이드록시말레산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 락트산, 점액산(mucic acid), 글루콘산, 벤조산, 숙신산, 옥살산, 페닐아세트산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 설파닐산, 아스파르트산, 글루탐산, 에데트산, 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 라우르산, 판토텐산, 탄산, 아스코르브산 및 발레르산의 염을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 염기 염으로는 약학적으로 허용가능한 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 알킬암모늄으로 형성된 것을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디메틸 및 디에틸 설페이트 등의 디알킬 설페이트 등과 같은 시약으로 사급화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 유리 화합물 또는 용매화물(예를 들어 물의 용매화물, 즉 수화물 또는 통상의 유기 용매, 예컨대 알콜의 용매화물)로서 결정성 형태일 수 있으며, 두 형태 모두 본 발명의 영역에 포함시키고자 한다. 용매화 방법은 일반적으로 당업계에 공지되었다.

본 발명의 하나 이상의 구체예에 있어서, 상처 치유에 인게놀 화합물의 사용은 유리하게도 하나 이상의 치유기 동안 취해지는 속도, 범위, 정도 또는 시간을 촉진하거나 향상시킬 수 있다. 인게놀 화합물은 또한 예를 들어, 상처 치유와 관련된 반흔 형성, 홍화, 피부 문리(skin marking), 또는 색소침착(저 색소침착 또는 고 색소침착)의 수준 또는 정도를 감소시키는 것과 같이, 치유 상처로부터 미용적 결과의 개선을 이루는데에도 유리할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 인게놀 화합물은 예방적 의미로, 예를 들어 주름방지 치료에 유용할 수 있다.

본 발명에 따라 치료될 수 있는 대상은 포유동물 대상: 인간, 영장류, 가축 동물(소, 말, 양, 돼지 및 염소 포함), 반려 동물(개, 고양이, 토끼, 기니 피그 포함) 및 포획 야생 동물을 포함한다. 편리한 시험 시스템을 제공할 수 있기 때문에, 실험용 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 기니 피그 및 햄스터가 또한 대상으로 고려될 수 있다. 비포유동물 종, 예컨대 조류, 양서류 및 어류가 또한 본 발명의 구체예에서 대상으로 고려될 수 있다. 대상은 또한 본 원에서 개체, 환자, 동물 또는 수용체로서 언급될 수도 있다.

본 원에서 사용되는 "조절(modulating)"이 사이토킨 생산과 관련하여 언급되는 경우에는, 경우에 따라 사이토킨 생산의 증가 또는 감소를 의미한다. 바람직한 구체예에 있어서, 이는 사이토킨 발현 또는 생산의 증가, 상향조절 또는 증진을 말한다. 피부 섬유아세포 및/또는 각질세포와 관련하여 사용되는 경우, "조절"은 하나 이상의 표현형 반응, 예컨대 세포 생육성 및 증식, 세포 기질 부착, ECM 재구성, MMP 생산, 섬유아세포 분화, 세포 형태 및 세포 이동의 변경(필요에 따라 증가 또는 감소)을 의미한다.

조절 유효량은 바람직한 용법에 따라 적용 또는 투여되는 경우 사이토킨의 생산을 목적하는 수준으로 조절, 바람직하게는 상향 조절하기에 충분한 양이다.

인게놀 화합물의 상처 치유, 미용 또는 기능적 결과 개선 유효량은 바람직한 용법에 따라 투여 또는 적용되는 경우 상처가 목적하는 정도로 치유되거나 바람직한 미용 효과 또는 기능적 결과를 이루도록, 하나 이상의 단계 또는 과정을 개시, 자극, 향상, 증대, 가속화 또는 촉진하기에 충분한 양이다. 상처 치료란 상처 치유가 소기의 결과를 이루도록, 하나 이상의 단계 또는 과정을 개시, 자극, 향상, 증대, 가속화 또는 촉진시키는 것을 의미한다.

적합한 유효량(투여량) 및 용법은 주치의가 결정할 수 있고, 처리되는 특정 조직 타입 및 상처, 상처의 특성 및 중증성, 즉 부분층인지 완전층인지 또는 급성인지 만성인지의 여부, 대상의 연령 및 일반적인 건강상태에 따라 달라질 수 있다. 인게놀 화합물은 상처 치유 과정동안 적절하다고 생각되는 시점에 투여될 수 있다. 따라서, 인게놀 화합물은 상처가 발생한 즉시 또는 직후 및/또는 치유를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 감소시키고/시키거나 미용적 측면을 개선하기 위해 상처 치유 과정의 임의의 후속 단계에 투여될 수 있다. 화합물은 또한 특히 반흔 형성, 홍화, 두께 및/또는 과 색소침착 또는 저 색소침착을 최소화하거나 감소시키기 위하여 기존의 반흔 조직에 투여될 수도 있다.

활성 성분은 단일 용량 또는 일련의 용량으로 투여될 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하나, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보조제와 함께 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물로 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 또한 사이토킨 생산의 조절, 피부 섬유아세포 및/또는 각질세포의 표현형 반응의 조절, 상처 치유의 촉진 또는 반흔 조직의 감소 또는 최소화 또는 상처의 미용적 또는 기능적 결과의 개선용 약제를 제조하는데 있어서 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 프로드럭의 용도에 관한 것이다.

상처 치유 약제 또는 조성물은 약 0.0001 내지 100 중량% 이하의 양으로 인게놀 안젤레이트 화합물을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예로, 조성물은 인게놀 화합물을 약 0.0001 내지 약 10 중량% 이하, 예를 들어 약 0.0005, 0.001, 0.0025, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15, 0.2, 0.25 또는 0.5% 내지 약 0.5, 1.0, 2.5 또는 5.0%의 양으로 함유한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 인게놀 화합물은 약 0.001 내지 약 1%의 양으로 존재하는 인게놀-3-안젤레이트이다.

인게놀 화합물은 임의의 적절한 형태, 이를테면 상처에 국소적인 도포 또는 상처에 주입하는 것 등과 같이 국소적으로, 또는 예컨대 경구, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함), 비강내, 흡입, 직장내 또는 질내 투여 등과 같이 전신적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 인게놀 화합물은 상처 부위 및 경우에 따라서는 상처 주변부에 국소적으로 투여, 즉 적용된다. 인게놀 화합물은 용액제, 에멀젼(수중유, 유중수, 에어졸 또는 포움), 연고, 페이스트, 로션, 분말제, 겔제, 하이드로겔제, 하이드로콜로이드 및 크림을 비롯한 임의의 적합한 형태로 국소적으로 적용될 수 있다. 적합한 담체 또는 첨가제로는 광유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 유화 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 사이클로덱스트린, 이소프로필 알콜, 에탄올, 벤질 알콜 및 물을 들 수 있다. 다른 한편으로, 인게놀 화합물은 능동 밀봉 드레싱의 형태로 존재할 수 있으며, 즉 인게놀 화합물이 드레싱, 예컨대 붕대, 거즈, 테이프, 망, 반창고, 필름, 막 또는 패치상에 코팅되었거나 함침된 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 인게놀 화합물은 이소프로필 알콜을 기반으로 한 겔의 형태로 국소적으로 적용된다.

본 원에서 대상으로 하는 조성물 및 드레싱의 제제는 당업자들에게 주지되었으며, 예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing, 1990]을 참조하기 바란다. 조성물은 임의의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이들은 모든 통상의 용매, 분산 매질, 충전제, 고형 담체, 코팅, 항진균제 및 항박테리아제, 피부 침투제, 계면활성제, 등장제 및 흡수제 등을 포함한다. 본 원에서 대상으로 하는 조성물의 담체는 조성물의 다른 성분들과 상용성이면서 대상에 유해하지 않다는 점에서 약제학적으로 허용가능하여야 한다. 조성물은 편의상 단위 제형으로 존재할 수 있으며, 제약 업계에 널리 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분으로 이루어진 담체와 배합하는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분 고형 담체, 또는 이 둘 다와 균일하고 친밀하게 배합시킨 후, 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.

본 발명은 또한 다른 보충적인 생물학적 또는 생리학적 활성제를 함께 사용하여 실시할 수 있는 것으로 이해하여야 할 것이다. 따라서, 본 원에 개시된 방법 및 조성물은 다른 생물학적 또는 생리학적 활성제, 예컨대 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 예컨대 A, C, D 및 E 및 이들의 에스테르 및/또는 예컨대 본 원에 기술된 것과 같은 성장 인자 및 사이토킨을 비롯한 추가의 상처 치유제와 함께 사용될 수 있다. 이들 추가의 약제는 인게놀 화합물과 함께 조성물 또는 드레싱으로 제제화되거나, 별도로 투여될 수 있다.

인게놀 화합물은 또한 인게놀 화합물이 생체적합성 폴리머로 코팅 또는 함침되었거나, 또는 이와 다른 방식으로 포함되는 삽입물로서 존재할 수 있다.

인게놀 화합물은 서방성(즉 방출제어성) 또는 지연성 형태로 투여될 수 있다. 서방성 제제는 투여되면 활성 성분이 대상의 체내에서 서서히 방출되고 소정 약물 농도를 최소 기간에 걸쳐 유지하는 것이다. 서방성 제제는 당업자들에게 주지되어 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 개별 단위, 예컨대 각각 예정량의 활성 성분을 함유하는 캅셀, 샤셰 또는 정제; 분말제 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체중의 용액 또는 현탁액(예: 구강 세척액); 겔, 연고 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 존재할 수 있다.

정제는, 임의로 하나 이상의 보조 성분을 이용하여 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는, 임의로 결합제(예: 불활성 희석제), 보존성 붕해제(예: 나트륨 전분 글리콜레이트), 가교화 폴리비닐 피롤리돈, 가교화 소듐 카복시메틸 셀룰로즈), 계면활성제 또는 분산제와 혼합된 자유 유동 형태의 활성 성분, 예컨대 분말제 또는 과립을 적당한 기계에서 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화한 분말화된 화합물의 혼합물을 적당한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나 분할될 수 있고, 예를 들어, 소정 방출 프로파일을 제공하도록 다양한 비율로 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈를 사용하여, 함유된 활성 성분을 지속 방출 또는 조절 방출하도록 제형화될 수 있다. 정제는 위 이외의 장 부분에서 방출되도록 임의로 장용 코팅될 수 있다.

직장 투여용 조성물은 예를 들어, 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 적합한 기제를 사용하여 좌제로서 제공될 수 있다.

질 투여용으로 적합한 조성물은 활성 성분외에, 당업계에 적절한 것으로 알려져 있는 담체를 함유하는 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이제로 존재할 수 있다.

비경구 투여용으로 적합한 조성물은 항산화제, 완충제, 살균제 및 조성물이 대상 수용체의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 현탁액을 포함한다. 조성물은 단위 용량 또는 다중 투여 밀봉 용기, 예를 들어, 앰풀 및 바이얼로 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 요하는 냉동 건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제들로부터 제조될 수 있다.

바람직한 단위 용량 조성물은 본 원에 기술된 바와 같은 활성 성분의 1일 용량 또는 단위, 1일 서브용량 또는 그의 적절한 분율을 함유하는 것이다.

상기 특별히 언급된 활성 성분 외에, 본 발명의 조성물은 해당 조성물의 타입과 관련하여 당업계에 통상적인 그밖의 다른 제제, 예를 들어 결합제, 감미료, 증점제, 향미제, 붕해제, 코팅제, 보존제, 활택제, 완충제, 항산화제 및/또는 시간 지연제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 수의 조성물 용도로 제공될 수도 있다. 이들은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단으로 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 예는

(a) 경구 투여, 외부 적용(예: 수성 및 비수성 용액제 또는 현탁제를 포함하는 음약), 정제, 거환제, 분말제, 과립제, 사료와 섞기 위한 펠렛, 혀 적용용 페이스트;

(b) 비경구 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사;

(c) 국소 적용, 예를 들어 상술된 바와 같은 크림, 연고, 겔, 로션 등

에 적합한 것들을 들 수 있다.

이하 본 발명이, 본 발명의 특정 구체예를 예시할 목적으로 주어지나 전술한 개론을 한정하고자 하지 않는 하기 실시예를 참조로 하여 설명될 것이다.

실시예 1: 사이토킨 생산에 대한 PEP005의 효과

실시예 1.1

PEP005 -처리된 인간 세포에 의한 사이토킨 생산

Me10538 세포, 각질세포, 섬유아세포 및 중성구의 밀집 배양물(confluent culture)을 PEP005(1 내지 100 ng/ml)의 부재 또는 존재하에서 6 시간동안 인큐베이션하였다. 상등액을 수거하고, 다중 검출 키트(Biosource International, Nivelles, Belgium)를 이용하여 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 사이토킨 존재에 대해 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 검출된 단백질의 단위는 pg/ml 이다.

표 1.1 시험관내 인간 세포에서 염증성 사이토킨의 유도. 세포를 지정된 농도의 PEP005와 6 시간동안 인큐베이션하고, 상등액을 제시된 사이토킨에 대해 분석하였다. (ND - 비검출, nt - 시험되지 않음). 검출 단백질의 단위는 pg/ml이다.

실시예 1.2

0.05% PEP005를 함유하는 이소프로필 알콜 겔 또는 플라시보 겔을 광선 각화증 병변이 있는 환자에 국소적으로 적용하였다. 겔(활성 겔 또는 플라시보 겔)의 적용 전 및 적용 3 개월 후, 환자의 피부 조직을 임상적으로 평가하였다. 겔(활성 겔 또는 플라시보 겔)의 적용 전 및 적용 3 개월 후, 환자의 피부 문리, 피부 고 색소침착 및 피부 저 색소침착을 임상적으로 평가하였다. 결과를 하기 표 1.2 및 1.3에 나타내었으며, 이들 표에는 피부 조직의 개선, 악화 또는 무변화, 또는 피부 문리, 고 색소침착 또는 저 색소침착의 존재 또는 부재를 보이는 환자의 수 또는 비율이 나타나 있다. 데이터는 0.05% PEP005 겔의 적용이 (플라시보에 비해) 피부 조직을 개선시켰음을 보여주고 있다. 데이터는 또한 0.05% PEP005 겔의 적용이 약물 적용 3 개월 후, (플라시보에 비해) 피부 문리를 지닌 환자의 수를 감소시켰음을 제시하고 있다. 또한, 데이터로부터 0.05% PEP005 겔의 적용이 약물 적용 3 개월 후, (플라시보에 비해) 피부 고 색소침착 또는 저 색소침착을 초래하지 않음을 알 수 있다.

표 1.2 광선 각화증의 IIa 상 임상 시험에서 0.05% PEP005 국소용 겔의 상처 치유 및 미용적 효과(환자 수)

플라시보 겔 0.05% PEP005 국소용 겔	피부 조직	피부 문리	반흔 형성	저 색소침착	과 색소침착
플라시보 겔 0.05% PEP005 국소용 겔	개선 악화 무변화 5 0 7 10 0 5	부재 존재 1 11 6 9	부재 존재 12 0 15 0	부재 존재 12 0 13 0	부재 존재 12 0 15 0

표 1.3 광선 각화증의 IIa 상 임상 시험에서 0.05% PEP005 국소용 겔의 상처 치유 및 미용적 효과(환자 비율)

플라시보 겔 0.05% PEP005 국소용 겔	피부 조직	피부 문리	반흔 형성	저 색소침착	과 색소침착
플라시보 겔 0.05% PEP005 국소용 겔	개선 악화 무변화 41.7% 0.0% 58.3% 66.7% 0.0% 33.3%	부재 존재 8.3% 91.7% 40.0% 60.0%	부재 존재 100.0% 0.0% 100.0% 0.0%	부재 존재 100.0% 0.0% 100.0% 0.0%	부재 존재 100.0% 0.0% 100.0% 0.0%

실시예 1.3

재료 및 방법

화합물

PEP005는 건조 분말로 제공되었다. 23.55 mM의 원액을 DMSO에서 제조하고, 분취액을 -20 ℃에서 저장하였다. 원액의 분취액을 사용일에 해동하고, 투약 전 및 투약 중에 실온에서 보관하였다. 중간 희석 단계는 DMEM 세포 배양 배지를 이용하여 수행하였다.

PBMC의 분리

PBMC를 분리하는데, Li-Heparin을 항응고제로 사용하여 처리한 새로이 채혈한 인간 혈액을 사용하였다. 세포를 3배 부피의 CliniMACS PBS/EDTA 완충제(Miltenyi, Bergisch Gladbach)로 희석시키고, 원뿔형 튜브에서 FicollPaque (Amersham Biosciences, Freiburg) 상에 주의하여 층상화시키고, 날개 회전자에서 중단없이 20 ℃에서 40 분간 400xg로 원심분리하였다. 상층을 흡입하여 간기의 흐트러지지 않은 단핵 세포층을 남겨 두었다. 간기 세포(림프구, 단핵 세포 및 혈소판)를 새로운 원뿔형 튜브에 조심스럽게 옮겼다. 원뿔형 튜브에 CliniMACS PBS/EDTA 완충제를 충전하고, 20 ℃에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 상등액을 완전히 제거하였다. 혈소판이 제거되도록, 세포 펠렛을 완충제 50 ml에 재현탁시키고, 20 ℃에서 10 분간 200xg로 원심분리하였다. 상등액을 완전히 제거하고, 최종 세척 단계를 반복하였다. 세포를 DMEM 배지(Invitrogen, Karlsruhe)에 재현탁시키고, 노이바우어 혈구계(Neubauer-hemocytometer)로 계수하였다.

PBMC 자극

PBMC 자극을 위해, 웰당 250.000 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세명의 서로 다른 건강한 제공자의 PBMC를 각각 상이한 세 농도(1, 10 및 100 nM)의 PEP005 또는 LPS 1 ㎍/ml(Linaris, Wertheim-Bettingen), PMA 10 ng/ml(Sigma, Deisenhofen) 및 이오노마이신 1 ㎍/ml(Sigma, Deisenhofen)로 자극하였다. 세포를 습윤 환경에서 37 ℃ 및 5% CO₂로 24 시간 인큐베이션하였다.

비드 현탁 시험

전형적인 비드 현탁 시험에서, 사이토킨을 비드 결합 항체를 이용하여 상등액으로부터 포획한다. 사이토킨을 이차 항체로 정량하여 샌드위치 면역분석을 완료한다. 각 사이토킨에 대한 표준 곡선 작성으로 사이토킨 농도를 계산한다.

BioRad BioPlex System을 제조자의 지시에 따라 사용하여 PBMC의 상등액에서 사이토킨 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 및 TNF-α를 정량적으로 측정하였다. 모든 시료는 이중으로 측정하였다. 검출된 단백질의 모든 단위는 pg/ml 이다.

PBMC 생육성 검증

사이토킨을 함유하는 상등액을 제거한 후, PBMC를 유세포 측정기로 생육성에 대해 조사하였다. 프로피듐 요오다이드 염색 용액(0,1 ㎍/시험의 1×10⁶ 세포)을 사용하여 사멸 세포의 양을 결정하였다. 비자극 PBMC를 음성 대조군으로 이용하였다.

결과

사이토킨 생산

PEP005의 면역자극 효과를 조사하기 위해, 세명의 서로 다른 건강한 제공자로부터의 PBMC를 PEP005에 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 노출시켰다. 상등액에 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 분비를 비드 현탁 시험과 공히 유세포 측정기로 정량적으로 측정하였다. 결과를 표 1.4 내지 1.8에 나타내었다.

표 1.4 PEP005와 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 인큐베이션한 후, 제공자 GK, AW 및 HL로부터 취한 PBMC의 IL-1β 생산. 검출된 IL-1β 단위는 pg/ml 이다.

표 1.5 PEP005B와 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 인큐베이션한 후, 제공자 GK, AW 및 HL로부터 취한 PBMC의 IL-2 생산. 검출된 IL-2 단위는 pg/ml 이다.

1 nM의 PEP005에서는 세명의 제공자로부터 얻은 PBMC의 상등액에서 IL-2 수준이 약 20 내지 80배(평균: 약 50배) 증가한 것으로 관찰되었다.

표 1.6 PEP005B와 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 인큐베이션한 후, 제공자 GK, AW 및 HL로부터 취한 PBMC에 의한 IL-6 생산. 검출된 IL-6 단위는 pg/ml 이다.

1 nM의 PEP005로 PBMC 상등액에서 IL-6 수준이 약 4 내지 6배가 증가되었다(PBMC 상등액에서 거의 9배 상승된 IL-6 수준).

표 1.7 PEP005와 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 인큐베이션한 후, 제공자 GK, AW 및 HL로부터 취한 PBMC에 의한 IL-8 생산. 검출된 IL-8 단위는 pg/ml 이다.

1 nM의 PEP005에 노출 후, PBMC 상등액에서 IL-8 수준은 3 내지 5배 증가하였다. 많은 상이한 세포(예: 단핵 세포/대식 세포, T 세포, 중성구, 섬유아세포, 내피 세포, 각질세포, 간 세포, 별아교 세포 및 연골 세포)들이 IL-8을 생산할 수 있었다.

표 1.8 PEP005와 1, 10 및 100 nM의 농도로 24 시간 인큐베이션한 후, 제공자 GK, AW 및 HL로부터 취한 PBMC에 의한 TNF-α 생산.

PEP005와 인큐베이션 후, 세명의 모든 제공자로부터 취한 PBMC 상등액에서 고 수준의 사이토킨 TNF-α이 검출되었다. TNF-α 수준은 약 120 nM(PEP005 1 nM로 자극) 내지 70 nM(PEP005 10 nM로 자극) 내지 20 nM(PEP005 100 nM로 자극) 이었 다. 비히클에만 노출된 PBMC의 상등액에서는 유의적인 TNF-α 수준이 검출되지 않았다.

실시예 2: 피부 섬유아세포 및 각질세포의 표현형 조절 및 상처 치유 반응에 대한 PEP005의 효과

재료 및 방법

피부 섬유아세포 세포 배양

카디프에 소재하는 웨일즈 의과 대학의 치과대 구강 외과에 근무하는 개인 주치의로부터 시험 동의서를 받아 정상 성인 피부 생검(6 mm)을 입수하였다(n=1). 국소 마취 적용후, 피부 생검을 수집하고, 성인 피부 섬유아세포 배양물을 단일 세포 현탁 기술로 수립한 후, 검사물을 효소 분해하였다. 이 기술은 시험관내에서 구강 및 피부 섬유아세포의 생 일차 배양을 확립하는데에 이미 신뢰적으로 사용되고 있는 기술이다(Cook et al, 2000; Stephens et al, 2001; 2003). 피부 섬유아세포를 L-글루타민(2 mM), 항생제(100 U/ml 페니실린 G 나트륨, 100 mg/ml 스트렙토마이신 설페이트 및 0.25 ㎍/ml 암포테리신 B) 및 10% 송아지 태아 혈청(모두 Invitrogen Ltd.(Paisley, U.K.)로부터 구입)을 첨가한 듈베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM)를 포함한 섬유아세포-혈청 함유 배지에서 배양하였다. 피부 섬유아세포 배양물을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 유지하고, 배양 배지는 2-3 일 마다 교환하였다. 모든 실험에서 피부 섬유아세포는 7-17 계대로 사용하였다.

각질세포의 세포 배양

인간 성인 표피 각질세포를 Cascade Biologies Inc.(Nottinghamshire, U.K.)로부터 저온 보존 상태로 구입하였다. 이들 세포(≥500,000 생 세포/바이얼)는 적어도 16 집단 배가의 증식능으로 >70% 생육성인 것으로 조사되었다. 표피 각질세포를 항생제(100 U/ml 페니실린 G 나트륨, 100 mg/ml 스트렙토마이신 설페이트 및 0.25 ㎍/ml 암포테리신 B) 및 EpiLife^® 한정 성장 보충물(EDGS, 정제된 소 혈청 알부민, 정제된 소 전이 하이드로코티손 재조합 인간 인슐린양 성장 인자 타입-1, 프로스타글란딘 E2 및 재조합 인간 표피 성장 인자로 구성됨, Cascade Biologies Inc.)을 첨가한 무혈청 EpiLife^® 배지(Cascade Biologies Inc.)에서 배양하였다. 표피 각질세포 배양물을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 유지하고, 배양 배지는 2-3 일 마다 교환하였다. 모든 실험에서 표피 각질세포는 4-6 계대로 사용하였다.

PEP005 제조

PEP005는 Peplin Limited(Brisbane, Australia)에서 20 mg 배치로 공급받아 4 ℃에서 저장하였다. 필요할 때, PEP005를 디메틸 설폭사이드(DMSO, >99.9%, Sigma Chemical Co., Dorset, U.K.)에 10 mg/ml의 농도로 가용화시켰다. 용액을 5 분간, 또는 용액이 맑아질 때까지 혼합하고, PEP005/DMSO 원액을 4 ℃에서 저장하였는데, 수 개월간 안정하였다.

사용전에, PEP005/DMSO 원액을 4 ℃ 저장으로부터 제거하여 실온으로 가온하 였다. 필요한 부피의 PEP005/DMSO를 폴리프로필렌 용기에 분취하고, PEP005/DMSO를 섬유아세포-혈청 함유 배지(피부 섬유아세포 배양의 경우) 또는 무혈청 EpiLife^® 배지(표피 각질세포 배양의 경우)에서 필요한 농도(전형적으로 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)로 희석하였는데, 신선한 PEP005/배양 배지 용액은 용액의 안정성 때문에 매일 상기 여러 농도로 제조하였다. PEP005/배양 배지 용액을 버리기 전에, 각 용액에 95% 에탄올/5% 메탄올(양자 공히 Fisher Scientific(Leicestershire, U.K.)로부터 입수)중의 적어도 2 부피의 0.1% 수산화나트륨(Sigma Chemical Co.)을 첨가하여 오염을 제거하였다.

피부 섬유아세포/각질세포의 세포 생존성 및 증식 평가

피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 생존성 및 증식을 평가하는데 MTT[3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 염료-환원 분석을 Cook et al(2000)에 따라 이용하였다. 트립신 처리후, 피부 섬유아세포 또는 표피 각질세포를 96-웰 미량역가판(VWR International Ltd., Leicestershire, U.K.)에 각각 2.5×1O³ 세포/웰 및 5×10³세포/웰의 세포 밀도로 시딩하였다. 각각 24 시간 및 48 시간 세포 시딩 후, 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 배양 배지를 0, 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml PEP005(PEP005 농도당 6개 배양 웰)를 함유하는 배양 배지(100 ㎕/웰)로 교체하였다. 각 PEP005-함유 배양 배지를 이틀마다 교환하면서 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 배양물을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 각각 7 및 3 일 유지하였다. (i) 피부 섬유아세포 및 표 피 각질세포 배양 배지 단독(무세포), (ii) 1% DMSO를 함유하는 배양 배지중의 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포, (iii) 0.1% DMSO를 함유하는 배양 배지중의 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포, (iv) 0.01% DMSO를 함유하는 배양 배지중의 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 및 (v) 0.001% DMSO를 함유하는 배양 배지중의 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포를 포함하여, 다양한 대조군(대조군당 6개 배양 웰)을 또한 각 시점에서 96-웰 미량역가판에서 수립하였다.

1, 3, 5 및 7 일에, 멸균 MTT(PBS중 5 mg/ml MTT 용액 25 ㎕, Sigma Chemical Co.)를 각 웰의 상응하는 배양 배지에 첨가하고, 96-웰 미량역가판을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 4 시간동안 유지하였다. 0.5M N,N-디메틸포름아미드(Sigma Chemical Co.) 중의 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS, Sigma Chemical Co.)로 구성된 추출 완충제(100 ㎕)를 각 웰에 첨가하고, 96-웰 미량역가판을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 4 시간동안 유지하였다. 각 웰의 흡광도를 Bio-Tek Instruments Microplate Autoreader EL311(Fisher Scientific)을 이용하여 540 nm에서 분광학적으로 기록하였다. 각 실험을 3회 별도로 수행하였다.

피부 섬유아세포/각질세포의 세포외 기질 부착성 평가

I형 콜라겐 및 피브로넥틴에 대한 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 부착성을 Cook et al(2000) 및 Stephens et al(2004)에 준해 수행하였다. 96-웰 미량역가판의 웰을 40 ㎍/ml 꼬리 민태(rat-tail) 힘줄 I형 콜라겐(Sigma Chemical Co.) 또는 40 ㎍/ml 혈장 피브로넥틴(Sigma Chemical Co.)과 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하 였다. 1% 소 혈청 알부민(Sigma Chemical Co.)과 4 ℃에서 4 시간동안 인큐베이션함으로써 비특이적 결합을 봉쇄하였다. 트립신 처리 후, 0, 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml PEP005(PEP005 농도당 6개 배양 웰)를 함유하는 무혈청 배양 배지중의 피부 섬유아세포 또는 표피 각질세포의 세포 현탁액(100 ㎕)을 둘 다 96-웰 미량역가판 웰에 2.5×10⁴ 세포/웰의 세포 밀도로 시딩하였다. 96-웰 미량역가판을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 1 시간 또는 3 시간동안 유지한 뒤, 비부착 세포를 흡입 제거하였다. 남아 있는 부착성 피부 섬유아세포 또는 표피 각질세포를 PBS(100 ㎕)로 세척하여(×2), 70% 에탄올(100 ㎕, Fisher Scientific)에 15 분동안 고정시킨 다음, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액(Sigma Chemical Co.)으로 25 분간 염색하였다. 과량의 크리스탈 바이올렛을 재증류수에서 세척(×5)하여 제거하고, 잔류 염료는 0.2% 트리톤 X-100 용액(25 ㎕, Sigma Chemical Co.)에 용해시켰다. (i) I형 콜라겐 또는 피브로넥틴의 존재하에 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 배양 배지 단독(무세포), (ii) 소 혈청 알부민의 존재하에 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 배양 배지 단독(무세포), (iii) I형 콜라겐/소 혈청 알부민 또는 피브로넥틴/소 혈청 알부민의 존재하에 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포 배양 배지 단독(무세포), (iv) 소 혈청 알부민의 존재하에 배양 배지중 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포, (v) I형 콜라겐 또는 피브로넥틴의 존재 및 부재하에 1% DMSO 함유 배양 배지중 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포, 및 (vi) I형 콜라겐 또는 피브로넥틴의 존재 및 부재하에 0.1% DMSO 함유 배양 배지중 피부 섬유아세포 및 표피 각질세포를 포함하여, 다양한 대조군(대조군당 6개 배양 웰)을 또한 각 시점에서 96-웰 미량역가판에서 수립하였다. 각 웰의 흡광도를 Bio-Tek Instruments Microplate Autoreader EL311을 이용하여 540 nm에서 분광학적으로 기록하였다. 각 실험을 3회 별도로 수행하고, 얻은 흡광도는 각 시료군에 대한 평균으로 나타내었다.

피부 섬유아세포의 세포외 기질 재구성 및 기질 금속단백 분해효소 생산의 평가

피부 섬유아세포가 PEP005의 존재하에서 그의 ECM 환경을 재형성/재구성하는 능력을, 섬유아세포 밀집 콜라겐 격자(FPCL)를 사용하여 Cook et al(2000)에 준해 조사하였다. 트립신 처리후, 내인성 MMP-2 및 MMP-9 활성을 제거하기 위해, 피부 섬유아세포를 10% 무 젤라틴 분해효소 송아지 태아 혈청(젤라틴-A 세파로스 칼럼을 사용하여 제조, GE Healthcare Ltd., Buckinghamshire, U.K.)을 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지에 현탁시켰다. 피부 섬유아세포(5×10⁵ 세포/750 ㎕ 무 젤라틴 분해효소 섬유아세포-혈청 함유 배지)를 3 ml 2×DMEM, 무 젤라틴 분해효소 송아지 태아 혈청(750 ㎕), 0.1M 수산화나트륨(750 ㎕), 1.7 mg/ml 꼬리 민태 힘줄 I형 콜라겐(225O ㎕, Rowling et al, 1990에 준해 제조됨) 및 PEP005(0, 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml PEP005)를 함유하는 53 mm 박테리아 사용급 배양 디시(VWR International Ltd.)에 총 7.5 ml의 부피(PEP005 농도당 3 FPCL)로 첨가하였다. (i) 섬유아세포-혈청 함유 배지 단독(무세포) 및 (ii) 1% DMSO를 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지중 세포를 비롯하여 다수의 대조군(대조군당 세개의 FPCL)을 또한 수립하였다. FPCL을 콜라겐 중합이 일어나도록 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 1 시간동안 유지하고, FPCL을 플레이트 가장자리로부터 분리하여 10% 무 젤라틴 분해효소 송아지 태아 혈청을 함유하는 2 ml 무-PEP005 섬유아세포-혈청 함유 배지에 재현탁시켰다. FPCL을 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 14 일간 유지하고, 배양 배지는 매일 교환해 주었다. 초기 제조후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 및 14 일에 세개의 각 중복 시료에 대해 수행된 세개의 상이한 격자 직경을 측정하여 ECM 재구성/격자 수축도를 정량화하였다. 이 시점에서 MMP 생산 및 활성을 분석하기 위해, 0, 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml PEP005의 존재하에 각 개별 FPCL로부터 격자 주변의 FPCL 조정 배지를 또한 수집하였다.

FPCL 시스템에서 세포에 의해 생산되는 프로(pro) 및 활성 MMP 종의 상대량을 결정하기 위하여, 젤라틴 지모그라피(zymography)를 Cook et al(2000)에 따라 사용하였다. 동 부피(15 ㎕)의 FPCL 조정 배지를 Mini-Protean 3 겔 전기영동 시스템(Bio-Rad Laboratories Ltd.)에 도입된 기성(pre-cast) 10% 젤라틴 지모그라피 겔(준비 겔 10% 젤라틴 지모그램 겔, Bio-Rad Laboratories Ltd., Hertfordshire, U.K.)을 이용하여 15 mA로 4 내지 5 시간동안 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하였다. 실온에서 1 시간동안 2.5% 트리톤 X-100 용액(Sigma Chemical Co.)에 침지시켜 겔로부터 SDS를 제거하였다. 5 mM 염화 칼슘(Sigma Chemical Co.), 25 mM 염화나트륨(Fisher Scientific) 및 5% Brij 35(Sigma Chemical Co.)를 함유하는 25 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7.6)에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션하여 MMP를 활성화시켰다. 겔을 쿠마시 블루[12% 아세트산 및 54% 메탄올(양자 공히 Fisher Scientific 제품)중의 0.05% 쿠마시 블루(Sigma Chemical Co.)]로 염색하고, 7.5% 아세트산 및 5% 메탄올로 탈색시킨 후, GS-690 이미지화 농도계(Imaging Densitometer) 및 이미지 분석 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories Ltd.)로 겔 이미지를 포착하였다. MMP-2 표준에 준한 분자량에서 선명한 밴드의 존재로 MMP임을 확인하였다(Cook et al, 2000).

각 실험은 2회 별도로 수행하고, 격자 수축 감소율(%) 및 MMP 농도계 값을 각 시료군에 대한 평균으로 나타내었다.

피부 섬유아세포 분화의 평가

TGF-β로 자극 후, 피부 섬유아세포 분화에 의한 α-평활근 액틴 발현도에 따라 피부 섬유아세포가 근섬유아세포로 분화하는 것에 대한 PEP005의 효과를 조사하였다. 트립신 처리 후, 피부 섬유아세포를 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지에 2.5×10⁴ 세포/ml의 세포 밀도로 현탁시켰다. 피부 섬유아세포 현탁액의 분취액(250 ㎕/웰)을 8-웰 챔버 슬라이드(VWR International Ltd.)에 시딩하고, 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 약 30 내지 40% 컨플루언시(confluency)가 일어날 때까지 유지하였다. 이 단계에서, 섬유아세포-혈청 함유 배지를 10 ng/ml TGF-β1 및 0, 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml PEP005(PEP005 농도당 세개의 챔버 슬라이드 웰)를 함유하는 배양 배지(250 ㎕/웰)로 교환하였다. (i) 섬유아세포-혈청 함유 배지 단독, (ii) 섬유아세포-혈청 함유 배지중 세포(사이토케라틴 또는 비멘틴 1^o Ab 대조군), (iii) 10 ng/ml TGF-β 및 1% DMSO를 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지중 세포 및 (iv) 1% DMSO를 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지중 세포를 비롯하여 다수의 대조군(대조군당 세개의 챔버 슬라이드)을 또한 수립하였다.

챔버 슬라이드를 5% CO₂/95% 공기 분위기에서 37 ℃로 3 일간 유지하였는 바, 이에 따라 세포가 약 75% 컨플루언시에 도달하였다. 챔버 슬라이드를 1:1 빙냉 아세톤:메탄올(300 ㎕/웰)에서 20 분동안 고정시키고, PBS중 1% BSA에서 4 ℃로 1 시간동안 차단시켰다. 챔버 슬라이드를 PBS중 1% BSA로 세척하고(×2), (i) 모노클로날 마우스 항인간 α-평활근 액틴 일차 항체(세척 완충제중 1:30, 250 ㎕/웰, Sigma Chemical Co.), (ii) 모노클로날 마우스 항인간 사이토케라틴 IgG1 일차 항체(세척 완충제중 1:30, 250 ㎕/웰, DakoCytomation Ltd., Cambridgeshire, U.K.), 또는 (iii) 모노클로날 마우스 항인간 비멘틴 IgG1 일차 항체(세척 완충제중 1:30, 250 ㎕/웰, DakoCytomation Ltd.) 중 하나와 인큐베이션하였다. 챔버 슬라이드를 실온에서 2 시간동안 일차 항체에서 인큐베이션한 뒤, PBS중 1% BSA로 세척하고(×3), 폴리클로날 토끼 항마우스 IgG's, FITC 접합 이차 항체(세척 완충제중 1:50, 250 ㎕/웰, DakoCytomation Ltd.)와 실온에서 빛을 차단하여 1 시간동안 인큐베이션하였다. 챔버 슬라이드를 PBS중 1% BSA로 세척하고(×3), 챔버를 꺼내 Vectashield^® 봉입제(Vector Laboratories Ltd., Cambridgeshire, U.K.)를 사용하여 슬라이드에 마운팅하고, 형광 현미경(Leica Leitz Dialux 20EB 형광 현미경, Leica Microsystems U.K. Ltd., Buckinghamshire, U.K.)으로 관찰하여, 디지털 이미지를 250 배율로 포착하였다. 각 실험은 2회 별도로 수행되었다.

결과

피부 섬유아세포/각질세포의 세포 생존성 및 증식에 대한 평가

피부 섬유아세포 불능성/증식으로부터 구한 평균값은 PEP005가 100 ㎍/ml의 농도에서 비처리 섬유아세포 대조군에 비해 피부 섬유아세포 각질세포에 대해 세포독성 효과를 보이는 것으로 나타났다.

그러나, 10 ㎍/ml의 농도에서 PEP005는 1, 3 및 5 일에 자극 효과를 가지는 것으로 나타났다. 또한, 7 일에는 0.01 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도가 세포 생존성/증식을 자극하는 것으로 나타났다.

피부 섬유아세포/각질세포의 세포외 기질 부착성 평가

I형 콜라겐 및 혈장 피브로넥틴에 대한 표피 각질세포 부착은 PEP005가 0.01 내지 10 ㎍/ml의 농도에서 I형 콜라겐에 대해 상당히 농도 의존적으로 세포 부착을 자극하는 것으로 입증되었다. 혈장 피브로넥틴에 대한 표피 각질세포의 자극 가능성에 대해 유사한 경향이 또한 1 내지 10 ㎍/ml 에서도 명백하였다.

피부 섬유아세포의 세포외 기질 재구성 및 기질 금속단백 분해효소 생산에 대한 평가

I형 콜라겐 격자 수축은 0.1 ㎍/ml PEP005에서 상당히 증가하였다. 프로 및 활성 MMP-2 수준은 0.01 내지 0.1 ㎍/ml의 PEP005 농도에서 증가한 것으로 관찰되었다.

피부 섬유아세포 분화의 평가

피부 섬유아세포는 TGF-β1이 존재하지 않으나, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 PEP005가 존재하는 경우 검출가능한 α-평활근 액틴 미세섬유를 나타내었다.

실시예 3: 상처 치유 파라미터에 대한 PEP005 영향 평가

재료 및 방법

PEP005 제조

PEP005는 Peplin Limited(Brisbane, Australia)에서 DMSO/이소프로판올을 기반으로 한 겔중에 0.01%(100 ㎍/ml), 0.028%(280 ㎍/ml) 및 0.05%(500 ㎍/ml) 제제로서 공급받았다. PEP005를 함유하지 않는 DMSO/이소프로판올을 기반으로 한 담체 겔을 또한 비히클 대조군으로 제공하기 위해 공급받았다. PEP005 및 비히클 겔은 4 ℃에서 저장하였는데, 수 개월간 안정하였다.

래트 절개 상처 치유 모델

최소의 새로운 조직 재생을 포함하여 급성(외과적) 절개 상처의 복구에 대한 PEP005의 효과를 조사하기 위하여, 래트의 전층 절개 상처 치유 모델을 이용하였다.

동물 관리

체중이 250 내지 300 g인 약 8 내지 10 주령의 성숙 수컷 SD 래트(Sprague Dawley 래트, Harlan U.K. Ltd., Oxfordshire, U.K.)를 본 조사에 이용하였다. 동물들을 먼저 23 ℃의 주변 온도로 12 시간 낮/밤 주기로 유지되는 환경에서 영국 내무성(Home Office) 규정에 따라 우리당 네마리 이하의 군으로 수용하였다(우리 치수 40×25×20 cm, 톱밥이 깔려있고 주당 2회 교환된다). 동물들에게 음식(표준 설치류 식이) 및 물을 마음껏 제공하였다. 실험전에 동물들을 상기 환경에 적응시키기 위해, 바닥에 깔린 톱밥을 새로이 갈아주고 음식 및 물을 계속 보충하여 주는 것을 제외하고는 방해없이 최소 1 주간 수용하였다. 상처를 낸 후, 동물들을 시술로부터 완전히 회복될 때까지 개별 수용 조건하에서 모니터하였다. 이어서, 동물들을 개별적으로 2 주간(즉, 이들의 상처가 완전히 재상피화될 때까지) 유지하였다. 최초 2 주후, 동물들을 남은 조사를 위해 네마리 이하의 군으로 유지하였다. 모든 동물 절차는 영국 내무성 허가증(PPL: 40/2650; PIL: 70/4934 및 PIL: 60/7661)을 받아 내무성 허가 시설에서 수행되었다.

전층 절개 상처 발생

기존의 항반흔 형성 연구(사이토킨 저해제 및 사이토킨 중화 항체 조사)는 단일 동물에 다중(절개) 상처를 이용하는 추세로서, 각 상처는 상이한 처치를 받았다. 과거 사용 및 용인에 따라, 이 다중 절개 상처 모델을 전층 절개 상처 치유에 대한 PEP005의 효과를 평가하기 위한 선택 모델로서 채택하고, 알려진 바와 같이 설치류의 미두가 다르다는 점을 고려하여 처치는 동물간에 로테이션되었다.

할로탄 및 공기 흡입으로 동물을 마취시키고, 각 래트의 등에 있는 털을 깍은 후, 살균제인 클로르헥시딘 글루코네이트(0.05% 수성)로 세척하였다. 각 래트의 등에 네개의 전층 절개 상처(길이 1 cm, 피하 근육층 및 피하 조직 포함)를 발생시켰다. 상처내에 육아 조직이 형성되도록 상처를 봉합하지 않은채로(벌려지도록) 두었다. 상처를 일으킨 후(0 일), 네 PEP005 농도(무 PEP005, DMSO/이소프로판올 겔 비히클, 0.01%, 0.028% 또는 0.05% PEP005)를 각 상처에 적용하고, 비처리 상처 대조군은 처리하지 않은채로 두었다. 각 동물군을 표 2.1에 따라 각각의 실험/수거기에 걸쳐 유지하였다.

표 2.1 (상처의 신장 강도 분석 및 반흔 조직 질 평가를 위해) 4 주 및 12 주간 확립시킨 실험군

군	처리	군 명	반복 상처수
군	처리	군 명	4 주	12 주
1	PEP005-비처치, 비히클-처리	N-V	10	12
2	PEP005-비처치, 무처리	N-NT	10	12
3	PEP005-노출, 비히클-처리	비히클	10	10
4	PEP005[0.01%]	PEP-0.01	10	10
5	PEP005[0.028%]	PEP-0.028	10	10
6	PEP005[0.05%]	PEP-0.05	10	10

절개 상처 부위에 PEP005 및 비히클 적용

손상 직후, 각 상처 주변의 가장자리 피부에 100 mm² 당 10 ㎕의 부피(각각 1 ㎍/lO ㎕, 2.8 ㎍/10 ㎕ 및 5 ㎍/10 ㎕ PEP005)로 가장자리 피부의 총 면적 600 mm²이 처리되도록 0.01%, 0.028% PEP005 또는 DMSO/이소프로판올 비히클 겔의 단일 처리를 하였다. 겔을 용적식 피펫으로 적용하고, 멸균 스파툴라를 이용하여 처리 면적상에 골고루 바르는데, 이때 제제가 상처에 직접 주입되지 않도록 주의를 기울 여야 한다. 겔을 적용 후 10 분간 건조되도록 방치하였다. 동물이 이들 상처를 방해하지 않도록 하기 위해, 각 상처를 건조 멸균 거즈(Release^®, Johnson & Johnson Wound Management Ltd., North Yorkshire, U.K.)로 드레싱하고, Millipore^TM 테이프(3M UK pic, Berkshire, U.K.)로 묶었다. 드레싱이 제거되지 않도록 각 동물을 또한 Elizabethan Collar로 고정시켰다. 상처후 드레싱을 3 일간 그 자리에 위치시켰다. 래트를 그의 각 실험군에 1, 4 주 및 12 주간 유지시킨 다음, 각 군의 동물을 안락시키고, 상처 및 상처 주위 조직의 상태(생육성, 홍반, 부종 등에 관해)를 표 2.1에 따라 모든 평가 시점에서 조사하였다. PEP005 노출이 실험 동물의 일반적인 건강/상태에 어떠한 부정적인 영향을 끼치는 지를 결정하기 위해, 조사 기간동안 동물의 체중도 달았다.

안락사, 조직/시료 수거 및 처리

수거(4 주 및 12 주)

상처 조직 및 정상적인 가장자리 피부를 절개하고, 각 상처로부터 상처/반흔을 담고 있는 단일 3 mm 스트립을 쌍날 장비를 이용하여 제거하였다. 이어서, 장력학적 분석전에 조직 스트립을 식염수로 축축하게 적신 수술용 거즈(Topper^TM, Johnson & Johnson Wound Management)에서 4 ℃로 보관하였다. 나머지 상처 조직을 10% 포르말린에 고정시켜 처리한 후, 파라핀 왁스에 함몰시켰다. 가로 절개물(6 ㎛)을 취해 해마톡실린 및 에오신(관례적인 조직학적 평가를 위해) 및 말로이(Mallory) 염료(기질 배향 분석을 위해)로 염색하였다.

상처 강도의 장력학적 평가(4 주 및 12 주)

손상 후 상처 강도는 경시적으로 증가하며, 따라서 이는 상처 성숙의 척도이다. 4 주 상처의 장력학적 분석을 위해 5.0 킬로그램 포스(kilogram force: kgf) 및 12 주 상처의 장력학적 분석을 위해 50.0 킬로그램 포스(kgf)의 실규모를 판독하도록 미리 보정한 인스트론 장력계(Instron Ltd., Buckinghamshire, U.K.)로 상처 파괴 강도를 정량화하였다. 각 0.01%, 0.028%, 0.05% PEP005, DMSO/이소프로판올 비히클 겔 및 비처리 상처 대조군으로부터 취한 조직 스트립(3 mm)을 50 mm/분의 "크로스-헤드(cross-head) 속도"로 상처의 가장자리를 분리하도록 설정한 장력계 그립에 고정시켰다. 상처 가장자리를 분리하는데 필요한 최대힘으로 파괴 강도를 측정하였다.

반흔 조직의 질 평가(4 주 및 12 주)

절편을 현미경 스테이지에 올려놓고, 현미경사진이 피부 표면에 대해 평행하게 찍히도록 절편을 배향/회전시켜, 각 0.01%, 0.028%, 0.05% PEP005, DMSO/이소프로판올 비히클 겔 및 비처리 상처 대조군으로부터 취한 조직학적 표본으로부터 기질 배향을 결정하였다. 그 다음에, 각 반흔의 디지털 이미지를 상부 및 중간 반흔 영역에서 포착하였다. 각 반흔내 대표적인 해당 영역을 선택하고, 조직학적 표본 이미지내 콜라겐 다발의 방향성을 나타내는 데이터를 생성하여 12×15°분절의 배향에 대해 출력하는 주문제작형 지면 이미지 배향 소프트웨어(CICA-MOS, Version 1.0)를 이용하여 각 영역내 기질 성분의 배향을 측정하였다. 전형적으로, 정상의 피부 조직은 약 45° 및 105°에서 방향성 피크를 지녀 제한된 수평 방향성을 가진 다. 이에 반해 반흔 조직은 0 내지 180°방향성(즉 피부 표면에 평행한 평면)이 매우 높은 수준이나, 45 내지 120°사이의 방향성은 대단히 작은 수평에 가깝게 배향된 콜라겐 다발을 상당 비율 가진다. 덜 절단된 반흔 조직이 0-180°이외의 방향으로 배향된 콜라겐 다발을 더 많이 가진다.

본 시험에서는 다음과 같은 두가지 수준의 조직 배향에 대해 조사하였다: (i) 각 0.01%, 0.028%, 0.05% PEP005, DMSO/이소프로판올 비히클 겔 및 비처리 상처 대조군으로부터 취한 반흔 조직을 수평±7.5°에 평행하게 배향된 기질의 양에 대해 비교하고, (ii) 이미지 포착전 절편 배향에 있을 수 있는 오차, 국소 피부 소기관(예: 모낭)의 가능한 영향 및 피부 표면의 기복/불규칙성을 고려하여, 각 군으로부터의 반흔 조직을 또한 수평으로부터 ±22.5°로 평행하게 배향된 기질의 양에 대해 비교하였다. 결국, 평면/수평 방향성의 콜라겐 다발이 많을 수록 반흔 형성이 보다 심각한 것이다.

결과

상처 강도의 장력학적 평가

4 주 및 12 주에 각 0.01%, 0.028%, 0.05% PEP005, DMSO/이소프로판올 비히클 겔 및 비처리 상처 대조군으로부터 취한 조직 스트립(3 mm)에서 입수한 평균 장력학적 평균 인장 강도값을 도 1에 나타내었다. 4 주에 입수한 평균 인장 강도값(도 1A)은 PEP005 노출로 인장 강도가 증가하는 용량 의존성 경향을 보여준다.

12 주에 입수한 평균 인장 강도값(도 IB)은 4 주에 비해 모든 실험 군에서 PEP005 처리후 2상 경향으로 인장 강도값이 증가한 것으로 판명되었는 바, 대조군 수준에 비해 0.01%에서 증가, 0.028%에서 하락에 이어 0.05% PEP005 농도에서 또 다른 증가로 이어졌다.

반흔 조직의 질 평가

0.028% PEP005로 국소 처리한 경우, 세개의 대조군에 비해 ±7.5° 또는 ±22.5°로 정렬된 콜라겐 다발의 비율이 감소하였다.

하기 표 3.1은 0.028% PEP005 적용 후 12 주에, 급성(외과적) 래트 전층 절개 상처에서 수평에 대해 ±7.5°및 수평에 대해 ±22.5°에서의 방향 데이터를 나타내는 중간 상처의 평균 반흔 기질 배향 분석 데이터를 DMSO/이소프로판올 비히클 (대조군) 및 비처리 상처 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. N-NT = PEP005-"비처치", 비처리, N-V = PEP005="비처치", 비히클 처리; V = PEP005-노출, 비히클 처리.

표 3.1

참고문헌

Claims

상처 치유가 필요한 대상에서 상처 치유를 촉진하는 방법으로서, 상기 대상에게 상처 치유 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
상처에서 반흔 조직을 감소 또는 최소화하거나, 미용적 또는 기능적 결과를 개선시키는 방법으로서, 그러한 것이 필요한 대상의 상처에 반흔을 감소시키거나 최소화하는 양, 또는 미용적이거나 기능적 개선량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
피부 섬유아세포 및/또는 각질세포의 표현형 반응을 조절하는 것이 필요한 대상에서 그러한 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 대상에게 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
피부 섬유아세포 및/또는 각질세포의 표현형 반응을 조절하는 것이 필요한 대상의 상처 부위에서 그러한 반응을 조절하는 방법으로서. 상기 대상에게 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
하나 이상의 사이토킨 생산을 조절하는 것이 필요한 대상에서 그러한 생산을 조절하는 방법으로서, 상기 대상에게 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
하나 이상의 사이토킨 생산을 조절하는 것이 필요한 대상의 상처 부위에서 그러한 생산을 조절하는 방법으로서, 상기 대상에게 조절 유효량의 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 하나 이상의 사이토킨은 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 및 TNF-α로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인게놀 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 상처에 국소적으로 적용되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인게놀 화합물은 하기 화학식을 갖는 것인 방법:

상기 식에서,

R¹ 내지 R³은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 아릴알킬, S(O)₂R', S(O)₂OR', P(O)(OR')₂ (여기에서, R'는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬임) 및 글리코실 중에서 선택되고;

R⁴는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 알콕시, 임의로 치환된 알켄옥시, 임의로 치환된 알킨옥시, 임의로 치환된 아실옥시, 임의로 치환된 아릴알콕시, S(O)₂R', OS(O)₂OR', OP(O)(OR')₂ (여기에서, R'는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬임) 및 글리콕시 중에서 선택된다.
제9항에 있어서, 화합물이 인게놀-3-안젤레이트, 20-O-아세틸-인게놀-3-안젤레이트 및 20-데옥시-인게놀-3-안젤레이트, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 중에서 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 화합물이 인게놀-3-안젤레이트인 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상처는 베인 상처, 열상, 외과적 절개, 천자, 찰과상(graze), 긁힌 상처, 압박 상처, 찰과상(abrasion), 마찰 상처, 만성적 상처, 궤양, 열 작용에 의한 상처, 화학적 상처, 병원성 감염에 의한 상처, 피부 이식편/이식 제공자 및 수용자 부위, 면역 반응 이상, 구강 상처, 위 또는 장 상처, 손상된 연골 또는 뼈, 절단 부위 및 각막 병변 중에서 선택되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상처가 피부 상처인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상처가 만성적 상처인 방법.
제14항에 있어서, 상처가 당뇨병-관련 상처인 방법.