CN106619600B - 巨大戟醇及其衍生物在增强溶酶体生成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巨大戟醇及其衍生物在增强溶酶体生成中的应用。该应用具体为HEP14或其衍生物在如下任一中的应用：诱导溶酶体生成；制备用于诱导溶酶体生成的药物；制备用于治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病的药物。HEP14能激活PKCα和PKCδ，进而通过两平行信号途径一方面激活转录因子TFEB，另一方面使转录抑制因子失活，最终作为“分子开关”控制溶酶体生成。PKC的激活导致GSK3β失活，进而引起TFEB去磷酸化向细胞核转移，同时活化状态的PKC还会激活MAPK激酶JNK2和p38，磷酸化ZKSCAN3，使ZKSCAN3从细胞核转移到细胞质。HEP14不影响mTORC1活性，因而不干扰细胞代谢平衡，可能是治疗溶酶体相关疾病的理想药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种巨大戟醇及其衍生物在增强溶酶体生成中的应用，特别涉及一种巨大戟醇HEP14(5β-O-当归酰基-20-去氧巨大戟醇,5-O-angeloyl-20-deoxyingenol)及其衍生物在增强溶酶体生成中的应用。
背景技术
溶酶体是细胞内一类负责清除降解代谢底物的酸性单膜细胞器。溶酶体功能发生障碍会引起溶酶体存储疾病(LSDs)和神经退行性疾病。增加溶酶体的生成可以促进细胞降解受损的细胞器和变性蛋白聚集体，促进脂类代谢，从而避免引发相关疾病。在转录水平，溶酶体的生成主要由TFEB和TFE3这两个转录因子调控，它们通过CLEAR(协调溶酶体的表达和调控)网络使溶酶体和细胞自噬相关基因表达上调，进而增强细胞降解功能。TFEB和TFE3的活性受mTORC1所介导的磷酸化调控，而mTORC1的活性由所处的营养环境决定。另外，具锌指结构的转录抑制因子ZKSCAN3会抑制溶酶体和细胞自噬基因的表达。
目前，除了感受营养状态的信号途径可以调控溶酶体生成已被证实之外，其他的信号途径尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种巨大戟醇HEP14(5β-O-当归酰基-20-去氧巨大戟醇,5-O-angeloyl-20-deoxyingenol)及其衍生物的新用途。
本发明所提供的HEP14的新用途可为HEP14或其衍生物在如下任一中的应用：
(1)诱导溶酶体生成；
(2)制备用于诱导溶酶体生成的药物；
(3)制备用于治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病的药物。
本发明所提供的HEP14的新用途具体为HEP14或其衍生物在如下任一中的应用：
(a1)激活TFEB蛋白，和/或制备用于激活TFEB蛋白的药物；
(a2)诱导TFEB蛋白进入细胞核，和/或制备用于诱导TFEB蛋白进入细胞核的药物；
(a3)激活蛋白激酶C，和/或制备用于激活蛋白激酶C的药物；
(a4)降低TFEB蛋白的磷酸化水平，和/或制备用于降低TFEB蛋白的磷酸化水平的药物；
(a5)抑制GSK3β蛋白活性，和/或制备用于抑制GSK3β蛋白活性的药物；
(a6)使ZKSCAN3蛋白失活，和/或制备用于使ZKSCAN3蛋白失活的药物；
(a7)诱导ZKSCAN3蛋白从细胞核转移至细胞质，和/或制备用于诱导ZKSCAN3蛋白从细胞核转移至细胞质的药物；
(a8)激活JNK2蛋白和/或p38蛋白，和/或制备用于激活JNK2蛋白和/或p38蛋白的药物；
(a9)诱导JNK2蛋白和/或p38蛋白进入细胞核，和/或制备用于诱导JNK2蛋白和/或p38蛋白进入细胞核的药物；
(a10)增强JNK2蛋白和/或p38蛋白的磷酸化水平，和/或制备用于增强JNK2蛋白和/或p38蛋白的磷酸化水平的药物；
(a11)增加溶酶体数量和/或加强溶酶体的降解功能，和/或制备用于增加溶酶体数量和/或加强溶酶体的降解功能的药物。
活性成分为HEP14或其衍生物且具有如下功能中至少一种的药物也属于本发明的保护范围：
(1)诱导溶酶体生成；
(2)治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病。
活性成分为HEP14或其衍生物且具有如下功能中至少一种的药物也属于本发明的保护范围：
(a1)激活TFEB蛋白；
(a2)诱导TFEB蛋白进入细胞核；
(a3)激活蛋白激酶C；
(a4)降低TFEB蛋白的磷酸化水平；
(a5)抑制GSK3β蛋白活性；
(a6)使ZKSCAN3蛋白失活；
(a7)诱导ZKSCAN3蛋白从细胞核转移至细胞质；
(a8)激活JNK2蛋白和/或p38蛋白；
(a9)诱导JNK2蛋白和/或p38蛋白进入细胞核；
(a10)增强JNK2蛋白和/或p38蛋白的磷酸化水平；
(a11)增加溶酶体数量和/或加强溶酶体的降解功能。
在本发明中，所述HEP14是结构式如式I所示的化合物；
在本发明中，所述HEP14的衍生物具体可为HEP15、Hyj1、Hyj16、Hyj18、Hyj26或Hyj28，这些衍生物的结构式具体参见实施例1部分。
在本发明的实施例中，所述蛋白激酶C具体指α亚型蛋白激酶C或δ亚型蛋白激酶C。
所述TFEB蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述α亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述δ亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述GSK3β蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述ZKSCAN3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述JNK2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示；所述p38蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
在所述应用或药物中，所述“降低TFEB蛋白的磷酸化水平”具体体现为如下中至少一种：(1)降低所述TFEB蛋白上的14-3-3蛋白结合区域的磷酸化水平；所述TFEB蛋白上的14-3-3蛋白结合区域的氨基酸序列如序列表中序列1的第208-213位所示(具体是Ser211位)；(2)降低所述TFEB蛋白(序列1)的第134位丝氨酸的磷酸化水平；(3)降低所述TFEB蛋白(序列1)的第138位丝氨酸的磷酸化水平。
在所述应用或药物中，所述溶酶体功能障碍相关疾病具体可为溶酶体存储疾病(LSDs)或神经退行性疾病。具体如老年性痴呆症、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、脊髓侧索硬化(渐冻症)等。
在所述应用或药物中，所述“诱导溶酶体生成”中的“溶酶体”为成熟溶酶体。
在本发明中，所述“治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病”具体可体现为如下中的任一种：
(a)治疗和/或预防由变性蛋白引发的相关神经退行性疾病；
(b)治疗和/或预防由脂滴累积引起的相关疾病；
(c)治疗和/或预防阿尔兹海默症。
本发明研究发现：HEP14或其衍生物能够激活蛋白激酶C(PKCα和PKCδ)，进而通过两条平行的信号途径，一方面激活转录因子TFEB，另一方面使转录抑制因子ZKSCAN3失活，最终作为“分子开关”控制溶酶体的生成。PKC的激活导致GSK3β失活，进而引起TFEB去磷酸化而向细胞核转移，同时活化状态的PKC还会激活MAPK激酶JNK2和p38，磷酸化ZKSCAN3，使ZKSCAN3从细胞核转移到细胞质。HEP14及其衍生物因为不会影响mTORC1的活性而干扰细胞代谢平衡，所以可能是治疗溶酶体相关疾病的理想药物。
附图说明
图1为小分子化合物HEP14促进溶酶体的生成。
图2为HEP14诱导增多的溶酶体呈BODIPY-pepstatin A阳性，说明这些增多的溶酶体都是已经成熟的。
图3为HEP14和Torin1都可以增强细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1的内源染色。
图4为HEP14可以显著增加不同类型细胞中的溶酶体数目。
图5为经HEP14处理后，细胞内许多TFEB和TFE3靶基因的表达都不同程度的上调。
图6为与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其TFEB和TFE3蛋白水平显著降低。
图7为用siRNA把TFEB的表达敲低就会明显抑制HEP14诱导的溶酶体增多。
图8为HEP14可以诱导内源的或融合EGFP标签的TFEB(TFEB-EGFP)向细胞核转移，但对内源的TFE3或融合mCh标签的TFE3(mCh-EGFP)无影响。
图9为经药物Bis1提前处理HeLa细胞后，HEP14就不能再使TFEB-EGFP入核。只有将PKC的α和δ亚型特意敲除，HEP14诱导TFEB入核才会明显被抑制，并且同时将α和δ亚型敲低之后抑制的效果会增强，而其他亚型敲低之后都不会影响HEP14诱导TFEB入核。
图10为磷酸化的PKCα和PKCδ信号随着HEP14处理时间的延长而增强。
图11为未经HEP14处理的正常状态下的PKCα和PKCδ主要弥散的分布在胞浆中，当用HEP14处理后PKCα和PKCδ的定位发生了显著的变化，PKCα重新定位到质膜上，而PKCδ则在质膜、核膜、细胞内囊泡上检测到了定位。
图12为PKCδ-EGFP聚集的囊泡可以被LysoTracker Red染上，这说明经HEP14处理使PKCδ转移到溶酶体上。当提前加入PKCδ特异的抑制剂Rottlerin后PKCδ就不能转移到Lyso Tracker Red阳性的溶酶体膜上，但是其质膜和核膜的定位是不受影响的。
图13为当用HEP14、Torin1和磷酸酶CIP处理细胞，都会看到TFEB相似的迁移率，说明经HEP14激活的PKCα和PKCδ减少了TFEB的磷酸化水平。Fold指不同处理TFEB的蛋白条带的亮度经Tubulin均一化之后与DMSO对比的增加倍数。S.E.是短曝光；L.E.是长曝光。
图14为HEP14和Torin1都会显著减弱TFEB蛋白上14-3-3结合区域(14-3-3结合区域的氨基酸序列为序列表中序列1所示TFEB蛋白的第208-213位)处的磷酸化水平。
图15为HEP14会作用于GSK3β使TFEB的S134和S138位去磷酸化。
图16为HEP14并不影响mTORC1的底物核糖体S6激酶(S6K)的磷酸化。
图17为与转入对照siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基基因的表达量显著降低。将丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A的亚基表达敲低并不能抑制HEP14诱导的TFEB入核。与转入对照siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因的表达量显著降低。将calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的表达敲低后，不抑制HEP14诱导的TFEB入核。
图18为随着HEP14处理时间的延长，GSK3α和GSK3β的磷酸化信号都明显增强。
图19为将经HEP14和Torin1处理过的细胞核质分离之后western blot检测发现，HEP14使内源ZKSCAN3由胞核转移到胞质，Torin1对ZKSCAN3的定位影响并不显著。
图20为在细胞水平，HEP14会使mCh-ZKSCAN3由胞核转移到胞质，同时伴随着TFEB-EGFP由胞质转移到胞核。然而Torin1处理并不会看到ZKSCAN3的出核现象，而在EBSS(无氨基酸、蔗糖、血清的培养基)培养基培养细胞，则能看到缓慢的ZKSCAN3出核现象(Starvtion)。
图21为在人类肝癌细胞和小鼠成神经细胞中观察到HEP14引起的ZKSCAN3出核现象。
图22为只有将PKCδ特异敲低才会抑制HEP14对ZKSCAN3的出核影响，而且抑制程度犹如Bis1处理，而将PKCα特异敲低与对照siRNA一样并不会影响HEP14对ZKSCAN3的作用。
图23为将GSK3α和GSK3β单独敲低或同时敲低都不会影响HEP14诱导的ZKSCAN3出核。
图24为经JNK抑制子和p38抑制子预先处理组HEP14不能再使ZKSCAN3出核，而ERKinhibitor并不影响HEP14的作用。
图25为与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因的表达量显著降低。
图26为JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38分别被siRNA敲低之后只有JNK2和p38组可以明显抑制HEP14诱导ZKSCAN3出核。而且JNK2和p38同时被敲低后这种抑制作用会更加明显。
图27为免疫染色发现细胞内源的JNK2和磷酸化的p38经HEP14处理之后从细胞质定位转移到细胞核定位。
图28为与敲低前对照组相比，将细胞中PKCδ的编码基因敲低后，HEP14诱导的JNK2和p38的磷酸化水平显著下降，将PKCαsiRNA敲低并不能降低磷酸化水平。
图29为在HeLa细胞中诱导表达Htt-97Q-GFP之后，加入HEP14处理可以明显降低细胞中polyQ蛋白的积累，且效果与Torin1处理效果接近。
图30为HEP14可以显著降低细胞中脂滴的量。在对HepG2细胞喂食过量的油酸以诱导脂滴的形成后，先采用溶酶体的抑制剂BFA1预先处理细胞，然后再加入HEP14处理细胞，HEP14就不能再降低脂滴的含量。
图31为HEP14促进APP/PS1小鼠脑部淀粉样蛋白(Aβ)的清除。其中，A为APP/PS1小鼠脑切片中Aβ免疫染色(上排)和Aβ及DAPI的共染(下排)；标尺，200μm。B为经HEP14(n＝3)和对照(n＝3)处理后APP/PS1小鼠中Aβ斑块的统计结果。C为经HEP14(n＝3)和对照(n＝3)处理后APP/PS1小鼠脑皮层区和海马区中Aβ40和Aβ42含量的统计结果；标尺，200μm。图中，Veh为对照组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及到的TFEB蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；α亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列2所示；δ亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列3所示；GSK3β蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示；ZKSCAN3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；JNK2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示；p38蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
Hela细胞：ATCC CCL-2。MCF7细胞：ATCC HTB-22。HEK293细胞：ATCC CRL-1573。NIH3T3细胞：ATCC CRL-1658。Neuro-2a细胞：ATCC CCL-131。HepG2细胞：ATCC HB-8065。SH-SY5Y细胞：ATCC CRL-2266。
实施例1、HEP14及其衍生物的制备及鉴定
一、HEP14和HEP15的制备及鉴定
(一)HEP14和HEP15的制备
将干燥的南欧大戟(Euphorbia peplus Linn.)全草(9.5千克)，用95％乙醇加热回流提取4次(提取时间依次为5、4、3、3小时)后过滤，合并滤液，回收乙醇后加入水混悬，然后用石油醚和氯仿依次萃取，每次等体积萃取4次，减压回收萃取溶剂后，得石油醚萃取部位(约299克)、氯仿萃取部位(约17克)。然后将石油醚萃取部位经200-300目硅胶柱层析，用石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱(石油醚/丙酮：1：0→0:1)，通过薄层层析(TLC)检测合并，得到6个部分(Fr.A-Fr.F)。其中Fr.A经过MCI、反相硅胶(RP-18)柱层析、正相硅胶柱层析(不同比例的石油醚-丙酮和石油醚-乙酸乙酯洗脱系统)，分离得到HEP14(1100毫克)和HEP-15(207毫克)。
(二)HEP14的鉴定
白色块状结晶(丙酮)；熔点为166℃；EI-MS m/z 414[M]+；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：206.8(C-9)，137.2(C-6)，135.3(C-2)，132.6(C-1)，124.1(C-7)，84.9(C-4)，83.1(C-3)，77.3(C-5)，71.9(C-10)，43.3(C-8)，38.7(C-11)，31.0(C-12)，28.5(C-16)，24.0(C-15)，23.2(C-13)，23.0(C-14)，21.9(C-19)，20.7(C-20)，15.6(C-18)，15.5(C-17)，OAng：168.4，139.9，127.1，17.1，15.9；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：6.07(1H，d，J＝1.2Hz，H-1)，5.76(1H，dd，J＝3.2，1.2Hz，H-7)，5.49(1H，s，H-3)，4.04(1H，m，H-8)，3.73(1H，d，J＝7.2Hz，H-5)，2.46(1H，m，H-11)，2.26(1H，m，H-12)，1.93(3H，t，J＝1.4Hz，H-20)，1.79(3H，d，J＝1.2Hz，H-19)，1.78(3H，s，H-18)，1.73(1H，m，H-12)，1.08(3H，s，H-17)，1.05(3H，s，H-16)，0.87(1H，m，H-14)，0.70(1H，m，H-13)，OAng：6.17(1H，m)，2.02(3H，dd，J＝5.6，1.6Hz)，0.98(3H，d，J＝7.2Hz)；以上波谱数据结合文献(Takahisa Nakane,Kazuo Masuda,etal.Fern constituents:six new triterpenoid alcohols from Adiantum capillus-veneris.Chem.Pharm.Bull.[J].1999,47(4):543-547.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据首次进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为5β-O-当归酰基-20-去氧巨大戟醇(HEP14)，其结构式如下。
(三)HEP15的鉴定
白色棒状结晶(丙酮)；熔点为167℃；EI-MS m/z 414[M]+；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：207.2(C-9)，139.1(C-2)，134.7(C-6)，129.8(C-1)，125.8(C-7)，85.1(C-4)，80.2(C-3)，77.0(C-5)，72.9(C-10)，44.0(C-8)，39.4(C-11)，31.1(C-12)，28.5(C-18)，24.0(C-15)，23.2(C-13)，23.1(C-14)，21.6(C-20)，17.5(C-17)，15.9(C-16)，15.4(C-19)，OAng：167.4，139.7，127.1，20.7，15.6；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：5.97(1H，dd，J＝3.2，1.6Hz，H-1)，5.87(1H，m，H-7)，3.78(1H，d，J＝5.6Hz，H-3)，5.27(1H，s，H-5)，4.23(1H，m，H-8)，2.44(1H，m，H-11)，1.84(3H，m，H-19)，1.77(1H，m，H-12)，1.60(3H，s，H-20)，1.16(3H，s，H-16)，1.08(3H，s，H-18)，1.01(3H，d，J＝7.2Hz，H-17)，0.70(1H，m，H-14)，0.96(1H，m，H-13)，OAng：6.14(1H，m)，2.03(3H，m)，1.96(3H，m)。以上波谱数据结合文献(H.Gotta,W.Adolf,H.J.Opferkuch,et al.On the active principles of the Euphorbiaceae,IХingenanetype diterpene esters from five Euphorbia species.Zeitschrift fuerNaturforschung,Teil B:Anorganische Chemie,Organische Chemie.[J].1984.39B(5):683-694.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据首次进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为3β-O-当归酰基-20-去氧巨大戟醇(HEP15)，其结构式如下。
二、HYJ系列化合物的制备及鉴定
(一)HYJ系列化合物的制备
将干燥的甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liou ex S.B.Ho)根部(20.0千克)粉碎成粗粉后，用95％乙醇室温浸泡3次(每次浸泡5天)后过滤，合并滤液，回收乙醇后加入水混悬，然后用石油醚和氯仿依次萃取，每次等体积萃取4次，减压回收萃取溶剂后，得石油醚萃取部位(约400克)、氯仿萃取部位(约72克)。然后将石油醚萃取部位经200-300目硅胶柱层析，用石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱(石油醚/丙酮：1：0→0:1)，通过薄层层析(TLC)检测合并，得到8个部分(Fr.A-Fr.H)。其中Fr.A经过MCI、反相硅胶(RP-18)柱层析、正相硅胶柱层析(不同比例的石油醚-丙酮和氯仿-乙酸乙酯洗脱系统)，分离得到Hyj-18(17毫克)、Hyj-26(7毫克)和Hyj-28(6毫克)。Fr.B经过反相硅胶(RP-18)柱层析、正相硅胶柱层析(不同比例的石油醚-丙酮和氯仿-乙酸乙酯洗脱系统)分别得到Hyj-1(160毫克)和Hyj-16(22毫克)。
(二)Hyj-1的鉴定
白色蜡状物；ESI-MS m/z:479[M+H]+，确定其分子量为478；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：206.4(C-9)，135.5(C-2)，134.6(C-6)，132.6(C-1)，126.3(C-7)，86.1(C-4)，83.0(C-3)，77.2(C-5)，72.0(C-10)，43.5(C-8)，38.6(C-11)，31.1(C-12)，28.5(C-16)，24.4(C-15)，23.1(C-14)，23.0(C-13)，21.2(C-20)，17.0(C-18)，15.7(C-17)，15.4(C-19)，OBen：167.4，133.5，130.1×2，129.8，128.5×2，OAce：172.6，21.4；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：6.14(1H，d，J＝1.5Hz，H-1)，5.88(1H，dd，J＝3.5，1.2Hz，H-7)，5.51(1H，br.s，H-5)，5.06(1H，s，H-3)，4.24(1H，br.d，J＝9.6Hz，H-8)，2.54(1H，m，H-12a)，2.30(1H，m，H-11)，1.77(3H，br.s，H-19)，1.75(1H，m，H-12b)，1.54(3H，s，H-20)，1.12(3H，s，H-17)，1.06(3H，s，H-16)，1.00(3H，s，H-18)，0.89(1H，m，H-14)，0.73(1H，m，H-13)，OBen：8.13(2H，dd，J＝6.0，1.0Hz)，7.60(1H，br.t，J＝6.4Hz)，7.49(2H，dd，J＝6.4，6.0Hz)，OAce：1.12(3H，s)。以上波谱数据结合文献(D.J.Pan,C.Q.Hu,J.J.Chang,et al.Kansuiphorin-C and-D,cytotoxicditerpenes from Euphorbia kansui.Phytochemistry[J].1991,30(3):1018-1020.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为3β-O-苯甲酰基-5β-O-乙酰基-20-去氧巨大戟醇(Hyj-1)，其结构式如下。
(三)Hyj-16的鉴定
淡黄色油状物；ESI-MS m/z:437[M+H]+，确定其分子量为436；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：207.1(C-9)，139.2(C-2)，135.0(C-6)，130.2(C-1)，126.1(C-7)，85.6(C-4)，80.6(C-3)，77.6(C-5)，73.3(C-10)，44.5(C-8)，40.0(C-11)，31.6(C-12)，29.0(C-16)，24.5(C-15)，23.8(C-14)，23.7(C-13)，22.2(C-20)，18.1(C-18)，16.3(C-17)，16.0(C-19)，OBen：166.3，133.7，130.2×2，129.4，128.7×2；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：5.99(1H，d，J＝1.5Hz，H-1)，5.89(1H，dd，J＝3.5，1.2Hz，H-7)，5.40(1H，br.s，H-5)，5.04(1H，s，H-3)，4.25(1H，m，H-8)，2.43(1H，m，H-11)，2.34(1H，m，H-12a)，1.82(3H，br.s，H-19)，1.76(1H，m，H-12b)，1.60(3H，s，H-20)，1.17(3H，s，H-17)，1.07(3H，s，H-16)，0.98(3H，d，J＝6.9Hz，H-18)，0.95(1H，m，H-14)，0.69(1H，m，H-13)，OBen：8.10(2H，dd，J＝6.0，1.0Hz)，7.59(1H，br.t，J＝6.4Hz)，7.45(2H，dd，J＝6.4，6.0Hz)。以上波谱数据结合文献(D.Uemura,H.Ohwaki,Y.Chen,etal.Isolation and structures of 20-deoxy-ingenol new diterpene,derivatives andingenol derivative obtained from Euphorbia kansui.Tetrahedron Lett.[J].1974,15(29):2527-2528.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为5β-O-苯甲酰基-20-去氧巨大戟醇(Hyj-16)，其结构式如下。
(四)Hyj-18的鉴定
淡黄色油状物；ESI-MS m/z:437[M+H]+，确定其分子量为436；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：207.0(C-9)，137.4(C-6)，135.5(C-2)，133.2(C-1)，124.5(C-7)，85.4(C-4)，84.2(C-3)，77.7(C-5)，72.3(C-10)，43.6(C-8)，39.3(C-11)，31.4(C-12)，28.7(C-16)，24.2(C-15)，23.5(C-14)，23.3(C-13)，22.2(C-20)，17.5(C-18)，15.8(C-17)，15.7(C-19)，OBen：167.5，133.7，130.0×2，129.8，128.8×2；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：6.14(1H，d，J＝1.5Hz，H-1)，5.77(1H，dd，J＝3.8，1.2Hz，H-7)，5.68(1H，s，H-3)，4.04(1H，m，H-8)，3.76(1H，br.s，H-5)，2.54(1H，m，H-11)，2.28(1H，m，H-12a)，1.83(3H，br.s，H-19)，1.81(3H，s，H-20)，1.76(1H，m，H-12b)，1.06(3H，s，H-17)，1.04(3H，s，H-16)，1.03(3H，d，J＝6.9Hz，H-18)，0.93(1H，m，H-14)，0.68(1H，m，H-13)，OBen：8.05(2H，dd，J＝6.0，1.0Hz)，7.61(1H，br.t，J＝6.4Hz)，7.48(2H，dd，J＝6.4，6.0Hz)。以上波谱数据结合文献(D.Uemura,H.Ohwaki,Y.Chen,et al.Isolation and structures of 20-deoxy-ingenol new diterpene,derivatives and ingenol derivative obtained from Euphorbia kansui.TetrahedronLett.[J].1974,15(29):2527-2528.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为3β-O-苯甲酰基-20-去氧巨大戟醇(Hyj-18)，其结构式如下。
(五)Hyj-26的鉴定
无色油状物；ESI-MS m/z:667[M+Na]+，确定其分子量为644；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：205.3(C-9)，138.9(C-6)，135.8(C-2)，131.2(C-1)，126.8(C-7)，84.4(C-4)，82.0(C-3)，77.0(C-5)，71.3(C-10)，68.3(C-13)，67.0(C-20)，42.6(C-8)，37.3(C-11)，34.4(C-12)，30.2(C-15)，28.5(C-14)，22.7(C-16)，18.2(C-18)，16.8(C-17)，15.4(C-19)，ODim：177.5，46.3，30.7，21.0，18.8，14.1，ODod：173.4，34.3，31.8，29.3×6，24.7，22.6，14.0；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：6.08(1H，d，J＝1.7Hz，H-1)，6.02(1H，dd，J＝4.2，1.2Hz，H-7)，5.43(1H，s，H-3)，4.14(2H，s，H-20)，4.08(1H，m，H-8)，4.05(1H，br.s，H-5)，2.72(1H，m，H-12a)，2.60(1H，m，H-11)，2.19(1H，m，H-12b)，1.78(3H，br.s，H-19)，1.20(1H，d，J＝5.0Hz，H-14)，1.16(3H，s，H-17)，1.03(3H，s，H-16)，0.97(3H，d，J＝6.9Hz，H-18)，ODim：2.31(1H，m)，1.92(1H，m)，1.15(3H，d，J＝7.0Hz)，0.96(3H，d，J＝6.4Hz)，0.92(3H，d，J＝6.4Hz)，ODod：0.96(2H，t，J＝7.6Hz)，1.55(2H，m)，0.88(3H，t，J＝7.0Hz)。以上波谱数据结合文献(T.Matsumoto,J.C.Cyoun,H.Yamada.Stimulatory effects of ingenols fromEuphorbia kansui on the expression of macrophage Fc receptor.Planta Med.[J].1992,58(3):255-258.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为3β-O-(2S,3-二甲基丁酰基)-13α-O–月桂酰基-巨大戟醇(Hyj-26)，其结构式如下。
(六)Hyj-28的鉴定
无色油状物；ESI-MS m/z:667[M+Na]+，确定其分子量为644；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ：205.5(C-9)，138.7(C-2)，136.9(C-6)，129.4(C-1)，126.7(C-7)，83.7(C-4)，80.0(C-3)，73.6(C-5)，72.3(C-10)，68.8(C-13)，65.4(C-20)，43.2(C-8)，38.3(C-11)，34.8(C-12)，30.1(C-15)，28.3(C-14)，22.4(C-16)，18.4(C-18)，16.6(C-17)，15.2(C-19)，ODim：176.2，46.0，30.8，20.6，18.9，13.9，ODod：173.6，34.3，31.5，29.3×6，24.7，22.6，14.1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：6.04(1H，d，J＝4.0Hz，H-7)，5.81(1H，d，J＝1.8Hz，H-1)，4.70(1H，ABq，J＝12.8Hz，H-20a)，4.53(1H，ABq，J＝12.8Hz，H-20b)，4.41(1H，s，H-3)，4.04(1H，dd，J＝12.6，4.0Hz，H-8)，3.68(1H，s，H-5)，2.72(1H，dd，J＝12.0，4.2Hz，H-12a)，2.43(1H，m，H-11)，2.17(1H，m，H-12b)，1.84(3H，br.s，H-19)，1.24(1H，d，J＝5.0Hz，H-14)，1.19(3H，s，H-17)，1.07(3H，s，H-16)，0.95(3H，d，J＝7.0Hz，H-18)，ODim：2.26(1H，m)，1.89(1H，m)，1.09(3H，d，J＝9.6Hz)，0.89(3H，d，J＝6.4Hz)，0.87(3H，d，J＝6.4Hz)，ODod：0.98(2H，t，J＝7.6Hz)，1.58(2H，m)，0.90(3H，t，J＝7.0Hz)。以上波谱数据结合文献(H.H.Ott,E.Hecker.Highly irritant ingenane type diterpene esters from Euphorbiacyparissias L.Experientia[J].1981,37(1):88-91.)，并通过2D-NMR谱图对其氢谱和碳谱数据进行了全归属，该化合物结构可被鉴定为3β-O-(2S,3-二甲基丁酰基)-13α-O–月桂酰基-巨大戟醇(Hyj-28)，其结构式如下。
实施例2、HEP14诱导溶酶体生成
一、Lyso Tracker Red染色法检测HEP14对溶酶体生成的调控作用
采用HEP14化合物处理HeLa细胞，然后利用Lyso Tracker Red染色法观察LysoTracker的着色来观察溶酶体的数目变化。具体操作如下：
采用不同系列浓度的HEP14化合物(0μM、10μM、20μM、40μM，溶剂为DMSO)处理HeLa细胞，3小时后，将经不同处理的细胞置于含0.3μM Lyso Tracker Red DND-99(Invitrogen公司产品，其产品目录号为L7528)的培养基中培养至30min，然后一方面直接激光共聚焦观察取像；另一方面，采用PBS悬浮细胞经流式细胞仪FACSAriaII分选，最后用FlowJo软件进行统计，得到溶酶体数目。实验同时设置用已知可以诱导溶酶体生成的mTORC1抑制剂Torin1(Tocris Bioscience公司产品，其产品目录号为Cat.No.4247)做阳性对照，其使用浓度为1mM。
结果显示：HEP14化合物可以显著增强Lyso Tracker的着色，并且呈浓度依赖效应，诱导的Lyso Tracker的着色程度近似于阳性对照Torin1。具体参见图1。
二、检测HEP14诱导生成的溶酶体是否为成熟溶酶体
由于BODIPY-pepstatin A可以指示成熟的溶酶体，本发明的发明人进一步采用BODIPY-pepstatin A检测了步骤一中经HEP14诱导增多的溶酶体是否为成熟溶酶体。具体操作如下：20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理HeLa细胞，3小时后，将经处理的细胞置于含0.3μMLyso Tracker Red DND-99和含1μM BODIPY-pepstatin A(ThermoFisher公司产品，其产品目录号为P12271)的培养基中共培养至30min，然后激光共聚焦显微镜观察取像。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的Hela细胞作为对照。
结果显示：HEP14诱导增多的溶酶体呈BODIPY-pepstatin A阳性，说明这些增多的溶酶体都是已经成熟的。具体参见图2。
三、检测HEP14对细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1的影响
此外，本发明的发明人还进一步对步骤一中经HEP14或Torin1处理后的细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1进行了内源染色。具体操作如下：将经20μM HEP14(溶剂为DMSO)和1μMTorin1(溶剂为DMSO)处理(处理3小时)后生长在盖玻片上的细胞分别用4％多聚甲醛室温固定15min，PBS润洗3×10min，之后0.05％(0.05g/100ml)saponin(皂苷)通透15min，PBS再次润洗3×10min，然后用5％(5g/100ml)的BSA(含有0.02％saponin)室温封闭1h，加入用block buffer稀释好的LAMP-1一抗(Abcam公司产品，其产品目录号为ab25630)，4℃孵育过夜。再经过PBS润洗3×10min，加入用block buffer稀释好的荧光标记的二抗室温1h，PBS润洗3×10min，封片拍照。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的Hela细胞作为对照。
结果显示：HEP14和Torin1都可以增强细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1的内源染色。具体参见图3。该结果进一步证明溶酶体数目增加了。
另外，为了检测HEP14化合物对溶酶体生成的促进作用是否为普遍现象，本发明的发明人采用了不同类型的细胞(MCF7、HEK293、NIH3T3、Neuro-2a和Primary neuron)替代以上步骤一至三中的Hela细胞，进行了如上实验(Lysotracker Red染色)。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的Hela细胞作为对照。结果证实，HEP14也可以显著增加其他不同类型细胞中的溶酶体数目，这其中就包括神经细胞。具体参见图4。因此，HEP14诱导溶酶体生成在不同的哺乳动物细胞中是普遍的现象。
实施例3、HEP14化合物诱导TFEB蛋白进入细胞核
一、检测HEP14对TFEB和TFE3靶基因的表达的影响
采用浓度为20μM的HEP14处理Hela细胞3小时，以未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的Hela细胞为对照，检测HEP14对细胞中TFEB和TFE3靶基因的表达情况的影响。具体操作如下：将细胞样品中的RNA用Trizol(Invitrogen)和氯仿提出后定量，每个样品取2μg作为模板，用ImProm-II Reverse Transcription system(Promega)合成cDNA，之后的PCR反应在MX3000P(Agilent Technologies)仪器上完成，每个样品三次重复，内参基因为GAPDH。数据分析使用7900HT Fast Real-Time PCR系统软件。
结果显示：经HEP14处理后，许多TFEB和TFE3靶基因的表达都不同程度的上调，这其中就包括TFEB本身。具体参见图5。
二、敲低细胞中TFEB和TFE3后研究HEP14对溶酶体生成的诱导情况
用siRNA敲低Hela细胞中TFEB和TFE3后检测HEP14对溶酶体生成的诱导情况。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
1、用siRNA敲低细胞中TFEB和/或TFE3的编码基因
用于敲低TFEB基因表达的siRNA序列如下：
5’-UGUAAUGCAUGACAGCCUGTT-3’；
5’-AUUGUCUUUCUUCUGCCGCTT-3’；
5’-UUGAUGUUGAACCUUCGUCTT-3’。
使用时，三条siRNA同时使用，一同转染到靶细胞中敲除效果好。
用于敲低TFE3基因表达的的siRNA序列如下：
5’-AUCCCUGCUCUCUUCAGUGTT-3’；
5’-AGGGCUGCUUUCCUUGGCCTT-3’；
5’-UCAUCAGCCUGGAGUCCAGTT-3’。
使用时，三条siRNA同时使用，一同转染到靶细胞中敲除效果好。
设置对照siRNA，序列如下：
5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
将各siRNA首先与Lipofectamine 2000混合，室温静置15min后转染至细胞中，使其终浓度为20pM，并且以24h为时间间隔转染两次，细胞在第二次转染后24h进行后续处理。siRNA敲降基因的效率由Western Blotting进行检测。
Western Blotting检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其TFEB和TFE3蛋白水平显著降低。具体参见图6。
2、检测敲低细胞中TFEB和/或TFE3后HEP14对溶酶体生成的诱导情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理经步骤1鉴定的TFEB和/或TFE3被敲低后的细胞(处理3小时)，然后用LysoTraker Red染色，一方面直接激光共聚焦观察取像；另一方面，采用PBS悬浮细胞经流式细胞仪FACSAriaII分选，最后用FlowJo软件进行统计，得到溶酶体数目。具体方法参见实施例2步骤一。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的Hela细胞作为对照。
结果显示：用siRNA把TFEB的表达敲低就会明显抑制HEP14诱导的溶酶体增多，而把TFE3的表达敲低就不会有这种效果。与之相对应的是，TFEB或TFE3表达被敲低却都可以抑制Torin1诱导的溶酶体生成。这暗示我们HEP14促进的溶酶体生成是通过TFEB而非TFE3完成的。具体参见图7。
三、检测HEP14对TFEB和TFE3的细胞定位的影响
为了进一步证明“HEP14促进的溶酶体生成是通过TFEB而非TFE3完成的”，本发明的发明人检查了经HEP14处理后TFEB和TFE3的细胞核定位情况。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
1、用能够表达融合EGFP标签的TFEB(TFEB-EGFP)的重组表达载体1和能够表达融合mCh标签的TFE3(mCh-EGFP)的重组表达载体2分别转染Hela细胞，获得两种瞬时转染细胞。其中，所述重组表达载体1为将TFEB蛋白的表达基因(Gene ID：7942)的第1-1431位插入到pEGFP-N2载体的酶切位点HindIII和/KpnI之间后得到的重组质粒。所述重组表达载体2为将TFE3蛋白的表达基因(Gene ID：7030)的第1-1728位插入到pEGFP-C1载体的酶切位点KpnI和BamHI之间后得到的重组质粒。
2、用20μM HEP14(溶剂为DMSO)分别处理步骤1构建的两种瞬时转染细胞以及未经转染的Hela细胞(处理3小时)，然后显微镜下观察统计TFEB和TFE3的入核比例。
结果显示：HEP14可以诱导内源的或融合EGFP标签的TFEB(TFEB-EGFP)向细胞核转移，但对内源的TFE3或融合mCh标签的TFE3(mCh-EGFP)无影响。Torin1却可以使这两种转录因子都入核。具体参见图8。
本发明的发明人进一步在肝细胞HepG2和神经细胞SH-SY5Y中进行了如上同样的实验。结果证实HEP14也只是特异的诱导内源TFEB入核，而Torin1引起TFEB和TFE3两者入核。
因此，进一步证明了HEP14诱导的溶酶体生成特异的通过TFEB而非TFE3来完成。
实施例4、HEP14化合物激活α亚型蛋白激酶C和/或δ亚型蛋白激酶C
一、检测HEP14引起的TFEB入核是否依赖于PKC信号途径
本发明的发明人检查了HEP14诱导的TFEB入核是否需要PKC信号途径参与。用可以抑制蛋白激酶C(PKC)所有亚型的药物Bis1(Cell Signaling Technology#9841)提前处理HeLa细胞，然后检查TFEB的入核情况。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
1、用实施例3步骤三中涉及的能够表达融合EGFP标签的TFEB(TFEB-EGFP)的重组表达载体1转染Hela细胞，获得瞬时转染细胞。
2、用2μM Bis1(溶剂为DMSO)处理步骤1构建的瞬时转染细胞以及未经转染的HeLa细胞(处理1小时)，然后用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理细胞3小时，显微镜下观察统计TFEB的入核比例。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的对照组。
结果显示：经药物Bis1提前处理HeLa细胞后，HEP14就不能再使TFEB-EGFP入核，但是Torin1引起的TFEB入核是不受影响的。这提示我们，HEP14引起的TFEB入核依赖于PKC信号途径而不依赖于mTORC1。具体参见图9。
二、参与调控HEP14诱导的TFEB入核的PKC的具体亚型
PKC激酶家族可以分为三个亚家族：classic PKCs(cPKCs)，包括α、β、γ亚型，novel PKC(nPKCs)包括δ、ε、η、θ亚型，atypical PKCs(aPKCs)包括ι、ζ亚型。为了研究清楚到底哪个亚型的PKC激酶参与调控HEP14诱导的TFEB入核，本发明的发明人利用siRNA分别将所有的PKC亚型敲低，然后观察HEP14诱导TFEB入核情况是否被抑制。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
1、用siRNA敲低细胞中各PKC亚型基因
敲低细胞中各PKC亚型基因的siRNA序列参加表1。
表1 敲低细胞中各PKC亚型基因的siRNA序列
使用时，三条siRNA同时转染到靶细胞中。
设置对照siRNA，序列如下：
5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
将各siRNA首先与Lipofectamine 2000混合，室温静置15min后转染至细胞中，使其终浓度为20pM，并且以24h为时间间隔转染两次，细胞在第二次转染后24h进行后续处理。siRNA敲降基因的效率由Western Blotting进行检测。其中，抗体为Cell SignalingTechnology产品，PKCα抗体的目录号为#2056，PKCδ抗体的目录号为#9616。
Western Blotting检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应亚型的PKC蛋白水平显著降低。
2、检测敲低细胞中各PKC亚型后HEP14诱导TFEB入核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理经步骤1鉴定的各亚型PKC蛋白编码基因被敲低后的细胞(处理3小时)，显微镜下观察统计TFEB的入核比例。
结果显示：只有将PKC的α和δ亚型特意敲除，HEP14诱导TFEB入核才会明显被抑制，并且同时将α和δ亚型敲低之后抑制的效果会增强，而其他亚型敲低之后都不会影响HEP14诱导TFEB入核。在Torin1处理组中，无论何种PKC的亚型被敲低都不会影响TFEB入核。这说明PKC激酶家族中的α(PKCα)和δ(PKCδ)亚型特异参与调控了HEP14诱导的TFEB入核。具体参见图9。
三、验证HEP14能否激活PKCα和PKCδ
为了进一步验证HEP14能否激活PKCα和PKCδ，本发明的发明人进行了如下实验。
1、分别利用PKCα和PKCδ的磷酸化抗体检测经HEP14处理后PKCα和PKCδ的磷酸化。具体操作如下：用HEP14(20μM)处理细胞，不同时间点收集细胞(0、0.5、1、2、3h)，裂解后通过western blot检测PKCα和PKCδ的磷酸化(抗体为Cell Signaling Technology产品，各一抗的目录号如下：p-PKCα#9375，p-PKCδ#9374，PKCα#2056，PKCδ#9616)。
结果发现：磷酸化的PKCα和PKCδ信号随着HEP14处理时间的延长而增强，说明HEP14可以激活PKCα和PKCδ。具体参见图10。
2、由于PKC的激活往往伴随蛋白亚细胞定位的改变。因此本发明的发明人利用PKCα和PKCδ连接EGFP的融合报告蛋白(PKCα-EGFP和PKCδ-EGFP)检测了经HEP14处理前后细胞内PKCα-EGFP和PKCδ-EGFP蛋白定位的改变。具体操作如下：
(1)用能够表达融合蛋白PKCα-EGFP的重组表达载体3和能够表达融合蛋白PKCδ-EGFP的重组表达载体4分别转染HeLa细胞，获得两种瞬时转染细胞。其中，所述重组表达载体3为将PKCα蛋白的表达基因(Gene ID：5578)的第1-2019位插入到pEGFP-N1载体的酶切位点EcoRI和KpnI之间后得到的重组质粒。所述重组表达载体4为将PKCδ蛋白的表达基因(Gene ID：5580)的第1-2031位插入到pEGFP-N1载体的酶切位点EcoRI和/KpnI之间后得到的重组质粒。
(2)用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)分别处理步骤1构建的两种瞬时转染细胞(转染后24h)(处理1小时)，然后显微镜下观察PKCα和PKCδ的细胞定位。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的对照组。
结果显示：未经HEP14处理的正常状态下的PKCα和PKCδ主要弥散的分布在胞浆中，当用HEP14处理后PKCα和PKCδ的定位发生了显著的变化，PKCα重新定位到质膜上，而PKCδ则在质膜、核膜、细胞内囊泡上检测到了定位。具体参见图11。
3、为了细究步骤2中PKCδ定位的这些细胞内囊泡到底是什么细胞器，本发明的发明人进一步用指示溶酶体的Lyso Tracker Red染色观察(具体方法参见实施例2步骤一)。
结果发现：这些PKCδ-EGFP聚集的囊泡可以被Lyso Tracker Red染上，这说明经HEP14处理使PKCδ转移到溶酶体上。具体参见图12。
4、提前加入10μM PKCδ特异的抑制剂Rottlerin(Sigma公司产品，其产品目录号为R5648)预先处理细胞30min，然后检测经HEP14处理(20μM；3h)后PKCδ的细胞定位，具体为用指示溶酶体的LysoTracker Red染色观察。
结果显示：当提前加入PKCδ特异的抑制剂Rotterlin后PKCδ就不能转移到LysoTracker Red阳性的溶酶体膜上，但是其质膜和核膜的定位是不受影响的。具体参见图12。
本发明的实验充分证实HEP14可以激活PKCα和PKCδ，而激活的PKCα和PKCδ调控了TFEB从细胞质转移到细胞核。
实施例5、HEP14化合物降低TFEB蛋白的磷酸化水平
一、检测HEP14化合物是否能降低TFEB蛋白的磷酸化水平
为了研究PKCα和PKCδ是如何调控TFEB入核的，本发明的发明人首先通过蛋白凝胶电泳检测经HEP14处理后的HeLa细胞内TFEB蛋白的迁移速率，这是基于蛋白翻译后被修饰其在凝胶电泳胶上的迁移率会改变。同时以Torin1和磷酸酶CIP(NEB公司产品，其产品目录号为M0290V)作为HEP14的对照。具体操作如下：用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理HeLa细胞3h，之后裂解细胞收集蛋白。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的HeLa细胞作为对照，并设置CIP处理组作为阳性对照。CIP处理组具体处理如下：蛋白裂解液(15μl)加入CIP(3μl)，裂解Hela细胞，37℃水浴1小时。之后，收集样品。Western blot检测TFEB蛋白的迁移速率。
结果显示：当用HEP14、Torin1和磷酸酶CIP处理细胞，都会看到TFEB相似的迁移率，说明经HEP14被激活的PKCα和PKCδ减少了TFEB的磷酸化。具体参见图13。
二、检测HEP14化合物减弱TFEB蛋白的磷酸化的作用位点
为了进一步研究HEP14化合物减弱TFEB蛋白的磷酸化的作用位点，本发明的发明人进一步对经HEP14处理后的HeLa细胞进行了western实验。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
1、用实施例3步骤三中涉及的能够表达融合EGFP标签的TFEB(TFEB-EGFP)的重组表达载体1转染HeLa细胞，获得瞬时转染细胞。
2、用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理步骤1构建的瞬时转染细胞3h，收样后用RIPA buffer裂解30min，离心后上清加入10μl GFP_Trap beads(chromotek lot50325001A)4℃孵育30min，离心收样做western。Western所用抗体为抗磷酸化的14-3-3结合区的抗体(cell signaling公司产品，其产品目录号为#9601)以及抗EGFP的抗体。
结果显示：HEP14和Torin1都会显著减弱TFEB蛋白上14-3-3结合区域(14-3-3结合区域的氨基酸序列为序列表中序列1所示TFEB蛋白的第208-213位)处的磷酸化水平，而此处的磷酸化介导了TFEB与14-3-3蛋白的结合，使TFEB被束缚在细胞质中。具体参见图14。
3、TFEB蛋白序列内还有GSK3β保守的磷酸化作用位点，即S/TxxxS/TxxxS/TP(x代表任意氨基酸)。为了找到哪个位点对于TFEB细胞质定位是必需的，发明人分别将这些可能的磷酸化位点做了缺失突变，然后发现只有氨基酸133-142位缺失突变会引起TFEB的入核，这提示GSK3β的磷酸化位点很有可能在氨基酸133-142这一区域内。发明人继续做定点突变，142位的丝氨酸突变成丙氨酸会引起TFEB入核，这是以前报道过得。单独将134位和138位的丝氨酸突变成丙氨酸都会略微引起TFEB入核，而同时突变这两个位点会明显引起TFEB入核。为了进一步确定磷酸化位点，发明人也进行了质谱的分析。首先把纯化的GST-GSK3β和His-TFEB(150-300aa)在体外进行激酶反应2h，然后跑胶分离His-TFEB，His-TFEB的蛋白带割胶后做质谱分析。质谱结果显示TFEB的S138位有明显的磷酸化修饰，而S134位和S142位可能也有磷酸化修饰，但较S138位可靠性低。然后进行了同位素γ-32P标记的体外激酶磷酸化试验，结果显示在不加GSK3β激酶而只有TFEB蛋白的情况下是检测不到同位素信号的，在加入GSK3β激酶组中，S134A和S138A突变的TFEB都会明显降低同位素信号，而S142A突变并不会降低同位素信号，之前的研究发现S142可能是mTORC1或ERK的磷酸化位点。S134A和S138A双突变的TFEB信号会比单独突变的信号降低更加明显，这充分说明GSK3β会直接磷酸化TFEB，而磷酸化位点是S134位和S138位，这是TFEB的两个新的磷酸化位点。过表达GSK3β(CA)可以抑制HEP14诱导的TFEB入核，但是发明人将S134AS138A双突变的TFEB与GSK3β(CA)同时表达，GSK3β(CA)并不会抑制突变的TFEB入核，这进一步证明S134位和S138位是GSK3β的作用位点。具体参见图15。
三、检测TFEB磷酸化的降低与mTORC1是否相关
之前已知TFEB磷酸化的降低是由Torin1抑制mTORC1的活性所引起的，为了进一步验证由HEP14所造成的TFEB磷酸化的降低是否与mTORC1相关。本发明的发明人检测了经HEP14处理前后Hela细胞中mTORC1的底物核糖体S6激酶(S6K)的磷酸化水平变化情况。具体操作如下：用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理Hela细胞，处理时间设置如下：0、0.5、1、2、3、4、5、6、7h。处理后裂解细胞收集蛋白，western blot检测mTORC1的活性。所用抗体为Cell Signaling Technology公司产品，产品目录号如下：p-S6K#9205，S6K#2708。
结果显示：HEP14并不影响mTORC1的底物核糖体S6激酶(S6K)的磷酸化，说明HEP14不会抑制mTORC1的活性。可见，HEP14激活的PKC信号途径所引起的TFEB入核并不是通过抑制mTORC1的活性实现的。具体参见图16。
实施例6、HEP14化合物抑制GSK3β蛋白活性
PKCα和PKCδ有可能会激活某种蛋白磷酸酶使TFEB去磷酸化，为了验证这种可能性本发明的发明人进行了如下实验验证：
1、将Hela细胞中主要的丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A的亚基分别敲低，然后检测HEP14是否还能诱导TFEB入核。具体操作如下：
(1)用siRNA敲低细胞中丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基的编码基因
敲低细胞中丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基的编码基因的siRNA序列参加表2。
表2 敲低细胞中丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基的编码基因和敲低细胞中calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的siRNA序列
使用时，三条siRNA同时导入靶细胞。
设置对照siRNA，序列如下：
5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
将各siRNA首先与Lipofectamine 2000混合，室温静置15min后转染至细胞中，使其终浓度为20pM，并且以24h为时间间隔转染两次，细胞在第二次转染后24h进行后续处理。siRNA敲降基因的效率由qRT-PCR进行检测。
实时定量荧光PCR(qRT-PCR)：将样品中的RNA用Trizol(Invitrogen)和氯仿提出后定量，每个样品取2g作为模板，用ImProm-II Reverse Transcription system(Promega)合成cDNA，之后的PCR反应在MX3000P(Agilent Technologies)仪器上完成，每个样品三次重复，内参基因为GAPDH。数据分析使用7900HT Fast Real-Time PCR系统软件。
qRT-PCR检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基基因的表达量显著降低。具体参见图17。
(2)检测敲低细胞中丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1或PP2A的亚基的编码基因后HEP14诱导TFEB入核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理步骤1构建的丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A的亚基编码基因被敲低的细胞3h，显微镜下观察统计TFEB的入核比例。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的对照组。
结果发现：将丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A的亚基表达敲低并不能抑制HEP14诱导的TFEB入核。具体参见图17。
2、由于最近有研究报道calcineurin磷酸酶由调控溶酶体钙离子流出的通道蛋白MCOLN1/TRPML1所激活，并且在抑制了mTORC1活性或禁食状态下可以促进TFEB入核。因而本发明的发明人将calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的表达敲低，然后检测HEP14是否还能诱导TFEB入核。具体操作如下：
(1)用siRNA敲低细胞中calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因
参见步骤1(1)。其中，敲低细胞中calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因的siRNA序列参加表3。qRT-PCR检测siRNA敲降基因的效率。
qRT-PCR检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因的表达量显著降低。具体参见图17。
(2)检测敲低细胞中calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因后HEP14诱导TFEB入核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理步骤1构建的calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的编码基因被敲低的细胞3h，显微镜下观察统计TFEB的入核比例。实验同时设置未经HEP14处理(以等量DMSO替代)的对照组。
结果发现：将calcineurin磷酸酶的亚基PPP3CB、PPP3R1或MCOLN1的表达敲低后，不抑制HEP14诱导的TFEB入核。具体参见图17。
以上步骤1和2的实验证明，HEP14激活的PKC信号通路不是通过丝氨酸苏氨酸磷酸酶PP1和PP2A，或者是calcineurin磷酸酶起作用的。
3、为了研究GSK3是否参与HEP14激活的PKC信号通路，本发明的发明人用抗体检测了经HEP14处理后的Hela细胞中GSK3的磷酸化水平，这种抗体可以同时识别GSK3αSer21位和GSK3βSer9位的磷酸化。具体操作如下：用HEP14(20μM)处理细胞，不同时间点收集细胞(0、0.5、1、2、3h)，裂解后通过western blot检测GSK3αSer21位和GSK3βSer9位的磷酸化(抗体为Cell Signaling Technology产品，各一抗的目录号如下：p-GSK3α/β#9331，GSK3α#9338，GSK3β#9315)。
结果显示：随着HEP14处理时间的延长，GSK3α和GSK3β的磷酸化信号都明显增强，说明HEP14会诱导GSK3的失活。具体参见图18。
实施例7、HEP14化合物诱导ZKSCAN3蛋白从细胞核转移至细胞质
由于ZKSCAN3作为转录抑制因子也会调控溶酶体生成，因此本发明的发明人也检测了HEP14对ZKSCAN3的影响。进行了以下实验：
1、把SH-SY5Y细胞的核质分离之后用抗ZKSCAN3的抗体进行western blot检测细胞内源ZKSCAN3在经HEP14处理前后的定位改变。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
(1)细胞核质分离试验：用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)处理SH-SY5Y细胞3h后，将细胞消化，置于冰上经NP-40裂解液(配方：10mMTris-HCl，pH7.5；150mMKCl；5mM MgCl2和0.5％(g/100ml)NP-40)裂解15min，1000g离心3min，上清即为细胞质部分。沉淀重悬在NP-40裂解液中，经超声处理(功率为20％)三次，每次5秒，即得到细胞核部分蛋白。
(2)western blot检测
将步骤(1)经胞质胞核分离之后的样品分别上样，一抗分别用抗ZKSCAN3蛋白的一抗(NOVUS公司产品，其产品目录号为NBP1-31566)，抗tubulin内参的一抗(Sigma-Aldrich公司产品)，抗Histone3蛋白的一抗(cell signaling公司产品，其产品目录号为#9715)孵育过夜，然后相应二抗孵育，暗室显色曝光。
结果显示：将经HEP14和Torin1处理过的细胞核质分离之后western blot检测发现，HEP14使内源ZKSCAN3由胞核转移到胞质，Torin1对ZKSCAN3的定位影响并不显著。具体参见图19。
2、在细胞水平，检测HEP14是否会促进ZKSCAN3由细胞核转移至细胞质。同时以Torin1作为HEP14的对照。具体操作如下：
(1)用能够表达融合蛋白mCh-ZKSCAN3的重组表达载体5和能够表达融合蛋白TFEB-EGFP的重组表达载体1(构建方法参见实施例3步骤三)分别转染Hela细胞，获得两种瞬时转染细胞。其中，所述重组表达载体5为将ZKSCAN3蛋白的表达基因(Gene ID：80317)的第1-1617位插入到pmCherry-C1载体的酶切位点HindIII和KpnI之间后得到的重组质粒。
(2)用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Torin1 1μM(溶剂为DMSO)分别处理步骤(1)构建的两种瞬时转染细胞3h，激光共聚焦显微镜取像观察并统计ZKSCAN3的出核情况。
结果显示：在细胞水平，HEP14会使mCh-ZKSCAN3由胞核转移到胞质，同时伴随着TFEB-EGFP由胞质转移到胞核。然而Torin1处理并不会看到ZKSCAN3的出核现象，而在EBSS(无氨基酸、蔗糖、血清的培养基)培养基培养细胞，则能看到缓慢的ZKSCAN3出核现象(Starvtion)。具体参见图20。
另外，为了验证HEP14引起的ZKSCAN3出核现象具有普遍适用性，本发明的发明人以人类肝癌细胞HepG2和小鼠成神经细胞Neuro-2a替代上述步骤1和2中的Hela细胞，进行实验(在多种细胞中过表达EGFP-ZKSCAN3经HEP14处理看ZKSCAN3出核情况)，结果发现在人类肝癌细胞和小鼠成神经细胞中也观察到了HEP14引起的ZKSCAN3出核现象，说明机制是保守的。具体参见图21。
3、为了研究HEP14诱导的ZKSCAN3出核是否也依赖于PKC信号通路，本发明的发明人利用siRNA分别将PKCα和PKCδ表达特异敲低，然后加入HEP14处理细胞，观察PKCα和PKCδ的敲低是否会抑制HEP14对ZKSCAN3的出核。同时设置抑制蛋白激酶C(PKC)所有亚型的药物Bis1替代HEP14作为对照。具体操作如下：
(1)用能够表达融合蛋白EGFP-ZKSCAN3的重组表达载体6转染Hela细胞，获得瞬时转染细胞。其中，所述重组表达载体6为将ZKSCAN3蛋白的表达基因(Gene ID：80317)的第1-1617位插入到pEGFP-C1载体的酶切位点HindIII和KpnI之间后得到的重组质粒。
(2)用siRNA分别敲低细胞中PKCα和PKCδ的编码基因
用siRNA分别敲低步骤(1)构建的瞬时转染细胞，具体操作参见实施例4步骤二。
(3)检测敲低细胞中PKCα和PKCδ的编码基因后HEP14诱导ZKSCAN3出核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Bis1 1μM(溶剂为DMSO)分别处理步骤(2)构建的PKCα或PKCδ的编码基因被敲低的细胞3h，激光共聚焦显微镜取像观察并统计ZKSCAN3的出核情况。
结果发现：只有将PKCδ特异敲低才会抑制HEP14对ZKSCAN3的出核影响，而且抑制程度犹如Bis1处理，而将PKCα特异敲低与对照siRNA一样并不会影响HEP14对ZKSCAN3的作用。具体参见图22。
4、本发明的发明人进一步将GSK3α和GSK3β单独敲低或同时敲低，然后加入HEP14处理细胞，观察GSK3α和GSK3β的敲低是否会抑制HEP14对ZKSCAN3的出核。具体操作如下：
(1)用siRNA敲低细胞中GSK3α和/或GSK3β的编码基因
用siRNA分别敲低步骤3构建的瞬时转染细胞(表达融合蛋白EGFP-ZKSCAN3)，具体操作参见实施例4步骤二。
其中，用于敲低GSK3α的编码基因的siRNA序列如下：
5’-AGAUGUAGGAGACAUUGGGTT-3’；
5’-UUUAAUCUGAGGGAACUUGTT-3’；
5’-AGUUAAAGCUUGUGAGGACTT-3’。
用于敲低GSK3β的编码基因的siRNA序列如下：
5’-AGUUUGACAUUUGGGUCCCTT-3’；
5’-UGUUUCCGGAACAUAGUCCTT-3’；
5’-AUACUUUCUUGAUGGCGACTT-3’。
qRT-PCR检测siRNA敲降基因的效率。
qRT-PCR检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的GSK3α和GSK3β的编码基因的表达量显著降低。
(2)检测敲低细胞中GSK3α和GSK3β的编码基因后HEP14诱导ZKSCAN3出核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)或Bis1 2μM(溶剂为DMSO)分别处理步骤(1)构建的GSK3α和/或GSK3β的编码基因被敲低的细胞3h，激光共聚焦显微镜取像观察并统计ZKSCAN3的出核情况。
结果发现：将GSK3α和GSK3β单独敲低或同时敲低都不会影响HEP14诱导的ZKSCAN3出核，这说明HEP14诱导ZKSCAN3出核依赖于PKCδ信号通路而不依赖也GSK3β信号通路。所以，被HEP14激活的PKC可能是通过另外的途径引起ZKSCAN3出核。具体参见图23。
实施例8、HEP14化合物诱导JNK2蛋白和/或p38蛋白进入细胞核，增强JNK2蛋白和/或p38蛋白的磷酸化水平
基于以上实施例，本发明的发明人推测被HEP14激活的PKCδ很可能通过激活其他的激酶使之磷酸化ZKSCAN3，然后诱导ZKSCAN3出核。为了证明这种可能性，发明人进行了如下实验。
1、首先检测了MAPK激酶是否参与诱导ZKSCAN3出核。MAPK激酶家族包括JNK、p38、ERK三类亚家族激酶。发明人先分别利用他们的抑制子(inhibitor)处理细胞，然后加入HEP14处理3h，然后观察各处理细胞中ZKSCAN3的出核情况。具体操作如下：在Hela细胞中过表达EGFP-ZKSCAN3(参见实施例7)后，用JNK的抑制剂SP600125(Abcam，ab120065)、p38的抑制剂SB203580(Abcam，ab120162)和ERK的抑制剂FR180204(Tocris Bioscience，Cat.No.3706)分别处理三个小时后，再用20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理3h，然后拍照统计ZKSCAN3出核率。
结果发现：经JNK抑制子和p38抑制子预先处理组HEP14不能再使ZKSCAN3出核，而ERK inhibitor并不影响HEP14的作用。这说明HEP14诱导ZKSCAN3出核是需要JNK和p38参与的。具体参见图24。
2、JNK激酶包括三种亚型：JNK1、JNK2、JNK3。到底是哪种亚型参与还是都有参与到ZKSCAN3出核呢？发明人进一步用siRNA分别敲低细胞中JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的基因表达，然后观察HEP14诱导的ZKSCAN3出核情况。具体操作如下：
(1)用siRNA分别敲低细胞中JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因
敲低细胞中JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因的siRNA序列参加表3。具体敲低方法参见上文。
表3 敲低细胞中JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因的siRNA序列
使用时，三条siRNA同时转染到靶细胞。
设置对照siRNA，序列如下：
5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
qRT-PCR检测siRNA敲降基因的效率。
qRT-PCR检测结果证实，与未转入siRNA的对照细胞相比，转入了相应siRNA的细胞其相应的JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因的表达量显著降低。具体参见图25。
(2)检测敲低细胞中JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因后HEP14诱导ZKSCAN3出核情况
用20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理步骤(1)构建的JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38的编码基因被敲低的细胞3h，然后拍照统计ZKSCAN3出核率。
结果显示：JNK1、JNK2、JNK3三种亚型和p38分别被siRNA敲低之后只有JNK2和p38组可以明显抑制HEP14诱导ZKSCAN3出核。而且JNK2和p38同时被敲低后这种抑制作用会更加明显。这提示我们JNK2和p38可能在PKCδ的下游参与到对ZKSCAN3的调控。具体参见图26。
3、通过免疫染色检测经HEP14处理前后细胞中JNK2和p38的细胞定位变化情况。具体操作如下：用20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理HeLa细胞90分钟后，用4％PFA固定细胞30分钟，0.5％saponin通透15分钟，5％BSA孵育1小时，然后抗体孵育4℃过夜。所用抗体为CellSignaling Technology产品，产品目录号如下：JNK#9252,p-p38#4511。同时用DAPI染色细胞核。
结果显示：免疫染色发现细胞内源的JNK2和磷酸化的p38经HEP14处理之后从细胞质定位转移到细胞核定位。具体参见图27。
4、用JNK2和p38的磷酸化抗体进行western blot检测，检测经HEP14处理前后细胞中JNK2和p38的磷酸化水平变化情况。具体操作如下：用20μM HEP14(溶剂为DMSO)处理HeLa细胞3h，然后收集细胞进行蛋白裂解，western blot检测JNK2和p38的磷酸化水平，所用抗体为Cell Signaling Technology公司产品，产品目录号为p-JNK#9251，JNK#9252，p-p38#4511，p38#8690。。
结果显示：用JNK2和p38的磷酸化抗体进行western blot检测发现，HEP14处理可以增强JNK2和p38的磷酸化水平，这种磷酸化水平升高说明蛋白被激活。
5、进一步检测将PKCδ或PKCαsiRNA敲低前后，经HEP14处理后细胞中JNK2和p38的磷酸化水平变化情况。具体操作如下：
(1)用siRNA分别敲低细胞中PKCα和PKCδ的编码基因
具体操作参见实施例4步骤二。
(2)检测分别敲低细胞中PKCα和PKCδ的编码基因后HEP14诱导的JNK2和p38的磷酸化水平，同时以未经敲低的正常细胞作为敲低前对照
具体操作参见步骤4。
结果显示：与敲低前对照组相比，将细胞中PKCδ的编码基因敲低后，HEP14诱导的JNK2和p38的磷酸化水平显著下降，将PKCαsiRNA敲低并不能降低磷酸化水平。以上试验充分说明，HEP14可以激活JNK2和p38，而这种激活作用是依赖于PKCδ的。具体参见图28。
实施例9、HEP14化合物加强溶酶体的降解功能
鉴于以上实施例研究发现，被HEP14激活的PKC信号途径可以通过同时引起TFEB的入核和ZKSCAN3的出核促进溶酶体的生成，那么发明人想知道HEP14能否促进溶酶体的降解功能。于是设计了如下几个试验：
1、首先检测了HEP14对外源过表达的亨廷顿(Htt)蛋白聚集体的清除。在HeLa细胞中诱导表达Htt-97Q-GFP之后，加入HEP14处理，然后观察细胞中polyQ蛋白的积累情况。同时设置以Torin1替代HEP14的对照。具体操作如下：
(1)构建Htt97Q-GFP稳定细胞系
将序列表中序列8所示的DNA片段(Htt97Q-GFP)插入到pcDNA4/myc-His A载体的酶切位点EcoRI和XhoI之间获得重组质粒，然后将其转入Hela细胞获得稳定细胞系。将稳定表达Htt97Q-GFP的HeLa细胞消化重新种在10cm的皿中，细胞密度以30-40％为宜，此时加入筛选的抗生素neomycin(G418)(100μM)。于培养箱中正常培养2-3周，期间换液3-5次以防止细胞因营养缺乏而死亡。最终将生长好的单克隆挑出，逐级扩大培养即从96孔板转移至24孔板再到6孔板。激光共聚焦显微镜下直接检测细胞表达荧光蛋白的情况，将表达均一的单克隆留下即为需要的稳转细胞系。
(2)首先往Htt97Q-GFP稳定细胞系加入doxycyclin(1μg/ml，Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为24390-14-5)诱导使Htt97Q-GFP表达，12h后换新鲜培养液，并补加不同浓度(20μM，40μM)的HEP14继续培养。同时设置Torin1 5μM(溶剂为DMSO)替代HEP14作为对照。在不同的时间点(0、24、48、72、96h)，在激光共聚焦显微镜下直接观察统计polyQ蛋白的累积情况。
结果发现：在HeLa细胞中诱导表达Htt-97Q-GFP之后，加入HEP14处理可以明显降低细胞中polyQ蛋白的积累，且效果与Torin1处理效果接近。具体参见图29。
2、对HepG2细胞喂食过量的油酸(OA)以诱导脂滴的形成，然后加入HEP14处理细胞，观察细胞中脂滴含量变化。具体操作如下：在种有HepG2细胞的培养皿中添加100μM的油酸oleic acid，待喂食12h细胞内形成明显脂滴后，换新鲜培养液，并补加不同浓度(20μM，40μM)的HEP14继续培养。在不同的时间点(0、24、48、72h、……)取样观察时要换加有含1μg/ml BODIPY(Sigma公司的产品，产品目录号为194235-40-0)培养基染色30min，在激光共聚焦显微镜下观察拍照，通过流式细胞分选仪定量结果。
结果显示：HEP14可以显著降低细胞中脂滴的量。具体参见图30。
3、进一步本发明的发明人在对HepG2细胞喂食过量的油酸(OA)以诱导脂滴的形成后，先采用溶酶体的抑制剂巴佛洛霉素A(BFA1)(Sigma公司产品，其产品目录号为B-1793)预先处理细胞，然后再加入HEP14处理细胞，观察细胞中脂滴含量变化。具体操作如下：首先过夜喂食100μM的油酸(OA)，第二天加入1μM巴佛洛霉素A(BFA1)，半小时后加入HEP14 20μM处理48h，其他组按照图上标注的加入相应的试剂处理，48h后用1μg/ml BODIPY染色一小时，然后拍照即可。
结果显示：HEP14就不能再降低脂滴的含量。综合以上实验结果，可见HEP14可以加强依赖于溶酶体的降解功能。具体参见图30。
4、APP/PS1小鼠是研究阿尔兹海默症(也就是老年痴呆病)的疾病模型，这种病鼠在5个月时开始发病，在其脑部会积累Aβ(淀粉样蛋白斑块)蛋白斑块。发明人在小鼠五个月大时腹腔注射HEP14，持续一个月注射，以注射等量蓖麻油作为对照，然后脑部切片免疫染色观察Aβ蛋白斑块累积情况。具体实验操作如下：雄性APP/PS1小鼠(5月龄)来自于北京医科利昊有限公司，饲养于中科院遗传与发育生物学研究所动物部。所有饲养和实验操作符合中科院动物伦理委员会要求。用DMSO配制HEP14储液，浓度为20mg/ml，并用芝麻油稀释至3mg/ml，此为注射液浓度。按照5mg/kg体重的剂量腹腔注射HEP14，每2天一次。HEP14腹腔注射处理一个月后，对小鼠麻醉并用生理盐水进行心脏灌流。10分钟后，改用4％多聚甲醛灌流5-10分钟。随后，完整取出小鼠脑部，置于5ml 4％多聚甲醛，固定过夜。第二天置于30％蔗糖溶液进行脱水，持续2天。2天后，完成固定脱水的小鼠脑部置于冷冻切片机进行切片。每张切片厚度为40微米，用细毛笔转移至盛有抗冻剂(甘油：乙二醇：0.1M磷酸盐缓冲液＝1:1:2，体积比)的96孔板中，随后置于-20℃冰箱过夜。每12张连续脑切片中选取一张进行免疫荧光染色。检测淀粉样蛋白使用的一抗为Cell Signaling Technology产品(#2454，兔源抗体)，稀释度为1:200，4℃孵育过夜。TBS洗三次后，孵育荧光二抗(驴抗兔)，稀释度为1:500，4℃孵育过夜。TBS洗三次后，进行DAPI染色(1:1000)10分钟，随后晾干封片。荧光定量统计时，随机拍摄海马区获取图片，并用NIS-Elements BR.3.00software(Nikon)统计单位面积中淀粉样蛋白荧光强度。另外，发明人提取小鼠脑部的蛋白利用特异识别Aβ40和Aβ42的抗体进行ELASA分析。利用Invitrogen的ELISA试剂盒(KHB3482，KHB3441)进行淀粉样蛋白的精确定量，实验按试剂盒说明书所列步骤操作。
脑部切片免疫染色观察Aβ蛋白斑块累积情况的结果显示：注射了HEP14的小鼠其脑部Aβ蛋白斑块明显减少，而注射了蓖麻油的对照组脑部Aβ蛋白斑块累积较多。提取小鼠脑部的蛋白利用特异识别Aβ40和Aβ42的抗体进行ELASA分析的结果显示：注射了HEP14后在小鼠脑部皮质区和海马区这两种Aβ蛋白相比于对照组都不同程度的减低，说明HEP14加速了小鼠脑部Aβ蛋白的清除。具体参见图31。
Claims (6)
1.HEP14在制备用于治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病的药物中的应用：
所述HEP14是结构式如式I所示的化合物；
所述溶酶体功能障碍相关疾病为阿尔兹海默症。
2.一种治疗和/或预防溶酶体功能障碍相关疾病的药物，其活性成分为HEP14；
所述HEP14是结构式如式I所示的化合物；
所述溶酶体功能障碍相关疾病为阿尔兹海默症。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：其具有如下至少一种功能：
(a1)激活TFEB蛋白；
(a2)诱导TFEB蛋白进入细胞核；
(a3)激活蛋白激酶C；
(a4)降低TFEB蛋白的磷酸化水平；
(a5)抑制GSK3β蛋白活性；
(a6)使ZKSCAN3蛋白失活；
(a7)诱导ZKSCAN3蛋白从细胞核转移至细胞质；
(a8)激活JNK2蛋白和/或p38蛋白；
(a9)诱导JNK2蛋白和/或p38蛋白进入细胞核；
(a10)增强JNK2蛋白和/或p38蛋白的磷酸化水平；
(a11)增加溶酶体数量和/或加强溶酶体的降解功能。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述蛋白激酶C为α亚型蛋白激酶C或δ亚型蛋白激酶C。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述TFEB蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；或
所述α亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述δ亚型蛋白激酶C的氨基酸序列如序列表中序列3所示；或
所述GSK3β蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示；或
所述ZKSCAN3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；或
所述JNK2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示；所述p38蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
6.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述“降低TFEB蛋白的磷酸化水平”体现为如下中至少一种：
(1)降低所述TFEB蛋白上的14-3-3蛋白结合区域的磷酸化水平；所述TFEB蛋白上的14-3-3蛋白结合区域的氨基酸序列如序列表中序列1的第208-213位所示；
(2)降低所述TFEB蛋白的第134位丝氨酸的磷酸化水平；
(3)降低所述TFEB蛋白的第138位丝氨酸的磷酸化水平。
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