CN111603483B - 一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用 - Google Patents

一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用。该丙腈类化合物通过抑制14‑3‑3蛋白与TFEB蛋白结合，减少TFEB(Ser210)表达，诱导TFEB核转位并增强TFEB的转录活性，从而诱导溶酶体相关基因的表达，增加溶酶体的生成，对Aβ25‑35诱导的神经毒性有显著的保护作用。所述化合物可以增加溶酶体生成，改善溶酶体功能以及治疗神经退行性疾病。

Description

一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，特别涉及一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用。
背景技术
14-3-3(YWHA，tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5- monooxygenaseactivation protein)是一类广泛表达的调控信号通路的蛋白家族，可以结合目标蛋白特定的磷酸化位点，改变目标蛋白的亚细胞分布、磷酸化状态和活化状态等，调节许多重要细胞生命活动，如：新陈代谢、细胞周期、细胞生长发育、细胞凋亡等。哺乳动物的 14-3-3蛋白共有7个亚型(β、ε、η、γ、θ、σ、ζ)，每种亚型在不同类型组织中的表达量不同，各有其特殊的功能。14-3-3β蛋白(YWHAB) 是14-3-3蛋白家族中含量最高的成员，参与生物体内多种信号转导、蛋白跨膜转运等过程。14-3-3β可与多种蛋白相互作用，与神经系统疾病的病理形成过程密切相关。
TFEB(transcription factor EB)是调控溶酶体生成的重要转录因子，被誉为溶酶体基因的“Master Regulator”。TFEB的转录活性取决于其亚细胞定位，受到翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用的精确调控。在营养充足的条件下，TFEB磷酸化，与14-3-3产生相互作用而滞留在胞质；在饥饿或者溶酶体功能障碍的状态下，TFEB去磷酸化，与14- 3-3分离并进入胞核，进而激活TFEB靶向基因的转录，从而激活溶酶体生成。因此，14-3-3是TFEB亚细胞定位的关键调控因子。
溶酶体生成和功能障碍是阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要发病机制。溶酶体是神经元内物质代谢的主要场所，某些衰老的细胞器和生物大分子等陷入溶酶体内并被消化掉是维持神经元稳态的关键因素之一。在中枢神经系统，溶酶体生成和功能异常可诱发阿尔兹海默症(AD)、帕金森氏病(PD)等诸多神经退行性疾病，动物实验研究发现，增加溶酶体生成，调节溶酶体功能可以有效加强AD模型鼠的神经元的突触可塑性，加强毒性蛋白的降解，增强其学习和认知功能。
当前的MTOR抑制剂，如torin1和雷帕霉素(rapamycin)通过抑制MTOR蛋白促进TFEB的细胞核转运来激活TFEB。诸如海藻糖和蔗糖之类的二糖以非MTOR依赖性方式,通过抑制AKT通路从而激活TFEB并且可以有益于神经退行性疾病。然而，直接靶向调控14- 3-3蛋白从而调节TFEB介导的溶酶体生成的小分子化合物尚未见报道。
发明内容
本发明基于已报道14-3-3β/TFEB p-S211复合物晶体结构(PDB ID:6A5Q)，确定了TFEB p-S211磷酸化位点通过疏水作用、静电作用和氢键作用与14-3-3β结合(14-3-3β关键氨基酸残基： Lys51/Arg58/Arg129/Tyr130)，并发现在二者结合界面S211附近的部分氨基酸也影响YWHA/14-3-3与TFEB的相互作用，进而调控TFEB 的亚细胞定位和转录活性，相关溶酶体的生成以及细胞自噬水平，阻断Aβ25-35诱导神经毒性，并为制备治疗神经退化性疾病药物提供了启发思路。本发明的目的在于提供强效的TFEB激活作用以用于治疗神经退行性疾病的小分子化合物，其具有简单的化学结构并且容易大规模合成。该化合物直接通过抑制14-3-3蛋白与TFEB蛋白结合，激活TFEB通路，从而增强溶酶体生成。本发明还提供了一种用于治疗可以受益于溶酶体功能障碍的方法，所述病症和疾病主要包括神经退行性疾病。
本发明目的之一：提供一种具有阻断作用的组合物，具体技术方案为：
一种能阻断Aβ25-35诱导神经毒性的组合物，其特征在于，所述组合物由Ⅰ所示结构式的化合物
Figure BDA0002520093460000031
和Neuro-2a细胞组成。
进一步地，Ⅰ所示结构式的化合物具体制备过程：2-氰乙基肼与苯乙酮在乙酸中反应6小时，缩合。所得产物与三氯磷酸在0-65℃下反应3小时；Vilsmeier-哈克反应得到3-(4-甲酰基-3-苯基-1H-吡唑-1-基)丙腈。最后与巴比妥酸在乙醇中加热反应得到终产物，反应式如式所示：
Figure BDA0002520093460000041
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
本发明目的之二：提供一种运用Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合 14-3-3β蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)细胞培养和靶向结合14-3-3β蛋白：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理；
(2)检测Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白情况及靶向结合14-3-3β蛋白的区域。
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
具体的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
进一步地，所述靶向结合14-3-3β蛋白的区域为TYR130、 ASP126、ASN175、LYS122、SER47。
本发明目的之三：提供一种阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，具体技术方案为：一种运用Ⅰ所示结构式的化合物阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，步骤如下：
(1)细胞培养和阻断诱导神经毒性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25- 35；
(2)检测细胞增殖和死亡情况。
进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
本发明目的之四：提供一种抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的方法，具体技术方案为：
一种运用Ⅰ所示结构式的化合物抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3 蛋白结合的方法，步骤如下：
(1)细胞培养和增强TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合： Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；
(2)检测TFEBTFEB-YWHA/14-3-3集合情况。
进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
本发明目的之五：提供一种诱导TFEB核转位的方法，具体技术方案为：
一种运用Ⅰ所示结构式的化合物诱导TFEB核转位的方法，具体步骤如下：
(1)细胞培养和抑制TFEB核表达：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入抑制核TFEB表达的 Aβ25-35；
(2)检测TFEB核转位情况。
进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
本发明目的之六：提供一种增强TFEB的转录活性的方法，具体技术方案为：
一种运用Ⅰ所示结构式的化合物增强TFEB的转录活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细胞培养和抑制TFEB的转录活性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入抑制TFEB的转录活性的Aβ25-35；
(2)检测TFEB转录活性。
进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。
优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。
本发明目的之七：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备靶向结合14-3-3β蛋白的靶向剂中的应用。
本发明目的之八：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备阻断Aβ25-35 诱导神经毒性的阻断剂中的应用。
本发明目的之九：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的抑制剂中的应用。
本发明目的之十：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备诱导TFEB的核转录的诱导剂中的应用。
本发明目的之十一：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备增强TFEB 的转录活性的增强剂中的应用。
本发明目的之十二：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备诱导 Neuro-2a细胞中溶酶体相关基因的转录的诱导剂中的应用。
本发明目的之十三：提供Ⅰ所示结构式的化合物在制备治疗退化性神经疾病的药物中的应用。
本发明发现了一种丙腈类化合物NC-1会影响TFEB的蛋白表达及诱导核转录，从而诱导Neuro-2a细胞中溶酶体相关基因的转录；引入Aβ25-35提高YWHA/14-3-3与TFEB的结合能力，诱导神经毒性，将丙腈类化合物NC-1、Neuro-2a细胞、Aβ25-35和TFEB结合在一起，证明化合物NC-1在Neuro-2a细胞中可以抑制细胞中TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白的结合能力，从而说明了其有阻断Aβ25-35诱导神经毒性的作用。
本发明的有益之处在于：本发明的一种丙腈类化合物NC-1和 Aβ25-35在Neuro-2a细胞中，对于YWHA/14-3-3与TFEB的结合具有相反的作用。同时创新性的引入Aβ25-35，证明化合物NC-1抵消其对 Neuro-2a细胞增殖的影响，间接的说明了NC-1化合物诱导TFEB核转录，从而诱导细胞中溶酶体相关基因的转录，并为阻断Aβ25-35类似物质诱导细胞毒性的方法及制备治疗退化性神经疾病药物提供了思路。
附图说明
图1为化合物NC-1靶向14-3-3β蛋白的计算机模拟分析结果
图2为CCK-8法检测Neuro-2a细胞增殖情况(对照组相比*P＜ 0.05，**P＜0.01)。
图3为台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒测定细胞死亡与(对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01)。
图4为CCK-8法检测Neuro-2a细胞增殖情况(与对照组相比** P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图5为台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒测定细胞死亡(与对照组相比**P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图6为IP实验检测TFEB-YWHA/14-3-3的结合情况(与对照组相比**P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图7为PRM检测TFEB(Ser210)的表达(与对照组相比**P ＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图8为免疫荧光检测TFEB的核转位情况(与对照组相比**P＜ 0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图9为TFEB的核转位情况(与对照组相比**P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)
图10为双荧光素酶报道基因检测TFEB蛋白的转录活性(与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
图11为RT-PCR检测溶酶体生成相关基因的表达(与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。与Aβ25-35组相比##P＜0.01)。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例一：相关材料与方法
1.1材料
神经细胞系Neuro-2a购自中科院上海细胞所，NC-1(3-(3-phenyl- 4-((2,4,6-trioxotetrahydropyrimidin-5(2H)-ylidene)methyl)-1H-pyrazol- 1-yl)propanenitrile，CAS号：475626-30-3)，Aβ25-35(Amyloid beta- peptide(25-35))购自美国MCE公司，CCK-8试剂盒、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒购买自碧云天公司，Trizol购自美国Invitrogen 公司，cDNA反转录试剂盒购自TaKaRa公司。TFEB、YWHA/14-3- 3,ACTB抗体均购买自美国Sigma公司。
1.2丙腈类化合物NC-1制备方法
2-氰乙基肼与苯乙酮在乙酸中反应6小时，缩合；所得产物与三氯磷酸在0-65℃下反应3小时；Vilsmeier-哈克反应得到3-(4- 甲酰基-3-苯基-1H-吡唑-1-基)丙腈；最后与巴比妥酸在乙醇中加热反应得到终产物，具体反应式如下：
Figure BDA0002520093460000101
制备得到的丙腈类化合物NC-1和Neuro-2a细胞组合能抑制 TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合。
1.3化合物靶向结合计算机模拟分析
确定靶向14-3-3β蛋白Lys51/Arg58/Arg129/Tyr130所在区域进行化合物靶向结合计算机模拟分析，晶体结构PDB ID:6A5Q。所用软件为薛定谔Maestro 11.4，3D作图软件为PyMol。
具体步骤：
1.蛋白准备：从Protein Data Bank上获得14-3-3β/TFEB p-S211 复合物的晶体结构(PDB ID:6A5Q)。使用Protein Preparation Wizard Panel模块对蛋白进行处理，去水、加氢、删除多余链、修补缺失残基、优化结构，随后将蛋白进行能量最小化等(OPLS2005力场，
Figure BDA0002520093460000111
Figure BDA0002520093460000112
RMSD)。
2.格点文件生成：将14-3-3β蛋白K51/R58/R129/Y130区域作为对接分析口袋，用Receptor Grid Generation模块制作格点文件，盒子大小为
Figure BDA0002520093460000113
(以Y130为中心)。
3.化合物NC-1准备：将化合物NC-1的2D格式通过LigPrep Module模块进行处理，输出3D结构。
4.结合分析：将准备好的配体导入，利用Glide模块进行分子对接，即受体和配体分子之间通过几何匹配和能量匹配而互相对接。
1.4细胞培养及处理方式
Neuro-2a细胞在37℃、浓度5％CO2培养箱中培养，采用含有 10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。NC-1及Aβ25-35均溶解于DMSO。研究NC-1对Neuro-2a毒性效应，采用的是0、10、20、40、80、160 μM NC-1处理Neuro-2a细胞24小时。研究NC-1对Aβ25-35暴露后的抑制作用效应，Neuro-2a细胞预处理NC-1(40μM)2小时后，在加入Aβ25-35(100μM)24小时。
1.5CCK-8试剂盒测定细胞活力
将1×104细胞按照分组接种于96孔板，每组设置5个复孔，按照1.2 所示条件处理细胞，培养24h后，除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后向每孔加入90μl新鲜培养基和10μl CCK-8溶液进行检测, 孵箱中孵育1h后，酶标仪A450nm处测定各孔OD值。
1.6台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒测定细胞死亡率
处理后的细胞，用台盼蓝染色液染色15分钟后，用Bio-Rad全自动细胞计数仪TC20进行死亡细胞计数。
1.7Western-bolt检测蛋白表达
用RIPA裂解液提取细胞蛋白。对提取的蛋白采用12％浓度的 SDS-PAGE进行分离，根据分子大小选择湿转或半干转，利用购自 sigma公司的购买的单克隆一抗，在4℃摇床孵育过夜；然后，用IgG 辣根过氧化物酶偶联二抗孵育，化学发光显色液显色。ChemiDoc XRS+成像系统对膜进行扫描，Image J软件分析统计。
1.8免疫共沉淀
将细胞用细胞裂解液裂解，离心，取1mg蛋白溶液(约500μl) 置于EP管中，加入5μgYWHA/14-3-3抗体到样本裂解液中(阴性对照用和一抗同种属来源的IgG)，取50μl的protein G-beads，分别加入到不同的抗原-抗体混合物EP管中，4℃旋转4h后，4℃以1000rpm 速度离心3min，弃去上清，用PBS洗涤沉淀3次，每次5min。向每个EP管中加入30μl的2×加样缓冲液，沸水煮10min，离心取上清进行Western-bolt实验检测TFEB-YWHA/14-3-3结合情况。
1.9双荧光素酶报道基因
ATG5作为TFEB直接调控基因，构建含ATG5启动子序列插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，将TFEB质粒与报告基因质粒共转染Neuro-2a细胞。转染48h后，加入报告基因裂解液充分裂解细胞并混匀，离心取上清用于测定，采用Dual LuciferaseReportAssay System(Promega)检测，并根据蛋白水平进行标准化。
1.10平行反应监测(parallel Reaction Monitoring,PRM)检测 TFEB(Ser210)的表达
PRM是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。PRM技术基于Q-Orbitrap 为代表的高分辨、高精度质谱平台，首先利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子，随后在collision cell中对母离子进行碎裂，最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。这样即可对样本中的TFEB(Ser210) (LVGVTSSpSCPADLTQKRELT)进行准确地特异性分析。
1.11实时定量荧光PCR分析
以总RNA提取试剂RNAiso Plus溶解细胞，按说明书步骤提取样本总RNA。取等量总RNA按反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit说明书步骤将总RNA转录为cDNA以进行后续实验。使用荧光定量检测试剂SYBR Master Mix及荧光定量PCR仪(CFX96，美国伯乐)进行基因实时定量荧光PCR分析，以明确各组间mRNA表达差异。特异性引物序列见表1。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCT方法计算mRNA表达量。
表1基因引物列表
Figure BDA0002520093460000131
Figure BDA0002520093460000141
1.12免疫荧光
细胞在固定后进行穿孔，血清封闭后，孵育自TFEB单克隆一抗，在4℃摇床孵育过夜；在室温孵育相应的荧光二抗1小时后，抗荧光淬灭剂封片，用共聚焦进行观察。
1.13统计学处理
实验数据以样本均值±标准误(SEM)表示。由SPSS 22.0统计软件进行分析，满足方差齐性和正态分布的数据采用方差分析，不满足方差齐性和正态分布的数据采用非参数检验。P<0.05为差异具有显著性意义。
实施例二：靶向14-3-3β蛋白结合的化合物NC-1的计算机模拟分析
按上述1.3方法进行化合物NC-1靶向结合14-3-3β蛋白 Lys51/Arg58/Arg129/Tyr130所在区域的计算机模拟分析。
分子对接结果显示如图1，化合物NC-1可以与靶蛋白14-3-3β的TYR130、ASP126、ASN175、LYS122、SER47形成5个氢键作用，氢键距离依次为
Figure BDA0002520093460000142
此外，化合物的苯环可以与氨基酸残基LYS122形成1个阳离子-π作用(。
说明化合物可靶向结合14-3-3β蛋白Lys51/Arg58/Arg129/Tyr130 区域，用于制备治疗退行性神经疾病药物，具备可改善老年痴呆等退行性神经系统疾病的能力。
实施例三：NC-1对Neuro-2a细胞增殖的影响
10，20，40μM的NC-1对细胞增殖无影响，80和160μM mol/L 的NC-1均可使细胞增殖受限，诱导细胞死亡，对细胞有明显的毒性作用。与对照相比，模型组80μM Aβ25-35作用细胞24h之后，Neuro-2a细胞活力下降了20％，细胞死亡率增高到了27.13％(图2)。与对照相比，模型组160μM Aβ25-35作用细胞24h之后，Neuro-2a细胞活力下降了50％，细胞死亡率增高到了49.13％(图3)。
实施例四：NC-1对Aβ25-35诱导神经毒性的保护作用
基于NC-1的对Neuro-2a细胞增殖的影响(Figure 1)和文献上关于Aβ25-35对Neuro-2a细胞毒性的报道，我们选取了40μM的NC-1 及100μM Aβ25-35用以测试NC-1的神经保护作用。我们发现模型组 100μM Aβ25-35作用细胞24h之后，Neuro-2a细胞活力下降了49.12％，细胞死亡率增高到了50.35％，说明100μM Aβ25-35显著抑制了 Neuro-2a细胞的增殖，并诱导细胞死亡。与模型组比较，40μM的NC- 1对Aβ25-35诱导的神经毒性有显著的保护作用(图4和图5)。
实施例五：NC-1抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3结合
与空白对照相比,40μM的NC-1即可显著抑制Neuro-2a细胞中 TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白的结合(降低了2倍，P＜0.01)， Aβ25-35显著增高了TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白的结合。与Aβ25-35模型组相比，NC-1显著逆转了Aβ25-35增高的TFEB蛋白与 YWHA/14-3-3蛋白的结合能力(图6)。TFEB去磷酸化，与YWHA/14- 3-3分离并进入胞核，进而激活TFEB靶向基因的转录。通过PRM技术检测发现，与空白对照相比,40μM的NC-1即可显著抑制Neuro-2a 细胞中TFEB(Ser210)表达(降低了2倍，P＜0.01)，Aβ25-35显著增高了 TFEB(Ser210)表达。与Aβ25-35模型组相比，NC-1显著逆转了Aβ25-35增高TFEB(Ser210)表达(图7)。
实施例六：NC-1诱导TFEB核转位
与空白对照相比,40μM的NC-1即可显著诱导Neuro-2a细胞中 TFEB蛋白的核转位(增高了2.2倍，P＜0.01)，Aβ25-35同时减少了细胞浆及细胞核TFEB的表达。与Aβ25-35模型组相比，NC-1显著逆转了Aβ25-35抑制的核TFEB表达(图8和图9)。
实施例七：NC-1增强TFEB的转录活性
与空白对照相比,40μM的NC-1即可显著诱导Neuro-2a细胞中 TFEB蛋白的转录活性(增高了2.26倍，P＜0.01)，Aβ25-35减少了 TFEB蛋白的转录活性。与Aβ25-35模型组相比，NC-1显著逆转了Aβ25-35抑制的TFEB蛋白的转录活性(图10)。TFEB可以直接控制溶酶体的发生，精确的调节溶酶体发生相关基因的表达。与空白对照相比, 40μM的NC-1即可显著诱导Neuro-2a细胞中溶酶体相关基因的转录，包括溶酶体膜标志蛋白Lamp1，溶酶体V-ATP酶Atp6v0d1,溶酶体水解酶Clcn7,Ctsb,溶酶体钙离子通道蛋白Trpml1。Aβ25-35抑制了溶酶体相关基因的转录。与Aβ25-35模型组相比，NC-1显著逆转了Aβ25-35抑制的溶酶体相关基因的转录(图11)。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (26)

1.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细胞培养和靶向结合14-3-3β蛋白：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理；所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM；
Figure FDA0004044857030000011
(2)检测Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白情况及靶向结合14-3-3β蛋白的区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向结合14-3-3β蛋白的区域为TYR130、ASP126、ASN175、LYS122、SER47。
5.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养和阻断诱导神经毒性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM；
(2)检测细胞增殖和死亡情况。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。
9.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养和增强TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM；
(2)检测TFEBTFEB-YWHA/14-3-3结合情况。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。
13.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物诱导TFEB核转位的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细胞培养和抑制TFEB核表达：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入抑制TFEB核表达的Aβ25-35；所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM；
(2)检测TFEB核转位情况。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。
17.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物增强TFEB的转录活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细胞培养和抑制TFEB的转录活性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入抑制TFEB的转录活性的Aβ25-35；所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM；
(2)检测TFEB转录活性。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。
21.权利要求1的Ⅰ所示结构式的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞靶向结合14-3-3β蛋白的靶向剂中的应用。
22.权利要求1的Ⅰ所示结构式的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞阻断Aβ25-35诱导神经毒性的阻断剂中的应用。
23.在Neuro-2a细胞中权利要求1的Ⅰ所示结构式的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的抑制剂中的应用。
24.权利要求1的Ⅰ所示结构式的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞诱导TFEB的核转录的诱导剂中的应用。
25.权利要求1的Ⅰ所示结构式所述的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞增强TFEB的转录活性的增强剂中的应用。
26.权利要求1的Ⅰ所示结构式的化合物在制备体外培养的Neuro-2a细胞诱导Neuro-2a细胞中溶酶体相关基因的转录的诱导剂中的应用，所述相关基因为Neuro-2a中的Clcn7、Atp6v0d1、Lamp1、Ctsb和Trpm11基因。
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