CN101360506A

CN101360506A - 创伤愈合的方法

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Publication number: CN101360506A
Application number: CNA2006800516339A
Authority: CN
Inventors: S·M·奥格伯恩; D·托马斯; R·莫斯利
Original assignee: Peplin Research Pty Ltd
Current assignee: Peplin Research Pty Ltd
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2009-02-04
Also published as: EP1965818A4; EP1965818A1; WO2007059584A1; BRPI0618926A2; CA2629899A1; JP2009517345A; US20160317486A1; NZ568168A; KR20080077625A; US20090215884A1

Abstract

本发明一般涉及在患者中促进创伤愈合的方法和组合物。特别地，本发明涉及巨大戟二萜醇化合物，特别是巨大戟二萜醇当归酸酯在创伤愈合中的用途，以及包含这些化合物的组合物。

Description

创伤愈合的方法

发明领域

发明背景

在本说明书中作者参考的出版物的书目详情集中列于说明书的末尾。

在本说明书中涉及的任何现有出版物(或来源于它的信息)或其他已知的任何事件都不，而且应当不会认为是承认或确认或任何形式的建议，以使该现有出版物(或来源于它的信息)或其他已知的事件都构成了本说明书所涉及的领域的普通知识的一部分。

创伤是特别地由，导致结构组织完整性受到物理破坏的机械、化学、热或病原性原因导致的外部或内部损伤。

创伤愈合，即，组织(特别是皮肤组织)完整性恢复是由各种调节细胞生长、细胞迁移、细胞分化和细胞增殖的生长因子和细胞因子协调作用的(Werner和Grose，2003；Bryan等人，2005)。方便地，可以将其描述为三个阶段：(i)炎症，(ii)增殖和(iii)成熟，每个阶段都可以进一步细分为更具体的阶段；尽管这些阶段并不对应于精确定义的时间段，可以有一定程度的重叠(Baum和Arpey，2005)。很多因素都与创伤后的创伤愈合的复杂过程有关，人们认为细胞因子在整个过程的调节中发挥了关键的作用(Hubner和Werner，1996).

(i)炎症(0-6天)

在产生创伤例如皮肤创伤后立即进行的第一阶段称作止血，由于纤维蛋白和血小板所介导的血管收缩和凝固，开始控制出血。凝块进一步用作到创口的成纤维细胞和炎症细胞的临时介质，并用作细胞因子和生长因子的贮存处。

在止血后，炎症细胞进入创伤中，延续了炎症过程(可以通过红斑、发热、肿胀和疼痛来证明)。这些中首先是由生长因子和细胞因子例如血小板衍生的生长因子(PDGF)和IL-8吸引的多形核细胞(PMNs)。IL-8是PMNs的主要化学引诱物(Werner和Grose，2003)，它快速和短暂表达对于炎症过程是关键性的。PMNs通过去除细胞碎屑、外来颗粒和细菌而开始清洁创伤，并在创伤中驻留相对较短的时间(1-2天)。接着，PMNs是细胞因子例如IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的主要来源。在损伤约3天后，单核细胞取代了PMNs，单核细胞转变为巨噬细胞，后者也发挥创伤清洁剂的作用，是IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的另一个来源，但是会在创伤位点保留较长的时间。在炎症期，强烈地向上调节IL-1β、IL-6和TNF-α表达(Grellner等人，2000；Grose等人，2002，Hubner等人，1996)，它们的协同表达可能对于正常修复是很重要的(Hubner等人，1996)。纤维细胞在炎症过程中发挥了重要作用，特别是与胶原蛋白和细胞因子产生有关，它们部分受到IL-1β和TNF-α的调节。

(ii)增殖(3天-数周)

肉芽化是炎症到增殖的重要连接阶段。在损伤后约3-4天开始肉芽组织形成，主要包含成纤维细胞和巨噬细胞。成纤维细胞迁移产生了持久性的基于胶原蛋白的细胞外基质(ECM)，巨噬细胞产生了多种的生长因子和细胞因子例如IL-1和TNF-α，接着会刺激生长因子的产生。

已经证明了，成纤维细胞表型对于创伤愈合应答和临床结果具有显著的影响(Stephens等人，1996，2001，2004)。研究显示，优先体现体内创伤愈合的组织(即，口腔粘膜组织)的成纤维细胞显示了不同的体外表型应答(al-Khateeb等人，1997)。此外，基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶在调节细胞迁移和损伤后的ECM改变中发挥了重要作用，已经证明了ECM再生减少和创伤愈合(即，慢性创伤)与成纤维细胞MMP产生和激活减少有关(Cook等人，2000)。与正常的真皮成纤维细胞相比，口腔粘膜和胎儿真皮成纤维细胞证明了I型胶原蛋白晶格重组和收缩增加，这与这些细胞类型通过ECM迁移和重新进入体外试验性创伤模型的良好能力有关(Stephens等人，1996；al-Khateeb等人，1997；Enoch，2006)。相反，与正常的真皮成纤维细胞相比，慢性创伤的成纤维细胞与I型胶原蛋白晶格重组和收缩减小有关，与细胞ECM迁移和体外创伤再生能力延迟或受损有关(Cook等人，2000；Stephens等人，2003；Wall，2006)。MMP-2的水平和活性增强与口腔粘膜和胎儿皮肤创伤位点的成纤维细胞有关，而慢性创伤成纤维细胞降低了MMP-2的水平和活性。

上皮再形成是创伤愈合过程的下一个关键事件，它主要是由迁移的角质形成细胞引发的。通过生长因子和细胞因子刺激的角质形成细胞增殖实现了上皮再形成，其中角质形成细胞通过肉芽组织迁移。在迁移过程中，这些细胞明显经受了很多的表型改变，表达与不同细胞表型有关的蛋白质。由于迁移的进行，角质形成细胞俘获了产生丝氨酸蛋白酶和MMPs的蛋白水解表型。角质形成细胞继续迁移到创伤空间中，直至完成，当分裂活跃的角质形成细胞又经受了表型改变以至于发生上皮细胞的分化和分层以及基膜的重形成时，从而完成上皮再形成过程。

细胞ECM粘附、蛋白酶导致的ECM降解和细胞因子和生长因子对这些过程的整个调节过程是创伤重塑和愈合的另外的关键特征，通过细胞整联蛋白-ECM相互作用，这些过程与细胞功能例如细胞迁移和创伤收缩是同等的。这些相互作用通过Rho家族和肌动蛋白结合蛋白而调节了细胞骨架重组和新的整联蛋白-ECM相互作用，同时蛋白酶会除去已存在的整联蛋白相互作用，导致从后方去-粘附并发生细胞迁移(Martin，1997；Stephens和Thomas，2002；Kirfel等人，2004)。如胶原蛋白晶格重组/收缩的实验定量，当不存在从后方去-粘附时，细胞收缩性会导致皮肤重组。

人们认为通过其对创伤边缘角质形成细胞的促有丝分裂效应和对嗜中性粒细胞的化学引诱效应，IL-6对于愈合应答方面的“发动”是很重要的(Werner & Grosse，2003；Galluci等人，2000)。认为IL-6的短暂表达对于无瘢痕的创伤形成是非常关键的(Liechty等人，2000)。

(iii)成熟(4天-数周或数月)

创伤成熟(或重塑)可以只发生几天或几周，但是整个过程可以持续高达数年。在该时期，观测到了收缩、发红减少、厚度减小、硬化减轻以及创伤的强度增强。在成肌纤维细胞影响下，创伤缩小，在肉芽组织中胶原蛋白产生减少，血管缩小。然后通过进一步的表皮细胞再生完成了创伤愈合(Werner和Grose，2003；Baum andArpey，2005)。

根据损伤和组织的性质，组织完整性的破坏会使患者容易感染、失血、组织功能丧失或瘢痕化。因此，创伤有效和完全的愈合对于患者的持续健康和康乐是非常重要的。许多因素会不利地影响创伤愈合过程，导致慢性或缓慢的创伤愈合，和/或瘢痕，这些因素包括损伤患者的年龄和一般健康、营养不良、疾病、所使用的压力、受损的循环、给药方法(例如抗癌和甾体治疗)、感染、存在外源性和坏死组织以及创伤的类型。

此外，即使创伤已经愈合，经常还会保留有瘢痕组织。瘢痕组织从功能和美容上都不如正常的未损伤皮肤。这种缺陷据信是在新组织形成过程中产生的新真皮内胶原蛋白束排列的结果。正常皮肤内的胶原蛋白束排列呈复杂的三维编织排列(通常称作“篮状-编织”排列)，这为皮肤提供了高水平的弹性和从损伤中恢复的能力。瘢痕组织内的胶原蛋白束排列呈更为平面的形式，束与皮肤的表面平行。三维编织的丧失以及被平行排列的胶原蛋白束取代据信是组织瘢痕的位点上不美观的原因。

促进创伤愈合仍然是深入探索和研究的焦点，当前有很多的方法和组合物用于治疗创伤以及促进创伤愈合，包括很多的被动和积极的敷料和绷带，以及局部用药物，以及坏死组织的物理和/或化学清创术。创伤愈合也包括非转化组织的细胞生长的坏死、凋亡和改变。

尽管如此，结果某种程度上仍然是不理想的，治疗慢性或缓慢的创伤愈合仍然给医学同人提出了严峻的挑战。因此，仍然需要其他的药剂和方法来治疗创伤并促进创伤愈合。此外，期望能够调节组织修复过程并由此促进更多正常胶原蛋白结构产生的药剂可以用于改善瘢痕组织性质。

大戟科植物覆盖了范围广泛的植物，包括大戟科的草。广泛报道了从这些物种中可以分离出的各种的巨大戟二萜，特别是巨大戟二萜醇化合物。该组中一种深入研究的种类是洋大戟L(又名E.hirtaL.，E.capitata Lam.)，其常用名包括泽泻、蛇草、猫发、昆士兰哮喘杂草和多花头大戟。该植物广泛分布于热带国家，包括印度、澳洲北部包括昆士兰。荸艾类大戟是另一类，从其中已经分离出了具有抗癌性质的巨大戟二萜醇当归酸酯(参见US 6,432,452，6,787,161和6,844,013)。巨大戟二萜醇-3-当归酸酯是从荸艾类大戟中提取和纯化的巨大戟二萜醇当归酸酯，特别是可以通过短期的局部施用用于治疗光化性角化病和非-黑素瘤性皮肤癌(NMSC)。巨大戟二萜醇-3-当归酸酯已经对很多细胞株显示了体外细胞毒性，并且已经在临床上确定了其体内效果。

发明简述

在整个说明书和权利要求中，除非上下文的需要，词语“包含”或其变形例如“包括”或“含”应当理解为是指包括所述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但是不排除任何其他的整体或步骤或者整体或步骤的组。

由于生长因子和细胞因子以及成纤维细胞和角质形成细胞在创伤愈合过程中的关键作用，分别调节它们产生或表型应答的药剂可以用于治疗创伤，通过促进、刺激、引发、增强或以其他方式加速创伤愈合过程和/或减小或使瘢痕最小，即改善美容。现在已经表明，巨大戟二萜醇化合物可以在外周血单核细胞(PBMCs)中调节免疫刺激活性，可以向上调节某些在创伤愈合中发挥作用的细胞因子的表达或产生。已经表明，可以使用这些化合物调节真皮成纤维细胞和角质形成细胞的表型和关键的创伤愈合应答。这种调节性的改变对于创伤愈合的结果，特别是皮肤创伤是有利的。有利的，这也可以导致创伤愈合的结果，同时瘢痕形成减少。现在，本发明提供新的方法来调节细胞因子产生和与创伤愈合有关的成纤维细胞和角质形成细胞的表型应答。因此，通过刺激急性炎症应答，例如增加PMN和巨噬细胞迁移以及提高促炎症细胞因子水平，可以促进创伤愈合。因此，本发明提供了创伤愈合和治疗创伤的方法。本发明也提供了促进更多正常的胶原蛋白结构产生的药剂，因此可以有利地改善愈合后创伤的瘢痕组织质量。

因此，在第一个方面，提供一种在需要的患者中调节一种或多种细胞因子产生的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在另一个方面，本发明提供一种在需要的患者的创伤位点调节一种或多种细胞因子产生的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。在一个实施方案中，施用包括向创伤位点局部施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在一个实施方案中，调节包括增加细胞因子产生。

在另一个实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL6、IL-8和TNF-α。

在另一个方面，提供一种在需要的患者中调节真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞的表型应答的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在另一个方面，本发明提供一种在需要的患者的创伤位点调节真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞的表型应答的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。在一个实施方案中，施用包括向创伤位点局部施用巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在另一个方面，本发明提供一种在需要的患者中促进创伤愈合的方法，包括给所述患者施用创伤愈合有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在一个进一步的方面，本发明提供一种在需要的患者中通过促进创伤愈合治疗创伤的方法，包括向局部施用创伤愈合有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药。

在一个实施方案中，创伤是皮肤创伤例如真皮或表皮创伤。

在一些实施方案中，该巨大戟二萜醇化合物选自巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和其药学可接受的盐和前药。

本发明所关注的化合物可以令人所期望地帮助恢复、产生或促进正常胶原蛋白结构，因此可以提供一种减小或使瘢痕最小或改善美容或功能性结果例如改善强度或弹性，或减少创伤发红、厚度、硬化或者色素沉着不足或过度的方法。这样，这些化合物可以提供改善或加快的速率来完成这一目的，特别是用于慢性创伤，其中可以“发动”炎症应答以促进愈合。

因此，在另一个方面，本发明提供一种在创伤中减小瘢痕或使瘢痕组织最小的或改善美容或功能性结果的方法，包括给需要的患者的创伤施用瘢痕减小或最小化量的或美容或功能改善量的巨大戟二萜醇当归酸酯化合物或其药学可接受的盐或前药。

附图简述

附图1图示的是，在使用0.01％，0.028％，0.05％PEP005后，与DMSO/异丙醇载体(对照)和未治疗的创伤对照组相比，在(A)第4周和(B)第12周在急性(外科)，大鼠完整厚度的切口创伤中获得的平均表面张力测定数据。N-NT＝PEP005-“空白”，未治疗的；N-V＝PEP005-“空白”，载体-治疗的；V＝PEP005-暴露的，载体-治疗的。

发明详述

在详细描述本发明前，应当理解，除非另有说明，本发明并不限于各组分的特定制剂、制备方法、给药方案等等，因为这些都可以不同。还应当理解的是，本文使用的术语仅仅是用于描述特定实施方案的目的，而不是意欲进行限制。

单数形式“一”、“一个”和“该”除非上下文另有清楚的说明，其包括复数方面。因此，例如当涉及“一种当归酰基-取代的巨大戟二萜”或“巨大戟二萜醇当归酸酯”时，如果适当，其包括单个化合物，以及两种或更多种化合物。

本文使用的“创伤”是指对组织结构的连续性或完整性的物理性破坏。“创伤愈合”是指恢复组织的完整性。应当理解的是，它可以是指组织完整性的部分或完全恢复。因此，治疗创伤是指促进、改善、发展、加速或以其他方式增进与创伤愈合过程有关的一个或多个阶段或过程。

创伤可以是急性或慢性的。慢性创伤包括褥疮、下肢静脉性溃疡和糖尿病足溃疡，可以简单地描述为难以愈合的溃疡。尽管并未完全知晓慢性创伤确切的分子病理学，一般公认是多因素的。由于在急性损伤期间居留和移动细胞的正常应答受损，这些创伤的特征在于炎症应答延长、创伤的细胞外基质(ECM)重塑缺陷和表皮细胞再生失败。

创伤可以是任何的内部创伤，例如皮肤的外部结构完整性得以保持的那些，例如擦伤或内溃疡，或外部创伤特别是皮肤创伤，因此，该组织可以是任何内部或外部的身体组织。在一个实施方案中，该组织是皮肤(例如人的皮肤)，即，创伤是皮肤创伤，例如真皮或表皮创伤。

人的皮肤有两个不同的层即表皮和真皮组成，它们下面是皮下组织。皮肤的主要功能是保护内脏器官和组织免于外部创伤和病原性感染、感觉和调节体温。

皮肤的最外层是表皮，约为0.04mm厚，没有血管，由4种细胞类型(角质形成细胞、黑素细胞、郎格尔汉细胞和梅克尔细胞)组成，叠成数个表皮细胞层。表皮的最内上皮层是基膜，它与真皮直接接触，并将表皮固定在真皮上。皮肤中发生的所有上皮细胞分裂都是在基膜上发生的。在细胞分裂后，上皮细胞迁移到表皮的外表面。在这种迁移期间，细胞所经历的过程称作角质化，由此失去了细胞核并且细胞转变为硬的、平坦的、有抵抗力的无活性细胞。当细胞到达最外层的表皮结构，即角质层(一个干燥、耐水的鳞状细胞层，有助于防止其下面的组织干燥)时，就完成了迁移。死亡的上皮细胞层不断地脱落并被从基膜移动到表面的角质化的细胞取代。由于表皮上皮没有血管，基膜依赖于真皮提供养分。

真皮是向表皮提供养分的高度血管化的组织层。此外，真皮包含神经末梢、淋巴系统、胶原蛋白和结缔组织。真皮约0.5mm厚，主要由成纤维细胞和巨噬细胞组成。这些细胞类型主要负责胶原蛋白的产生和维持，其中胶原蛋白是在所有动物结缔组织包括皮肤中发现的一种蛋白质。胶原蛋白主要负责皮肤的回弹、弹性。在富含胶原蛋白的真皮下发现的皮下组织提供了皮肤的可动性、绝缘性、热量贮存和血液流动到在它之上的组织中。

创伤可以分类为两种一般类型中的一种，即部分皮层创伤或全皮层创伤。部分皮层创伤局限于表皮和真皮浅表，没有损害真皮的血管。全皮层创伤涉及真皮的破坏，并延伸至较深的组织层，包括真皮血管的破坏。部分皮层创伤的愈合仅仅是通过上皮组织的简单再生而发生。在全皮层创伤中的创伤愈合更为复杂。本发明所关注的皮肤创伤可以是部分皮层或全皮层创伤。

本发明关注的创伤包括切口和裂伤、外科切口或伤口、刺伤、擦伤、抓伤、压伤、擦伤、摩擦伤(例如，尿布疹、摩擦性水疱)、褥疮(例如，压疮或褥疮)；热效应伤(冷和热源导致的烧伤，不管是直接还是通过传导，对流或辐射以及电源)、化学创伤(例如酸或碱烧伤)或病原性感染(例如病毒、细菌或真菌)包括开放或不完整的烫伤、皮肤斑疹、污点和痤疮、溃疡、慢性创伤(包括与糖尿病有关的创伤例如下肢或足溃疡、下肢静脉性溃疡和压疮)、皮肤接枝/移植供体和受体位点、免疫应答病症例如牛皮癣和湿疹、胃或肠溃疡、口腔创伤包括口腔溃疡、受损的软骨或骨、截肢术创伤和角膜损伤。

至于“巨大戟二萜醇”包括具有C3，C4，C5-三氧基反式二环[4.4.1]-十一烷的巨大戟二萜骨架的化合物。这些化合物被广泛地报道，并且在文献中是已知的，可以从植物例如大戟科的物种中分离出来以及化学合成(参见例如Winkler等人，2002和Tanino等人，2003)。这些化合物一般是在大戟科植物的提取物中发现的。因此，提取物可以包含从叶、主干、花、种子、树皮或树皮和主干之间渗出或存在于上述部位中的树液或液体或半固体物质。最优选地，提取物是来自树液。此外，提取物可以包含位于从大戟科植物的树液、树叶、主干、花、树皮或其他植物原料中提取的部分中的液体或半固体物质。例如，可以物理处理植物以破坏植物纤维和细胞外基质物和组织间和组织内物质提取到溶剂包括水性环境中。所有这些化合物的来源都包括在本发明内，包括通过化学合成途径获得的化合物。

此处涉及的大戟科的成员包括下列属的物种：铁苋属、Acidoton、Actinostemon、Adelia、Adenocline、Adenocrepis、Adenophaedra、Adisca、Agrostistachys、山麻杆属、Alchorneopsis、Alcinaeanthus、Alcoceria、油桐属、Amcmoa、雀儿舌头属、Angostyles、Anisophyllum、五月茶属、Aphora、银柴属、Aporosella、Argythamnia、Astrococcus、Astrogyne、Baccanrea、斑籽木属、Bernardia、Beyeriopsis、秋枫木属、留萼木属、Blumeodondron、Bonania、Bradleia、山漆茎属、Breyniopsis、土密树属、Buraeavia、Caperonia、Caryodendron、Celianella、Cephalocroton、口果粉衣属、刺果树属、地锦草属、Cheilosa、Chiropetalum、Choriophyllum、Cicca、假铁苋属、Cleidon、闭花木属、Cluytia、粗毛藤属、Cnidoscolus、Coccoceras、变叶木属、穴盘木属、Conami、Conceveiba、Conceveibastrum、Conceveibum、Corythea、Croizatia、巴豆属、Crotonopsis、Crozophora、Cubanthus、Cunuria、Dactylostemon、黄蓉花属、Dendrocousinsia、Diaspersus、Didymocistus、异萼木属、Discocarpus、Ditaxis、Dodecastingma、铁色属、Dysopsis、Elateriospermum、Endadenium、胚乳属、轴花属、红果属、Erythrochilus、Eumecanthus、大戟属、Euphorbiodendron、土沉香属、白饭树属、Galearia、Garcia、Gavarretia、白树属、Giara、Givotia、算盘子属、Glochidionopsis、Glycydendron、裸花属、Gymnosparia、Haematospermum、Hendecandra、橡胶树属、海厄属、Hieronyma、Hippocrepandra、澳杨属、Hymenocardia、Janipha、麻风树属、Julocroton、Lasiocroton、黄花木属、Leonardia、Lepidanthus、Leucocroton、Mabea、血桐属、锦葵属、木薯属、Mappa、Maprounea、蟲屎属、山靛属、Mettenia、微药属、Microdesmis、Microelus、Microstachy、Maocroton、翡翠塔属、Mozinna、澳杨属、圆叶血桐属、脐花属、白茶树属、Orbicularia、叶轮木属、Oxydectes、Palenga、全腺属、Paradrypeptes、Pausandra、红雀珊瑚属、Pera、多甲藻属、Petalostigma、叶下珠属、Picrodendro、Pierardia、Pilinophytum、Pimeleodendron、皮兰属、Platygyna、Plukenetia、Podocalyx、圣诞红属、Poraresia、内侧附肢属、Pseudanthus、铁线莲属、Quadrasia、Reverchonia、Richeria、龙胆木属、蓖麻属、Ricinocarpus、咖马粉属、蚂蝗属、Sanwithia、乌桕属、Savia、Sclerocroton、Sebastiana、一叶萩属、Senefeldera、Senefilderopsis、软珊瑚属、管海绵属、Spathiostemon、蜗牛属、乌桕属、宿萼木属、乳木属、四联球菌属、Tetraplandra、Tetrorchidium、Thyrsanthera、Tithymalus、Trageia、滑桃树属、三宝木属、Tyria和Xylophylla。

优选和特别适合实施本发明的属是大戟属。该属中特别有用的种类包括Euphorbiaaaron-rossii，Euphorbia abbreviata，Euphorbiaacuta，Euphorbia alatocaulis，Euphorbia albicaulis，Euphorbiaalgomargmata，Euphorbia aliceae，Euphorbia alta，Euphorbiaanacampseros，Euphorbia andromedae，Euphorbia angusta，Euphorbia anthonyi，Euphorbia antiguensis，Euphorbiaapocynifolia，Euphorbia arabica，Euphorbia ariensis，Euphorbiaarizonica，Euphorbia arkansana，Euphorbia arteagae，Euphorbiaarundelana，Euphorbia astroites，Euphorbia atrococca，Euphorbia baselicis，Euphorbia batabanensis，Euphorbiabergeri，Euphorbia bermudiana，Euphorbia bicolor，Euphorbiabiformis，Euphorbia bifurcata，Euphorbia bilobata，Euphorbiabiramensis，Euphorbia biuncialis，Euphorbia blepharostipula，Euphorbia blodgetti，Euphorbia boerhaavioides，Euphorbiaboliviano，Euphorbia bracei，Euphorbia brachiata，Euphorbiabrachycera，Euphorbia brandegee，Euphorbia brittonii，Euphorbia caesia，Euphorbia calcicola，Euphorbia campestris，Euphorbia candelabrum，Euphorbia capitellata，Euphorbiacarmenensis，Euphorbia carunculata，Euphorbia cayensis，Euphorbia celastroides，Euphorbia chalicophila，Euphorbiachamaerrhodos，Euphorbia chamaesula，Euphorbia chiapensis，Euphorbia chiogenoides，Euphorbia cinerascens，Euphorbiaclarionensis，Euphorbiacolimae，Euphorbia colorata，Euphorbiacommutata，Euphorbia consoquitlae，Euphorbia convolvuloides，Euphorbia corallifera，Euphorbia creberrima，Euphorbiacrenulata，Euphorbia cubensis，Euphorbia cuspidata，Euphorbiacymbiformis，Euphorbia darlingtonii，Euphorbia defoliata，Euphorbia degeneri，Euphorbia deltoidea，Euphorbia dentata，Euphorbia depress a Euphorbia dictyosperma，Euphorbiadictyosperma，Euphorbia dioeca，Euphorbia discoidalis，Euphorbia dorsiventralis，Euphorbia drumondii，Euphorbiaduclouxii，Euphorbia dussii，Euphorbia eanophylla，Euphorbiaeggersii，Euphorbia eglandulosa，Euphorbia elata，Euphorbiaenalla，Euphorbia eriogonoides，Euphorbia eriophylla，Euphorbia esculaeformis，Euphorbia espirituensis，乳浆大戟，Euphorbia excisa，Euphorbia exclusa，Euphorbia exstipitata，Euphorbia exstipulata，Euphorbia fendleri，Euphorbiafilicaulis，Euphorbia flliformis，Euphorbia florida，Euphorbiafruticulpsa，Euphorbia garber，Euphorbia gamnerii，Euphorbiagerardiana，Euphorbia geyeri，Euphorbia glyptosperma，Euphorbia gorgonis，Euphorbia gracilior，Euphorbia gracillima，Euphorbia gradyi，Euphorbia graminea，Euphorbia graminieaEuphorbia grisea，Euphorbia guadalajarana，Euphorbiaguanarensis，Euphorbia gymnadenia，Euphorbia haematantha，Euphorbia hedyotoides，Euphorbia heldrichii，Euphorbiahelenae，Euphorbia helleri，Euphorbia helwigii，Euphorbiahenricksonii，猩猩草，Euphorbia hexagona，Euphorbiahexagonoides，Euphorbia hinkleyorum，Euphorbia hintonii，Euphorbia hirtula，飞扬草，Euphorbia hooveri，Euphorbiahumistrata，Euphorbia hypericifolia，Euphorbia inundata，Euphorbia involuta，Euphorbia jaliscensis，Euphorbia jejuna，Euphorbia Johnston，Euphorbia juttae，Euphorbia knuthii，Euphorbia lasiocarpa，Euphorbia lata，Euphorbia latazi，Euphorbia latericolor，Euphorbia laxiflora Euphorbialecheoides，Euphorbia ledienii，Euphorbia leucophylla，Euphorbia lineata，Euphorbia linguiformis，Euphorbialongecornuta，Euphorbia longepetiolata，Euphorbialongeramosa，Euphorbia longinsulicola，Euphorbia longipila，Euphorbia lupulina，Euphorbia lurida，Euphorbia lycioides，Euphorbia macropodoides，macvaughiana，Euphorbia manca，Euphorbia mandoniana，Euphorbia mangleti，Euphorbia mango，Euphorbia marylandica，Euphorbia mayana，Euphorbiamelanadenia，Euphorbia melanocarpa，Euphorbia meridensis，Euphorbia mertonii，Euphorbia mexiae，Euphorbia microcephala，Euphorbia microclada，小叶大戟，Euphorbia misella，Euphorbiamissurica，Euphorbia montana，Euphorbia montereyana，Euphorbiamulticaulis，Euphorbia multiformis，Euphorbia multinodis，Euphorbia multiseta，Euphorbia muscicola，Euphorbianeomexicana，Euphorbia nephradenia，Euphorbia niqueroana，Euphorbia oaxacana，Euphorbia occidentalis，Euphorbiaodontodenia，Euphorbia olivacea，Euphorbia olowaluana，Euphorbia opthalmica，Euphorbia ovata，Euphorbia pachypoda，Euphorbia pachyrhiza，Euphorbia padifolia，Euphorbia palmeri，Euphorbia paludicola，Euphorbia parciflora，Euphorbiaparishii，Euphorbia parryi，Euphorbia paxiana，Euphorbiapediculifera，Euphorbia peplidion，Euphorbia peploides，孛艾大戟，Euphorbia pergamena，Euphorbia perlignea，Euphorbiapetaloidea，Euphorbia petaloidea，Euphorbia petrina，Euphorbiapicachensis，Euphorbia pilosula，Euphorbia pilulifera，Euphorbia pinariona，Euphorbia pinetorum，Euphorbiapionosperma，Euphorbia platysperma，Euphorbia plicata，Euphorbia poeppigii，Euphorbia poliosperma，Euphorbiapolycarpa，Euphorbia polycnemoides，Euphorbia polyphylla，Euphorbia portoricensis，Euphorbia portulacoides Euphorbiaportulana，Euphorbia preslii，铺地草，Euphorbia pteroneura，Euphorbia pycnanthema，Euphorbia ramosa，Euphorbia rapulum，Euphorbia remyi，Euphorbia retroscabra，Euphorbia revolula，Euphorbia rivularis，Euphorbia robusta，Euphorbia romosa，Euphorbia rubida，Euphorbia rubrosperma，Euphorbia rupicola，Euphorbia sanmartensis，Euphorbia saxatilis M.Bieb，Euphorbiaschizoloba，Euphorbia sclerocyathium，Euphorbia scopulorum，Euphorbia senilis，Euphorbia serpyllifolia，Euphorbia serrula，Euphorbia setiloba Engelm，Euphorbia sonorae，Euphorbiasoobyi，Euphorbia sparsiflora，Euphorbia sphaerosperma，Euphorbia syphilitica，Euphorbia spruceana，Euphorbiasubcoerulea，Euphorbia stellata，Euphorbia submammilaris，Euphorbia subpeltata，Euphorbia subpubens，Euphorbiasubreniforme，Euphorbia subtrifoliata，Euphorbia succedanea，Euphorbia tamaulipasana，Euphorbia telephioides，Euphorbiatenuissima，Euphorbia tetrapora，光棍树，Euphorbia tomentella，Euphorbia tomentosa，Euphorbia torralbasii，Euphorbiatovariensis，Euphorbia trachysperma，Euphorbia tricolor，Euphorbia troyana，Euphorbia tuerckheimii，Euphorbiaturczaninowii，Euphorbia umbellulata，Euphorbia undulata，Euphorbia vermiformis，Euphorbia versicolor，Euphorbiavillifera，Euphorbia violacea，Euphorbia whitei，Euphorbiaxanti Engelm，Euphorbia xylopoda Greenm.，Euphorbia yayalesiaUrb.，Euphorbia yungasensis，Euphorbia zeravschanica和Euphorbia zinniiflora。

特别优选的乳木属的物种包括格氏聚苞大戟和Synadeniumcompactum。

特别优选的翡翠木属的物种包括翡翠塔和紫纹龙。

优选的Endadenium属的物种是Endadenium gossweileni。

当用于提供大戟二萜醇当归酸酯的来源时，荸艾类大戟在本发明的实施中是特别有用的。本文涉及的“荸艾类大戟”或其缩写“E.peplus”包括该植物的各种品种、株、系、杂交物或衍生物，以及植物学或园艺学的相关物质。此外，使用整个大戟科植物或其部分包括树液或种子可以实施本发明或者可以使用其他再生的物质。一般地，当使用种子或再生物质时，首先需要让植物或苗繁殖。

本文涉及的大戟科植物、大戟类或E.peplus进一步包括遗传修饰的植物。遗传修饰的植物包括转基因植物或者除去特性或向下调节、突变或其他改变包括改变或诱导对特定基因显示调节作用的基因物质的内源基因序列的植物。因此，不以大戟科植物或大戟科或E.peplus物种天然存在的显示其特征的植物也包括在本发明中，并包括在上述术语的范围内。

在本发明的一个实施方案中，该巨大戟二萜醇化合物具有下式：

其中R¹-R³独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的链烯基、任选取代的炔基、任选取代的酰基、任选取代的芳烷基、S(O)₂R′、S(O)₂OR′、P(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、链烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖基；和R⁴选自氢、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的酰氧基、任选取代的芳基烷氧基、OS(O)₂R¹、OS(O)₂OR′、OP(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、链烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖氧基(glycoxy)。

在本发明的一个实施方案中，R¹-R⁴中的至少一个不是氢。在其一个优选的形式中，R¹不是氢。

在本发明一个特别的实施方案中，R¹是任选取代的酰基C(O)-R。在其进一步的实施方案中，R是任选取代的烷基、链烯基或炔基。在其一个更优选的实施方案中，R可以是直链或支链的，可以最多有6或最多有10个碳原子。在其一个实施方案中，R是支链的。

在本发明的某些实施方案中，R¹-R³中的一个是当归酰基，如下文所示，或R⁴是O-当归酰基。这些化合物在本文也称作巨大戟二萜醇当归酸酯。在本发明一个特别优选的实施方案中，R¹是当归酰基。

在本发明的某些实施方案中，R²和R³中的一个或两个是氢。R²和R³也可以形成亚甲二氧基或亚乙二氧基。

在本发明的某些实施方案中，R⁴是氢、羟基或酰氧基，例如乙酰氧基。

在本发明的某些实施方案中，在所述方法中使用的化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯，及其药学可接受的盐和前药。

R⁴＝OH，巨大戟二萜醇-3-当归酸酯

R⁴＝OAc，20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯

R⁴＝H，20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯

在本发明一个特别的实施方案中，该化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯(本文也称作“PEP005”)。本文所述的“巨大戟二萜醇-3-当归酸酯”或“PEP005”包括天然产生以及化学合成的形式。

可以施用合成化学领域已知烷基化、烯基化、炔基化、芳烷基化或酰基化而不含羟基的方法在巨大戟二萜醇化合物上进行烷基化、烯基化、炔基化、芳烷基化或酰基化(参见例如Greene和Wutz，1999；March，5^th Edition；Larock，1999；通过参考将其全部内容引入本文)。例如可以用烷基(或芳烷基)卤化物例如甲基碘(或苄基溴)或二烷基硫酸酯例如硫酸二甲酯或二乙酯将羟基烷基化(或芳烷基化)。可以通过用适当的羧酸、酰卤和酸酐在碱或偶合剂存在下处理来实现酰基化。可以通过化学方法实现糖苷的形成，例如将巨大戟二萜醇化合物与受保护的糖化合物反应，其中C-1已经通过用羟基或羧基偶合卤化而激活，糖的羟基已经通过保护基封闭。可替代地，可以使用适当的糖基转移酶例如UDP-半乳糖依赖性半乳糖基转移酶和UDP-葡萄糖依赖性糖基转移酶，通过酶方法实现糖苷的形成。优选的C-1连接的糖是呋喃糖或吡喃糖(糖)取代基，其与巨大戟二萜醇当归酸酯结构通过糖的C-1(常规编号)连接而形成乙酰键。示例性的糖基包括还原糖例如葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，它们都与巨大戟二萜醇化合物的氧原子相连接。

可以通过本领域已知的方法来制备硫酸、磺酸和磷酸基。R¹的例子包括氢、C_1-6烷基、苯基和苄基。

本文使用的术语“烷基”是直链、支链或环烷基，优选C_1-20烷基，例如C_1-10或C_1-6。直链和支链烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正-丁基、仲-丁基、叔丁基、正-戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2，2，-三甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、庚基、5-甲基己基、1-甲基己基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、4，4-二甲基戊基、1，2-二甲基戊基、1，3-二甲基戊基、1，4-二甲基-戊基、1，2，3-三甲基丁基、1，1，2-三甲基丁基、1，1，3-三甲基丁基、辛基、6-甲基庚基、1-甲基庚基、1，1，3，3-四甲基丁基、壬基，1-，2-，3-，4-，5-，6-或7-甲基-辛基、1-，2-，3-，4-或5-乙基庚基、1-，2-或3-丙基己基、癸基，1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-和8-甲基壬基、1-，2-，3-，4-，5-或6-乙基辛基、1-，2-，3-或4-丙基庚基、十一烷基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-或9-甲基癸基、1-，2-，3-，4-，5-，6-或7-乙基壬基、1-，2-，3-，4-或5-丙基辛基、1-，2-或3-丁基庚基、1-戊基己基、十二烷基，1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-或10-甲基十一烷基、1-，2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-乙基癸基、1-，2-，3-，4-，5-或6-丙基壬基、1-，2-，3-或4-丁基辛基、1-2-戊基庚基等等。环状烷基(也称作“环烷基”)的例子包含单-或多环烷基例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基，环癸基等等。当烷基一般是指“丙基”、“丁基”等等时，应当了解的是，如果适当，它是指任何的直链、支链和环的异构体。烷基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

本文使用的术语“链烯基”是包含至少一个碳碳双键的直链、支链或环烃残基，包括烯化的如上述定义的单-、二-或多-不饱和的烷基或环烷基，优选C_2-20链烯基(例如C_2-10或C_2-6)。链烯基的例子包括乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、环戊烯基、1-甲基-环戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、环己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、环辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1，3-丁二烯基、1-4-戊二烯基、1，3-环戊二烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，3-环己二烯基、1，4-环己二烯基、1，3-环庚二烯基、1，3，5-环庚三烯基和1，3，5，7-环辛四烯基。链烯基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

本文使用的术语“炔基”是包含至少一个碳碳叁键的直链、支链或环烃残基，包括炔化的如上述定义的单-、二-或多-不饱和的烷基或环烷基。除非碳原子数目确定，该术语优选是指C_2-20炔基(例如C_2-10或C_2-6)。例子包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基和丁炔基异构体和戊炔基异构体。炔基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

术语“芳基”是指芳香烃环系统的任何单、多核，共轭和稠合的残基。芳基的例子包括苯基、联苯基、三联苯基、四联苯基、萘基、四氢萘基、蒽基、二氢蒽基、苯并蒽基、二苯并蒽基、菲基、芴基、芘基、茚基、azulenyl、chrysenyl。优选的芳基包括苯基和萘基。芳基可以被如本文定义的一个或多个任选取代基任选取代。

术语“酰基”是指基团C(O)-R，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基、芳烷基或芳基残基。酰基的例子包括甲酰基、直链或支链的烷酰基(例如C_1-20)例如，乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-甲基丙酰基、戊酰基、2，2-二甲基丙酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基和二十烷酰基；环烷基羰基例如环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基和环己基羰基；直链或支链烯酰基(例如C_2-20)例如当归酰基；和芳酰基例如苯甲酰基、甲苯酰基和萘酰基。R残基可以如本文所述任选取代。

芳烷基是被如本文定义的芳基取代的如本文所定义的烷基。在一个实施方案中，烷基在末端被芳基取代。芳烷基的例子包括苯基C₁-C₂₀烷基例如苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、苯戊基和苯己基。烷基和芳基中的一个或全部可以独立地被本文定义的一个或多个任选的取代基任选取代。

烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基和所述酰基的任选取代基包括：卤素(氯、溴、碘和氟)、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、苯基、硝基、卤代甲基(例如三溴甲基、三氯甲基、三氟甲基)，卤代甲氧基(例如三氟甲氧基、三溴甲氧基)、C(O)C_1-6烷基、氨基(NH₂)、C_1-6烷基氨基(例如甲基氨基，乙基氨基和丙基氨基)、二C_1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基和二丙基氨基)、CO₂H、CO₂C_1-6烷基、硫代(SH)和C_1-6烷硫基。任选的取代基也包括CH₂基被羰基(C＝O)替代，或者可以是亚甲二氧基或亚乙二氧基。

应当认识到，在制备本发明关注的巨大戟二萜醇化合物的合成或半合成过程中，必需或需要保护其他可以反应或对所使用的反应或转化条件敏感的官能团。这些官能团的适当保护基是本领域已知的，可以根据标准的操作来使用。本文使用的术语“保护基”是指引入的官能团，它暂时使特定的官能团失去活性。这些保护剂和在适当的阶段引入并随后除去的方法是公知的(Greene和Wutz，1999)。

本发明也涉及巨大戟二萜醇化合物的前药。作为巨大戟二萜醇化合物的前药的任意化合物都在本发明的范围和精神内。术语“前药”以最广义使用，包括能够在体内通过酶或水解分裂转变为本发明的化合物的那些衍生物。这些衍生物是本领域技术人员容易发现的，包括例如游离的羟基转变为酯或酸酐的化合物。将本发明的化合物酰基化的方法，例如制备酯前药是本领域公知的，可以包括用适当的羧酸、酸酐或氯化物在适当的催化剂或碱存在下处理该化合物。其他选择和制备适当前药的常规方法是本领域已知的，并且在文献中进行了描述，例如WO 00/23419，Design of prodrugs，HansBundgaard，Ed.，Elsevier Science Publishers，1985，和TheOrganic Chemistry of Drug Desig and Drug Action，Chapter 8，pp352-401，Academic press，Inc.，1992，将其内容通过参考引入本文。

该化合物的适当的药学可接受的盐包括但不限于药学可接受的无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐，或者药学可接受的有机酸例如醋酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、延胡索酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、门冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸的盐。碱盐包括但不限于，与药学可接受的阳离子例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵形成的盐。用试剂例如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯例如硫酸二甲酯和二乙酯等等可以将包含氮的碱性基团变成四价。

本发明的化合物可以是游离化合物或溶剂化物(例如，在水中为水合物，或在常用有机溶剂例如醇中)的晶体形式，这些形式也意欲在本发明的范围内。溶剂化的方法是本领域内公知的。

在本发明的一个或多个实施方案中，巨大戟二萜醇化合物在创伤愈合中的应用可以有利地促进或改善一个或多个愈合阶段的速率、程度、范围或所花费的时间。巨大戟二萜醇化合物也可以用于从愈合的创伤中达到改善美容的结果，例如降低瘢痕的水平或程度、发红、皮肤印记或色素沉着(色素沉着不足或过度)，这些都不同形式地与创伤的愈合有关。在某些实施方案中，巨大戟二萜醇化合物可以用于预防意义，例如作为抗皱纹治疗。

根据本发明治疗的患者包括哺乳动物患者：人、灵长类、家畜(包括牛、马、羊、猪和山羊)，伴侣动物(包括狗、猫、兔、豚鼠)和俘获的野生动物。如果可以提供常规的试验系统，也可以关注实验室试验动物例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在本发明的某些实施方案中，也可以关注非哺乳动物类例如鸟、两栖动物和鱼。本发明的患者也可以是指个体、患者、动物或受者。

当用于细胞因子产生时，如果适当，本文使用的“调节”是指增加或减少细胞因子产生。在一个优选的实施方案中，这涉及增加、向上调节或增强细胞因子表达或产生。当用于真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞时，“调节”是指改变(如果适当，增加或减少)一种或多种表型应答例如细胞生存力和增殖、细胞基质粘附、ECM再生、MMP产生、成纤维细胞分化、细胞形态和细胞迁移。

调节有效量是当根据期望的给药方案使用或施用时的量，该量足以调节，优选向上调节细胞因子的产生至期望的水平。

创伤愈合、美容或功能性结果改善有效量的巨大戟二萜醇化合物是当根据期望的给药方案使用或施用时的量，该量足以引发、刺激、增强、增长、加速或以其他方式促进创伤愈合的一个或多个阶段或过程至期望的程度或达到期望的美容效果或功能性结果。治疗创伤是指实现引发、刺激、增强、增长、加速或促进创伤愈合的一个或多个阶段或过程以达到期望的结果。

主治医师可以确定适当的有效量(剂量)和给药方案，可以取决于特定的组织类型和要治疗的创伤，创伤的性质和严重度即是部分皮层还是全皮层，慢性或急性，以及患者的一般年龄和健康。在创伤愈合过程中，可以在认为适当的时间施用巨大戟二萜醇化合物。因此，可以在创伤发生后立即或稍后，和/或在创伤愈合过程的任意后续阶段施用巨大戟二萜醇化合物，以促进愈合和/或减少瘢痕和/或改善美容。也可以将化合物施用于已存在的瘢痕组织以使其最小或减小，特别是瘢痕、发红、厚度和/或色素沉着不足或过度。

可以以单一剂量或一系列的剂量来施用活性成分。尽管可以单独施用该活性成分，但是优选其以组合物存在，优选是与一种或多种药学可接受的佐剂的药物组合物。因此，本发明也涉及巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐或前药在制备调节细胞因子产生，调节真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞的表型应答，促进创伤愈合或者在创伤中减小或使瘢痕组织最小或改善美容或功能性结果的药物中的应用途。

创伤愈合的药物或组合物可以包含约0.0001％到高达100重量％的巨大戟二萜醇当归酸酯化合物。在优选的实施方案中，该组合物包含约0.0001％到高达10重量％的巨大戟二萜醇化合物，例如约0.0005，0.001，0.0025，0.005，0.01，0.025，0.05，0.075，0.1，0.125，0.15，0.2，0.25或0.5％到约0.5，1.0，2.5或5.0％。在本发明的一个实施方案中，巨大戟二萜醇化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯，存在量为约0.001到约1％。

该巨大戟二萜醇化合物可以以任何适当的形式施用：局部施用，例如局部敷用于创伤或注射到创伤处，或系统施用，例如口服、胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和真皮内)、鼻、吸入、直肠或阴道施用。

在本发明的一个优选的实施方案中，巨大戟二萜醇化合物施用，即局部应用于创伤位点，以及任选创伤位点周围。该巨大戟二萜醇化合物可以以任何适当的形式局部使用，包括溶液、乳剂(水包油，油包水，气雾剂或泡沫剂)、软膏、糊剂、洗剂、粉末、凝胶、水凝胶、水胶体和乳膏。适当的载体或添加剂包括矿物油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、cetearyl醇、2-辛基十二烷醇、环糊精、异丙基醇、乙醇、苯甲醇和水。可替代地，巨大戟二萜醇化合物可以以活性封闭辅料的形式存在，即巨大戟二萜醇化合物浸入或包封在辅料例如绷带、纱布、带、网、橡皮膏、薄膜、膜或贴剂。

在本发明的一个实施方案中，巨大戟二萜醇化合物以基于异丙醇的凝胶形式局部使用。

本文关注的组合物和辅料的组成是本领域技术人员公知的，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18^th Edition，MackPublishing，1990。组合物可以包含任何适当的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有常用的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、包衣剂、抗真菌和抗菌剂、真皮渗透剂、表面活性剂、等张剂和吸收剂等等。在与组合物的其他成分相容的意义上，本发明关注的组合物的载体必须是药学可接受的并对患者无害。该组合物可以方便地以单元剂型的形式存在，可以通过制药领域公知的任意方法来制备。这些方法包括将活性成分与载体相混合的步骤，其中载体是由一种或多种助剂组成的。一般地，制备该组合物，包括将活性成分与液体载体、或精细分离的固体载体或两者均匀和直接地混合，然后如果必要使产物成型。

应当理解的是，本发明也可以与其他补充性生物学或生理学活性剂结合使用。因此，本文所述的方法和组合物可以与其他生物学或生理学活性剂例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、维生素例如A，C，D和E及它们的酯，和/或其他创伤愈合剂，包括生长因子和细胞因子例如本文所述的那些结合使用。这些其他的试剂可以与巨大戟二萜醇化合物一起配制成组合物或敷料或单独施用。

该巨大戟二萜醇化合物也可以以植入物的形式存在，其包含包被、沉浸或以其他方式携带巨大戟二萜醇化合物的生物相容性聚合物。

该巨大戟二萜醇化合物可以以持续(即控释)或缓释的形式施用。持续释放制剂是其中施用后活性成分在患者体内缓慢释放并在最小的时间里维持所需的药物浓度的制剂。持续释放制剂的制备是本领域技术人员公知的。

适合口服的本发明的组合物可以是以每个都包含预定量的活性成分的分离单元例如胶囊、囊剂或片剂；作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液或混悬液(例如漱口液)；凝胶、软膏或水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂的形式存在。

可以通过任选与一种或多种助剂压片或成模来制备片剂。可以通过在适当的机器中压制自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分来制备压制片，任选与粘合剂(例如惰性稀释剂)、防腐崩解剂(淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在适当的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物成型来制备模印片。任选可以将片剂包衣或刻痕，可以通过配制来缓释或控释活性成分，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素来产生所需的释放性质。片剂任选可以具有肠溶衣，以在肠部分而不是胃中释放。

直肠施用的组合物可以作为栓剂存在，其包含适当的基质，例如可可脂、甘油、明胶或聚乙二醇。

适合阴道施用的组合物可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式存在，除了活性成分外，它们还包含本领域已知的适当的载体。

适合胃肠外施用的组合物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与所预期的受者的血液等张的溶质；和水性和非水性无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和管中，可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体例如注射用水。可以由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备临时的注射溶液和混悬液。

优选的单位剂量的组合物是包含如上所述的活性成分每日剂量或单元、每日亚-剂量，或其适当部分的那些。

应当理解的是，除了上述特别涉及的活性成分以外，本发明的组合物可以包含本领域常用的所讨论的组合物类型的其他试剂，例如粘合剂、甜味剂、增稠剂、芳香剂、崩解剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或延时剂。

本发明的化合物也可以在兽医学组合物中使用而存在。这些组合物可以通过本领域已知的任何适当的方法来制备。这些组合物的例子包括适合下列的那些：

(a)口服、外用(例如，灌服包括水性和非水性溶液或混悬液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒、与饲料混合的丸剂、用于舌的糊剂；

(b)胃肠外施用，例如作为无菌溶液或混悬液用于皮下、肌内或静脉内注射；

(c)局部施用，例如如上所述的乳膏、软膏、凝胶、洗剂等等。

现在参考下列的实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅仅是用于解释说明某些实施方案的目的，而不是意欲限制如上文所述的本发明的普遍性。

实施例

实施例1：PEP005对细胞因子产生的作用

实施例1.1

通过PEP005-治疗的人细胞的细胞因子产生

在没有或存在PEP005(1-100ng/ml)的条件下，将Me 10538细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和嗜中性粒细胞的汇合培养物培养6小时。收集上清液并分析下列细胞因子的存在；使用多重检测试剂盒(Biosource International，Nivelles，Belgium)分析TNF-α、IL-6和IL-8。结果在表1中列出。所检测的蛋白质的单位是pg/ml。

实施例1.2

将包含0.05％PEP005或安慰剂凝胶的异丙醇凝胶局部应用于光化性角化病损伤的患者。在使用该凝胶(活性剂或安慰剂)前和三个月后，临床评估患者的皮肤纹理。在使用该凝胶(活性剂或安慰剂)三个月后，临床评估患者的皮肤斑纹、皮肤色素沉着过度和皮肤色素沉着不足。结果列于表1.2和1.3中，它们表明了显示皮肤纹理改善、恶化或未改变或者存在或不存在皮肤斑纹、色素沉着过度和色素沉着不足的患者的数目或百分比。该数据表明，使用0.05％PEP005凝胶(与安慰剂相比)改善了皮肤纹理。该数据也表明，在使用药物3个月后，使用0.05％PEP005凝胶(与安慰剂相比)降低了具有斑纹的患者的数目。此外，数据表明，在使用药物3个月后，使用0.05％PEP005凝胶(与安慰剂相比)不会导致皮肤色素沉着过度或不足。

实施例1.3

材料和方法

化合物

PEP005是以干燥粉末提供的。在DMSO中制备23.55mM的母液，将等分部分在-20℃下贮存。在使用日将母液的等分部分融化，并在给药前和期间在室温下贮存。使用DMEM细胞培养基进行中间稀释步骤。

PBMC的分离

为了分离PBMC，使用新抽取的人血，同并用Li-肝素作为抗凝血剂进行处理。用3倍体积的CliniMACS PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi，Bergisch Gladbach)稀释细胞，小心地分层到圆锥试管的FicollPaque(Amersham Biosciences，Freiburg)上，并在20℃下在没有制动器的浮桶式转头中以400xg离心40分钟。吸出上层，剩下稳定在分裂周期的单核细胞层。将分裂间期的细胞(淋巴细胞、单核细胞和血小板)小心地转移到新的圆锥试管中。用CliniMACSPBS/EDTA缓冲液填充该圆锥试管，并在20℃下以300xg离心10分钟。完全除去上清液。为了除去血小板，将细胞沉淀物再悬浮于50ml的缓冲液中，在20℃下以200xg离心10分钟。完全除去上清液，并重复最后的洗涤步骤。将细胞再悬浮于DMEM培养基(Invitrogen，Karlsruhe)中，并在Neubauer-血细胞计数器中计数。

PBMC的刺激

为了刺激PBMC，将每孔250.000个细胞植入到96孔板中。用三种不同浓度(1，10和100nM)的PEP005或LPS 1μg/ml(Linaris，Wertheim-Bettingen)，PMA 10ng/ml(Sigma，Deisenhofen)和伊屋诺霉素1μg/ml(Sigma，Deisenhofen)分别刺激三个不同健康供体的PBMC。将细胞在37℃和5％CO₂的潮湿大气下培养24小时。

珠悬浮测定

在典型的珠悬浮试验中，用与珠结合的抗体从上清液中俘获细胞因子。用第二抗体定量该细胞因子以完成夹心免疫测定。在每种细胞因子的标准曲线的帮助下计算细胞因子的浓度。

根据制造商的说明使用BioRad BioPlex System在PBMC的上清液中定量测定细胞因子IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8和TNF-α。所有的样品都进行一式两份的测定。所检测的所有蛋白质的单位是pg/ml。

PBMC的生存力的鉴定

在除去包含细胞因子的上清液后，通过流式细胞仪测定PBMC的生存力。使用碘化丙啶染色溶液(0.1μg/1x10⁶个细胞的试验)确定死亡细胞的数量。使用未刺激的PBMC作为阴性对照。

结果

细胞因子产生

为了研究PEP005的免疫刺激作用，将来自三个不同健康受体的PBMCs暴露于浓度为1，10和100nM的PEP005中24小时。使用珠悬浮测定，通过流式细胞仪定量测定分泌到上清液中的IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8和TNF-α。结果如表1.4-1.8所示。

表1.4.在浓度为1，10和100nM的PEP005中培养24小时后来自供体GK，AW和HL的PBMCs的IL-1β产生。所检测的IL-1β的单位是pg/ml。

	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)
	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)	供体：GK	0	94.49	61.62	0
供体：AW	0	314.73	173.33	10.92	供体：GK	0	94.49	61.62	0
供体：AW	0	314.73	173.33	10.92	供体：HL	0	125.17	98.04	11.76

表1.5.在浓度为1，10和100nM的PEP005B中培养24小时后来自供体GK，AW和HL的PBMCs的IL-2产生。所检测的IL-2的单位是pg/ml。

	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)
	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)	供体：GK	0	82.68	60.3	10.56
供体：AW	0	54.61	31.53	2	供体：GK	0	82.68	60.3	10.56
供体：AW	0	54.61	31.53	2	供体：HL	0	17.86	19.47	12.84

在1nM PEP005中，观测到来自三个受体的PBMCs的上清液中IL-2水平提高了约20到80倍(平均：约50倍)。

表1.6.在浓度为1，10和100nM的PEP005B中培养24小时后来自供体GK，AW和HL的PBMCs的IL-6产生。所检测的IL-6的单位是pg/ml。

	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)
	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)	供体：GK	68.69	320.61	216.09	0
供体：AW	30.71	131.46	61.66	0	供体：GK	68.69	320.61	216.09	0
供体：AW	30.71	131.46	61.66	0	供体：HL	11.88	69.48	73.97	95.43

1nM的PEP005导致PBMC上清液中IL-6的水平提高了约4到6倍(在PBMC上清液中IL-6的水平提高了几乎9倍)。

表1.7.在浓度为1，10和100nM的PEP005中培养24小时后来自供体GK，AW和HL的PBMCs导致的IL-8产生。所检测的IL-8的单位是pg/ml。

	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)
	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)	供体：GK	4834.48	13652.6	9418.94	52.77
供体：AW	7642.56	28029.68	11438.34	205.36	供体：GK	4834.48	13652.6	9418.94	52.77
供体：AW	7642.56	28029.68	11438.34	205.36	供体：HL	2535.39	12148.42	18220.74	217.52

在暴露于1nM的PEP005后，PBMCs的上清液中IL-8的水平提高了3到5倍。很多不同的细胞(例如单核细胞/巨噬细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、角质形成细胞、肝细胞、星形胶质细胞和软骨细胞)能够产生IL-8。

表1.8.在用浓度为1，10和100nM的PEP005培养24小时后来自供体GK，AW和HL的PBMCs导致的TNF-α产生。

	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)
	载体对照	PEP005(1nM)	PEP005(10nM)	PEP005(100nM)	供体：GK	0	148.42	76.14	19.44
供体：AW	0	130.99	73.48	12.93	供体：GK	0	148.42	76.14	19.44
供体：AW	0	130.99	73.48	12.93	供体：HL	0	90.72	71.6	35.75

在用PEP005培养后，在来自所有三种供体的PBMCs的上清液中检测到高水平的细胞因子TNF-α。TNF-α水平的范围是约120nM(用1nM的PEP005刺激)到70nM(10nM的PEP005)到20nM(100nM的PEP005)。在仅暴露于载体的PBMCs的上清液中没有检测到显著的TNF-α水平。

实施例2：PEP005对于调节真皮成纤维细胞和角质形成细胞的表型和创伤愈合应答的作用

材料和方法

真皮成纤维细胞培养

从在Oral Surgery Clinic，School of Dentistry，Wales Collegeof Medicine，Cardiff中护理的、征得同意的个体中获得正常的成年人皮肤活检(6mm)(n＝1)。在使用局部麻醉后，收集真皮活检，在将样品酶降解后，通过单个细胞悬浮技术建立成年人真皮成纤维细胞培养物。以前已经使用该技术可靠地建立体外口腔和真皮成纤维细胞的能存活的原代培养物(Cook等人，2000；Stephens等人，2001；2003)。在包含成纤维细胞-血清的培养基中培养真皮成纤维细胞，该培养基包含达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，补充有L-谷酰胺(2mM)，抗生素(100U/ml青霉素G钠，100mg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)和10％胎牛血清(都购自Invitrogen Ltd.，Paisley，U.K.)。将该真皮成纤维细胞培养物保持在37℃和5％CO₂/95％空气的大气下，每2-3天更换培养基。在所有实验中，使用7-17代的真皮成纤维细胞。

角质形成细胞培养

冷冻保存的成年人的表皮角质形成细胞购自Cascade BiologiesInc.，Nottinghamshire，U.K。测定这些细胞(≥500,000存活细胞/瓶)，其中＞70％存活，增殖的能力是至少16倍的群体倍增。将该表皮角质形成细胞在不含血清的EpiLife培养基(Cascade BiologiesInc.)中培养，该培养基补充有抗生素(100U/ml青霉素G钠，100mg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)和EpiLife

DefinedGrowth Supplement(EDGS，包含纯化的牛血清白蛋白，纯化的牛transferring，氢化可的松、重组人胰岛素样生长因子1型，前列腺素E2和重组人表皮生长因子，Cascade Biologies Inc.)。将该表皮角质形成细胞培养物保持在37℃和5％CO₂/95％空气的大气下，每2-3天更换培养基。在所有实验中，使用4-6代的表皮角质形成细胞。

PEP005的制备

PEP005是由Peplin Limited，Brisbane，Australia以20mg的批次提供的，将其在4℃下贮存。当需要时，将PEP005以10mg/ml的浓度溶解于二甲亚砜(DMSO，＞99.9％，Sigma Chemical Co.，Dorset，U.K.)中。将溶液搅拌5分钟，或直至溶液变澄清，将PEP005/DMSO母液在4℃下贮存，它在数月内都是稳定的。

在使用前，将PEP005/DMSO母液从4℃贮存中移出，并加热至室温。将所需体积的PEP005/DMSO等分到聚丙烯管中，并在包含成纤维细胞-血清的培养基(用于真皮成纤维细胞培养基)或不含血清的EpiLife培养基(用于表皮角质形成细胞培养物)中将PEP005/DMSO稀释成需要的浓度(典型地为0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml)，由于溶液的稳定性，每天制备上述不同浓度的新鲜PEP005/培养基溶液。在清除PEP005/培养基溶液前，将至少2倍体积的0.1％氢氧化钠(Sigma Chemical Co.)的95％乙醇/5％甲醇(都来自Fisher Scientific，Leicestershire，U.K.)溶液加入到每个溶液中以进行净化。

真皮成纤维细胞/角质形成细胞存活力和增殖的评估

根据Cook等人(2000)，使用MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物]染料-还原测定来评估真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的存活力和增殖。在胰酶消化后，将真皮成纤维细胞或表皮角质形成细胞分别以2.5x10³个细胞/孔和5x10³个细胞/孔的细胞密度植入到96-孔微量滴定板(VWR InternationalLtd.，Leicestershire，U.K.)中。分别在植入细胞24小时和48小时后，用包含0，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005(PEP005的每种浓度6个培养孔)的培养基(100μl/孔)替换真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基。将真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基分别维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气下7和3天，每两天更换分别包含PEP005的培养基介质。在每个时间点也确定96-孔微量滴定板中的各种对照物(每种对照6个培养孔)，包括(i)只含真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基(没有细胞)，(ii)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含1％DMSO的培养基中，(iii)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含0.1％DMSO的培养基中，(iv)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含0.01％DMSO的培养基中，和(v)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含0.001％DMSO的培养基中。

在第1，3，5和7天，将无菌MTT(25μl的5mg/ml MTT的PBS溶液，Sigma Chemical Co.)加入到每个孔的相应培养基中，将该96-孔微量滴定板维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气下4小时。将由10％十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma Chemical Co.)的0.5M N，N-二甲基酰胺(Sigma Chemical Co.)溶液组成的萃取缓冲液(100μl)加入到每个孔中，并将该96-孔微量滴定板维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气下4小时。通过Bio-Tek Instruments MicroplateAutoreader EL311(Fisher Scientific)在540nm处通过分光光度读取每个孔的吸收值。每种试验在三种不同的情况中进行。

真皮成纤维细胞/角质形成细胞的细胞外基质粘附的评估

根据Cook等人(2000)和Stephens等人(2004)进行真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞与I型胶原蛋白和纤连蛋白的粘附。将96-孔微量滴定板的孔在4℃下用40μg/ml大鼠尾部腱的I型胶原蛋白(Sigma Chemical Co.)或40μg/ml血浆纤连蛋白(SigmaChemical Co.)培养过夜。通过在4℃下用1％牛血清白蛋白(SigmaChemical Co.)培养4小时来阻断非特异性结合。在胰酶消化后，将包含0，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005(每种PEP005浓度6个培养孔)的无血清培养基中的真皮成纤维细胞或表皮角质形成细胞的细胞混悬液(100μl)都植入到96-孔微量滴定板的孔中，细胞密度为2.5x10⁴个细胞/孔。将该96-孔微量滴定板维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气中1小时或3小时，然后通过抽吸除去未粘附的细胞。用PBS(100μl)洗涤(x2)剩余的粘附的真皮成纤维细胞或表皮角质形成细胞，在70％乙醇(100μl，Fisher Scientific)中固定15分钟，并用0.1％结晶紫溶液(SigmaChemical Co.)染色25分钟。在双蒸水中洗涤(×5)除去过量的结晶紫，剩余的染料溶解在0.2％Triton X-100溶液(25μl，SigmaChemical Co.)中。在每个时间点，也在96-孔微量滴定板中确定不同的对照物(每种对照6个培养孔)，包括(i)单用真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基(无细胞)，在I型胶原蛋白或纤连蛋白存在下，(ii)单用真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基(无细胞)，在牛血清白蛋白存在下，(iii)单用真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞培养基(无细胞)，在I型胶原蛋白/牛血清白蛋白或纤连蛋白/牛血清白蛋白存在下，(iv)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在培养基中，在牛血清白蛋白存在下，(v)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含1％DMSO的培养基中，存在和不存在I型胶原蛋白或纤连蛋白，和(vi)真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞在包含0.1％DMSO的培养基中，存在和不存在I型胶原蛋白或纤连蛋白。通过Bio-Tek Instruments Microplate Autoreader EL311在540nm处通过分光光度读取每个孔的吸收值。每种试验在三种独立的情况中进行，所得到的吸收值用每组样品的平均值表示。

真皮成纤维细胞的细胞外基质再生和基质金属蛋白酶产生的评估

根据Cook等人(2000)，通过成纤维细胞聚集的胶原蛋白晶格(FPCLs)检查在PEP005存在下真皮成纤维细胞重塑/重组它们的ECM环境的能力。在胰酶消化后，将真皮成纤维细胞悬浮在包含成纤维细胞-血清的培养基中，以除去内源性MMP-2和MMP-9的活性，其中该培养基包含10％无明胶酶的胎牛血清(用gelatin-A Sepharose柱制备，GE Healthcare Ltd.，Buckinghamshire，U.K.)。将真皮成纤维细胞(5x10⁵个细胞/750μl无明胶酶的成纤维细胞-血清的培养基)加入到53mm细菌级培养皿(VWR International Ltd.)中，该培养皿包含3ml 2x DMEM，无明胶酶的胎牛血清(750μl)，0.1M氢氧化钠(750μl)，1.7mg/ml大鼠尾部腱I型胶原蛋白(2250μl，根据Rowling等人，1990制备)和PEP005(0，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005)，总体积为7.5ml(3FPCLs/PEP005浓度)。同时确定各种对照物(3FPCLs/对照物)，包括(i)单用包含成纤维细胞-血清的培养基(无细胞)，和(ii)细胞在包含1％DMSO和成纤维细胞-血清的培养基中。将FPCLs维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气中1小时，以发生胶原蛋白聚合，从板的边缘分离FPCLs并再悬浮于2ml不含PEP005、包含成纤维细胞-血清和10％无明胶酶的胎牛血清的培养基。将FPCLs维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气中14天，每天更换培养基。在第1，2，3，4，5，6，7，10和14天，在初始配制后，在三个重复样品上各进行三个不同的晶格直径测定以定量ECM重组/晶格收缩的程度。在0，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005存在下，从各种个体FPCL中收集晶格周围的FPCL条件培养基，以分析在这些时间点的MMP产生和活性。

为了确定在FPCL系统中细胞产生的前-和活性MMP物质的相对量，根据Cook等人(2000)，使用明胶酶谱法。在掺入到Mini-Protean3凝胶电泳系统(Bio-Rad Laboratories Ltd.)的预凝块10％明胶酶谱凝胶(现成的凝胶，10％明胶酶谱凝胶，Bio-Rad LaboratoriesLtd.，Hertfordshire，U.K.)上，在15mA下将等体积(15μl)的FPCL条件培养基进行4-5小时的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。在室温下通过在2.5％Triton X-100溶液(SigmaChemical Co.)中浸渍1小时从凝胶中除去SDS。通过37℃下在25mMTris-HCl缓冲液，pH 7.6中培养过夜来激活MMPs，其中该缓冲液包含5mM氯化钙(Sigma Chemical Co.)，25mM氯化钠(FisherScientific)和5％Brij35(Sigma Chemical Co.)。用考马斯蓝(0.05％考马斯蓝，Sigma Chemical Co.，在12％乙酸和54％甲醇中，都来自Fisher Scientific)将凝胶染色，在7.5％乙酸和5％甲醇中去色，用GS-690 Imaging Densitometer和Image Analysis Software(Bio-Rad Laboratories Ltd.)捕捉凝胶像。通过在与MMP-2标准品相当的分子量时出现的清晰带来证明MMP的同一性(Cook等人，2000)。

每种试验在两种独立的情况中进行，所获得的晶格收缩和MMP密度计值降低的％用每组样品的平均值表示。

真皮成纤维细胞分化的评估

通过在用TGF-β刺激后，分化的真皮成纤维细胞的α-平滑肌肌动蛋白表达的程度检验PEP005对于真皮成纤维细胞分化为成肌纤维细胞的作用。在胰酶消化后，将真皮成纤维细胞悬浮于包含10％胎牛血清、成纤维细胞-血清的培养基，细胞密度为2.5x10⁴个细胞/ml。将真皮成纤维细胞悬浮液的等分(250μl/孔)植入到8-孔室型载玻片(VWR International Ltd.)中，并维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气中，直至约30-40％汇合。在该阶段，用包含10ng/ml TGF-β1和0，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml或100μg/ml PEP005(每种PEP005浓度3个室型载玻片孔)的培养基(250μl/孔)取代该包含成纤维细胞-血清的培养基。同时确定各种对照物(每种对照物3个室型载玻片)，包括(i)单用包含成纤维细胞-血清的培养基，(ii)细胞在包含成纤维细胞-血清的培养基(细胞角蛋白或波形蛋白1°Ab对照物)中，(iii)细胞在包含10ng/ml TGF-β和1％DMSO以及含成纤维细胞-血清的培养基中，和(iv)细胞在包含1％DMSO和含成纤维细胞-血清的培养基中。

将室型载玻片维持在37℃和5％CO₂/95％空气大气中3天，结束时，细胞已经达到约75％的汇合。将室型载玻片固定在1∶1冰冷丙酮∶甲醇(300μl/孔)中20分钟，并在4℃下，在1％BSA的PBS溶液中阻断1小时。将室型载玻片在0.1％BSA的PBS溶液中洗涤(x2)，并用下列一抗中的一种培养：(i)单克隆的小鼠抗-人α-平滑肌肌动蛋白一抗(1∶30，在洗涤缓冲液中，250μl/孔，SigmaChemical Co.)，(ii)单克隆的小鼠抗-人细胞角蛋白IgG1一抗(1∶30，在洗涤缓冲液中，250μl/孔，DakoCytomation Ltd.，Cambridgeshire，U.K.)，或(iii)单克隆的小鼠抗-人波形蛋白IgG1一抗(1∶30，在洗涤缓冲液中，250μl/孔，DakoCytomation Ltd.)。在室温下将室型载玻片在一抗中培养2小时，在1％BSA的PBS溶液中洗涤(x3)，并在室温下用多克隆的兔抗-小鼠IgG′s，与FITCs结合的二抗(1∶50，在洗涤缓冲液中，250μl/孔，DakoCytomationLtd.)避光培养1小时。将室型载玻片用0.1％BSA的PBS溶液洗涤(x3)用Vectashield

封固介质(Vector Laboratories Ltd.，Cambridgeshire，U.K.)封固从载玻片中移出的室，并通过荧光显微镜(Leica Leitz Dialux 20EB fluorescent microscope，LeicaMicrosystems U.K.Ltd.，Buckinghamshire，U.K.)观察，以x250的放大率捕捉数字图像。每种试验在两种不同的情况中进行。

结果

真皮成纤维细胞/角质形成细胞生存力和增殖的评估

从真皮成纤维细胞无能/增殖获得的平均值表明，与未治疗的成纤维细胞对照物相比，浓度为100μg/ml的PEP005对真皮成纤维细胞/角质形成细胞显示了细胞毒性作用。

但是，当浓度为10μg/ml时，PEP005在第1，3和5天显示具有刺激作用。此外，到第7天，0.01μg/ml和0.1μg/ml的浓度显示了刺激细胞存活/增殖的作用。

真皮成纤维细胞/角质形成细胞的细胞外基质粘附的评估

表皮角质形成细胞与I型胶原蛋白和血浆纤连蛋白的粘附表明，浓度为0.01-10μg/ml的PEP005对I型胶原蛋白显示了显著的剂量依赖性的细胞粘附刺激。在1-10μg/ml的浓度下，也显示了能够刺激表皮角质形成细胞与血浆纤连蛋白粘附的类似趋势。

真皮成纤维细胞的细胞外基质重组和基质金属蛋白酶产生的评估

在0.1μg/ml的PEP005中，I型胶原蛋白晶格收缩明显增强。在浓度为0.01-0.1μg/ml的PEP005中，观测到前-和活性MMP-2水平提高。

真皮成纤维细胞分化的评估

当不存在TGF-β1，但存在1μg/ml和10μg/ml PEP005时，真皮成纤维细胞显示了可检测的α-平滑肌肌动蛋白微丝。

实施例3：PEP005对创伤愈合参数的影响的评估

材料和方法

PEP005的制备

PEP005是由Peplin Limited，Brisbane，Australia以基于DMSO/异丙醇-凝胶的0.01％(100μg/ml)，0.028％(280μg/ml)和0.05％(500μg/ml)制剂的形式提供的。也提供不含PEP005、基于DMSO/异丙醇的载体凝胶作为载体对照。将PEP005和载体凝胶在4℃下贮存，它在数月内都是稳定的。

大鼠切口创伤愈合模型

为了检验PEP005对于急性(外科)切口创伤的恢复，包括最低限度的新组织产生的作用，使用大鼠全层切口创伤愈合模型。

动物饲养

在该研究中，使用成年的雄性Sprague Dawley大鼠(Harlan U.K.Ltd.，Oxfordshire，U.K.)，约8-10周大，体重在250-300g之间。根据Home Office规则，开始时，将动物以每笼(笼子大小为40x25x20cm，有锯屑床，每周更换2次)最多4只分组圈养，维持在23℃的环境温度、12小时亮/暗循环的环境中。自由给动物提供食物(标准啮齿动物食物)和水。为了使动物适应周围的环境，在实验前，将动物最少圈养1周，除了清洁床上物品和补充食物和水以外不要干扰它们。在创伤后，动物在个体圈养条件下监测，直至从此过程完全恢复。然后动物维持个体圈养2周时间(即，直至它们的创伤完全重新上皮形成)。在此最初的2周时间之后，在研究的剩余时间里维持动物为每组最多4只。以U.K.Home Office Licences(PPL：40/2650；PIL：70/4934和PIL：60/7661)的Home Officelicensed establishment进行所有的动物程序。

全层切口创伤的产生

预计前述的抗瘢痕研究(研究细胞因子抑制剂和细胞因子的中和抗体)使用单个动物的多个(切口)创伤，每个创伤接受不同的治疗。由于其过去的使用和接受度，选择多-切口创伤作为所选择的模型来评价PEP005对于全层切口创伤愈合的作用，在动物中反复进行治疗，以考虑啮齿动物中已知的caudo-cranial差异。

用氟烷和空气的吸入剂麻醉动物，并将每只大鼠的背面剃毛并用杀菌剂葡糖酸氯己定(0.05％水溶液)洗涤。在每只动物的背部产生4个全层切口创伤(1cm深，包括肉膜和皮下组织)。创伤保持不缝合(允许裂口)，以在创伤中形成肉芽组织。在创伤(第0天)后，在每个创伤上使用四种PEP005浓度(无PEP005，DMSO/异丙醇凝胶载体，0.01％，0.028％或0.05％PEP005)中的一种，同时不治疗的创伤对照保持不治疗状态。根据表2.1，在每个实验/收集期中维持每个动物组。

表2.1.4周和12周确定的实验组(用于创伤抗拉强度分析和瘢痕组织质量评估)。

将PEP005和载体用于切口创伤位点

在损伤后，立即使用体积为10μl/100mm²(分别为1μg/10μl，2.8μg/10μl和5μg/10μl PEP005)的0.01％，0.028％PEP005或DMSO/异丙醇载体凝胶治疗每个创伤周围的边缘皮肤，总面积为600mm²的边缘皮肤接受治疗。用阳性置换吸量管来使用该凝胶，用无菌刮铲使其均匀地涂敷到治疗区域，小心操作，不要直接把药物引入到创伤中。在使用后，将该凝胶干燥10分钟。为了防止动物受到它们创伤的干扰，使用干燥的无菌纱布(Release

，Johnson& Johnson Wound Management Ltd.，North Yorkshire，U.K.)包住伤口，用Millipore^TM带(3M UK pic，Berkshire，U.K.)固定。也可以给每个动物装配Elizabethan Collar，以防止辅料移动。在创伤后，将辅料保留在原处3天。将大鼠在它们各自的实验组中维持1，4和12周，当使每组的动物安乐死后，根据表2.1在所有评估点检测创伤的情况和创伤周围的组织(包括存活力、红斑、水肿等等)。在研究过程中也将动物称重，以确定暴露在PEP005中是否对于实验动物的一般健康/情况有任何的不利效果。

安乐死、组织/样品收集和处理

收集(第4和12周)

切离创伤组织和正常的边缘皮肤，用成对的刀片工具从每个创伤中切除混入到创伤/瘢痕中的一个3mm小条。然后在张力测量前，在4℃下将组织带贮存在盐水湿润的外科纱布(Topper^TM，Johnson &Johnson Wound Management)中。将剩余的创伤组织固定到10％福尔马林中，处理，并埋入到石蜡中。取横剖面(6μm)，用苏木精和曙红(用于常规组织学评价)和Mallory′s染料(用于基质定向分析)染色。

创伤强度的张力评估(第4和12周)

在损伤后，创伤强度随着时间而增加，因此是创伤成熟度的一个测量值。用Instron张力计(Instron Ltd.，Buckinghamshire，U.K.)定量创伤的断裂强度，预先标定刻度，以从第4周创伤的张力分析中可以得到5.0千克力(kgf)的满刻度读数，从第12周创伤的张力分析中得到50.0千克力(kgf)的满刻度读数。将分别来自0.01％，0.028％，0.05％PEP005，DMSO/异丙醇载体凝胶和未治疗的创伤对照组的组织带(3mm)夹在张力计的柄中，设置为在50mm/分钟的“十字头速度”下牵拉创伤的边缘。所测定的断裂强度是导致创伤边缘分离必需的最大力量。

瘢痕组织性质评估(第4和12周)

在0.01％，0.028％，0.05％PEP005，DMSO/异丙醇载体凝胶和未治疗的创伤对照组的组织学标本中检测基质定向，通过将切片置于显微镜载物台上，定向/旋转切片以使所取得到显微照片平行于皮肤的表面。然后在上端和中间的瘢痕区捕捉每个瘢痕的数字图像。选择每个瘢痕内感兴趣的代表性区域，用常用的书写图像的定向软件(CICA-MOS5 Version 1.0)测量每个区域的基质组分的方向，该软件所产生的数据是用于描述组织学标本图像中胶原蛋白束的方向性，所提供的输出描述的是12x15°片段中的定向。典型地，正常的皮肤组织具有限定为水平的方向，方向的峰值为约45°到105°。相反，瘢痕组织具有很大比例的定向接近水平的胶原蛋白束，非常高水平的方向性在0-180°(即，平行于皮肤表面的平面)，但是在45到120°之间只有非常少的方向性。脱离的瘢痕组织越少，所具有的定向在0-180°以外的胶原蛋白束就越多。

该研究考察了2个水平的组织定向，(i)比较0.01％，0.028％，0.05％PEP005，DMSO/异丙醇载体凝胶和未治疗的创伤对照组的瘢痕组织的基质量，定向平行于水平±7.5°和(ii)为了考虑切片定向的可能的误差，在图像捕捉前，也比较局部表皮细胞器(例如毛囊)和在皮肤表面、每组的瘢痕组织中的起伏/不规则物的可能的影响，比较的方面是定位为平行于水平，即呈±22.5°的基质的量。最后，胶原束平行/水平方向的程度越大，瘢痕就越严重。

结果

创伤强度的张力评估

在第4周和12周，从0.01％，0.028％，0.05％PEP005，DMSO/异丙醇载体凝胶和未治疗的创伤对照组的组织带(3mm)获得的平均张力、平均抗拉强度值如附图1所示。在第4周获得的平均抗拉强度值(附图1A)表明了一种剂量依赖的趋势，抗拉强度随着暴露的PEP005而增加。

在第12周获得的平均抗拉强度值(附图1B)表明，与第4周相比，所有实验组的抗拉强度值提高，在PEP005治疗后，产生了二相趋势，在0.01％增加并且在0.028％减少至对照水平，然后在0.05％PEP005浓度下又增加。

瘢痕组织质量评估

与三个对照组相比，用0.028％PEP005的局部治疗降低了在±7.5°或±22.5°处排列的胶原蛋白束的百分比。

下表3.1提供了与DMSO/异丙醇载体(对照)和未治疗的创伤对照组相比，在使用0.028％PEP005第12周后，在急性(外科)、大鼠全层切口创伤中，在与水平呈±7.5°和与与水平呈±22.5°的方向上中间创伤的平均瘢痕基质定向分析所显示的方向数据。N-NT＝PEP005-“空白”，未治疗，N-V＝PEP005＝“空白”，载体治疗；V＝PEP005-暴露的，载体治疗的。

表3.1

	N-NT	N-V	V	0.028％PEP005
	N-NT	N-V	V	0.028％PEP005	±7.5°	10.55％	946％	9.01％	6.99％
±2.5°	30.32％	26.84％	26.03％	21.81％	±7.5°	10.55％	946％	9.01％	6.99％

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Claims

1.一种在需要的患者中促进创伤愈合的方法，包括给所述患者施用创伤愈合有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

2.一种在创伤中减小瘢痕组织或使瘢痕组织最小或改善美容或功能性结果的方法，包括给需要的患者的创伤处施用减小瘢痕或使瘢痕最小的量或者化妆或功能改善量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

3.一种在需要的患者中调节真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞的表型应答的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

4.一种在需要的患者的创伤位点调节真皮成纤维细胞和/或角质形成细胞的表型应答的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

5.一种在需要的患者中调节一种或多种细胞因子产生的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

6.一种在需要的患者的创伤位点调节一种或多种细胞因子产生的方法，包括给所述患者施用调节有效量的巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐。

7.根据权利要求5或6的方法，其中一种或多种细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL6、IL-8和TNF-α。

8.根据权利要求1-7任一的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物或其药学可接受的盐是局部用于创伤。

9.根据权利要求1-8任一的方法，其中所述巨大戟二萜醇化合物具有下式：

其中R¹-R³独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的链烯基、任选取代的炔基、任选取代的酰基、任选取代的芳烷基、S(O)₂R′、S(O)₂OR′、P(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、链烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖基；和R⁴选自氢、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯氧基、任选取代的炔氧基、任选取代的酰氧基、任选取代的芳基烷氧基、S(O)₂R¹、OS(O)₂OR′、OP(O)(OR′)₂(其中R′是氢、烷基、链烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基)和糖氧基。

10.根据权利要求9的方法，其中该化合物选自巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯和20-脱氧-巨大戟二萜醇-3-当归酸酯及其药学可接受的盐。

11.根据权利要求10的方法，其中该化合物是巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。

12.根据权利要求1-11任一的方法，其中创伤选自切口和裂伤、外科切口、刺伤、擦伤、抓伤、压伤、磨伤、摩擦伤、慢性创伤、溃疡、热效应伤、化学创伤、病原性感染导致的创伤、皮肤接枝/移植供体和受体位点、免疫应答病症、口腔创伤、胃或肠创伤、受损的软骨或骨、截肢位点和角膜损伤。

13.根据权利要求12的方法，其中该创伤是皮肤创伤。

14.根据权利要求12或13的方法，其中该创伤是慢性创伤。

15.根据权利要求14的方法，其中该创伤是与糖尿病有关的创伤。