KR20080067625A

KR20080067625A - 인슐린 접합체의 제조를 위한 방법

Info

Publication number: KR20080067625A
Application number: KR1020087009648A
Authority: KR
Inventors: 니테쉬 다베; 파르사 하즈라; 아누즈 고엘; 니타 로이; 아난드 케다카르; 하리쉬 이에르; 가우탐 크리스난; 에이치. 에스 만주나스; 쉬리쿠마르 수리아나라얀; 고빈다사마이 마니캄; 골디 사츠데브; 마이앙크 가르그
Original assignee: 바이오콘 리미티드
Priority date: 2005-10-13
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2008-07-21
Also published as: US20110020871A1; ES2546016T3; EP1934252A1; JP5047978B2; CN101291952B; DK1934252T3; PL1934252T3; JP2009511039A; BRPI0520622B8; EP1934252B1; MX2008004674A; BRPI0520622A2; BRPI0520622B1; IL190666A0; IL190666A; PT1934252E; WO2007043059A1; CN101291952A; EP1934252A4; US8058391B2

Abstract

본 발명은 인슐린-올리고머 접합체 IN-105를 제조하는 방법을 청구한다. 식 G-A-V-R-[B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬]을 갖는 IN-105 전구체가 피치아(Pichia)에 클로닝되고 발현된다. 생합성 전구체가 그 후에 활성화된 올리고머에 접합된다. IN-105 전구체-올리고머 접합체는 그 후에 단백질분해효소로 처리되고 정제되어 식 인슐린-OC-CH₂-CH₂-(OCH₂CH₂)₃-OCH₃의 활성 인슐린-올리고머 접합체를 제공한다.

인슐린-올리고머 접합체

Description

인슐린 접합체의 제조를 위한 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF INSULIN CONJUGATES}

본 발명은 식 인슐린-올리고머의 인슐린-올리고머 접합체의 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 식 G-A-V-R-[B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬]의 전구체 IP-F의 클로닝 및 발현, 발현된 생합성 전구체의 활성화된 올리고머와의 접합에 이은 단백질분해효소 처리 및 정제에 의해 활성 인슐린-올리고머 접합체를 수득하는 것을 포함한다.

이자섬의 β-세포는, 단백질 분해 시 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 인슐린으로 되는, 전구-인슐린(pro-insulin)으로 알려진, 인슐린의 단일 사슬 전구체를 분비한다. 이 인슐린 분자는 종간에 매우 보존적이고 일반적으로 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 아미노산 사슬로 구성된다. 천연의 인간 인슐린 분자(mw 5,807 달톤)는 아미노 말단에 글리신을 갖는 21개 아미노산 잔기의 A-사슬; 및 아미노 말단에 페닐알라닌을 갖는 30개 아미노산 잔기의 B-사슬을 갖는다. 인슐린은 단량체로 존재할 수도 있고, 아니면 이량체 또는 세 개의 이량체로부터 형성된 육합체로 응집될 수도 있다. 단량체는 수용체에 결합하는 능력을 가지며 생물학적으로 활성인 형태이다.

인슐린 폴리펩티드는 체내에서 포도당의 운반, 이용 및 저장의 조절을 담당하는 일차적인 호르몬이다. 인슐린의 부족한 생산 또는 인슐린에 대한 수용체의 감소된 민감성의 결과로서 탄수화물 대사에서의 결함은 생물학적 장애인 당뇨병을 유발한다. 당뇨병은 포도당을 이용하는 정상적인 능력을 손상시키고 그 결과로 혈중 당 농도를 증가시킨다(고혈당증). 포도당이 혈액에 축적됨에 따라, 과도한 농도의 당이 소변으로 배출된다(당뇨). 당뇨병의 다른 증상들은 증가된 소변량 및 빈도, 갈증, 가려움증, 허기짐, 체중 감소, 및 쇠약을 포함한다. 방치할 경우 당뇨병은 케톤증에 이어 구역질 및 구토를 수분하는 산증을 유발한다. 독성 물질이 계속 축적됨에 따라, 환자는 당뇨병성 혼수에 빠지게 되고, 이는 환자를 사망에 이르게 한다. 당뇨병에는 두 가지 유형이 있다. 타입 I는 인슐린-의존성 당뇨병, 또는 IDDM이다. IDDM은 예전에는 “유년-발병형 당뇨병”으로 알려져 있었다. IDDM에서, 인슐린은 췌장에 의해 분비되지 않고 외부 공급원으로부터 제공되어야만 한다. 타입 II 또는 성인-발병형 당뇨병은 일부 진행성인 경우에 인슐린이 요구된다고 하더라도, 일반적으로 식이에 의해 조절될 수 있다.

전통적으로 소 및 돼지 인슐린이 인간의 당뇨병을 치료하기 위하여 거의 유일하게 사용되었다. 재조합 기술이 발달하면서 인간 인슐린의 상업적 규모의 제조가 발효에 의해 가능해졌다. 또한, 천연 인간 인슐린의 활성에 상응하는 생물학적 활성을 갖는 유전적으로 조작된 인슐린 유사체가 당뇨병을 치료하기 위하여 개발되었다. 그러나 당뇨병의 치료는 전형적으로 인슐린의 규칙적인 주사를 요구한다. 인슐린 주사의 불편함으로 인해, 다양한 접근법들이 비-주사가능 경로에 의한 투여 를 위해 인슐린을 제형화하고자 시도되었다. 이러한 공개문헌의 열거는 다음을 포함한다: US 4,338,306(Kitao 등)은 인슐린의 직장 투여를 위한 인슐린 및 8 내지 14개 탄소 원자를 갖는 지방산 및 그의 비독성 염의 약학적 조성물을 보고한다; US 4,579,730(Kidron 등)은 인슐린의 경구 투여를 위한 담즙산 또는 그의 알칼리 금속염과 함께 장코팅된 인슐린 조성물을 보고한다; US 5,283,236(Chiou 등)은 약물이 코눈물관을 통과하여 순환계 내로 흡수되는 안구를 통해 인슐린의 전신 전달을 위한 펩티다제 억제제 뿐만 아니라, 고분자량 폴리텝티드의 전신 흡수를 보조하기 위하여 투과-증진제를 포함하는 인슐린 조성물을 보고한다; US 5,658,878(Backstrom 등)은 인슐린 및 하부 기도에서 인슐린의 흡수를 증진시키는 탄소 사슬 길이 10개(즉, 카프르산염 나트륨), 12개(라우르산염 나트륨), 또는 14개(미리스트산염 나트륨)의 포화 지방산의 나트륨 염을 보고한다; US 5,853,748(New 등)은 인슐린, 담즙염 또는 담즙산, 및 인슐린의 경구 투여를 위해 소화관의 pH를 pH 7.5 내지 9로 조절하는데 사용되는, 탄산염 또는 중탄산염 이온의 장-코팅된 조성물을 보고한다. US 6,200,602(Watts 등)는, 정제, 캡슐제 또는 환제가 근위 결장에 도달할 때까지 인슐린 및 흡수 촉진제의 유리를 방지하기 위한 코팅제로, 분산제와 6 내지 16개 탄소 원자를 갖는 지방산의 혼합물 및 그의 염 또는 중간 사슬 지방산의 모노/다이글리세라이드의 혼합물을 포함하는 흡수 촉진제를 이용하여 인슐린의 결장 전달을 위한 인슐린의 약물 전달 조성물을 보고한다.

경구 투여에 의해 인슐린을 전달하고자 하는 여러 시도가 문헌에서 발견된다. 당뇨병 환자에서 정상 혈당을 달성하기 위한 인슐린의 경구 투여와 관련된 문 제점은 약학 및 의학 문헌에 잘 기록되어 있다. 위장관(GI tract)에서 대사 효소는 인슐린을 신속히 분해하여 생물학적으로 분해된 생성물을 형성한다. 예를 들면, 위에서, 경구적으로 투여된 인슐린은 효소적 단백질분해 및 산성 분해를 거친다. 창자에서의 생존은 과도한 단백질분해에 의해 저지된다. 관내강에서, 인슐린은 위효소 및 췌장효소, 엑소펩티다제 및 엔도펩티다제, 및 솔가장자리 펩티다제를 포함하는 다양한 효소에 의해 공격받는다. 인슐린이 이러한 효소 공격에도 분해되지 않는다고 하더라도, 인슐린이 생체 내에서 그의 수용체에 도달하기 전에 관통해야만 하는 생물학적 장벽이 인슐린의 경구 투여를 제한할 수도 있다. 예를 들면, 인슐린은 낮은 막 투과성을 가져 관내강으로부터 혈류 내로 통과하는 그의 능력을 제한할 수도 있다.

인슐린과 같이 약학적으로 활성인 폴리펩티드는 약물-올리고머 접합체의 복잡분산 혼합물을 제공하기 위하여 폴리에틸렌 글리콜의 복잡분산 혼합물 또는 폴리에틸렌 글리콜 함유 중합체의 복잡분산 혼합물과 접합되어져 왔다; US 4,179,337(Davis 등)은 인슐린과 같은 폴리펩티드와 유니온 카바이드사(Union Carbide)로부터 제공되는 MPEG-1900 및 MPEG-5000과 같은 다양한 폴리에틸렌 글리콜과의 접합을 보고한다. US 5,567,422(Greenwald)는 생물학적 활성 구핵원자와, 5,000 달톤의 수평균 분자량을 갖는, m-PEG-OH(유니온 카바이드사)와 같은 폴리에틸렌 글리콜과의 접합을 보고한다.

인슐린과 같은 폴리펩티드와 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 당지질 중합체 및 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 지방산 중합체의 접합이 US 5,359,030(Ekwuribe 등)에 보고되었다.

US 6,011,008(Domb 등)은 산화-민감성 성분의 수용성 다당류 접합체를 생산하는 방법을 보고하는데, 이 방법은 (a) 상기 다당류를 과옥소산 산화에 의해 다이알데하이드로 활성화시키고;(b) 이 다이알데하이드를 간섭 음이온 및 부산물로부터 정제하고;(c) 상기 접합체를 형성하기 위하여 쉬프 염기 형성에 의해 산화-민감성 성분을 정제된 다이알데하이드에 접합시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 단계(c)의 접합체는 환원 성분에 의해 아민 접합체로 환원된다. 인슐린은 pH 8.9의 붕산염 완충용액 내에서 순수한 산화 AG(아라비노갈락탄)의 용액과 인슐린을 4℃에서 밤새 반응시킴으로써 아민 또는 이민 결합을 통해 산화된 AG(아라비노갈락탄)에 접합된다. 이 투명 용액을 셀룰로오스 투석을 통해 여막 분석하고 동결 건조하여 115 mg의 백색 고체를 수득하였다.

US 6,022,524(Maisano 등)는 가열 및 교반 후, 실온으로 냉각시키고 300 ml DMSO 중의 11.73 g NHS(0.102 mol) 용액을 첨가한 다음, 400 ml DMSO 중의 19.6 g N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(0.097 mol) 용액과 함께 적가하여 제조된, DTPA 및 다이메틸설폭사이드(DMSO)의 용액 중에서 Gd-DTPA와 돼지 인슐린의 접합을 보고한다. 이 혼합물을 16시간 동안 교반한 후, 여과하고 그 여과물을 50℃ 및 5 Pa 하에서 증발에 의해 농축하여 약 160 ml 부피의 농후 오일을 수득하였다.

US 6,309,633(Ekwuribe 등)은 실온에서 트라이에틸아민 및 DMSO의 존재 하에서 인슐린과 라우르산염 PEG5의 접합을 위한 고체 인슐린의 용도를 보고한다. 이 반응은 매 30분마다 HPLC로 관찰되었다. 이 접합체는 분취 HPLC를 이용하여 정제 되었다.

US 6,828,297(Ekwuribe 등)은 활성화된 올리고머와의 접합 및 B29로 개질된 PEG7-헥실-인슐린의 정제를 위하여 아연 또는 아연 부재 인간 인슐린을 이용하여 PEG7-헥실-인슐린을 제조하는 방법을 보고한다. 다이메틸설폭사이드 및 트라이에틸아민 중의 인슐린을 22+/-4℃에서 활성화된 올리고머와 반응시켰다. 유기 용매 및 소분자량의 불순물을 제거하기 위하여 조 반응 혼합물을 투석하거나 정용여과하고, 아세트산암모늄 완충용액으로 교환하고 동결 건조하였으며; 이를 추가로 0.5% 트라이에틸아민/0.5% 인산염 완충용액(TEAP A)으로 평형화된 RP-HPLC로 분석하였다. 이 컬럼을 TEAP A 및 TEAP B(80% 아세토나이트릴 및 20% TEAP A) 용매 시스템을 이용하여 농도구배로 용출시켰다. 접합체를 포함하는 분획을 모으고 용출 완충용액 및 용매를 아세트산암모늄 완충용액에 대한 투석 또는 정용여과로 제거하고 동결 건조하여 백색 분말의 PEG7-헥실-인슐린, B29 모노접합체(순도>97%)를 수득하였다. 현재, 기존의 종래 기술은 사용된 인슐린이 생물학적으로 활성 형태인 접합된 인슐린을 제조하기 위한 출발 물질로 순수한 인슐린 분말 또는 결정의 사용을 교시한다.

본 발명은 식 Z-[B-사슬]-Q-[A-사슬]의 전구체 IP-X로부터 인슐린-올리고머 접합체의 제조를 용이하게 하는데, 상기에서 Z는 선도 펩티드 서열이고, B-사슬은 인간 인슐린 또는 그의 유사체의 B 사슬이고, Q는 A 및 B 사슬 사이에 링커 펩티드 서열이고, A-사슬은 인간 인슐린 또는 그의 유사체의 A 사슬이다. 전구체 IP-X는 B-사슬 상의 LysB29 위치 및 선도 펩티드 Z의 N-말단 아미노산에서 올리고머와 접 합된다. IP-X-올리고머 접합체는 그 후에 단백질분해효소로 처리되고 이어서 활성 인슐린-올리고머 접합체를 수득하기 위하여 정제된다.

출발 물질은 전구체 IP-X를 함유하는 발효 배양액이다. IP-X 함유 배양액은 IP-X를 정제하기 위하여 이온-교환, HPLC, RP-HPLC 및 결정화와 같은 크로마토그래피의 병용이 수행된다.

본 발명은 생물학적으로 활성 형태의 순수한 인슐린 결정을 얻고(예컨대, 인슐린 전구체의 펩티드 전이), 활성 인슐린을 수득하기 위하여 인슐린 전구체를 절단하고, 순수한 인슐린 결정을 수득하기 위한 수차례의 크로마토그래피 정제 단계들(예컨대, 이온-교환 크로마토그래피, HPLC 및 RP-HPLC)에 관여하는 몇 가지 단계들이 누락된, 인슐린-올리고머 접합체를 제조하는데 더욱 간편하고 경제적인 방법이다.

[발명의 요약]

본 발명은 식 G-A-V-R-[B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬]의 IN-105 전구체 IP-F를 발현시키고, IP-F를, IP-F의 LysB²⁹ 위치 및 선도 펩티드 GAVR의 N-말단 아미노산 Gly¹에 접합하는, 활성화된 올리고머로 처리하는 것을 포함하는, 인슐린-올리고머 접합체 IN-105를 제조하는 방법을 제공한다. IP-F는 일반식 -OC-(CH₂)_n-(OCH₂CH₂)_n-OCH₃을 갖는 올리고머와 접합되는데, 여기서, n은 1 내지 8의 정수이고 두 개의 n 모두가 동일하거나 다를 수 있고; 바람직한 실시양태에서 상기 활성화된 올리고머는 분자식 C₁₄H₂₃NO₈(CAS.no.622405-78-1)을 가지며, 식 인슐린-OC-CH₂-CH₂-(OCH₂CH₂)₃-OCH₃의 IN-105를 수득한다.

본 발명은 식 G-A-V-R-[B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬]의 생합성 전구체 서열 IP-F의 용도를 포함한다. 본 발명에 사용된 선도 서열 G-A-V-R은 문헌에 기술된 바와 같은 효모 내 인슐린의 증가된 발현에 요구되는 어떠한 음전하로 하전된 아미노산도 포함하지 않는다. 본 발명의 방법은 생물학적으로 활성 형태인 순수한 인슐린을 수득하기 위한 몇 단계의 정제가 누락되는, 인슐린 접합체를 제조하는데 보다 간편하고 경제적이다. 본 발명은 IN-105 전구체 IP-F의 A 사슬 또는 C-펩티드(RDADDR) 상에는 어떠한 접합도 포함하지 않고 접합이 B 사슬(LysB²⁹) 상에, 그리고 선도 사슬 G-A-V-R의 Gly에서 일어난 후 인슐린-올리고머 접합체 IN-105를 수득하기 위하여 단백질분해효소로 처리되는 생성물을 얻는다. 본 방법의 결과로서 접합된 인슐린의 총 생산 비용은 최소화된다.

[발명의 상세한 설명]

IP-X는 식 Z-[B-사슬]-Q-[A-사슬]의 인슐린-올리고머 전구체를 나타내는데, 여기서 Z는 선도 서열 펩티드이고, B-사슬은 인간 인슐린 또는 그의 유사체의 B 사슬이고, Q는 A 및 B 사슬의 링커 펩티드 서열이고, A-사슬은 인간 인슐린 또는 그의 유사체의 A 사슬이다. 선도 펩티드는 예를 들면 펩티드들, GAVR, ARR, AARAARGR, HHHHHHAAR, 및 HHAHAHAHAAR을 포함한다. 링커 펩티드 Q는, 예를 들면, RDADDR, RDALQR, REEAEAEAEPR, RPGR, RAR, RR, 및 R을 포함한다.

IP-X 전구체는 대장균(Escherichia coli), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), CHO 세포 등과 같은 임의의 적당한 발현 시스템에 의해 생산될 수도 있다.

본 발명에서, IP-X의 가장 바람직한 실시양태는 선도 서열 Z가 GAVR이고, B-사슬이 인간 인슐린의 B(1-30)이고, 링커 펩티드 Q가 RDADDR이고, A-사슬이 인간 인슐린 A(1-21)인 것이다. 식 G-A-V-R-[B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬]로 표시되는 IP-X 전구체는 본 명세서에서 이후에 IP-F로 명명된다. IP-F는 피치아 파스토리스 발현벡터인 pPIC9K 내에서 Mat-알파 시그널 펩티드와 함께 해독틀 내로 클로닝된다. 피치아 파스토리스 숙주 균주, GS115는 IPF를 발현하는 피치아 클론을 수득하기 위하여 재조합 플라스미드로 형질전환된다. 분비된 IP-F를 트립신, 카복시펩티다제 B 및 N-하이드로석시니아마이드 에스테르(활성화된 올리고머)로 처리하여 IN105를 수득한다.

IN-105 전구체 IP-F 서열

서열: 피치아 파스토리스 내 발현을 위해 최적화된 코돈

예상 분자량: 6907.82 Da

측정 pI 값: 5.46

염기(183 bp) 및 아미노산(61 aa)

IN-105 전구체 IP-F는 P. 파스토리스에 의해 배양 배지 내로 분비된다. 배양액을 원심분리하여 세포를 상층액으로부터 분리한다. 전구체 IP-F의 포획에는 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 유용한 복수 개의 선택권이 있다. 본 발명에서는, 음이온 교환 크로마토그래피 및 HIC가 IP-F를 포획하는데 사용된다.

발효 배양액으로부터 SP-세파로스 풀 전체로 수행된, IN-105 전구체 IP-F의 결정화는 모든 불순물들을 제거하고, 이는 RP-HPLC-1 단계에서 컬럼 오염을 감소시키는데 일조한다. 이온 교환 컬럼으로부터 생성물을 용출하기 위해 사용되는, 아세트산암모늄염이 또한 결정화에 의해 제거된다. 순수한 결정형 전구체는 또한 후속된 접합 단계에 있어 비용을 절감하는데 일조하고 반응 효율을 증가시킨다. 결정형 형태는 동결되어 보관될 수 있는데, 이는 -20℃에서 보관될 때 실질적으로 수일간 안정해질 수 있다.

IN-105는 IP-F-올리고머 접합체를 제공하기 위하여 IP-F가 활성화된 올리고머를 이용하여 B²⁹ 라이신에 먼저 접합되는 반응에 의해 생성된다. IP-F-올리고머 접합체는 단백질분해효소로 처리되는데, 상기 링커-펩티드(RDADDR) 및 선도 서열(GAVR)이 절단되어 활성 인슐린-올리고머 접합체를 얻는다. 사용된 두 개의 단백질분해효소는 트립신 및 카복시펩티다제 B이다. LysB²⁹가 올리고머에 의해 차단되기 때문에, LysB²⁹에서의 트립신 절단의 가능성은 최소화된다. 그러나, 트립신 절단을 위한 다른 가능한 부위는 B-22(Arg), C-1(Arg) 및 C-6(Arg)의 C-말단부이다. 2nd 단백질분해효소(카복시펩티다제 B) 처리는 B 사슬로부터 유리 염기(Arg) 아미노산을 제거하기 위하여 수행되는데, 이 부위는 최종 생성물 IN-105를 얻기 위하여 하나의 여분의 Arg가 B-30(Thr)과 부착되는 곳이다. 두 개 단백질분해효소 처리는 형성된 불순물과 관련된 최소 생성물과 함께 수율이 최대화되는 최적 반응 조건에서 단일 공정으로 수행된다.

효소 절단 반응이 종결된 후, 불순물은 예컨대, 제1 RP-HPLC 단계에 의해 IN-105로부터 분리될 수도 있다. 본 발명에서 불순물은 제1 RP가 낮은 pH에서 수행되고 최종 정제가 높은 pH에서 수행될 때 제거된다. 저 부하 및 25 내지 30으로 개시하는 농도가 15 g/L의 수지 부하에서 수행되었다. 제1 RP-HPLC 단계는 약 93-95%의 순도를 나타내었다. 제거될 필요가 있는 많은 불순물들이 존재하였는데, RP-HPLC 단계 후에 잔존하는 이러한 불순물들은 다음 회차의 RP-HPLC에 용출 풀을 적용함으로써 정제된다. 최종 생성물 IN-105는 97-98%의 순도를 갖는다.

RP-HPLC가 밀접하게 관련된 불순물들의 정제를 위해 가장 바람직한 단계들 중의 하나라고 하더라도, 이온 교환, HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) 등과 같은 다른 기술을 이용하는 저압 크로마토그래피가 또한 사용될 수 있다.

실시예 1: 피치아 파스토리스 에서 IN105 전구체 IP -F의 발현

pPIC9K/IP-F 플라스미드를 BglII로 소화시키고 P. 파스토리스 GS115(his4)의 전기수용적격 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 재생 혼합물(Regeneration mix)을 YNBD 한천(1.34% 아미노산 무함유 효모 질소 염기, 2% 덱스트로스, 2% 한천) 플레이트 상에 도말하고 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니를 마이크로 역가 플레이트 상의 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스) 액체배지에서 적절한 대조군과 함께 성장시켰다. 상기 플레이트를 제네티신(G418)을 함유하는 YPD 한천(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스, 2% 한천) 플레이트 상에 찍어서 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 1-3 mg/ml G418에 내성을 갖는 클론을 발 현 연구에 사용하였다.

게놈 DNA를 용해를 위한 자이몰리에이즈(zymolyase) 효소를 이용하여 선택된 재조합 피치아 클론으로부터 제조하였다. 게놈 내 IP-F의 삽입을 확인하기 위하여 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. GS115 숙주 균주를 음성 대조군으로 사용하였다.

P. 파스토리스에서의 발현 연구는 30℃에서 BMGY(1% 펩톤, 2% 효모 추출물, 1.34% 효모 질소 염기, 2% 글리세롤, 4×10^-5% 바이오틴, 10O mM 인산염 완충용액, pH 6.0)에서 성장한 클론들을 대상으로 수행되었다. 성장한 클론들은 이어서 BMMY(1% 펩톤, 2% 효모 추출물, 1.34% 효모 질소 염기, 0.5% 메탄올, 4×10^-5% 바이오틴, 10O mM 인산염 완충용액, pH 6.0)에서 메탄올로 유도되었다. 메탄올 유도는 총 3일간 수행되었다. 클론들 각각의 조 상층액을 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. IP-F는 약 7 kDa 단백질로서 분비되었다.

이 클론을 진탕 플라스크 내에서 메탄올 유도 후 3일간 IP-F의 분비에 대해서 분석하였다. HPLC 방법이 대칭 C18 컬럼(4.6×250 mm, 300 Å, 5 마이크론, 워터스) 및 완충용액 A(물 중 0.1% TFA) 및 B(100% 아세토나이트릴)를 이용하는 분석을 위해 사용되었다. 상기 컬럼은 시료 주입 전에 25% 완충용액 A로 평형화된다. 프로그램된 농도구배가 시료 측정을 위해 1 ml/분의 유속으로 적용된다: 25% 완충용액 A 내지 40% 완충용액 A의 선형 농도구배가 시료 주입 후 프로그램된 농도구배의 최초 15분간 이루어진다; 40% 완충용액 A가 프로그램의 15분 및 16분 째에 유지 된다; 그 후에 완충용액 A의 농도는 16분 및 18분 째 사이에 농도구배를 이용하여 25%로 되돌아간다; 완충용액 A의 농도는 다음 회차의 운전을 위해 컬럼을 평형화시키기 위하여 마지막 5분간은 운전 동안에 일정하게 유지된다.

실시예 2

접종 배지(1% 효모 추출물, 0.5 펩톤, 2% 한천 및 20% 일수소화 덱스트로스) 상에서 성장한 단일 분리 콜로니로부터 한 루프의 배양액을 50 ml BYYG 배지(1% 펩톤, 2% 효모 추출물, 1.34% 효모 질소 염기, 2% 글리세롤 및 pH 6.0의 10% 1 M 인산염 완충용액)를 포함하는 250 ml 플라스크에서 30+/-1℃ 및 230+/-10 rpm으로 배양한다. 48 내지 50시간의 배양 후 600 nm에서 측정된 광학 밀도는 10 +/-2에 이른다. 이 세포들을 50% w/v 세포 현탁액을 만들기 위하여 100 ml 플라스크 내 6 ml의 생산 배지(1% 펩톤, 2% 효모 추출물, 1.34% 효모 질소 염기, 0.5% 메탄올 및 pH 6.0의 10% 1 M 인산염 완충용액)에 현탁하였다. 플라스크를 30℃에서 배양하였다. 30 ㎕의 메탄올을 2일째부터 매일 모든 플라스크에 첨가하였다. 4일째에 분석 결과 0.069 g/L이었다.

실시예 3

동결(-85℃)된 피치아 세포를 50 ml 성장 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, pH 6.0의 10% 1 M 인산염 완충용액, 0.67% 효모 질소 염기 및 0.1% 글리세롤)를 포함하는 250 ml 플라스크에서 30+/-1℃ 및 230+/-10 rpm으로 배양하여 접종 플라스크 를 준비하였다. 20 내지 28시간의 배양 후, OD(600nm)는 10-12에 이른다. 이들 세포를 4% 글리세롤, 0.0093% 황산칼슘, 1.82% 황산칼륨, 1.49% 황산마그네슘, 0.0413% 수산화칼륨을 포함하는 1 L의 발효 배지를 포함하는 2 L 배양기에서 추가로 배양하였다. 배양기를 30℃ 및 pH 5.0에서 운전하였다. 폭기율은 0.1-1.0 vvm로 설정되었다. 폭기 속도는 용존 산소가 10% 이상을 유지하도록 조절되었다. 생물량은 50% 글리세롤 공급에 의해 300-400 g/L까지 축적되었다. 메탄올을 유도를 위해 공급하였다. 메탄올 공급 5일째 분석 결과 0.76 g/L이다.

실시예 4(선택적 접합)

IN-105를 하기를 포함하는 단계들에 의해 IN-105 전구체를 포함하는 무세포 발효 배양액으로부터 제조한다,

a) SP-세파로스 컬럼을 완충용액 A(2 C.V)로 평형화시키고, 무세포 배양액의 pH를 빙초산으로 4.0에 맞춘 후 상층액을 45 g/L의 수지에서 컬럼에 로딩하였다. 완충용액 A(1.5 C.V)를 이용하여 세척을 수행하고 생성물을 60% 완충용액 B로 용출하였다. 용출 풀을 8회 농축하였고 수율은 95%였다.

[완충용액 A-1O mM 아세트산암모늄 pH 4.0; 완충용액 B-1 M 아세트산암모늄 pH 4.0].

b) IN-105 전구체를 포함하는 용출 풀을 취하여 물로 1:1 희석한 후 pH를 1O N NaOH를 이용하여 5.0으로 맞추었다. 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하였다. 이 혼합물을 결정화를 위해 6-8시간 동안 저온 상태에 보관하였 다. IN-105 전구체의 회수율은 95%였다.

c) IN-105 전구체 결정을 포함하는 6 g의 습식 펠렛을 취하여 32 ml의 50O mM 붕산염 완충용액(pH 8.1)을 첨가하였다. pH를 10 N NaOH를 이용하여 10.5로 맞추었다. 11 ml의 아세토나이트릴에 용해된 370 mg 올리고머를 첨가하고 내용물을 교반하였다. 총 접합된 생성물의 수율은 약 78%였다.

d) 단계 (c)의 접합된 생성물과 물을 동일 부피로 취하였다. 이 용액의 pH를 빙초산을 이용하여 5.0으로 맞춘 후 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 상기 혼합물에 첨가하고 pH를 1 N NaOH를 이용하여 5.1로 맞추었다. 이 혼합물을 결정화를 위해 밤새 4℃에서 보관하였다. 이 단계의 수율은 90%였다.

e) 단계 (d)의 습식 결정 펠렛을 0.5 M 트리스 염기 용액에 용해시켜 생성물의 농도를 16 g/L로 만들었다. 이 용액의 pH를 1 N NaOH를 이용하여 7.4로 맞추었다. 그 후에 0.027 mM의 트립신 및 0.3×10^-3 mM의 카복시펩티다제 B를 이 반은 혼합물에 첨가하고 24℃에서 12시간 동안 유지하였다. 이로부터 형성된 생성물은 80%의 단계 수율을 갖는 IN-105였다.

f) 입자 크기: 10-15 μ, 기공 크기: 120 Å의 수지로 충진된 컬럼을 15% B를 이용하여 평형화시키고, 단계 (e)의 반응 혼합물을 1:10으로 희석하고 로딩 전에 pH를 7.0으로 맞추고, 15% B로 세척하였다. 15 내지 25% B를 이용하여 20 Cvs 이상 용출을 수행하였다. 95% 순도의 분획이 얻어졌다.

[완충용액 A: 1O mM 아세트산염 나트륨 pH 7.0; 완충용액 B: 100% 아세토나 이트릴],

g) 단계 (f)의 용출물을 추가로 희석하고 로딩 전에 pH를 8.5로 맞춘 후, 20% B를 이용하여 세척을 수행하였다. 20 내지 35% B를 이용하여 15 CVs 이상 용출을 수행하였다. 97% 순도의 분획이 얻어졌다.

[완충용액 A: 10O mM 트리스 pH 8.5; 2O mM 염화마그네슘; 완충용액 B: 아세토나이트릴]

h) 단계 (g)의 용출 풀을 취하고 물을 이용한 희석에 의해 IN-105의 농도를 6 mg/ml로 낮추었다. 시료의 pH를 빙초산을 이용하여 4.5로 맞추었다. 0.6%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하고 pH를 최종적으로 5로 맞춘 후 결정 형성을 위하여 이 혼합물을 4℃에서 밤새 보관하였다. 원심분리 후 90%의 단계 수율을 갖는 결정을 회수하였다.

실시예 5(선택적 접합)

IN-105는 하기를 포함하는 단계들에 의해 IN-105 전구체를 포함하는 무세포 발효 배양액으로부터 제조된다:

a) pH 7에서 취한 무세포 배양액을 PLRP S 50-70 MICRON으로 충진된 컬럼 상에 로딩하였다. 이 배양액을 5% MeCN으로 만들고, 1O mM 아세트산 나트륨(pH 7.0) 및 5% MeCN으로 평형화된, 상기 컬럼 상에 로딩하였다. 4 g/L 로딩으로부터 90%의 회수율을 얻었다.

b) IN-105 전구체를 포함하는 용출 풀을 취하여 물을 이용하여 1:1로 희석하 고 pH를 1O N NaOH를 이용하여 5.0으로 맞추었다. 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하였다. 이 혼합물을 결정화를 위하여 6-8시간 동안 저온 상태에서 보관하였다. IN-105 전구체의 회수율은 95%였다.

c) IN-105 전구체 결정을 포함하는 2O g의 습식 펠렛을 취하고 92 ml의 50O mM 붕산염 완충용액(pH 8.1)을 첨가하였다. pH를 10 N NaOH를 이용하여 10.5로 맞추고; 40 ml 아세토나이트릴에 용해된 1.13 g의 올리고머를 반응 혼합물을 교반하는 상태에서 첨가하였다. 총 접합된 생성물의 수율은 77%였다.

d) 단계 (c)의 접합된 생성물과 물을 동일 부피로 취하였다. 이 용액의 pH를 빙초산을 이용하여 5.0으로 맞춘 후 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 이 혼합물에 첨가하였고 pH를 1 N NaOH를 이용하여 5.1로 맞추었다. 이 혼합물을 결정화를 위해 4℃에서 밤새 보관하였다. 이 단계의 수율은 90%였다.

e) 단계 (d)의 습식 결정 펠렛을 0.5 M 트리스 염기 용액에 용해시켜 생성물의 농도를 20 g/L로 만들었다. 이 용액의 pH를 1 N NaOH를 이용하여 7.4로 맞추었다. 0.02 mM 트립신 및 13×1O^-3 mM 카복시펩티다제 B를 이 반응 혼합물에 첨가하였다. 12시간 경과 후 형성된 생성물은 85%의 단계 수율을 갖는 IN-105였다.

f) 입자 크기: 10-15 μ, 기공 크기: 120 Å의 수지로 충진된 컬럼을 10% 완충용액 B를 이용하여 평형화시키고, 단계 (e)의 반응 혼합물을 33% 농도의 MeCN을 이용하여 1:10으로 희석하고 pH를 3.5로 맞춘 후, 15% B로 세척하였다. 단계별 농도구배를 이용하여 용출을 수행하였다. 58.6%의 수율이 얻어졌다.

[완충용액 A: 10 mM 아세트산나트륨 pH 7.0, 완충용액 B: 100% 아세토나이트릴]

g) 단계 (f)의 용출물을 추가로 희석하고 로딩 전에 pH를 7.5로 맞추고, 20% 완충용액 B를 이용하여 세척을 수행하였다. 22 내지 32% 완충용액 B를 이용하여 20 CVs 이상 용출을 수행하였다. 97% 순도의 분획이 얻어졌다.

[완충용액 A: 100 mM 트리스 pH 8.5; 20 mM 염화마그네슘; 완충용액 B: 아세토나이트릴].

h) 단계 (g)의 용출 풀을 취하고 IN-105의 농도를 물을 이용한 희석에 의해 6 mg/ml로 낮추었다. 시료의 pH를 빙초산을 이용하여 4.5로 맞추었다. 0.6%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하고 pH를 최종적으로 5로 만들고 IN-105 결정을 형성하기 위하여 이 혼합물을 4℃에서 밤새 보관하였다. 원심분리 후 90%의 단계 수율을 갖는 결정을 회수하였다.

실시예 6(완전 접합)

a) SP-세파로스 컬럼을 완충용액 A(2 C.V)로 평형화시키고, 무세포 배양액의 pH를 빙초산을 이용하여 4.0으로 맞추고 상층액을 20 g/L 부하에서 컬럼 상에 로딩하였다. 완충용액 A(1.5 C.V)를 이용하여 세척을 수행하고 생성물을 1O C.V의 0 내지 100% B로 용출하였다. 용출 풀을 8회 농축하였고 수율은 98%였다.

b) IN-105 전구체를 포함하는 용출 풀을 취하여 물로 1:1 희석하고 pH를 1O N NaOH를 이용하여 5.0으로 맞추었다. 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하였다. 이 혼합물을 결정화를 위하여 6-8시간 동안 저온 상태로 보관하였다. IN-105 전구체의 회수율은 95%였다.

c) 습식 결정 펠렛을 DMSO에 용해시켜 생성물의 농도를 60 g/ml로 만들었다. 이 반응 혼합물에 0.001 %(v/v) 트라이에틸아민을 첨가하였다. 올리고머를 0.4 M의 농도로 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시키고 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 15시간 경과 후 80%의 수율로 완전히 접합된 생성물이 회수되었다.

d) 단계 (c)의 접합된 생성물과 물을 동일 부피로 취하였다. 이 용액의 pH를 빙초산을 이용하여 5.0으로 맞춘 후 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 상기 혼합물에 첨가하고 pH를 1 N NaOH를 이용하여 5.1로 맞추었다. 이 혼합물을 결정화를 위하여 4℃에서 밤새 보관하였다. 이 단계의 수율은 90%였다.

e) 단계 (d)의 습식 결정 펠렛을 0.5 M 트리스 염기 용액에 용해시켜 생성물의 농도를 25 g/L로 만들었다. 이 용액의 pH를 1 N NaOH를 이용하여 7.4까지 상승시켰다. 0.02 mM 트립신 및 3×1O^-3 카복시펩티다제를 이 반응 혼합물에 첨가하였다. 14시간 경과 후 형성된 IN-105는 80%의 단계 수율을 나타내었다.

f) 입자 크기: 10-15 μ, 기공 크기: 120 Å의 수지로 충진된 컬럼을 15% 완충용액 B를 이용하여 평형화시키고; 단계 (e)의 반응 혼합물을 1:10으로 희석하고 로딩 전에 pH를 7.0으로 맞추었다. 15% 완충용액 B를 이용하여 세척을 수행하고 27 내지 37%의 완충용액 B를 이용하여 20 Cvs 이상 용출을 수행하였다. 90% 순도의 분획이 얻어졌다.

[완충용액 A: 10O mM 트리스 pH 8.0; 2O mM MgCl2, pH 8.5; 완충용액 B: 100% 아세토나이트릴]

g) 단계 (f)의 용출물을 추가로 희석하고 로딩 전에 pH를 9.0으로 맞추고, 20% 완충용액 B를 이용하여 세척을 수행하였다. 20 내지 35% 완충용액 B를 이용하여 15 CVs 이상 용출을 수행하였다. 97% 순도의 분획물이 얻어졌다.

[완충용액 A: 10O mM 트리스 pH 9.0; 2O mM 염화마그네슘; 완충용액 B: 아세토나이트릴]

h) 단계 (g)의 용출 풀을 취하고 IN-105의 농도를 물을 이용한 희석에 의해 6 mg/ml로 낮추었다. 이 시료의 pH를 빙초산을 이용하여 8.3 내지 4.5로 맞추었다. 0.6%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하고 pH를 최종적으로 5로 만들고 이 혼합물을 결정 형성을 위하여 4℃에서 밤새 보관하였다. 원심분리 후 90%의 단계 수율을 나타내는 결정을 회수하였다.

실시예 7(완전 접합)

a) SP-세파로스 컬럼을 완충용액 A(2 C.V)로 평형화시키고, 무세포 배양액의 pH를 빙초산을 이용하여 4.0으로 맞추고 상층액을 45 g/L 부하로 상기 컬럼에 로딩하였다. 완충용액 A(1.5 C.V)를 이용하여 세척을 수행한 후 생성물을 60% B로 용출하였다. 용출 풀을 8회 농축하였고 수율은 95%였다.

[완충용액 A-1O mM 아세트산암모늄 pH 4.0; 완충용액 B-1 M 아세트산암모늄 pH 4.0]

c) 습식 결정 펠렛을 DMSO에 용해시켜 생성물의 농도를 60 g/ml로 만들었다. 이 반응 혼합물에 0.001 %(v/v) 트라이에틸 아민을 첨가하였다. 올리고머를 0.4 M 농도로 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시키고 반응 혼합물에 첨가하였다. 15시간 경과 후 완전히 접합된 생성물을 80%의 수율로 회수하였다.

d) 단계 (c)의 접합된 생성물과 물을 동일 부피로 취하였다. 이 용액의 pH를 빙초산을 이용하여 5.0으로 맞춘 후 0.4%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 이 혼합물에 첨가하고 pH를 1 N NaOH를 이용하여 5.1로 맞추었다. 상기 혼합물을 결정화를 위하여 4℃에서 밤새 보관하였다. 이 단계에서의 수율은 90%였다.

e) 단계 (d)의 습식 결정 펠렛을 0.5 M 트리스 염기 용액에 용해시켜 생성물의 농도를 25 g/L로 맞추었다. 이 용액의 pH를 1 N NaOH를 이용하여 7.4로 상승시키고, 이 반응 혼합물에 0.02 mM 트립신 및 3×1O^-3 카복시펩티다제 B를 첨가하였다. 14시간 경과 후 형성된 IN-105는 80%의 단계 수율을 나타내었다.

f) 입자 크기:10-15 μ, 기공 크기: 120 Å의 수지로 충진된 컬럼을 10% 완 충용액 B를 이용하여 평형화시키고, 단계 (e)의 반응 혼합물을 15% 농도의 MeCN을 이용하여 1:10으로 희석하고 pH를 3.5로 맞추고 5 마이크론 필터를 통해 부하물을 여과하고; 15% B를 이용하여 세척을 수행하였다. 17 내지 23% 완충용액 B를 이용하여 20 Cvs 이상 용출을 수행하였다. 77%의 수율을 갖는 94.2% 순도의 단백질을 얻었다.

[완충용액 A: 250 mM 아세트산, 완충용액 B: 아세토나이트릴]

g) 단계 (f)의 용출물을 추가로 희석하고 로딩 전에 pH를 9.0으로 맞추고, 20% 완충용액 B를 이용하여 세척을 수행하였다. 22 내지 32% B를 이용하여 15 CVs 이상 용출을 수행하였다. 97% 순도의 분획이 얻어졌다.

[완충용액 A: 100 mM 트리스 pH 9.0; 2O mM 염화마그네슘; 완충용액 B: 아세토나이트릴]

h) 단계 (g)의 용출 풀을 취하여 물을 이용한 희석에 의해 IN-105의 농도를 6 mg/ml로 낮추었다. 시료의 pH를 빙초산을 이용하여 8.3 내지 4.5로 맞추었다. 0.6%(v/v) 페놀 및 4%(v/v) 0.3 N 염화아연을 첨가하고 pH를 최종적으로 5로 만들고 혼합물을 IN-105 결정을 형성하기 위하여 4℃에서 밤새 보관하였다. 원심분리 후 90%의 단계 수율로 결정을 회수하였다.

Claims

하기를 포함하는 인슐린 접합체의 제조방법:

i) 전구체 IP-X의 발현을 위한 클로닝

ii) 전구체 IP-X를 생산하기 위한 상기 클론의 발효

iii) 전구체 IP-X의 분리

iv) 전구체 IP-X와 올리고머의 접합

v) IP-X-올리고머 접합체의 단백질분해효소로의 처리, 및

vi) 활성 인슐린-올리고머 접합체 또는 유사체 인슐린-올리고머 접합체의 정제.
제1항에 있어서, 상기 전구체 IP-X가 선도 서열 및 합성 인간 전구-인슐린 펩티드 또는 유사체를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 선도 서열이 음전하로 하전된 아미노산을 포함하지 않는 방법.
제2항에 있어서, 상기 선도 서열이 G-A-V-R인 방법.
제2항에 있어서, 상기 전구-인슐린 펩티드가 [B-사슬]-R-D-A-D-D-R-[A-사슬] 인 방법.
제1항에 있어서, 상기 전구체 IP-X가 특이적으로 IP-F인 방법.
제6항에 있어서, 상기 전구체 IP-F가 효모에서 발현되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 전구체 IP-F가 호메탄성(methylotropic) 효모에서 발현되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 호메탄성 효모가 피치아(Pichia)인 방법.
제1항 내지 제8항에 있어서, 상기 전구체 IP-F가 이온 교환 크로마토그래피 및 이에 수반되는 결정화에 의해 배양액으로부터 분리되는 방법.
제10항에 있어서, 상기 결정화가 페놀, ZnCl₂ 중에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전구체 IP-X가 활성화된 올리고머로 처리되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 전구체 IP-F가 활성화된 올리고머로 처리되는 방법.
제12항 및 제13항에 있어서, 상기 올리고머가 일반식 HOOC-(CH₂)_n-(OCH₂CH₂)_n-OCH₃을 갖고, 여기서 두 개의 n이 같거나 다르고 n이 1-8의 정수인 방법.
제14항에 있어서, 상기 올리고머가 C₁₄H₂₃NO₈의 석신아마이드 유도체인 방법
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IP-F와 활성화된 올리고머의 접합이 붕산염 완충용액, 아세토나이트릴, DMSO로부터 선택되는 하나 이상의 용매 중에서 수행되는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머가 IP-F 내 B 사슬의 Lys-B²⁹에서 접합되는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IP-F-올리고머 접합체가 IP-F-[OC-(CH₂)_n-(OCH₂CH₂)_n-OCH₃]₂인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IP-F-올리고머 접합체가 추가로 결정화되는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IP-F-올리고머 접합체가 단백질분해효소로 처리되어 활성 인슐린-올리고머 접합체를 수득하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 단백질분해효소가 트립신 또는 카복시펩티드분해효소 B 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 방법.
제21항에 있어서, 상기 활성 인슐린-올리고머 접합체가 RP-HPLC 및 결정화에 의해 정제되는 방법.
제22항에 있어서, 상기 활성 인슐린-올리고머 접합체가 인슐린-OC-(CH₂)_n-(OCH₂CH₂)_n-OCH₃이고, 여기서 두 개의 n이 같거나 다르고 n이 1-8의 정수인 방법.
제23항에 있어서, 상기 활성 인슐린-올리고머 접합체가 인슐린-OC-CH₂-CH₂-(OCH₂CH₂)₃-OCH₃인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (vi)의 활성 인슐린-올리고머 접합체가 (a) 역상 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 결정화를 포함하는 공정에 의해 정제되는 방법.
제22항 및 제25항에 있어서, 상기 RP-HPLC 단계가 반복되는 방법.
제25항에 있어서, 상기에서 로딩되는 시료의 pH가 하나의 RP-HPLC 단계에서 5 내지 8 범위인 방법.
제26항에 있어서, 상기에서 로딩되는 시료의 pH가 하나의 RP-HPLC 단계에서 8 내지 11 범위인 방법.