KR20080052826A - 신규 페놀 배당체 항산화 화합물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 페놀 배당체(phenolic glycoside) 화합물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 신규 페놀 배당체인 Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C에 관한 것이다. 본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)은 뛰어난 라디칼 소거 능력을 보임으로, 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐 아니라 노화 방지 화장품 및 기능성 식품에도 유용하게 이용될 수 있다.

Glyscavin, 페놀 배당체, Mycelia sterilia, 항산화, 노화방지.

Description

신규 페놀 배당체 항산화 화합물 및 이의 제조 방법{Novel phenolic glycoside antioxidant compound and the preparation method thereof}

본 발명은 신규 페놀 배당체(phenolic glycoside) 화합물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 신규 페놀 배당체인 Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C에 관한 것이다.

각종 산화반응, 화학약품, 식품, 인체질환 및 방사선 등에 의해 슈퍼옥사이드(superoxide, O₂ ^-), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 및 과산화수소 (H2O2) 등과 같은 반응성이 큰 강한 활성산소와 유리 라디칼(free radical) 등이 생체 내에 생성되면 이들에 의해서 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 지질이 산화되어 세포막에 지질 과산화물이 생성되게 된다. 세포막에 지질과산화물이 축적하면 세포막의 유동성과 기능성이 저하됨으로 세포의 전체적인 기능이 억제되고 세포의 구조도 변화하는 등 조직상에 국소적인 장해가 생기면서 각종 질환이 유발되게 되는 것이다. 또한 활성산소와 유리라디칼은 세포 구성성분인 핵산, 당 등을 변형 또는 파괴함으로써 암을 비롯하여 알콜성 간염 등의 간장 질환, 뇌혈관 장해로 인한 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 질환 등 각종 인체 질환의 원인이 되고 있다. 또한 활성산소는 식품에 다량으로 존재하는 불포화 지방산 등과 반응하여 산패의 원인이 되어 식품의 안전성 및 고품질 유지에 결정적인 결함을 초래하기도 하며 각종 산화물에 의한 동식물의 산화적 스트레스, 미생물 발효시 발생하는 활성산소에 의한 수율저하 등 많은 분야에서 활성산소에 의한 문제가 야기되고 있다.

따라서 강력하면서도 독성이 없는 항산화 활성을 갖는 새로운 물질의 발견은 각종 질병의 치료제 개발이나 노화방지용 화장품첨가제 및 식품첨가제 등으로 매우 유용하게 활용될 것이다.

지금까지 지질과산화 저해제로는 BHT(butylated hydroxy toluene) 및 BHA(butylated hydroxy anisol) 등과 같은 합성 항산화제가 사용되어 왔으나, 이들 BHT나 BHA는 지질과산화 저해활성은 우수하나 암 또는 기형을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높아 계속적으로 사용할 수 없는 단점이 있었다. 따라서 천연물로부터 새로운 항산화 활성물질을 창출하여 독성이나 부작용이 전혀 없는 항산화제를 개발하는 것이 필요하다.

한편, 미생물 대사산물로부터 탐색된 항산화 물질은 약 20여 종이 알려져 있으며, 지금까지 보고된 미생물로부터 유래된 항산화 활성물질은 대부분 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 유래된 것이 대부분이며, 카바졸(carbazole)계 화합물이 가장 많이 보고되었다. 대표적인 화합물들은 스트렙토마이세스 엑스폴리아투 스(Streptomyces exfoliatus) 균체 아세톤 추출물로부터 발견된 카르퀴노스타틴(carquinostatin) 외에도 안티오스타틴(antiostatin), 카라조스타틴(carazostatin), 네오카로조스타틴(neocarozostatin), 카바조마이신(cabazomycin) 등이 보고되었다. 또한 페나진(phenazine)계 항산화 물질로는 벤토시아닌(benthocyanin), 벤토포에닌(benthophoenin), 페나조비리딘(phenazoviridin) 등이 밝혀졌으며 기타 티아졸계 화합물로 티아졸스타틴과 나프테르핀 피롤로스타틴 등이 보고되었다.

국내 지질과산화 저해물질의 탐색연구는 대부분 식품소재를 재료로 하여 항산화 활성의 유무 및 활성정도를 측정하고 식품보호제로서의 이용에 국한되어 있어 활성물질의 추출, 정제 및 구조해석 등의 연구는 매우 미흡한 실정이었다.

1990년대 초 한국생명공학 연구원에서 본격적으로 지질과산화 저해활성물질을 탐색하는 연구가 시작되어 토양방선균 배양액 또는 천연물로부터 지질과산화 저해활성물질을 조사하였으며, 스트렙토마이세스 균주로부터 페닐티아졸린(phenylthiazoline)계 신규 화합물인 4-메틸애루진산(4-methylaeruginic acid), 애그로사이브 실린드라세(Agrocybe cylindracea) 균주로부터 강력한 자유라디칼 제거제 활성을 나타내는 새로운 인돌 알칼로이드 화합물, 폴리오젤루스 멀티플렉스(Polyozellus multiplex) 균주로부터 테르페닐계 신규 화합물 폴리오젤린(polyozellin), 국내 자생 약용식물인 울머스 다비디아나(Ulmus davidiana)로부터는 세스키테르펜 o-나프톨퀴논(sesquiterpene o-naphthoquinone)계 신규 화합물인 다비디아논(davidianone)을 발견하였다. 또한, 스트렙토마이세스 니트로스포리 우스 (Streptomyces nitrosporeus) 균주로부터 벤자아마이드(benzamide)계 화합물인 벤자스타틴(benzastatin) A, B, C, D, E, F 및 G의 화합물을 발견하였다.

이에 본 발명자들은 토양 시료에서 신규 진균을 동정한 후, 상기 진균에서 신규 페놀 배당체를 분리, 정제하여 화학식 및 구조를 결정하였으며, 상기 신규 페놀 배당체의 라디칼 소거 능력이 우수함을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 페놀 배당체 화합물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 생산하는 Mycelia sterilia F020054 균주(KCTC 10898BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제 공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 신규 당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규 페놀 배당체 화합물을 제공한다.

본 발명은 신규 페놀 배당체 화합물의 화학식은 하기와 같다.

이때, R은 수소 또는 C₁ ~ C₁₀의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것이 바람직하며, C₂ ~ C₈의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것이 보다 바람직하며, C₃ ~ C₇의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것이 더욱 바람직하며, C₂ ~ C₆의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것이 더욱 바람직하며, C5의 펜틸, 펜테닐 또는 펜타디에닐기인 것이 가랑 바람직하다. 상기 펜테닐기는 2-펜테닐, 3-펜테닐 또는 4-펜테닐기인 것이 가장 바람직하다. 상기 펜타디에닐기는 1,4-펜타디에닐, 1,3-펜타디에닐, 펜타-3,4-디에닐, 펜타-2,3-디에닐, 펜타-1,2-디에닐 또는 펜타-1,4-디에닐인 것이 가장 바람직하다.

본 발명자들은 항산화 효과를 보이는 신규 페놀 배당체 화합물을 분리하고 각각 Glyscavin A, Glyscavin B 및 Glyscavin C라 명명하였으며, 상기 신규 화합물의 화학식은 하기와 같다.

Glyscavin A

Glyscavin B

Glyscavin C

본 발명의 상기 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 생산하는 Mycelia sterilia F020054 균주(KCTC 10898BP)를 제공한다.

본 발명의 상기 신규 페놀 배당체 화합물은 대한민국 충북 노동굴에서 채취한 토양 시료에서 분리한 신규 진균에서 분리되었다. 상기 신규 진균는"Mycelia sterilia F020054"라 명명되었으며, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 소재 생물자원센터에 2006년 1월 19일자로 기탁하였다(수탁번 호: KCTC 10898BP). 본 균주는 자낭균강에 속하는 곰팡이로서 포자를 형성하지 않았으며, 기존의 보고된 곰팡이와 비교하였을 때 90% 이상의 상동성을 나타내는 균주가 없어 잠정적으로 Mycelia sterilia로 명명하였다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 하기의 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 1) 진균 Mycelia sterilia F020054를 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 2) 단계 1)의 수득한 배양액을 클로로포름 및 n-부탄올로 추출하는 단계; 3) 단계 2)의 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(50:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 3:1)를 사용하여 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(20:1)를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 TLC로 순차적으로 분리하는 단계; 및 4) 단계 3)에서 분리한 활성 분획을 40% 메탄올을 용매로 하여 역상 분취 HPLC를 실시하여 정제하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 진균은 YPS 배지를 이용하여 배양하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

본 발명의 Mycelia sterilia F020054에서 분리, 정제한 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)을 이용하여 수퍼옥사이 드(superoxide) 및 ABTS^·+를 대상으로 한 라디칼 소거 활성을 조사하였다. 그 결과, 대조군인 BHA보다 뛰어난 라디칼 소거 능력을 보임을 확인하였다(표 1 참조). 이를 통해 본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물은 항산화제로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 Mycelia sterilia F020054에서 분리, 정제한 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)은 뛰어난 항산화 활성을 보임이 증명되었다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 알콜성 간염 등의 간장질환, 뇌혈관 장애로 인한 뇌졸중, 심극경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 및 암 등 각종 인체 질환의 예방 및 치료뿐만 아니라 노화방지에도 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 2 내지 화학식 4의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 젤라틴 등을 섞어 조용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 형탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체충, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C)가 약 0.1 ~ 100 ㎎/kg이고, 바람직하게는 5 ~ 50 ㎎/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)의 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/kg으로 나타나, 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐만 아니라 노화방지를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 포함하는 노화 방지용 화장품을 제공한다.

본 발명의 노화방지용 화장품으로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제 등이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 신규 페놀 배당체 화합물을 함유하는 노화 방지용 화장품을 제조함에 있어서, 통상적으로 함유되는 피부 외용제 조성물에 본 발명의 산구절초 추출물이 1 내지 15 중량부, 바람직하게는 2 또는 10 중량부로 첨가할 수 있다. 본 발명의 피부용 외형제에는 본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성 분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 진균 동정 및 배양

생산되는 진균 F020054는 대한민국, 충북 노동굴에서 채취한 토양 시료로부터 분리되었다. 상기 균주의 분류 연구는 한국생명공학연구원에 의뢰하였다. 상기 균주는 보고된 진균주와 매우 낮은 상동성을 보이며, 자낭균강에 속하는 곰팡이로서 포자를 형성하지 않았으며, 기존의 보고된 곰팡이와 비교하였을 때 90% 이상의 상동성을 나타내는 균주가 없었다. 상기 균주는 Mycelia sterilia F020054라 명명하였으며, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 소재 생물자원센터에 2006년 1월 19일자에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 10898BP). 사면배지보존 및 액체배양조건을 위해, 본 진균은 PDA 배지(potato dextrose broth 2.0%, agar 1.8%,Difco, USA)에서 배양하였으며, 장기 유지를 위해, 균체를 15% 글리세롤이 포함된 YPS 배지(glucose 2.0%, yeast extract 0.2%, polypeptone 0.5%, MgSO₄ 0.05%. KH₂PO₄ 0.1%, pH 6.0; Difco, USA)에서 -70℃로 보존하였다.

상기 균주의 집락(loopful)은 PDA(Difco Co., USA) 사면배지에서 배양한 균체를 120 ㎖ YPS 배지가 포함된 500 ㎖ 플라스크(balffled Erlenmeyer flask)에 접종하여 배양하였다. 상기 플라스크를 140 rpm 속도로 교반되는 회전 진탕기(rotary sharker: 고려기기, 대한민국)에서 28℃로 3일 동안 배양하였다. 종자 배양(seed culture) 10 ㎖을 같은 종류의 120 ㎖ 배양배지를 포함하는 500 ㎖ 플라스크에 배양하였다. 발효는 140 rpm 속도로 교반되는 회전 진탕기에서 28℃로 7일 동안 배양하였다.

< 실시예 2> 신규 페놀 배당체 추출, 분리 및 정제

<2-1> 진균 배양액으로부터 추출

배양액 전체 12 ℓ를 배양액 여과액과 균사체로 분리하기 위하여 여과하였다. 배양액 여과액은 CHCl₃로 추출한 후 물층을 다시 n-BuOH로 추출하여 n-BuOH 추출물을 얻었다.

<2-2> n - BuOH 추출물의 분리 및 정제

n-BuOH 추출물은 진공 상태에서 농축하였으며, 상기 농축액을 실리카 겔 컬럼(Merck silica gel 60, Merck, USA)으로 옮기고, 극성을 증가시킨 CHCl₃-MeOH 혼합용매(50:1 ~ 3:1)으로 용출하였으며, 3개의 활성 분획을 수득하였다.

상기 활성 분획을 농축하였으며, CHCl₃-MeOH 혼합용매(20:1)로 실리카 겔 컬럼(Merck silica gel 60, Merck, USA) 상에서 재크로마토그래피 및 MeOH를 이용한 세파덱스 LH-20(Sepadex LH-20, Pharmacia Co, Ltd., USA) 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography), 및 TLC(Kiesel gel 60 F254, Merck, USA)로 순차적으로 용출되었다. 상기 활성 분획은 6.0 m㎖/min 유동속도로 메탄올과 물의 혼합용매(2:3)를 사용하여 역상 분취 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 15020 mm, Japan)를 실시하여 순수하게 정제된 노란 분말의 신규 페놀 배당체 화합물을 얻었다. 이때, 36, 46 및 56분 잔류시간의 피크(peak)에 회수되었으며, Glyscavin A는 8.7 mg, Glyscavin B는 15.2 mg, 및 Glyscavin C는 159.6 mg 이었다.

<2-3> 신규 페놀 배당체 화합물( Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)의 구조 분석

상기 실시예 2-2를 통해 얻은 물질의 선광도는 편광기(JASCO DIP-370 polarimeter)를 사용하여 측정하였다. 자외선 흡수 스펙트럼은 자외선 분광광도계(Shimadzu UV-260 spectrophotometer, Japan)를 통해 측정하였으며, 적외선 흡수 스펙트럼은 자외선 분광광도계(FT-IR Equinox 55 spectrometer, Burker, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한 핵자기공명(NMR) 분석(Burker AMX 300, Burker, USA)을 통하여 ¹H 및 ¹³C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMZC(1H-detected heteronuclear Multiplie-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Cohence) 스펙트럼을 얻었다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 및 2D NMR 실험체는 Bruker DMX 600 상의 CD₃OD에서 기록되었다. ¹H 및 ¹³C NMR의 화학적 변위는 내부 표준으로서 각각 3.30 및 49.9 ppm상에서 CD₃OD의 메틸기를 참조하여 δ 값(ppm)이 주어졌다. ESIMS 데이터는 70 eV에서 JEOL JMS-SX 102A 기기(JEOL, 일본)에서 얻어졌다. HRFAB-MS 스펙트럼은 TEA(triethanolamine)의 매트릭스와 함께 질량분석기(JEOL JMS HX-110 mass spectrometer,JEOL, 일본)를 이용하여 측정하여 분자 구조를 결정하였다.

측정 결과는 하기와 같으며, 화학식 2의 화합물은 Glyscavin A, 화학식 3의 화합물은 Glyscavin B, 화학식 4의 화합물은 Glyscavin C의 신규한 화합물로 동정하였다.

[Glyscavin A]

1) 물성 : 노란색 분발

2) 선광도 : [a]²⁵D - 21.9^o(c= 0.2, 메탄올)

3) 질량분석치 : HRFAB-MS[M+Na]⁺ m/z 391.1369 (calcd for C₁₈H₂₄NaO₈, 391.1369)

4) 분자식 : C₁₈H₂₄O₈

5) 구조 : 4-O-b-D-글루코파라노실-2-하이드록시메틸-3-펜타-1,3-디에닐)페놀

[4-O-b-D-glucopyranosyl-2-hydroxymethyl-3-penta-1,3-dienyl)phenol]

6) 자외선 흡수 스펙트럼[UV λ_max nm(log ε) in 메탄올] : 223(4.13), 271(4.12), 388(3.74) cm^-1

7) 적외선 흡수 스펙트럼(IR V_max): 3402, 2925, 2650, 1377, 1244

8) ¹H-NMR(CD₃OD, 600 MHz): 7.02(d, J= 9.0 Hz), 6.75(dd, J= 15.6, 8.7 Hz), 6.71(d, J= 15.6 Hz), 6.65(d, J= 9.0 Hz), 6.27(ddd, J= 15.0 Hz, 8.7 Hz, 1.2 Hz), 5.81(dd, J= 15.0 Hz, 6.6 Hz), 4.76(d, J= 7.2 Hz), 4.72(d, J= 13.5 Hz), 4.70(d, J= 13.5 Hz), 3.85(dd, J= 12.0 Hz, 2.4 Hz), 3.65(dd, J= 12.0 Hz, 5.4 Hz), 3.45(brt, J= 8.4 Hz), 3.42(t, J= 9.0 Hz), 3.37(t, J= 9.0 Hz), 3.33(m), 1.80(dd, J= 6.6 Hz, 1.2 Hz)

9) ¹³C-NMR(CD₃OD, 150 MHz): 153.3(C-1), 149.9(C-4), 136.8(C-2´), 134.2(C-3´), 131.3(C-3), 130.5(C-4´), 125.8(C-2), 124.9(C-1´), 118.3(C-5), 114.9(C-6), 103.8(C-1″), 78.3(C-3″), 78.1(C-5″), 75.1(C-2″), 71.4(C-4″), 62.6(C-6″), 58.2(C-7), 18.4(C-5´)

[Glyscavin B]

1) 물성 : 노란색 분발

2) 선광도 : [a]²⁵D - 110.7^o(c= 0.5, 메탄올)

3) 질량분석치 : HRFAB-MS[M+Na]⁺ m/z 393.1522 (calcd for C₁₈H₂₆NaO₈, 393.1525)

4) 분자식 : C₁₈H₂₆O₈

5) 구조 : 4-O-b-D-글루코파라노실-2-하이드록시메틸-3-펜트-1-에닐)페놀[4-O-b-D-glucopyranosyl-2-hydroxymethyl-3-pent-1-enyl)phenol]

6) 자외선 흡수 스펙트럼[UV λ_max nm(log ε) in 메탄올] : 225(3.75), 225(3.75), 299(3.12)

7) 적외선 흡수 스펙트럼(IR V_max): 3394, 2928, 1707, 1394, 1244, 1076 cm^-1

8) ¹H-NMR(CD₃OD, 600 MHz): 7.00(d, J= 9.0 Hz), 6.65(d, J= 9.0 Hz), 6.59(brt, J= 15.9 Hz), 6.04(dt, J= 15.9 Hz, 6.9 Hz), 4.77(d, J= 7.2 Hz), 4.72(s), 3.85(dd, J= 12.0 Hz, 2.4 Hz), 3.69(dd, J= 12.0 Hz, 5.4 Hz), 3.45(brt, J= 8.4 Hz), 3.43(t, J= 9.0 Hz), 3.38(t, J= 9.0 Hz), 3.30(m), 2.23(brq, J= 6.6 Hz), 1.53(m), 0.99(t, J= 6.0 Hz)

9) ¹³C-NMR(CD₃OD, 150 MHz): 153.1(C-1), 149.5(C-4), 138.2(C-2´), 131.4(C-3), 125.8(C-2), 124.6(C-1´), 118.2(C-5), 114.7(C-6), 103.6(C-1″), 78.1(C-3″), 77.8(C-5″), 75.0(C-2″), 71.3(C-4″), 62.5(C-6″), 58.6(C-7), 36.8(C-3´), 23.6(C-4´), 14.1(C-5´)

[Glyscavin C]

1) 물성 : 노란색 분발

2) 선광도 : [a]²⁵D - 12.8^o(c= 0.2, 메탄올)

3) 질량분석치 : HRFAB-MS[M+Na]⁺ m/z 393.1680 (calcd for C₁₈H₂₈NaO₈, 395.1682)

4) 분자식 : C₁₈H₂₈O₈

5) 구조 : 4-O-b-D-글루코파라노실-2-하이드록시메틸-3-펜틸페놀(4-O-b-D-glucopyranosyl-2-hydroxymethyl-3-pentylphenol)

6) 자외선 흡수 스펙트럼[UV λ_max nm(log ε) in 메탄올]: 223(3.53), 367(3.35)

7) 적외선 흡수 스펙트럼(IR V_max): 3368, 2928, 1657, 1359, 1243, 1076 cm^-1

8) ¹H-NMR(CD₃OD, 600 MHz): 7.00(d, J= 9.0 Hz), 6.60(d, J= 9.0 Hz), 4.72(d, J= 7.2 Hz), 4.71(d, J= 12.6 Hz), 4.69(d, J= 12.6 Hz), 3.87(dd, J= 12.0 Hz, 2.4 Hz), 3.45(brt, J= 8.4 Hz), 3.42(t, J= 9.0 Hz), 3.37(t, J= 9.0 Hz), 3.34(m), 2.79(m), 1.52(m), 1.37(m), 0.17(m)

9) ¹³C-NMR(CD₃OD, 150 MHz): 152.8(C-1), 150.4(C-4), 134.5(C-4), 126.5(C-2), 117.9(C-5), 113.9(C-6), 104.1(C-1″), 78.5(C-3″), 78.0(C-5″), 71.5(C-4″), 62.7(C-6″), 57.5(C-7), 33.3(C-3´), 31.7(C-2´), 27.1(C-1´), 23.6(C-4´), 14.5(C-5´)

< 실험예 1> 신규 페놀 배당체 화합물( Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)의 수퍼옥사이드( superoxide ) 소거 활성 측정

수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성은 Beauchamp 등(Beauchamp C. Fridovich I., Anal Biochem . 44:276-287, 1971)의 방법을 변형한 Kim 등(Kim et al, J Abtibiot. 56:1000-1003, 2003)의 방법으로 측정하였다. 혼합물은 0.030 mM 리보플라빈(riboflavin), 1 mM EDTA, 0.60 mM 메티오닌(methionine) 및 0.030 mM NBT 용액을 포함하는 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 7.8) 140 ㎕와 DMSO에 시험 화합물 및 참조 화합물이 다양한 농도로 용해된 시료 용액 10 ㎕로 구성되었으며, DMSO는 대조군으로 사용되었다.

본 발명자들은 수퍼옥사이드를 형성하기 위하여 광유도 반응은 2개의 20 W 형광 램프가 부착된 알류미늄 호일로 포장된 박스 안에서 수행하였다. 반응물과 램프 사이의 거리는 조명의 명암도가 1,000 lux에 도달할 정도가 되도록 조정하였 다. 반응물은 25℃에서 8분간 조명을 쬐어 주었다. 청색 포르바잔(formazan)을 형성하는 저해된 NBT에 의해 광화학적으로 감소된 리보플라빈은 수퍼옥사이드 음이온을 형성하였다. 조명을 쪼이지 않은 반응 혼합물은 음성 대조군으로 이용되었다. NBT의 저해는 마이크로플레이트를 이용한 조사(irradiation) 전, 후에 560 nm에서 흡광도 차이에 의해 측정되었다. 소거 활성은 대조군 및 시험 시료의 흡광도 차를 이용하여 계산되었다. 상기 실험은 3회 수행되었으며, 흡광도 변화는 평균을 냈다.

소거 활성(%)=(1-ΔA_시료/ΔA_대조군)× 100

ΔA_시료 : 시험 화합물을 포함하는 웰의 흡광도 변화.

* ΔA_대조군: 시험 화합물을 대신하여 DMSO가 포함된 웰의 흡광도 변화.

* EC₅₀ 값 : 저해된 NBT의 손실 50% 원인이 되는 기질의 농도.

그 결과, 수퍼옥사이드를 소거하는 활성은 대조군을 사용한 BHA보다 더욱 뛰어남을 확인하였다(표 1 참조).

< 실험예 2> 신규 페놀 배당체 화합물( Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)의 ABTS ^·+ 소거 활성 측정

본 발명자들은 화합물의 전체 항산화 활성을 Re 등(Re R., et al ., Free Radical Biol Med . 26:1231-1237, 1999)에 기재된 ABTS^·+ 제거 분석방법을 이용하여 결정하였다. ABTS^·+ 양이온 라디칼은 실온에서 12시간 동안 어두운 상태에서 증류수 상의 7.0 mM ABTS^·+와 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate) 사이의 반응으로 생성시켰다. ABTS^·+용액은 A₃₇₄에서 0.7 값이 될 때까지 PBS로 희석하였다. 이후 25℃에서 10 ㎕ 시료 용액에 190 ㎕ ABTS^·+ 용액을 첨가하여 반응을 시작하여 변화를 측정하였다.

그 결과, 수퍼옥사이드의 경우와 동일하게 ABTS^·+를 소거하는 활성은 대조군을 사용한 BHA보다 더욱 뛰어남을 확인하였다(표 1 참조).

화합물	수퍼옥사이드	ABTS·+
Glyscavin A	1.17	1.90
Glyscavin B	1.19	2.11
Glyscavin C	3.63	2.42
BHT	6.00	11.28

* 상기 결과는 제거된 자유 라디칼 50%인 EC₅₀(μM)로 표현하였다.

< 실험예 3> 급성 독성 실험

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 2마리씩 나누었다. 상기 실시예에서 제조한 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다.

시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 1,000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

1. 정제의 제조

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

상기 정제의 구성성분은 하기와 같다.

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 5.0 ㎎

락토오스 BP 150.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎

2. 캡슐제의 제조

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 캡슐제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 일정량의 부형제 및 스테아르산마그네슘과 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

상기 캡슐제의 구성성분은 하기와 같다.

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 5.0 ㎎

전분 1500 100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

3. 주사액제의 제조

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 상기 실시예의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 이어서 120℃로 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 얻었다.

상기 주사액제의 구성성분은 하기와 같다.

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 100 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

< 제제예 2> 식품의 제조

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.2 ~ 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.1 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙( gravies )의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.1 ~ 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품( dairy products )의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C)를 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 Glyscavin A(또는 Glyscavin B 또는 Glyscavin C)의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),

종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C)의 건조분말(1 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

< 제제예 3> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82% 주입하여 Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C)를 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C)를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

Glyscavin A(Glyscavin B 또는 Glyscavin C) 0.1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

하기에 본 발명의 노화 방지용 화장품을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 4> 피부 외용제의 제조

1. 크림의 제조

세토스테아릴알코올 2.8 중량부

밀난 2.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부

피이지-100 스테아레이트 1 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부

호호바오일 4 중량부

스쿠알란 3.8 중량부

폴리소르베이트 60 1.1 중량부

마카다이아오일 2 중량부

초산토코페롤 0.2 중량부

메칠폴리실록산 0.4 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

Euxyl K-400 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 7 중량부

메칠파라벤 0.05 중량부

글리세린 6 중량부

d-판데놀 0.2 중량부

신규 페놀 배당체 화합물 4.6 중량부

트리에탄올아민 0.2 중량부

pt 41891 0.2 중량부

p-H₂O 46.05 중량부

2. 로션의 제조

세토스테아릴알코올 1.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부

피이지-100 스테아레이트 2.6 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 0.6 중량부

스쿠알렌 4.8 중량부

마카다이아오일 2 중량부

호호바오일 2 중량부

초산토코페롤 0.4 중량부

메칠폴리실록산 0.2 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 4 중량부

메칠파라벤 0.1 중량부

산탄검 0.1 중량부

글리세린 4 중량부

d-판데놀 0.15 중량부

알란토인 0.1 중량부

신규 페놀 배당체 화합물 3.5 중량부

카르보내(2% aq. Sol) 4 중량부

트리에탄올아민 0.15 중량부

에탄올 3 중량부

pt 41891 0.1 중량부

p-H₂0 48.3 중량부

본 발명의 신규 페놀 배당체 화합물(Glyscavin A, Glyscavin B, Glyscavin C)은 뛰어난 라디칼 소거 능력을 보임으로, 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐 아니라 노화 방지에도 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (14)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 신규 페놀 배당체(phenolic glycoside) 화합물(R은 수소 또는 C₁ ~ C₁₀의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이다.)

   <화학식 1>

   
2. 제 1항에 있어서, R은 C₂ ~ C₈의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 제 1항에 있어서, R은 C₃ ~ C₇의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것을 특징으로 하는 화합물.
4. 제 1항에 있어서, R은 C₄ ~ C₆의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기인 것을 특징으로 하는 화합물.
5. 제 1항에 있어서, R은 펜틸, 펜테닐 또는 펜타디에닐기인 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 5항에 있어서, 펜테닐기는 2-펜테닐, 3-펜테닐 또는 4-펜테닐인 것을 특징으로 하는 화합물.
7. 제 5항에 있어서, 펜타디에닐기는 1,4-펜타디에닐, 2,4,-펜타디에닐, 1,3-펜타니에닐, 펜타-3,4-디에닐, 펜타-2,3-디에닐, 펜타-1,2-디에닐 또는 펜타-1,4-디에닐인 것을 특징으로 하는 화합물.
8. 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물을 생산하는 Mycelia sterilia F020054 균주(수탁번호: KCTC 10898BP).
9. 1) 제 8항의 진균 Mycelia sterilia F020054 균주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;

   2) 단계 1)의 수득한 배양액을 클로로포름 및 n-부탄올로 추출하는 단계;

   3) 단계 2)의 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(3:1 내지 50:1)를 사용하여 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(20:1)를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 TLC로 순차적으로 분리하는 단계; 및

   4) 단계 3)에서 분리한 활성 분획을 40% 메탄올을 용매로 하여 역상 분취 HPLC를 실시하여 정제하는 단계를 포함하는 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물의 제조 방법.
10. 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화제.
11. 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 활성산소가 과량으로 축적되어 발병하는 질환은 간장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 또는 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물.
14. 제 1항의 신규 페놀 배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 노화 방지용 화장품.