KR20080032575A - 특이 난황항체 함유 제제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질을 대량 분리하여 분무건조시켜 얻는 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 항원을 면역한 산란계로부터 생산된 면역한 항원에 대한 특이항체를 함유하는 난황을 할란하여 얻은 난황액에 pH 5 이하의 산성용액으로 6배 희석한 다음 급속냉동 및 해동과정을 이용하여 효과적으로 수용성 난황항체를 분리한 후 당을 첨가하여 분무건조하는 것을 특징으로 한다.

수지전착, 에칭, 마스킹잉크, 우레탄아크릴 물질, 전리 활성화 물질, 증착부

Description

특이 난황항체 함유 제제의 제조방법{Manufacturing method of product containing specific IgY}

본 발명은 특정항원을 면역하여 얻은 계란의 난황으로부터 난황항체를 함유하는 제제의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 난황항체를 공장규모의 대량생산과정 중에서 냉동 및 해동의 물리적 방법을 이용하여 난황의 지질층과 난황항체 함유 단백질층을 분리한 후 비용적인 측면에서 적용이 어려운 동결건조 방법을 배제하고, 덱스트린과 글루코스와 같은 당을 첨가하여 분무건조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

계란은 오래전부터 영양분이 풍부한 대중 식품 중의 하나로 인식되어 왔으며, 계란은 독특한 특징을 지니고 있는데 그것은 어미 닭이 가진 면역항체가 계란으로 옮겨가서 축적되고 자손에게 전해진다는 점이다.

종래에는 여러 병원성 항원에 대한 항체를 제조하기 위해 토끼 등의 동물을 면역 처리하여 얻어진 혈청으로부터 병원성 항원에 대한 특이항체를 생산하는 방법이 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법은 작은 포유동물의 적은 혈청으로부터 항체를 채취하여야 하는 단점이 있으며 항체 생산량도 극히 미량이다. 따라 서 병원성 항원에 대한 항체를 쉽게 생산하기 위한 방법으로 현재 산란계를 면역 처리하여 생성된 항체가 산란계의 계란내 난황에 고농도로 축적되는 점을 이용하여 항체를 획득하는 방법이 각광받고 있다. 특히 산란계의 난황에 존재하는 특이항체를 난황 면역글로불린(Immunoglobulin Yolk, IgY) 또는 난황항체라고 하는데, 이는 산란계의 혈청에 존재하는 특이항체인 면역글로불린(IgG)이 계란의 난황으로 이동되어 생성되는 항체이다.

계란 난황에 함유된 수용성 단백질인 알파, 베타, 감마-리베틴(α, β, γ-livetin)은 산란계 혈청으로부터 유래된 알부민, 알파, 2-글리코단백질(α, 2-glycoprotein) 및 혈청 IgY와 동일하다는 것이 면역학적으로 증명되었다. 또한, 최근들어 항 헬리코박터 파일로리 항체를 함유하는 계란이 개발된 이후, 각종 항원에 대한 특수 면역 항체를 함유하는 기능성 계란에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

국내에서도 병원성 미생물을 항원으로 하여 산란계의 계란으로부터 난황항체를 수득하는 방법 및 이를 포함하는 조성물 또는 식품 등의 개발이 활발히 이루어지고 있다(대한민국 특허등록 제 10-0364198호, 제 10-0324441호 등).

상기 언급된 계란유래의 난황항체는 대량 제조하여 생산하기에 적합하므로 식품 등에 이용 가능하며, 일반적으로 항체함유 계란의 난황부분을 액상형태로 식품에 첨가하거나 스프레이 건조나 동결건조에 의해 건강식품이나 가축사료첨가용으로 이용되고 있다. 난황항체의 적용분야가 광범위해짐에 따라 화장품과 제약원료로 이용하기 위해서는 적용제형 특성상 난황으로부터 난황항체를 효율적으로 대량 분 리해야 한다. 난황항체 분리의 관건은 항체를 포함하는 수용성 단백질 부분과 지질 등을 포함하는 불용성의 성분을 얼마나 효율적으로 분리하느냐와 함께 생산비용이 저렴한 건조방법에 있다. 유기용매를 이용한 방법 또는 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용한 침전법과 카라기난(carrageenan)과 원심분리를 이용한 방법 등 많은 방법들이 시도되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 모두 원심분리법이 병행되어야 하는데 대량 공정을 위한 원심분리의 경우 경제적으로 적용에 문제가 있을 뿐만 아니라 유기용매나 침전제의 사용은 화장품, 식품, 제약에 사용하는데 제약이 된다. 또한 원심분리없이 수소이온 농도를 조절한 이온수를 이용하고 카라기난을 이용하여 불용성의 지질과 단백질의 침전을 증가시킨 다음 수용성 상층액에 열안정성 목적으로 당을 첨가하여 건조하는 방법이 제시되었으나(공개특허 10-2004-0074145), 대량공정시 원심분리와 막 분리없이 카라기난 첨가만으로는 고순도의 항체단백질 생산에 한계가 있으며 카라기난 첨가에 따라 항체역가가 저하될 뿐만 아니라 저렴한 비용으로 수용성이 우수한 고역가의 항체생산을 위해서는 효율적인 항체단백질의 대량생산 기술뿐만 아니라 저렴한 비용의 건조방법이 필요하다.

본 발명자들은 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분리 및 분무건조에 의한 제조방법에 관한 것으로써, 본 발명에 의한 특이 난황항체 함유 난황으로부터 난황항체의 대량 분리 제조방법 및 건조방법을 이용하면 높은 항체역가와 수용성이 높으면서도 경제적인 대량 제조공정이 가능하게 되므로 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 산란계에 병원성 항원을 주입하여 생산된 면역란의 난황으로부터 항체단백질의 대량분리 제조시 가장 큰 걸림돌인 항체를 함유하는 수용성 단백질층과 지질층을 분리하는 방법과 비용 및 효율적인 측면에서 효과적인 분무건조에 의한 건조단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분리 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 특이 난황항체 함유 계란의 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분리 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 (1)산란계에 병원성 항원을 주입하여 면역란을 생산하는 단계와; (2)상기 면역란에서 난황을 분리하는 단계와; (3)난황액과 정제수를 1:6 내지1:8 비율로서 희석하여 교반기로 혼합한 다음 1M 시트릭산 용액을 이용하여 혼합 난황액을 pH 4.0-5.0으로 조정한 다음 1시간 동안 교반하는 단계와; (4)동결 및 해동에 내구성이 있는 100 kg 용량의 스테인레스 재질 통을 이용하여 혼합용액 80kg을 담은 후 -25℃ 조건에서 15시간 동결처리 후 상온에서 해동시키는 단계와; (5)침전부분인 지질층과 난황항체가 함유되어 있는 상층액을 분리하여 얻은 상층액을 저온살균(60-65℃)한 다음 덱스트린, 글루코스, 트레할로스 등과 같은 당을 7-50％ 첨가하여 분무건조시켜 항체단백질 분말을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분리 제조하는 것으로 구성되어 있다.

본 발명에서는 일반적으로 난황의 지질층의 침전목적으로 사용되는 카라기난 을 이용하지 않았는데 이는 냉장이나 상온에서 정치시 층분리가 일어나지 않아 카라기난 사용시 원심분리 또는 필터링(filtering) 과정을 필수적으로 거쳐야 됨을 확인하였고, 원심분리를 하지 않고 필터링(filtering) (0.45㎛)시에는 상층액은 깨끗이 분리되었으나, 자주 교환해야하는 단점이 있기 때문이다.

본 발명에서는 산처리만을 하여 난황항첼르 함유한 상층액을 분리하였는데 적정비율은 1:6-1:8이 비율로 난황액과 정제수의 비율을 통해 분리하였다.

본 발명에서는 얻어진 난황항체 함유 상층액의 고형분 함량이 평균 0.7-0.9％로서 분무건조가 어려워 생산비용이 높은 동결건조 방식을 배제하고 고형분 제고를 목적으로 덱스트린, 글루코스, 트레할로스와 같은 당류를 7-50％ 첨가하여 분무건조를 통해 시제품을 제작하였다.

따라서, 본 발명에서는 결론적으로 대량생산과정에서 현실적으로 적용이 어려운 원심분리 또는 필터링(filtering) 방법을 배제한 물리적 방법(냉동 및 해동)에 의한 난황항체 함유 수용성부분의 분리 및 당 첨가에 의해 분무건조 방법에 의해 효과적으로 난황항체 함유 제제를 제조할 수 있었다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 실시예의 결과나 본 발명의 청구범위에 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1 : 산처리와 물리적 방법을 이용한 난황항체의 분리〉

대장균 K88 유래 장점막 점착인자인 섬모단백질을 항원으로 하여 프레운즈 컴플리트 어쥬번트(Freund's complete adjuvant)와 1:1의 비율로 혼합하여 1차 면 역 후 프레운즈 인컴플리트 어쥬번트(Freund's incomplete adjuvant)와 혼합한 항원을 2주 간격으로 2회 산란계에 추가면역한 후 접종항원에 대한 항체역가를 조사한 후 면역계란을 수거하였다. 수거된 면역계란을 할란하여 난황만을 분리한 후 혼합하여 난황액을 제조하였다. 얻어진 난황액 20L에 정체수를 이용하여 1:7의 부피비율로 희석한 후 교반기로 혼합한 다음 1M 시트릭산(1M citric acid) 용액을 이용하여 pH 4.5로 조정한 다음 1시간 교반 후 100L 용량의 통에 80L씩 담아 15시간 동안 냉동시켰다. 냉동 후 상온에서 해동하여 불용성의 지질층은 제거하고 항체가 함유된 수용성의 상층액만을 수득하였다. 수득한 상층액은 저온살균(60-65℃)을 실시하였다.

〈실시예 2 : 분무건조법에 의한 건조〉

실시예 1에 의해 제조된 난황항체 함유 상층액 10L씩에 당으로서 덱스트린을 각각 7％, 10％, 15％, 20％, 30％, 40％, 50％ 수준으로 혼합하여 분무건조시켰다. 분무건조하여 얻은 시료를 항체역가, 수율 등을 조사한 결과 [표1] 에 나타낸 바와 같이 무첨가대비 항체역가가 5％ 이상인 7-50％ 수준으로 첨가시키는 것이 적합한 것으로 나타난다.

항체역가 조사는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법으로 실시하였다. 측정하고자 하는 항원이 5㎍/㎖이 되도록 카르보네이트-바이카르보네이트 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 마이크로플레이트(MicrotestⅢ flexible Assay plate, Falcon 3991)에 4℃에서 하룻밤 동안 방치하여 피복한 후 PBST를 이용하여 여분의 항원을 세척해 내고, 5％ 탈지유 용액(pH 7.3)으로 2시간 동안 실온에서 방치하였 다. 분리한 상층액은 5％ 탈지유 용액과 PBST(Tween-20 0.05％ 함유 인산 완충용액)를 동량으로 섞은 희석용액으로 3배수로 희석한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체로 AP Conjugated rabbit anti-chicken IgY(IgG)(Jackson, USA)를 사용하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 기질용액으로 phosphate substrate tablet(p-nitrophenyl phosphate, Pierce-ImmunoPure PNPP tablets)를 10％ diethanolamine(0.5mM MgCl₂ [pH9.8] 함유)에 녹인 용액을 사용하여 20분간 효소 반응시킨 후 5M NaOH를 사용하여 효소 반응을 중지시켰으며, 마이크로플레이트 리더(BIO-TEK instrument inc., EL800)를 이용하여 405nm에서 항체역가를 측정하였다.

[표1] 분무건조법에 의한 수용성 난황항체 제조

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 난황으로부터 난황항체의 대량 분리 및 분무건조 제조방법을 이용하면 높은 항체역가를 유지하면서도 경제적인 대량생산공정이 가능하게 되므로 식음료, 화장품 및 약품소재 등 다양한 제품소재로 폭넓게 적용 가능하여 이에 따른 매출증대 효과를 가져올 수 있다.

Claims (2)

1. (1)산란계에 병원성 항원을 주입하여 면역란의 생산 및 난황을 분리하여 난황액을 제조하는 단계와;

   (2)난황액과 정제수를 1:6 내지 1:7 비율로서 희석하여 교반기로 혼합한 다음 1M 시트릭산 용액을 이용하여 혼합 난황액을 pH 5.0 이하로 조정하여 1시간동안 교반한 후 동결 및 해동시켜 난황항제를 함유하는 수용성 단백질 상층액을 분리하는 단계와;

   (3)얻어진 상층액을 저온살균(60-65℃)한 다음 분무건조를 위한 부형제로서 당을 적정량 첨가한 후 분무건조시켜 항체단백질 분말을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분리 및 건조방법.
2. 제1항에 있어서, 난황항체 함유 상층액에 당을 7-50％의 비율로서 첨가하여 분무건조시키는 것을 특징으로 특이 난황항체 함유 난황으로부터 항체 단백질의 대량 분무건조 제조방법.