JP6903774B2 - 経口送達のための安定なプールされた母乳抗体 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１３日に出願された米国特許出願第６２／５１８，６３１号の優先権を主張する。

本発明は、母乳由来の抗体製剤を対象とする。
特に、経口摂取に対して改善された安定性を有する母乳由来の抗体製剤に関する。

公衆衛生協会（ＡＰＨＡ）（American Public Health Association、2007）は、ヒトの乳は、ヒトの乳児のほとんど全てに最も適切な食品であり、重要な予防的健康手段であることを認識している。しかしながら、母乳の授乳に対する社会的、経済的、教育的、制度的、および政治的障壁は、ヒトの乳が十分に利用されていないことを意味し、したがって、母親およびその子孫の両方における慢性疾患のリスクが継続する。

現在のところ、（ａ）ヒト母乳試料の収集、（ｂ）ヒトの健康に有益な特性を有することが知られている抗体の１つ以上の前記試料からの抽出、（ｃ）それら由来の抗体の任意の特徴付け、および（ｄ）貯蔵および簡単な、好ましくは経口摂取を可能にするための適切な貯蔵寿命を有する安定な送達系へのそれら由来の抗体の減少について、容易に入手可能な方法は知られていない。

免疫グロブリン抽出およびエンドトキシンの特徴付けは、血清または細胞培養上澄み液などの生物学的試料について記載されているが、これらの抽出および特徴付けプロトコルは、その独特の特性のため、母乳には容易に適用されない。これらの独特の特性には、とりわけ、抗体濃度、ｐＨ、脂質濃度、粘度、および糖含有量が含まれる。

長期間の保存に耐えることができ、経口摂取に適した母乳由来のプールされた抗体製剤を産生する方法が必要とされている。母乳の重要な成分の精製および貯蔵のためのこのような方法は、乳児、小児、および成人の母乳の利益へのより良い接近に寄与し、それによって公衆衛生を改善することができる。

哺乳動物ドナーから一定量の乳を収集する工程と、一定量の乳の非殺菌試料を精製して抗体画分を抽出する工程と、抗体画分を特徴付けて存在する抗体の型を決定する工程と、経口剤形の調製に使用するための抗体のプール組成物を提供する工程とを含む、熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに提供されるのは、熱安定性抗体組成物を調製する方法であって、前記熱安定性抗体組成物は、室温で少なくとも２週間安定である。

さらに提供されるのは、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法であり、ここで、抗体画分は、存在する抗体の量を決定するためにさらに特徴付けられる。

さらに、哺乳動物ドナーがヒトである、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに、抗体画分が非特異的である、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに、非殺菌試料が硫酸アンモニウム沈殿を用いて精製される、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに、非殺菌試料を、硫酸アンモニウム沈殿を用いて約４５％〜６５％の硫酸アンモニウム濃度で精製する、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに、非殺菌試料が硫酸アンモニウム沈殿を用いて約６５％の硫酸アンモニウム濃度で精製される、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法が提供される。

さらに提供されるのは、抗体のプールされた組成が少なくとも約９０％のＩｇＡである、上記の熱安定性抗体組成物を調製する方法である。

さらに、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物が提供される。

さらに、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物であって、熱安定性組成物が室温で少なくとも２４時間安定である、熱安定性組成物が提供される。

さらに、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物であって、熱安定性組成物が室温で少なくとも２週間安定である、熱安定性組成物が提供される。

免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物であって、免疫サプリメントが経口剤形である組成物がさらに提供される。

さらに、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物が提供され、ここで、約４５〜６５％の硫酸アンモニウム濃度での硫酸アンモニウム沈殿が、抗体の非特異的分取およびエンドトキシン減少の目的のために使用される。

さらに、硫酸アンモニウム濃度が約６５％である、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物が提供される。

さらに、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物が提供され、ここで、エンドトキシン減少が、低温殺菌されていないヒト母乳の量に対して少なくとも６９％である。

さらに、上記の熱安定性組成物を用いて製造された免疫サプリメント経口剤形が提供される。

さらに、上記の方法に従って製造された免疫サプリメント経口剤形が提供される。

硫酸アンモニウム沈殿の使用は、さらに、約４５〜６５％の硫酸アンモニウム濃度で提供され、免疫サプリメントの調製において使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物を調製する。

さらに、約６５％の硫酸アンモニウム濃度で硫酸アンモニウム沈殿を使用して、免疫サプリメントの調製に使用するための、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの熱安定性組成物を調製することが提供される。

単なる例示として好ましい実施形態を示す図において、図１は、全乳（カラム１〜２）、清澄化乳（カラム３〜４）、または３０％もしくは４０％硫酸アンモニウムで沈殿させた母乳試料からヒト母乳由来抗体を検出するためのウェスタンブロットである。 図２は、図１と同じ実験設定であるが、４５％および６５％の濃度のより高い硫酸アンモニウムを用いて、ヒト母乳由来抗体を検出するためのウェスタンブロットである。 図３は、陰性対照としてゲルを用いてヒト母乳由来抗体を検出するためのウェスタンブロットであり、一次抗体は排除されたが、二次抗体は保持された。 図４は、大腸菌エンドトキシン標準サンプルを、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）発色性エンドトキシン定量キット上で実行したことを示す表である。 図５は、図４（カラムＥ）において算出された標準曲線値を示すグラフであり、光学吸光度値（４１０ｎｍで）が縦軸にプロットされ、エンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍｌで）が横軸にプロットされている。 図６は、各処理段階（全母乳；清澄乳；アンモニウム沈降Ｉｇ；カラム精製Ｉｇ）から測定されたエンドトキシンレベルを示す表であり、式中、「Ｉｇ」は免疫グロブリンの略であり、抗体と同義語である。 図７は、母乳由来抗体の熱安定性試験に適した試薬条件を同定するためのアッセイの展開およびアッセイ結果を示す表である。 図８は、異なる温度条件および異なる長さのインキュベーションを比較することによって母乳由来抗体の熱安定性を試験するためのアッセイ模式図を示す表であり、ここで、各抗体条件は、三重で試験された。 図９は、図８の模式図に対応する、（４０５ｎｍでの）試料吸光度測定値の表である。 図１０は、図８および９のカラム１〜３に対応する、ストック抗体試料の吸光度値の平均および標準偏差誤差バーを有するグラフである。 図１１は、図８および９のカラム４〜６に対応する、１／１０希釈抗体試料の吸光度値の平均および標準偏差誤差バーを有するグラフである。

本明細書には、熱安定性特性を有する母乳抗体の新規な安定化方法が記載されている。また、本明細書には、母乳ドナーと同様の領域内にレシピエントが位置する場合に最大の利益が生じ得る新規な地理的分類が記載されている。母乳のこのような地理的特徴付けを通じて、レシピエントは、これらの抗体が、レシピエントが曝露される可能性が高い病原体に対して反応性である場合、抗体サプリメントから利益を得ることができ、この可能性は、レシピエントが、地理的に抗体ドナーに近接しており、したがって、同じ病原体に曝露される可能性が高い場合に最も高い。とりわけ、高度、地理的特徴、湿度などの要因は、病原体の拡散に影響を及ぼす可能性があり、したがって、互いに近接して生活または仕事をしている人々は、遠く離れて生活または仕事をしている人々と比較して、同じ病原体に遭遇する可能性がより高い。

母乳から母親の抗体を抽出し、精製し、安定化するための新規な方法を構成する様々な工程が、組み合わされた場合に、本明細書に記載される。母乳の様々な特性（粘性、抗体組成、抗体濃度、および抗体力価を含むが、これらに限定されない）は、血清またはハイブリドーマ上澄み液とは異なり、したがって、母体抗体捕捉に特異的なプロセスは、当技術分野では以前には知られておらず、（非母体）抗体捕捉の現存する方法とは異なる。

好ましい実施形態では、乳からの免疫グロブリン抽出は、（１）本明細書の実施例に記載される乳清澄化工程、および（２）析出のための６５％硫酸アンモニウムの使用を含み、これらの両方は、公知の血清またはハイブリドーマ関連技術とは異なる。

本明細書中に記載される本製剤の好ましい実施形態は、抗体調製物の開発において進行中の課題である抗体の長期保存（理想的には室温で）を提供する。
例えば、２０１４年には、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された１つの経口製剤化ペプチドのみが存在し、劣化に抵抗する経口タンパク質療法を送達する際に薬学界が直面する困難を強調している。

本明細書中に記載される好ましい実施形態の製剤およびプロセスは、ＩｇＡサブタイプ抗体（例えば、この抗体を包装して、有利な熱安定性および容易な運搬を提供し、より大きな地理的分布に関する母乳免疫の利点を拡張し、そして乳製品で生じる腐敗を最小化／排除する）のための改善された安定性を提供する。

本明細書中に記載されるプロセスは、生化学的技術および分析技術を組み合わせて、ヒトを含む哺乳動物の母乳から天然に存在する母体抗体を抽出する。
本明細書中に記載される製剤およびプロセスは、ヒトの摂取のために処方されるヒト抗体に特異的であるが、このコンセプトは、乳を産生する他の哺乳動物に適用され得る。例えば、本明細書中に記載される製剤およびプロセスは、ウシのために処方されたウシ抗体またはヒツジのために処方されたヒツジ抗体を送達するために提供され得る。

さらに、ヒトレシピエントがヒト抗体から利益を得るのと同様に（ヒトに感染することが知られている病原体に対して防御するので）、異なる種から抗体を消費することに利益があり得る。例えば、一部のウシ免疫グロブリン製品は、消化能が損なわれているヒト患者の腸疾患を管理するために使用される血清由来ウシ免疫グロブリンのように、ヒトの消費のために設計されている。

試料収集
本発明の一実施形態では、母体抗体の抽出工程は、哺乳動物ドナーからの母乳の収集から始まる。母乳は、物理的刺激、機械的ポンプ装置、これらの組み合わせ、または乳管からの母乳の流れを刺激する任意の他の方法を使用することによって、母乳から搾り出されてもよい。この実施形態では、好ましい作業の流れは、（１）試料を収集すること、（２）冷凍を介して試料を移送すること、（３）収集後すぐに乳を製剤に処理することであってもよい。試料処理が急速に（すなわち、同日に）生じ得ない状況では、試料は、（輸送中に）冷蔵され、次いで、処理の準備ができるまで凍結され得る。あるいは、試料は、取得直後に直接的に凍結されてもよい。全体的な目標は、母乳全体が周囲室温またはそれに近い時間を最小限に抑えることである。好ましくは、母乳の凍結／解凍サイクルは、母乳中の抗体の構造を損傷し得るので、回避される。

母乳の滅菌収集を促進するために、母乳および乳首は、アルコール拭き取り用品または他の洗浄剤で処理される。ヒトの皮膚表面を滅菌／消毒するためにすでに使用されている、アルコールワイプまたは石鹸を含む洗浄剤が、このために適している。しかしながら、強酸および塩基類は、試料加工前に収集された母乳試料のｐＨおよび／または酸性度に影響を及ぼす可能性があるので、避けるべきである。

同様に、母乳の流れを促進するために使用されるポンプ装置は、乳房に適用される前に、洗浄剤で拭かれるか、または一般的な消毒技術で滅菌されるべきである。

この実施形態において、母乳は、適切なバッグまたは容器に収集され得る。バッグまたは容器は、（限定されないが）プラスチック、金属、ポリマー、またはそれらの組み合わせなどの材料から作製されてもよく、好ましくは、種々の温度に対する耐性および抗体との交差反応性の欠如に基づいて選択される。例えば、市販の母乳貯蔵バッグは、典型的には、容易な貯蔵のために可撓性であり、漏れを防ぐために二重ジッパーシールを有し、室温（約２５℃）、冷蔵（約４℃）、および凝固点温度（約−１８℃未満または約−１８℃）を含む種々の温度で安定である。

抗体の安定性を最大にし、抗体分解を最小にするために、凍結温度は、数日を超えて母乳を貯蔵するための好ましい条件である。しかしながら、他の条件（例えば、冷蔵または室温）下での母乳の貯蔵は、特に、冷蔵または室温下で費やされる保存時間が制限される場合、抗体抽出方法と依然として適合し得る。

他のミルク処理プロトコルとは異なり、本発明の工程では低温殺菌を行わないことが重要である。低温殺菌熱処理プロセスは、抗体を変性／分解し、これは、本明細書中に記載される抗体保存および安定化戦略と適合しない。

抗体抽出（精製）
抗体の摘出または精製（純化）方法は、粗（非特異的）から高度に特異的まであり得る。本明細書中で使用される場合、「粗」は、抗体サブタイプを区別せず、そして多数の（または全ての）抗体サブタイプを保持する一方で、「特異的」は、以下に記載されるように、クラス特異的または抗原特異的親和性を指し得る。

好ましい実施形態では、抽出工程の全体的な目標は、（１）対象の成分、例えば抗体、好ましくは全ての母乳抗体サブタイプを捕捉すること、（２）全ての他の望ましくない成分、例えば水、脂肪、糖、タンパク質、小分子、および試料を汚染している可能性がある任意の病原体または他の環境化合物を洗い流すこと、（３）精製された抗体画分を溶離（収集）すること、である。本発明の好ましい方法は、抗体の可能な限り広いスペクトルを捕捉するように設計される。したがって、最大の抗体捕獲を容易にする非特異的方法が好ましい。好ましくは、全ての抗体は、病原体に対する防御を最大限にし、全抗体回収を最大限にするために、それぞれの母乳試料から収集され得る。したがって、より制限的なクラス特異的親和性精製法と比較して、粗なパン抗体精製方法が本発明の目的にとって好ましい。

以下は、母乳から抗体を捕捉するために使用され得る抽出方法である。

−物理化学的分画は、試料から特定の成分（抗体など）を分離するための物理的方法、化学的方法、電気的方法、またはそれらの組み合わせを指す。これは、抗体の析出（例えば、硫酸アンモニウム析出）、サイズ排除（例えば、透析法メンブラン、サイズ排除樹脂、および高分子量カットオフを有するダイアフィルトレーション装置）、固相結合（例えば、固定化メタルキレートクロマトグラフィー）、または電荷による分離（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）を指し得る。好ましくは、硫酸アンモニウム沈殿、透析法精製、および免疫グロブリンカラム結合精製が使用される。

−クラス特異的親和性精製は、特定の標的クラスの全ての抗体を捕捉する固相結合および／または生物学的リガンド（例えば、ジャカリン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌ）を指し得る。５つの主要な免疫グロブリンクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらは、それらの重鎖によって区別される。

−抗原特異的親和性精製は、特定の抗原にのみ結合する抗体の摘出を指すことができる（抗体のクラスまたはアイソタイプに関係なく）。例えば、目的の抗原は、対応する抗原特異的抗体の精製および溶離を可能にする、固相支持体表面上、樹脂上、またはビーズ上に固定化され得る。

−ネガティブ選択とは、母乳の望ましくない成分（例えば、アルブミンおよびカゼイン）を取り除くことをいう。（１）有益な栄養効果および／または免疫効果に寄与しない可能性があり、および／または（２）それらの存在が、目的の精製母乳抗体を安定化および／または処方するための努力を複雑にする可能性があるため、特定の成分を除去することが望ましい場合がある。

抗体のキャラクタリゼーション
以下の方法を使用して、母乳由来の抗体を特徴付けることができる。これらの方法の各々は、抗体試料の構造または純度について独特の知見を生じる。それらは、採取された抗体が完全な状態（劣化）および汚染の要件を満たすことを確実にするために使用され得る。

−マススペクトロメトリー（ＭＳ）は、タンパク質、ペプチド、およびアミノ酸残留分量での抗体調製物の生物物理学的特徴付けのために使用することができる。この手段は、より高次の構造、凝集、および複合体形成を評価するために使用され得る。例えば、ＭＳを使用して、抗体が完全であるか、またはより小さなペプチドまたはアミノ酸に分解されたかどうかを測定し得る。

−収率および力価の判定：関連する用語の収率および力価は、重要な差異を有する。収率は、最終調製物中の全抗体量を指し、抗体濃度に体積を乗じたものとして計算される；抗体濃度は、光計測から得られる。しかし、濃度および収率は、この調製物における抗体分子の機能的活性を説明しない。機能的活性または力価は、特定の抗原に対する抗体溶液の機能的濃度または希釈因子である。ＥＬＩＳＡイムノアッセイにベース希釈系列は、力価を決定し得る一般的な方法である。

汚染の評価および封じ込め：抗体などの生物由来抽出物は、しばしば、ウイルス、真菌、寄生虫、細菌、およびエンドトキシンとしても知られる細菌リポ多糖（ＬＰＳ）を含む（しかし、これらに限定されない）微生物による汚染について試験される。抗体精製プロトコルのエンドトキシン除染の利点を実証するアッセイが好ましい。商用グレードの抗体精製プロトコルは、現行の良好製造実務（ＣＧＭＰ）要件に従うものとし、これは、生成物の保護および汚染の防止を助けるための予防手段および予防措置として役立つ。ＣＧＭＰ実施により与えられる保護を超えて、精製キットを用いて、例えば、本明細書に記載の生物由来抽出物からＬＰＳを除去することもできる。

−Ｘ線構造解析：結晶学は、分子の３次元構造を評価することができる技術であり、抗体の構造を誘導するために歴史的に使用されてきた。これは、精製された抗体が、前述の純化工程の後に、それらの典型的なＹ字形の構造を保持しているかどうかを決定するために使用され得る。

抗体配合組成および投与経路
多くの管轄区域において、経口摂取（液体、錠剤など）は、製品が栄養補助食品として分類されるための規制要件である。したがって、経口摂取は、使用者の利便性、およびその後の使用者のコンプライアンスに加えて、本実施形態による栄養補助食品のための好ましい製品送達システムである。ＩｇＡに富む母乳の消費量は、母親の抗体を得るための簡単な方法であるが、（１）経時的に乳汁が腐敗する、（２）成人は母乳を飲むことが不快である、および（３）母乳ドナーは、無菌の乳の取り扱いに起因して、または乳汁自体中の病原体の豊富さに起因して、汚染物質または病原体を突然通過させる可能性がある。

乳由来抗体は、（例えば）乳であってもよい意図された希釈剤中でのそれらの溶解性を最大にするように製剤化されてもよい。抗体配合組成はまた、胃、小腸、および大腸にわたってｐＨが異なることが知られている胃腸管における抗体の安定性を最大にするように設計することができ、ヒトまたは非ヒトの乳児、小児、青年、および成人などの異なるレシピエントに対して改変することができる。例えば、子供はゴム状の形成を好むかもしれず、一方、成人は粉末またはカプレットを好むかもしれない。これらの製剤等について以下に説明する。さらに、この製剤は、レシピエントの胃腸組織による抗体のその後の取り込みを促進するように設計され得る。例えば、抗体製剤は、抗体の活性および安定性を促進するために、消化管のｐＨおよび／またはプロテアーゼ活性を一時的かつ安全に変化させるために、例えば、重炭酸ナトリウム（ベーキングソーダ）の用量と共に摂取され得る。

記載された製品は、（１）抗体が母乳の天然に存在する成分であり、（２）母乳が消費に安全であり、（３）外因性または合成成分が添加されていないので、一般に安全であると認識されるべきである（ＧＲＡＳ）。以下は、好ましい実施形態による母乳由来の抗体についての適切な経口製品製剤であり得、それぞれが特定の利点を有する。

タブレット：これらは、多くの異なる形状およびサイズで入手可能であり、長期間安定であり、製造が簡単である：１つ以上の活性成分を、いわゆる賦形剤（タブレットを一緒に保持するのを助ける担体物質）と組み合わせ、次いでタブレット形態に圧縮する。錠剤は、コーティングされていても、コーティングされていなくてもよい。塗装は、湿気を防止し、細菌汚染を遮断し、嚥下を容易にし、および／または胃酸から保護することができる。

ｉ．発泡性錠剤：発泡性（発泡）錠剤を、グラスの中の飲用水に溶解する。それらは嚥下が困難な人によく適しており、薬物が胃に到着するまでに既に溶解しているので、非発作性タブレットよりも速い効果を有することができる。

ｉｉ．チューアブル錠剤およびトローチ剤：これらは、喉において作用を有することが意図される活性成分、例えば、喉痛、または口腔内層を介して吸収され得る活性成分を含む。これらの錠剤を噛むか、または吸引する。

ｉｉｉ．舌下（Sublingual）錠（ラテン語の下位語から、「sub」は「下」を意味し、「lingual」は「舌」を意味する）：これらの錠剤は、舌の下で溶解し、活性成分は、口の内層を介して直接吸収される。

カプセル、ソフトゲル＆ゲルキャップ（Gel cap）：カプセルは、通常はゼラチン製のシェルを有し、シェルの内側には、粉末、顆粒または液体の形態の薬物がある。シェルは、胃または腸内で溶解し、次いで活性成分を放出する。カプセルは、長期間持続し、無味であり、感受性の高い活性成分は、カプセル中に良好に保たれる。チューアブルカプセルはまた、口の内層を通じた活性成分の吸収を促進し得る。

徐放性錠剤およびカプセル剤：徐放性（持続放出性）錠剤およびカプセル剤は、それらの活性成分をより徐々に放出するように設計され、これは、所与の期間をカバーするために必要な用量の数を減少させることができる。

粉末及び顆粒、茶、滴剤、液体：
ｉ．粉末および顆粒：粉末または顆粒形成の薬物は、通常、飲み込むために水に溶解される。一例は、ビタミンＣ粉末である。

ｉｉ．茶：活性成分を放出するために温水に入れられる乾燥植物材料の混合物。植物抽出物または精油を含有するインスタントティーもある。

ｉｉｉ．滴剤：液体自体が医薬品の有効成分であるか、または有効成分が液体、通常は水または水とアルコールの混液に溶解されているかのいずれか。
用量は、滴数で付与される。

ｉｖ．液体およびシロップ：液体製品では、１つ以上の活性成分は、通常、水に溶解または懸濁される。液体自体が活性成分であってもよい。これらの形態は、錠剤の嚥下に問題がある人々に一般的である。薬物を含む濃縮糖溶液はシロップと呼ばれ、小児用製品に一般的である。

実施例
硫酸アンモニウム及びカラム精製
ヒト母乳試料を、初乳および乳から全ての脂肪を除去するために、１３，０００ｒｐｍで６０分間の遠心分離によって清澄化した。清澄化（脂質およびカゼインなどの固形粒子の除去）後、硫酸アンモニウム析出［ＡＳＰ］（Grodzki & Berenstein、2009）を抗体の析出に使用した。４０〜４５％の範囲の硫酸アンモニウムが、血液血清からのＩｇＧの析出について記載されているが（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，２００１）、より広い範囲の硫酸アンモニウム濃度が、この実施形態の目的のために使用され、血液血清とは対照的に、母乳から得られた抗体についての最適条件を同定した。

ＡＳＰに続いて、試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析して硫酸アンモニウムおよび他の残留分を除去し、次いで、一般的な製造業者のプロトコル（Thermo Fisher Scientific, 2018）に従って、セファロース４Ｂに結合したＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭに対するパン−ヒト捕獲抗体を含む免疫グロブリン［Ｉｇ］精製カラムで抗体をさらに富化した。ｐＨ２．８のカラム溶出緩衝液（これは、ハイブリドーマ由来の抗体溶出のための標準である）を、ｐＨ４．０に対して比較した。ｐＨ２．８緩衝液は、ウェスタンブロットによって示される抗体捕捉を促進したが（図１〜２）、ｐＨ４．０は、溶出液中に検出可能な抗体を生じなかった。ウェスタンブロットによって検出された抗体試料を定量するために、最適濃度測定［ＯＤ］を用いて、タンパク濃度を測定し、０．１ｍｇ／ｍｌの読み取り値を得て、本明細書に記載のＡＳＰおよびＩｇの精製方法がヒト抗体を産生することを確認した。本明細書中に概説される精製工程の完了後、抗体試料を、当業者によって「生理食塩水」または単に「緩衝液」とも呼ばれるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。

図１〜３は、母乳由来抗体を検出するためのウェスタンブロットを示す（１０％還元条件；１０秒画像露光）。図１に示すように、全母乳（カラム１〜２）、清澄乳（カラム３〜４）、または３０％または４０％硫酸アンモニウムで沈殿させた母乳試料（カラム５〜１２）からのヒト母乳由来抗体を、Ｘ軸に沿って示される希釈で検出するために、パンーヒト免疫グロブリン検出抗体を使用した。
Ｉｇカラム精製後、試料をウェスタンブロットによりアッセイして、上澄み液（カラム７、８、１１、１２）よりも沈殿したペレット（カラム５、６、９、１０）中に抗体がより多く存在する濃度を同定した。市販のヒトＩｇＡを陽性対照として使用した（カラム１３、１４）。

図２は、図１と同じ実験設定を有するが、より高い硫酸アンモニウム濃度４５％および６５％を有する。これらの条件の両方が図１でアッセイした濃度よりも優れていたが、６５％硫酸アンモニウムが、沈殿したペレット中に最大信号が存在し（カラム５、６）、上澄み液中に最小信号が存在する（カラム７、８）最適条件であった。市販のヒトＩｇＡを陽性対照として使用した（カラム９、１０）。血清免疫グロブリン析出について以前に記載された４０〜４５％の範囲より上および下の両方のアンモニウム割合を、この実施例の目的のために使用した。
母乳試料からの抗体析出は、血清または細胞培養上澄み液からの抗体析出とはかなり異なる可能性があることが予想された。母乳は、特徴的な抗体濃度、ｐＨ、粘性、糖含量、汚染物質の濃度などを有するので、母乳に使用する最適なアンモニア試薬割合を経験的に決定する方法であった。実際、本明細書中に報告されるウェスタンブロット（図１および２）は、硫酸アンモニウム免疫グロブリン沈降の効率が、３０〜４０〜４５〜６５％硫酸アンモニウムから一貫して増加することを示す。６５％アンモニウム割合は、標準の４０％よりもはるかに大きく、血清抽出のために誘導されたプロトコルが母乳抽出のためにそれほど有効ではないことを確認する。

図３は、陰性対照としてのゲルを示し、ここで、一次抗体は除去されたが、二次抗体は保持された。このゲル上のバンドの欠如は、非特異的信号が存在しないことを示し；従って、以前のゲル中の信号は、真正の抗体検出を表す。

エンドトキシン除染
ＡＳＰ工程は、タンパク質溶解性を変更させ、凝集を促進し、これは、しばしば、該溶液からの「塩析」タンパク質と呼ばれる、タンパク質を沈殿させるのを助ける。病原体やその他の汚染物質のサイズ、凝集に対する感受性、溶解性、表面電荷が抗体とは異なることを考えると、バクテリア、ウイルス、およびアレルゲンなどの汚染物質は、抗体画分と共沈殿するとは予想されないであろう。しかし、上記のＡＳＰおよびＩｇの精製方法は、この実施例において、試料除染のさらなる予想外の利点をもたらした。これは、ポリクローナルの収集について予想外であり、母乳と血清または組織培養上清との間の多くの異なる特性を付与した。この利点を例示するために、この実施例では、エンドトキシン（環境に共通する細菌毒素）を母乳加工の各段階で測定した：全母乳、清澄母乳、硫酸アンモニウム沈降試料、およびＩｇカラム精製試料。図４〜６に示されるように、試料加工法は、最初の母乳試料と比較して６９〜８８％のエンドトキシンの低下をもたらした。注目すべきことに、これらの実験は、比較的高いバックグラウンドエンドトキシン量を有する標準的な非滅菌実験室条件で行った。この実施例の実験室試料試験結果は、３９〜３４３ＥＵ／ｍＬの範囲の内毒素であったが、製造級のＧＭＰクリーンルーム設備は、臨床ヒト用途に適した＜０．００５ＥＵ／ｍＬ〜＜１．０００ＥＵ／ｍＬの範囲の、はるかに低いエンドトキシンを有する最終物質を生成することができる。

図４〜６は、本明細書中の抗体精製方法がまた、汚染除去の利点を生じることを実証するためのエンドトキシン測定を示す。図４は、大腸菌エンドトキシン標準サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）発色性エンドトキシン定量キット上で実行したことを示す。このキットは、試料中のエンドトキシン濃度を、エンドトキシンの存在下で生成される発色信号と相関させることによって測定する。具体的には、試料中のエンドトキシンは、溶解物に含まれるＣ因子のタンパク質分解活性を活性化する。次いで、活性化されたＣ因子プロテアーゼは、キットの発色基質を切断し、これにより黄色の色彩が得られ、これを４１０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度により定量し、標準曲線に対して外挿することができる。

４つの濃度を使用し（カラムＡ）、２連で実行し（カラムＢ、Ｃ）、次いで平均した（カラムＤ）。カラムＥの補正値を使用して、図５の標準曲線を構築した。

図５は、図４（カラムＥ）で計算された標準曲線値をプロットで示す。光学吸光度値（４１０ｎｍで）を縦軸にプロットし、エンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍｌで）を横軸にプロットする。Ｒ２値は０．９９８３である。

図６は、好ましい実施形態の試料加工段階の各々から測定されたエンドトキシンレベル（全母乳；清澄乳；アンモニウム沈殿Ｉｇ；カラム精製Ｉｇ）を示す。最後の列に見られるように、加工試料は３９．４３〜１０５．５９ＥＵ／ｍｌであり、未加工母乳の３４３．３２ＥＵ／ｍｌから６９〜８８％減少した。

抗体分解アッセイ開発
母乳由来ヒト抗体の分解を測定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］を展開した（図７および８）。最初に、精製母乳ヒト抗体、続いて母乳ヒト抗体に対する一次（１°）抗体、続いて一次抗体に対する酵素結合二次（２°）抗体、続いてその酵素的切断が分光光度法によって検出可能であるｐＮＰＰ基質で、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングする。１°および２°抗体は、意図しない交差反応性を排除するために非ヒトである。無傷の母乳ヒト抗体の存在を、４０５ｎｍでの吸光度の分光光度読取りに従って定量した。

図７は、母乳由来抗体の熱安定性を試験するのに適した試薬条件を同定するためのアッセイの展開を示す。左側のＥＬＩＳＡプレート模式図に見られるように、Ａｌは、最高の吸光度シグナル（４０５ｎｍで）を有すると予想され、一方、他の全ての細胞は陰性対照である。研究１（中央のパネル）において、Ａｌは、最も高い吸光度信号を有するが、細胞Ａ２およびＢ２はまた、高い信号を有し、このことは、２°抗体が非特異的信号に寄与し得ることを示唆する。これは、研究２（右パネル）における２°抗体の濃度を減少させることによって対処され、これは、細胞Ａ２およびＢ２における非特異的信号を最小化した。これらの研究およびその後の研究は、好ましい実施形態の配合組成が母乳ヒト抗体に熱安定性を提供するかどうかを決定する最終ＥＬＩＳＡアッセイ（図８を参照のこと）において使用するための特異的条件を改良するのに役立った。

図８は、様々な温度および時間条件下で母乳由来抗体の安定性を試験するための模式図である。非希釈抗体を、カラム１〜３、列Ａ〜Ｅにおいて３連で試験した。１／１０抗体希釈を、カラム４〜６、カラムＡ〜Ｅにおいて３連で試験した。カラム７および８を、それぞれ、一次検出抗体および二次検出抗体を欠く陰性対照として使用した。抗体を以下の条件下でインキュベートした：最小抗体劣化に相関する標準的な保存抗体保管条件を表す一貫した冷蔵（列Ａ）；典型的には約２５℃である室温で２４時間のインキュベーション（列Ｂ）；抗体劣化の対照として６５℃で２４時間のインキュベーション（列Ｃ）；室温で７日間のインキュベーション（列Ｄ）；および室温で１４日間のインキュベーション（列Ｅ）。

図９において、各ウェルから得られた４０５ｎｍでの吸光度の読みを、図８のアッセイ図式上のそれぞれの位置にプロットする。

図１０および１１は、図９から得られた吸光度値の平均および標準偏差誤差バーをプロットしたものである。図１０は、図８および９のカラム１〜３に対応する、非希釈抗体からのデータのプロットである。図１１は、図８および９のカラム４〜６に対応する、１／１０希釈抗体からのデータのプロットである。

非希釈抗体（図１０）および１／１０希釈抗体（図１１）の両方について、室温での２４時間のインキュベーションは、抗体安定性に悪影響を及ぼさなかった（各図内の最初の２つのバーを比較されたい）。逆に、６５℃での２４時間のインキュベーションは、非希釈抗体および１／１０希釈抗体の両方について、室温での２４時間のインキュベーションと比較して、統計的に有意な減少（ｐ値＜０．０５）をもたらした（第２および第３のバーを比較）。この低下は、高熱への複数時間の曝露後に予想される抗体分解と一致し、図１０および１１において、このアッセイが無傷の抗体（第１のバー）と分解した抗体（第３のバー）とを区別することを証明する。

驚くべきことに、室温で１４日間インキュベートした抗体（第５のバー）は、劣化させていない抗体（第１のバー）および室温でわずか２４時間インキュベートした抗体（第２のバー）と同様の安定性を有した。さらに、室温で１４日間インキュベートした試料の安定性測定は、６５℃で２４時間インキュベートした試料よりも有意に大きく（ｐ値＜０．０５）、特定の方法で産生された抗体が、熱安定剤を必要とせずに、室温で２週間までの分解を回避することを確認した。

このように、例として本発明の様々な実施形態を詳細に説明してきたが、本発明から逸脱することなく変形および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。本発明は、添付の特許請求の範囲内に入るような全てのそのような変形及び修正を含む。

Claims (37)

1. 非抗体成分を実質的に含まないヒト抗体の組成物であって、硫酸アンモニウム沈殿により得られた、非殺菌母乳の試料に由来するヒト特異的免疫原性を有する精製ヒトＩｇＡを含み、該組成物は、全抗体の８１％超に相当する無傷の抗体を含み、該全抗体は、無傷の抗体および分解した抗体を含み、該組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、組成物。
2. 非抗体成分を実質的に含まないヒト抗体の組成物であって、所定の地理的領域でのヒトへの使用が示される経口配合組成の調製に使用するためのヒト特異的免疫原性を有する精製ヒトＩｇＡを含み、該組成物は、硫酸アンモニウム沈殿により得られた、所定の地理的領域に存在するドナーから得られた非低温殺菌ヒト母乳の試料に由来する精製ヒトＩｇＡであって、全抗体の８１％超に相当する無傷の抗体を含み、全抗体は無傷の抗体および分解した抗体を含み、該組成物は２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、組成物。
3. 無傷の抗体が、全抗体の少なくとも８５％を表す、請求項１または２に記載の組成物。
4. 無傷の抗体が、全抗体の少なくとも８８％を表す、請求項３に記載の組成物。
5. 無傷の抗体が非特異的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 少なくとも９０％の精製ヒトＩｇＡを有する抗体のプールされた組成物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 経口剤形の調製に使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 経口剤形用の非殺菌ヒト母乳の一定量から抽出された精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約４５〜６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
9. 経口剤形のための精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約４５〜６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、精製ＩｇＡは、所定の地理的領域に存在するドナーから得られた一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出され、経口剤形は、所定の地理的領域での使用が示され、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
10. 経口剤形用の精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、精製ＩｇＡは、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出され、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
11. 経口剤形のための精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、精製ＩｇＡは、所定の地理的領域に存在するドナーから得られた一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出され、経口剤形は、所定の地理的領域での使用のために示され、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
12. ヒトドナーから一定量の低温殺菌されていない母乳を採取し、
    硫酸アンモニウム濃度約４５％〜６５％で硫酸アンモニウム沈殿を用いて抗体画分を抽出するために一定量の低温殺菌されていない母乳の試料を精製し、
    存在する抗体の種類を決定するために抗体画分を特徴付け、
    経口剤形の調製に使用するためのプールされた抗体組成物を提供し、
    ここで、前記抗体組成物は２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、抗体組成物を調製するための方法。
13. 所定の地理的領域においてヒトドナーから一定量の低温殺菌されていない母乳を採取し、
    硫酸アンモニウム濃度約４５％〜６５％で硫酸アンモニウム沈殿を用いて抗体画分を抽出するために一定量の低温殺菌されていない母乳の試料を精製し、
    存在する抗体の種類を決定するために抗体画分を特徴付け、
    所定の地理的領域において使用するために示される経口剤形の調製に使用するためのプールされた抗体組成物を提供し、
    ここで、前記抗体組成物は２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、抗体組成物を調製するための方法。
14. 前記抗体画分が、存在する抗体の量を決定するためにさらに特徴付けられる、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記抗体画分が非特異的である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記試料が、硫酸アンモニウム沈殿を用いて約６５％の硫酸アンモニウム濃度で精製される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記プールされた抗体組成物が、少なくとも９０％のＩｇＡである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 一定量の低温殺菌されていない一定量のヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約４５〜６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
19. 経口配合組成の調製のための精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約４５〜６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、精製ＩｇＡは、所定の地理的領域に存在するドナーから得られた一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出され、経口配合組成は、所定の地理的領域での使用が示され、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
20. 精製ＩｇＡの組成物を調製するための硫酸アンモニウム濃度が約６５％の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、精製ＩｇＡは、一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出され、前記ＩｇＡの組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、前記使用。
21. 経口配合組成の調製のための精製ＩｇＡの組成物を調製するための、約６５％の硫酸アンモニウム濃度の硫酸アンモニウム沈殿の使用であって、所定の地理的領域に存在するドナーから得られた一定量の低温殺菌されていないヒト母乳から抽出された精製ＩｇＡ、経口配合組成は所定の地理的領域での使用について示され、前記ＩｇＡの組成物は２５℃で少なくとも１４日間の安定性を有する、前記使用。
22. ヒトドナーから一定量の低温殺菌されていない母乳を採取し、
    硫酸アンモニウム濃度約４５％〜６５％で硫酸アンモニウム沈殿を用いて抗体画分を抽出するために一定量の低温殺菌されていない母乳の試料を精製し、
    存在する抗体の種類を決定するために抗体画分を特徴付け、
    経口配合組成の調製に使用するためのプールされた抗体組成物を提供し、
    ここで、前記抗体組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、方法。
23. 所定の地理的領域においてヒトドナーから一定量の低温殺菌されていない母乳を採取し、
    硫酸アンモニウム濃度約４５％〜６５％で硫酸アンモニウム沈殿を用いて抗体画分を抽出するために、一定量の低温殺菌されていない母乳の試料を精製し、
    存在する抗体の種類を決定するために抗体画分を特徴付け、
    所定の地理的領域において使用するために示される経口配合組成の調製において使用するためのプールされた抗体組成物を提供し、
    ここで、前記抗体組成物は、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、方法。
24. 前記抗体画分が、存在する抗体の量を決定するためにさらに特徴付けられる、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記抗体画分が非特異的である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記試料が、硫酸アンモニウム沈殿を用いて約６５％の硫酸アンモニウム濃度で精製される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記プールされた抗体組成物が、少なくとも９０％のＩｇＡである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 非抗体成分を実質的に含まないヒト抗体の組成物であって、硫酸アンモニウム濃度約４５％〜６５％の硫酸アンモニウム沈殿により得られた非低温殺菌母乳の試料に由来するヒト特異的免疫原性を有する精製ヒトＩｇＡを含む組成物であって、全抗体の８１％超に相当する無傷の抗体を含み、全抗体が無傷の抗体および分解した抗体を含み、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、組成物。
29. 非抗体成分を実質的に含まないヒト抗体の組成物であって、所定の地理的領域での使用が示される経口配合組成の調製に使用するためのヒト特異的免疫原性を有する精製ヒトＩｇＡを含み、精製ヒトＩｇＡは、約４５％〜６５％の硫酸アンモニウム濃度を有する硫酸アンモニウム沈殿により得られた所定の地理的領域に居住するドナーから得られた非殺菌ヒト母乳の試料に由来し、組成物は、全抗体の８１％超に相当する無傷の抗体を含み、全抗体は無傷の抗体および分解した抗体を含み、２５℃で少なくとも１４日間安定性を有する、組成物。
30. 無傷の抗体が、全抗体の少なくとも８５％を表す、請求項２８または２９に記載の組成物。
31. 無傷の抗体が、全抗体の少なくとも８８％を表す、請求項３０に記載の組成物。
32. 硫酸アンモニウム濃度が約６５％である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
33. 硫酸アンモニウム沈殿が、抗体の非特異的分取および内毒素減少の目的のために使用される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
34. 組成物中のエンドトキシン減少が、化学精製の直前の試料に対して少なくとも６９％である、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
35. 無傷の抗体が非特異的である、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
36. 組成物が、少なくとも９０％のＩｇＡを有するプールされた抗体組成物を含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
37. 経口剤形の調製に使用される、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の組成物。

Images