KR20080027518A

KR20080027518A - 호스라디시 페록시다제가 컨쥬게이션된 황소개구리비텔로제닌의 모노클로랄 항체와 이를 이용한 비텔로제닌측정용 샌드위치법 엘리사 키트

Info

Publication number: KR20080027518A
Application number: KR1020060092641A
Authority: KR
Inventors: 박장수
Original assignee: 박장수
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2008-03-28

Abstract

본 발명은 양서류의 혈중에 존재하는 비텔로제닌의 양을 측정하는 면역학적 방법에 의한 수질환경 진단에 관한 것으로서, 1차항체가 코팅된 웰플레이트에 측정하고자 하는 비텔로제닌을 투여하고, 호스라디시페록시다제(HRP)가 라벨링되고 황소개구리의 비텔로제닌에 특이적으로 결합하는 모노클로랄 항체를 직접 결합시킴에 의해 황소개구리의 비텔로제닌을 정량함으로써 담수에서의 내분비계 장애물질에 의한 오염 정도의 진단이 가능하도록 하는 비텔로제닌 측정방법에 관한 것이다.

황소개구리, 비텔로제닌, 항체, 항원 엘리사법

Description

호스라디시 페록시다제가 컨쥬게이션된 황소개구리 비텔로제닌의 모노클로랄 항체와 이를 이용한 비텔로제닌 측정용 샌드위치법 엘리사 키트{HRP(horseradish peroxidase) conjugated Rana catesbeina's vitellogenin monoclonal antibody and Sandwich ELISA(Enzyme linked immonosorbent assay) kit of Rana catesbeina's vitellogenin}

도 1은 본 발명에 의한 1차항체, 비텔로제닌 및 효소가 결합된 2차항체를 이용하여 비텔로제닌을 측정한 결과를 표시한 사진.

도 2는 본 발명에 의한 붕어의 비텔로제닌 농도에 따른 2차항체의 친화력을 나타낸 검량선을 표시한 그래프.

본 발명은 양서류의 혈중에 존재하는 비텔로제닌의 양을 측정하는 면역학적 방법에 의한 수질환경 진단에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 호스라디시페록시다제(HRP)가 라벨링되고 황소개구리의 비텔로제닌에 특이적으로 결합하는 모노클로랄 항체를 이용하여 보다 정확 신속하게 황소개구리의 비텔로제닌을 정량함으로써 담수에서의 내분비계 장애물질에 의한 오염 정도의 진단이 가능하도록 하는것이다.

일반적으로 비텔로제닌(Vitellogenin)은 어류, 양서류 및 곤충 등의 알(egg)을 이루는 인당단백질(phosphoglycoprotein)로서 알세포 형성시 에스트로겐(estrogen)의 작용에 의해 합성이 유도되며, 알세포 내의 농도는 체액보다 보통 30 -100배 정도 높다. 비텔로제닌은 17β-에스트라디올 노닐페닐 및 비스페놀A 등과 같이 생체 내분비계(endocrine system)를 교란시키는 에스트로겐성(estrogenic) 화합물에 의해 비정상적으로 합성이 증가하며, 이들 에스트로겐성 화합물에 의해 수컷이나 치어에서 비텔로제닌 합성이 증가하면 암수 성 교차가 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 어류의 간이나 체액속의 비텔로제닌의 양은 담수에서의 내분비계 장애물질에 의한 오염정도를 나타내는 생체지표(biomaker)로 사용될 수 있다.

생체내에서 이러한 비텔로제닌의 특이한 분비로 인하여 오염지표 확인을 위한 다양한 비텔로제닌의 정량 검출 측정방법들이 개시되어 있으며, 효소결합면역흡수분석법(ELISA), 효소면역정량법(EIA), 형광면역정량법(FIA), 발광면역정량법(LIA), 방사능면역정량법(RIA) 등 면역학적 방법이 주로 사용되고 있다. 상기 면역학적 방법을 위해서는 기본적으로 항-비텔로제닌에 대응하는 항체를 형성하여 항원 항체의 결합반응을 유도하고, 상기 결합된 항원-항체의 농도를 인식하기 위하여 발색제, 등의 기구를 항체에 결합시켜 상기 항체를 인식함으로써 측정하는 것이다.

그러나, 종래 기술인 효소결합면역흡수분석법(ELISA)은 간접적인 방법으로 96웰플레이트 판(96 Well plate)에 먼저 항원인 비텔로제닌을 붙이고, 상기 비텔로제닌을 인식하는 1차항체 결합시킨다. 그 이후, 상기 1차항체와 결합될 수 있는 2 차 항체를 붙이되, 상기 2차 항체에는 인식이 가능한 호스라디시 페록시다제(HRP)가 붙어 있어, 상기 HRP가 붙어 있는 이차항체를 인식함으로써 비텔로제닌을 측정하는 것으로서, 상기와 같은 간접적인 효소결합면역흡수분석법(ELISA)은 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 96웰플레이트판에 항원인 비텔로제닌을 붙이기 위해서는 과다한 시간이 소요된다는 것이다. 전체 작업중 항원을 붙이는 이러한 첫 번째 작업은 거의 12시간 가까이 소모되어 전체 작업을 위한 많은 시간이 소모된다는 단점이 있다.

둘째, 비특이적인 결합으로 인하여 미량으로 존재하는 비텔로제닌의 측정이 정확하지가 않다는 것이다. 즉, 엘리사법에서 사용되는 항체중 측정의 기본이 되는 HRP가 컨쥬게이션 된 2차항체는 1차항체를 생성한 동물의 항체인식 항체이며, 통상적으로 마우스의 항체를 인식하는 안티 마우스 항체이다. 따라서 마우스의 비특이적인 항체가 있을 경우 이들을 모두 인식함으로써 오차율이 커지는 문제점이 있다. 이러한 문제점은 극히 미량으로 존재하는 비텔로제닌을 측정하는 방법으로써는 부적합할 뿐만 아니라 측정값 그 자체의 신뢰성에 많은 문제점을 남긴다.

이에 본 발명에서는 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로 비텔로제닌의 측정이 보다 빨리 이루어지도록 하는 것을 목적으로 한다.

그리고, 본 발명은 비텔로제닌의 비특이적인 결합을 최대한 억제함으로써 비텔로제닌의 측정이 보다 정확하게 이루어지도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 한국생명공학연구원(KRIBB)에 수탁번호 KCTC 10613BP로서 기탁된 하이브리도마 세포주 CVmA2에 의해 생산되고, 황소개구리의 비텔로제닌에만 특이적으로 결합되는 모노클로랄 항체에 호스라디시 페록시다제가 결합되는 것을 특징으로 하는 호스라디시 페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션된 황소개구리 비텔로제닌의 모노클로랄 항체를 제공하는데 그 기술적 요지가 있다.

또한, 본 발명은 황소개구리 비텔로제닌 항원에 대한 1차항체가 부착되어 있는 마이크로 웰플레이트상에 비텔로제닌 항원을 결합시키고, 호스라디시페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션 된 특이적 2차항체를 상기 비텔로제닌 항원에 직접 결합시킴으로써 비텔로제닌의 정량적 측정이 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 황소개구리 비텔로제닌의 측정 방법.제공하는데 다른 기술적 요지가 있다.

이하 상기의 특성을 가지는 본 발명을 도시한 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.

먼저,본 발명에서는 상술한 바와 같이 황소개구리의 비텔로제닌에 대한 항체를 이용하는 것으로 황소개구리의 혈중에 존재하는 비텔로제닌의 면역학적 측정방법에 관한 것이다.

구체적으로 설명하면, 마이크로웰플레이트상에 우선 비텔로제닌에 대한 1차 항체를 코팅한다. 이러한 1차항체는 모노클로랄 항체 또는 폴리클로랄 항체 등 어느 것이나 가능하며, 비텔로제닌에 대한 항체이면 족하다. 대개 이러한 1차항체는 이를 생산하는 마우스 유래의 하이브리도마를 제조한 후, 이 세포주를 배지 또는 마우스의 복강내에서 배양함으로써 제조 할 수 있다. 또는 범용적으로 사용되는 황소개구리의 비텔로제닌에 대한 어떠한 항체의 사용도 가능할 것이다. 일예를 들어 마우스 유래의 항체를 생산하는 방법을 설명하면, 먼저, 황소개구리의 혈중에 존재하는 비텔로제닌의 양을 증폭시켜 추출한 후, 이것을 항원으로하여 마우스를 면역화 시킨 다음, 통상의 세포융합 방법에 따라 즉, Kohler 및 Milstein이 제시한 세포융합의 기본 방법에 따라 황소개구리 비텔로제닌으로 면역시킨 마우스의 비장세포와 마우스의 골수증 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조한다.

상기와 같은 1차항체를 마이크로플레이트상에 코팅된 것은 다량으로 제작이 가능하다. 따라서 이러한 1차항체가 코팅된 플레이트는 상업적으로 제작이 가능하므로 사용자는 이상태로 이용이 가능하다. 따라서 종래의 엘리사법(ELISA)처럼 처음에 플레이트상에 항원을 코팅시키기 위해 12시간씩 작업을 해야하는 번거러움을 들 수 있게 되는 것이다.

다음, 상기 1차항체가 코팅된 플레이트상에 사용자는 황소개구리의 혈액에서 채취한 비텔로제닌을 항원으로써 상기 1차항체와 결합시킨다. 플레이트의 각 웰에 투입된 비텔로제닌은 항원으로써 작용함으로 상기 1차항체와 결합되어 있는 상태이다. 따라서 이러한 비텔로제닌을 정량적으로 확인하기 위하여 효소가 라벨링된 2차항체를 상기 항-비텔로제닌에 결합시킨다. 이때, 상기 2차항체는 항-비텔로제닌에 특이적으로 결합되는 항체로써 모노클로랄 항체로 이루어지며, 구체적으로는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KRIBB)에 수탁번호 KCTC 10613BP로 기탁된 하이 브리도마 세포주 CVmA2에서 생성되는 모노클로랄항체를 이용한다. 상기 모노클로랄 항체에는 효소, 구체적으로는 호스라디시 페록시다제(HRP:horaseradish peroxidase)가 결합되도록 한다. 따라서 상기 모노클로랄 2차항체는 어떤 다른 동물을 이용하여 항체를 생성하더라도 그동물이 가지고 있는 비특이적 항체는 인식하지 않게 된다. 따라서 폴리클로랄 항체를 1차항체로 사용하더라도 비특이적인 결합은 나타나지 않으므로 정확한 비텔로제닌의 정량측정이 가능하게 되는 것이다.

다음은 상기에서 설명한 본 발명에 의한 황소개구리 비텔로제닌의 정량측정방법을 구체적인 실시예를 통하여 자세히 설명하기로 한다.

실시예 1: 황소개구리 비텔로제닌의 정제

비텔로제닌을 확보하기 위해, 황소개구리의 암컷을 MS222(tricaine methanesulfonate)로 마취시킨 후 17α-ethynylestradiol 500 μg을 일주일 간격으로 두 번 주입시킨 다음, 황소개구리의 혈액을 채집하여 Start buffer(0.05 M Tris-HCl, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), pH 7.5)로 투석하였다. 투석된 분획을 Mono Q column에 로딩하고 0.05 M Tris-Hcl, 1 mM PMSF, pH 7.5의 buffer를 사용하여 이온교환에 의해 단백질을 정제하였다. 각 분획에 대하여 SDS-PAGE(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하여 비텔로제닌이 존재하는 분획을 확인하고, 이를 마우스 면역을 위한 항원으로 사용하였다.

실시예 2: 마우스 면역

상기 실시예 1에서 정제한 비텔로제닌 항원이 들어있는 PBS(phosphate-buffered saline)와 같은 부피의 complete Freund's adjuvant가 섞인 에멀젼을 만들어서 생후 6 내지 8주 가량된 암컷 Balb/c mouse의 복강내에 주입하였다. 한 가지 항원에 대해 3 내지 5마리에 주사하였다. 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하되, 이 때는 incomplete Freund's adjuvant를 사용하였다. 다시 2주 후에 항원(먼저 주사한 양의 절반)이 섞인 PBS를 꼬리의 정맥에 주사하였다. 마지막 부스팅(boosting) 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청(serum)을 얻은 뒤, PBS buffer에 1/1,000로 희석하여 ELISA를 이용하여 항체의 역가(titer)를 결정하였다. OD(optical density)가 음성대조군(negative control, 항원을 주입하지 않은 마우스의 혈청)에 비해 0.2이상이 되면 면역화가 성공한 것으로 보고 세포융합을 준비하고, Titer가 낮으면 2주일이 되기를 기다렸다가 다시 부스팅하였다.

실시예 3: 마이엘르마 세포의 준비

융합하기 적어도 2주전에 액체 질소 탱크에서 마이엘르마 세포(Sp2/O-/Ag14)를 꺼내어 complete RPMI 1640(with 10% FBS(fetal bovine serum)에서 배양하였다. 이 때 complete RPMI 1640는 RPM 1640 1 pack, NaHCO3 2.02g(24 mM), β-mercaptoethanol 3.5 μl에 증류수를 부어 1 l가 되게 만들었다. 세포의 수가 5 x 105/ml 정도이면 일부를1/10 내지 1/20 정도로 희석하였으며, 접종 세포(seeding cell)의 밀도는 2.5 내지 5 x 104/ml 정도가 적당하였다.

실시예 4: 1차 항체의 제조

항원을 접종하여 면역시킨 마우스를 경추탈구법으로 죽인 후, 18-G니들을 끼운 10 ml 주사기에 차가운 0.34 M sucrose 용액을 8 ml정도 채운 후 복막내에 주입하였다. 복부를 부드럽게 두세번 누른 뒤 되도록 한방울도 남기지 않고 흡입하였다. 이때 복강내에 있는 세포들(대부분 대식세표(macrophage))이 따라오게 된다. 이를 튜브에 담고 20 ml의 차가운 HAT 배지(FBS가 20%로 들어간 complete RPMI 1640에 HAT와 보조제(supplement)를 넣은 것)를 채운 다음, 상온에서 100xg로 5분간 원심분리한 후 상등액은 버렸다. 세포 펠렛(cell pellet)을 차가운 HAT 35 ml에 현탁하여 96 well plate에 100 μl/well씩 분배한 후, 이를 CO2 incubator에서 배양하였다. 이 때 세포의 농도는 1 x 105 cell/ml 정도 되게 현탁하는 것이 표준이나 굳이 계수할 필요는 없다. 배양한 후 배양액을 정제하여 폴리클로날 항체를 제조하였다.

실시예 5; 2차항체의 제조

기본적으로 2차항체는 국제기탁기관인한국생명공학연구원(KRIBB)에 수탁번호 KCTC 10613BP로서 기탁된 하이브리도마 세포주 CVmA2를 이용하는 것으로 한다. 이는 상기 세포주에서 형성되는 모노클로랄 항체가 황소개구리의 비텔로제닌 항원에만 특이적으로 결합하는 항체이기 때문이다. 이러한 특이적 항체의 형성이 가능해짐에 따라 비텔로제닌의 정량 측정이 가능하며, 이하 상기 특이적 모노클로랄 항체 의 제조과정을 좀 더 상세히 설명하기로 한다.

실시예 2에서 항원을 접종하여 면역시킨 마우스를 경추탈구법으로 죽인 후, 복막을 가르고 비장을 척출하였다. 비장에 들러붙어 있는 지방조직을 되도록 깨끗이 제거한 후, petri dish에 스트레이너(strainer)를 얹고 두 조각낸 비장을 넣은 다음, supplemented RPMI 1640 8 ml를 주사기로 곳곳에 찔러 넣었다. 이 때 supplement RPMI 1640은 세척배지(washing medium)라고도 하며, serumdl 없는 complete RPMI 1640에 해당한다. 주사기 플런저(plunger)의 뒷 부분으로 비장을 으깨고, supplemented RPMI 1640으로 플러저 뒤와 메쉬(mesh) 앞 뒤를 세척하였다. 이렇게 하여 얻어진 비장의 세포 현탁액(cell suspension)을 15 ml conical tube에 담고, 3분 가량 방치하여 찌꺼기가 가라앉으면 새 튜브에 옮겼다.

한편, 상기 실시예 3에서 준비된 조직배양 플라스크에서 배양한 마이엘르마 세포를 수확하였다. 뚜껑을 꼭 닫은 다음 손바닥으로 세게 한두번 쳐서 바닥에 붙어 있던 것들까지 떨어지게 하였다. 50 ml conical tube에 옮겨 200xg로 5분간 원심분리한 후, 진공 라인(vacuum line)에 연결한 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)으로 배지를 흡입 제거한 다음, supplemented RPMI 1640을 가하고 피펫팅(pipetting)하여 세포를 현탁하였다. 다시 200xg로 5분간 원심분리하여 세포를 가라앉히고 배지는 피펫으로 제거하였다. 마이엘르마 세포를 10 ml의 supplemented RPMI 1640에 현탁하고 세포수를 세었다.

1x107의 마이엘르마 세포와 1x108의 splenocyte를 50 ml 튜브로 옮겨서 섞고 세척배지로 채운 후, 200xg로 5분간 원심분리하고 배지는 제거하였다. 37℃의 물이 채원진 비이커에 튜브를 담그고 2분간 방치한 후, 튜브 끝을 가볍게 몇 번 쳐서 세표 펠렛을 부드럽게 만들었다. PEG(polyethylene glycol) 용액을 가해서 세포융합을 일으키는 가장 중요한 과정으로, 튜브를 37℃의 물에 담근채로 천천히 흔들어 주면서 1ml의 PEG 용액을 1분 동안 가하였다. 이것을 100xg로 2분간 원심분리한 뒤 배지는 제거하였다. 30 ml 의 HAT에 조심스럽게 현탁시킨 후 CO2 incubator에 30분간 두었다.

이렇게 만들어진 세포가 들어있는 용액을 96 well plate에 well 당 100 μl 씩 넣었다. 4 내지 5일 후 HAT를 70 μl well에 첨가한 후 도말(plating)한지 5 내지 7일 가량되면 콜로니(colony)가 생기고 이틀에 한번씩 HAT를 100 μl씩 갈아주었다. colony가 점차 커져서 well 바닥의 10 내지 50% 정도를 덮으면 배지 상등액을 취하여 항체가 존재하는지 여부를 ELISA로 확인하였다.

상기 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 비텔로제닌에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위해, ELISA 분석방법으로 다음과 같이 스크리닝하였다.

클로닝 단계에 다라 배지를 다르게 사용하였다. 첫 클로닝에서는 HAT를, 두 번째에는 HT(hypoxanthine, thymidine)를, 나머지 경우에는 complete medium을 사용하였다. 항원-특이적 항체(Antigen-specific antibody)를 만드는 well의 세포 전부를 0.5 ml의 배지가 들어있는 24 well plate로 옮기고, 100 ml로 맞춘 마이크로피펫을 사용하여 세포를 풀어주었다. 이를 CO2 incubator에 하룻밤 방치한 후 세포의 수를 세어 적당한 배지에 연속 희석하여 8 cell/ml가 되게 만들었다. Feeder가 장착된 96 well plate에 100 μl씩(즉 0.8 cell/well) 분주하여 37℃, CO2 incubator에서 배양하였다. 배지를 교체하면서 세포를 키워 콜로니가 적당히 크면 ELISA를 실시하였다.

그 결과, 비텔로제닌 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 먼저 선별하고, 이후 여러번의 반복 실험을 통해 비텔로제닌 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별한 후, 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하엿다. 선별된 클론을 동결 보존한 후, 그 상층액에 대하여 효소 면역 측정법으로 역가를 측정하였다.

실시예 6: 모노클로날 2차항체의 대량 생산

상기 실시예 5에서 얻은 하이브리도마 세포로부터 모노클로날 항체를 대량 생산하기 위하여, Balb/c 마우스에 0.5ml의 프리스테인(pristane)을 복강내로 주사하였다. 1주일 후에 각각의 하이브리도마 세포들을 마우스 1마리당 5 x 106개씩 주사하고, 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하였다. 이 복수액은 높은 농도로 자란 하이브리도마 세포를 포함하고 있으므로, 채취된 복수액을 3,000 g에서 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상층액반을 취하여 다음 실험에 사용할 수 있도록 -20℃에서 보관하였다.

모노클로날 항체를 복수액으로부처 정제하기 위하여, 채취된 복수액의 상층액에 포화된 황산암모늄 용액을 동량으로 첨가하여 단백질만을 침전시켰다. 침전물 을 PBS buffer에 용해시킨 후 투석하고, Protein G agarose affinity column을 이용하여 분리한 후, 항체 단백질의 양을 브레드포드 측정법으로 정량하여 -70℃에서 보관하였다.

실시예 7: 모노클로날 2차항체에 효소 결합

상기 실시예6에서 대량생산된 모노클로랄 항체에 호스라디시 페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)를 결합시키기 위하여HRP(horseradish peroxidase) 5㎎을 1.2㎖의 증류수에 녹인후 0.1M sodium periodate 0.3㎖을 10mM sodium phosphate(pH 7.0) 완충용액에 에 넣는다. 이것을 실온에서 20분간 반응 시킨 후 이 HRP solution을 4℃에서 1mM sodium phosphate(pH 4.0)를 용매로 하여 12시간 동안 투석시킨다. 모노항체를 20mM carbonate(pH 9.5)에 희석시켜 그 농도가 10㎎/㎖ 되게 한 다음 0.5㎖의 antibody solution와 투석한 HRP를 혼합하여 실온에서 2시간 동안 반응 시킨다. 여기에 100㎕의 sodium borohydride(4㎎/㎖ in water)를 첨가하여 PBS에 여러번 투석시킨다.

HRP와 모노항체는 protein A를 이용해서 분리해 내고 그리고 HRP와 결합되지 않은 모노항체는 affinity chromatography를 이용하여 분리해 냈다.

실시예 8: 진단킷트의 제조

효소결합면역흡수분석법(ELISA)을 이용하여, 1차 항체로는 황소개구리의 비텔로제닌 모노클로날 항체, 2차 항체로는 효소 등으로 표지한 본 발명의 황소개구 리의 비텔로제닌 모노클로날 항체를 사용하여 다음과 같은 구성으로 진단 킷트를 제작하였다.

진단킷트구성

① 황소개구리 항원(vitellogenin) 120㎕ (농도 400ng/ml)

② 1차항체가 코팅된 96 well plate 1ea

③ HRP가 conjugation된 황소개구리 2차항체 50㎕

④ PBS(Phosphatase substrate solution) buffer 50ml

⑤ PBST buffer(10X) 40ml

⑥ PBSTG buffer 50ml

⑦ 발색제 10㎖

⑧ Stop solution 10㎖

실시예 9: 2차 항체와 비텔로제닌의 항원-항체 반응 확인

실시예 7에서 생산하여 정제한 HRP가 결합된 모노클로날 항체의 비텔로제닌에 대한 특이적 반응성을 샌드위치법을 이용하여 다음과 같이 확인하였다.

황소개구리의 모노클론항체가 코팅된 96 well plate(판)에 standard curve를 만들기 위해 왼쪽 줄 첫 번 well부터 항원(vitellogenin)을 1000배 희석한 후 PBS buffer로 1:2씩 well별로 차등 희석하여 well당 50㎕ 씩 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. plate를 PBS로 세척한 후 PBSTG(PBST + Gelatin) 용액을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킴으로써 blocking하였다. 그 후 판을 PBST(PBS-Tween20)으로 세척한 후 각 well에 황소개구리의 혈청을 PBS 용액에 500배 희석하 여 well 당 된 50㎕ 씩 넣어 37℃에서 2시간 동안 코팅시키고 그 후 판을 PBS-Tween20으로 세척하였다. 여기에 HRP가 conjugation된 발색 모노클론항체를 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이것을 PBS-Tween20을 사용하여 판을 3번 세척한 후 발색제 A와 B를 각각 1:1의 비율로 섞은 후 이를 well 당 50㎕씩 넣고 발색하여 3-5분 안에 reader로 흡광도를 측정하였다(595nm).

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 2차항체는 비텔로제닌의 농도에 따라 비례적으로 반응함을 알 수 있다.

이상에서 상세히 살펴 본 바와 같이 본 발명에서 제공하는 1차항체가 코팅된 웰플레이트를 이용함으로써 대량 생산이 가능하고, 사용자의 시간이 단축되는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면, 효소가 결합된 2차항체가 비텔로제닌 항원에 바로 결합되어 측정이 이루어지므로 비특이적인 결합이 억제되어 측정값의 신뢰성이 향상되는 다른 효과도 있다.

Claims

한국생명공학연구원(KRIBB)에 수탁번호 KCTC 10613BP로서 기탁된 하이브리도마 세포주 CVmA2에 의해 생산되고, 황소개구리의 비텔로제닌에만 특이적으로 결합되는 모노클로랄 항체에 호스라디시 페록시다제가 결합되는 것을 특징으로 하는 호스라디시 페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션된 황소개구리 비텔로제닌의 모노클로랄 항체.
황소개구리 비텔로제닌 항원에 대한 1차항체가 부착되어 있는 마이크로 웰플레이트상에 비텔로제닌 항원을 결합시키고, 호스라디시페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션 된 특이적 2차항체를 상기 비텔로제닌 항원에 직접 결합시킴으로써 비텔로제닌의 정량적 측정이 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 황소개구리 비텔로제닌의 측정 방법.