KR101035863B1 - 요각류 유래의 비텔로제닌 단백질 및 이를 이용한 내분비교란물질 오염 측정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 요각류 유래의 비텔로제닌 단백질 및 요각류 유래 비텔로제닌 단백질 발현량의 증감을 지표로 하여 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법으로서, 상기 발현량의 증가는 내분비 교란물질 오염 증가를 의미하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 해양생태계의 내분비 교란물질 오염을 효율적이고 정확하게 측정할 수 있는 바이오 마커 및 이를 이용한 오염 측정을 정확하고 용이하게 수행할 수 있다.

요각류, 내분비 교란물질

Description

요각류 유래의 비텔로제닌 단백질 및 이를 이용한 내분비 교란물질 오염 측정하는 방법{VITELLOGENIN PROTEIN FROM COPEPOD AND METHOD FOR DETERMINING ENDOCRINE DISRUPTOR CONTAMINATION USING THE SAME}

본 발명은 내분비 교란물질 오염을 측정하는 방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 신규한 내분비 교란물질 오염 측정용 바이오 마커로 사용할 수 있는 단백질 및 이를 이용한 내분비 교란물질 오염을 측정하는 방법에 관한 것이다.

비텔로제닌(Vitellogenin: Vg)은 배 발생을 위한 비축 에너지를 제공하는 난황 비텔린(vitellin)의 큰 전구체 단백질이다(Hagedorn 및 Kunkel, 1979; Wahli 등, 1981). 비텔로제닌(Vg)은 발생하는 난모세포에 의하여 비텔린으로서 흡수되어 부화 전 정상적 발생을 위한 자유 아미노산, 지질, 탄수화물 및 엑디스테로이드(ecdysteroid)를 제공한다. 미숙한 시기에는 일반적으로 낮은 농도로 존재하던 Vg는 성적으로 성숙한 암컷에서 그 농도가 증가한다. 수컷에서는 Vg 유전자는 정상적으로는 침묵상태(silent)이지만 에스트로겐이나 에스트로겐 모조체(mimics)에 반응하여 활성화될 수 있다(Flouriot 등, 1995; Palmer 및 Palmer, 1995). 척추동물에서 Vg 생산은 에스트로겐 리셉터 (ER) 경로의 제어를 받는다. 그러나, 쌍각류 같 은 무척추동물에서는 비텔로제닌 생산은 에스트라디올(estradiol: E2)과 신경 펩티드(neuropeptide) 둘 다의 제어하에 있는 것으로 보인다(Osada et al., 2003). 척추동물에서 Vg 농도는 혈장에서 일정기간 동안 높게 유지될 수 있는데, 이는 Vg 단백질이 서서히 분해되기 때문이다(Denslow 등, 1999). 그러므로, 특히 미성숙 암컷 및 수컷에서 혈장 내 Vg 농도는 에스트로겐 화합물에 노출 여부에 대한 유용한 생체 마커로 고려된다(Hansen 등, 1998; Okoumassoun 등, 2002; Marin 및 Matozzo, 2004; Matozzo 등, 2008).

최근 Vg의 흥미로운 기능이 알려졌다. 예를 들어, 꿀벌의 Vg는 항산화제로 작용하고 여왕벌의 수명을 연장시키는 것으로 보고되었다(Corona 등, 2007). Corona 등은 주로 Vg 유전자의 발현의 차이 때문에 파라콰트(Paraquat)를 주사한 여왕벌이 일벌보다 높은 생존률을 가지는 것을 관찰하였다. 유사한 항산화제 역할이 선충류인 케노랍디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans)의 Vg에서 관찰되었다(Nakamura 등, 1999). 밀크위드 벌레(milkweed bug) (Oncopeltus Fasciatus)는 카드뮴에 노출되면 난소 성숙이 지연되고 비텔로제닌 생성이 저해되는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 Vg의 감소에 기인한 것으로 추정되며, 반대로, Vg가 증가하면 카드뮴에 대하여 내성력이 증가한다(Cervera 등, 2006). Vg에 대한 관심은 내분비 교란 화학물질 (EDCs) 노출에 대한 바이오 마커로서 유용성으로부터 주로 유래하였다. 어류의 Vg 측정은 EDCs 노출의 바이오마커로서 인식되어 왔다(Flouriot 등, 1995; Marin 및 Matozzo, 2004; Ebrahimi, 2005; Hara 등, 2007; Maradonna 및 Carnevali, 2007; Matozzo 등, 2008). 연체동물, 갑각류, 수생곤충, 및 환형동물 같은 무척추동물에 대해서는 Vg 바이오 마커가 현장 또는 실험실-기반 연구에서 EDS의 영향을 평가하기 위하여 사용되었다(Matozzo 등, 2008).

요각류는 해양 먹이사슬에서 가장 풍부한 분류군이다(Raisuddin 등, 2007). 일반적으로, 요각류는 어류와 다른 수생생물들의 먹이이다. 요각류로부터의 Vg 유전자에 대한 완전한 cDNA 서열을 GenBank에서 검색하면 단지 두 개의 서열, 즉 각각 연어 기생충인 레페오프테이루스 살모니스(Lepeophtheirus salmonis)의 Vg1 및 Vg2인 EF490954 및 EF490955가 검색된다.

조간대 해안에 서식하는 요각류인 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus)(Copepoda, Harpacticoida)는 EDC의 급성, 만성 및 여러 세대에 걸친 독성에 대한 잠재적 모델 생물로서 알려졌다(Lee 등, 2007, 2008; Raisuddin 등, 2007). 크기가 작기 때문에 (<1 mm), 내분비 기능과 요인의 직접적인 측정은 T. 자포니쿠스(T. japonicus)에 적합하지 않다. 그러나, 분자생물학적 수단을 이용하고 발현되는 유전자 태그 (expressed sequence tag: EST)와 게놈 DNA 시퀀싱의 1x 커버리지를 확인함으로써 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 분자생물학적 내분비학 및 발생의 연구가 가능하다(Lee 등, 2005; Rasuddin 등, 2007).

특정 오염원이 내분비 교란물질인지 여부와 해양 환경 내에서 내분비 교란물질의 농도 또는 오염 정도를 측정할 수 있는 신뢰성 있는 바이오 마커에 대한 요구가 있다. 화학적 측정은 극미량의 내분비 교란물질 측정에 감수성이 의심되는 경우가 많고, 실제 생체 끼치는 장기적 독성 평가에 많은 단점을 내포한다.

T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 Vg 연구는 발생의 분자생물학적 기작을 이해하는 것뿐 아니라 이 요각류 종을 Vg 바이오 마커를 사용하여 미량 금속과 EDC의 바이오모니터링에 사용하는데에 유용하다. 본 발명자는 신규한 T. 자포니쿠스(T. japonicus)로부터의 Vg 유전자의 클로닝과 서열 분석을 보고한다. 본 발명자는 또한 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg와 다른 종들 사이의 계통발생적인 관계 및 여러 발생학적 단계 및 미량 금속에 노출된 요각류에서 그것의 발현을 분석하여 본 발명을 완성하였다.

Genebank 데이터베이스 검색 결과는 요각류로부터 Vg 유전자 서열은 여태까지 오직 연어 기생충으로부터만 알려졌다는 것을 나타내었다. Eichner 등(2008)은 ETS 및 마이크로어레이에 의하여 탈피 후 성숙 및 알 생산 동안의 총전사체(transcriptomes)를 시험하여 연어 기생충의 연어에 대한 병원성의 단서를 밝히는 것에 초점을 맞추었다. 두 가지의 보고된 cDNA 서열은 연어 기생충의 Vg1 및 Vg2를 제공한다. 본 발명자는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)에서 GS 20 분석에 의하 여 약 400,000 EST를 얻고, GS-FLX에 의하여 1x 커버리지의 전체 게놈(약 200Mb)을 얻었다. 이들 데이터로부터, 비록 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-UTR 및 3'-UTR을 알기 위하여 5'-, 3'-RACE 및 게놈 워킹(Genome Walking) 과정이 필요하긴 하였지만, 전장 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg cDNA를 클로닝할 수 있었다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg의 단백질 서열의 얼라인먼트 결과는 연어 기생충의 Vg1과 높은 유사성을 나타내었다. 그러므로, 동정된 Vg 유전자는 Vg1을 암호화한다고 추측할 수 있었다. Vg 들의 타입이나 명명법에 대하여 몇몇 보고들은 1 가지 이상의 이소형(isoform)이 존재한다는 것을 확인하였다. 예를 들어 Sawaguchi 등(2003)은 모기고기(mosquitofish: 갬버시아 아피니스(Gambusia affinis))로부터 600 kDa의 VgA 및 VgB 및 400 kDa의 Vg 같은 세 가지 Vg들을 보고하였다. 세 가지 Vg들의 cDNA 서열은 VgA 및 VgB가 모두 난황 단백질 도메인을 가지고 있었고 400 kDa의 Vg는 포스비틴이 없는 Vg임을 나타내었다. Felber 등 (1980)은 제노푸스 레비스(Xenopus laevis)로부터 두 개의 별개이지만 서로 관련 있는 군을 형성하는 네 가지 cDNA 서열을 동정하여 각각 A1, A2, B1, B2라 명명하였다. 게다가, C. 엘레강스 (C. elegans)에서는 Vg 단백질을 암호화하는 여섯 가지 유전자가 동정되었다(Spieth 등, 1985). 이는 구조와 기능 관점에서 비텔로제닌의 다양한 특성을 시사한다. T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 Vg2 서열이 더 연구되면 요각류로부터의 기존 Vg 서열에 대한 추가의 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Vg 유전자는 에스트로겐 반응 인자 (estrogen response element: ERE)를 함유하는 것으로 보고된다(Teo 등, 1998; Kim 등, 2004; Mimoto 등, 2007). T. 자포 니쿠스(T. japonicus) Vg 유전자의 5'-UTR 프로모터 영역에서 잠재적 MRE 및 ERE 반쪽 부위를 확인하였다. 종전에 암수한몸 어류인 크립톨레비아스 마르모라투스(Kryptolebias marmoratus) (이전에는 Rivulus marmoratus)에서 한 개의 ERE, 한 개의 MRE 및 두 개의 생체이물질 반응 인자 (xenobiotic respose element: XRE)가 Vg 유전자의 프로모터 서열에서 확인되었다(Kim 등, 2004). Vg 합성의 금속-유도된 조절은 부분적으로 Vg에서 MRE의 역할을 밝힐 수 있을 것이다. 그러나, T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 내 이들 인자의 정확한 조절 역할에 대하여 좀 더 완전한 분석으로 확인하여야 한다.

갑각류에서 Vg는 난소 외 및/또는 난소 내 공급원에 의하여 합성될 수 있다(Yano 및 Chinzei, 1987; Tom 등, 1992; Chang 및 Shih, 1995). 합성 후, Vg는 번역 후 수식으로서 더 작은 서브유닛으로 절단되고 절단 부위는 섭틸리신과 유사한 전구단백질 엔도펩티아제인 전환효소에 의하여 인지된다(Zmora 등, 2007). T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg에서 절단 부위를 찾지 못하였으나 이 같은 부위를 확인하는 것이 그 기능적 특징을 이해하는데 도움이 될 것이다.

계통발생적 유연관계 분석 결과 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg는 다른 나머지 갑각류들보다 연어 기생충에 더 가까운 것으로 나타났다. Vg의 진화와 관련하여, Babin 등은 아포리포포린, 아포리포프로틴 B, Vg 및 마이크로솜 트리글리세리드 이송 단백질을 코딩하는 유전자는 동일한 다유전자 수퍼패밀리의 구성원임을 시사하였다. 이전에, 계통발생학적 유연관계에 관하여 Baker(1988a, 1988b) Vg와 유사한 기능을 수행하는 여러 복제수의 전구체 유전자가 척추동물에서 아포리포프로 틴 B-100 및 지질단백질 리파제의 일부를 암호화하도록 변형되었다고 시사하였다. 게다가, 무척추동물 Vg는 닭과 개구리 Vg와 상동성이 있고 그 일부는 닭의 비텔린 II 및 개구리의 Vg에 대응하는 인간 폰비레브란드 인자(von Villebrand factor: VWD)와 유사하다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg는 또한 C-말단의 1060 잔기에서 시작하여 1240 잔기에서 종결되는 VWD 도메인을 함유한다. 다른 갑각류 동물과 마찬가지로 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg는 포스비틴(phosvitin) 및 폴리세린 도메인을 나타내지 않았다. 이들 도메인은 다수 척추동물과 곤충 Vg에서 발견되고 직렬 세린 반복단 (tandem serin repeat)을 함유하는 것으로 나타났다. 이들은 곤충의 리셉터-매개된 세포내이입(endocytosis) 동안 리셉터 결합에서 역할을 한다(Wahli, 1988). 이것의 결여는 갑각류가 Vg의 세포내이입 동안 Vg 리셉터 결합에 상이한 기작을 이용할 수 있다는 점을 시사한다.

T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 유전자는 노플리우스 단계에서는 유의하게 발현되지 않았다. 발현은 큰 코페포다 단계에서는 보다 분명하였다. 이 같은 발현 패턴은 Vg 발현이 ER에 의하여 조절되고 ER 기능이 발생-특이적이라는 점에서 이치에 맞는다. 암컷은 수컷에 비하여 유의하게 높은 발현량을 나타내었다. 암컷 요각류는 알 밴지 3 주째 내지 8주째 단계에서 더 높은 Vg 발현량을 나타내었고 알 밴지 4 주째에서 발현 정점이 관찰되었다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) 암컷은 제 2 주에서 알을 배고 5주령에서 높은 다산성이 관찰되었다(Raisuddin 등, 2007). 그러므로, Vg 발현은 성체 요각류의 성숙과 대응한다.

요각류가 미량금속에 노출되면 오직 Cd만이 96 시간 후에 유의한 양으로 Vg 유도를 한다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg의 프로모터 서열은 MRE를 나타낸다. 그러므로, 금속의 효과는 시험되었다. Cd는 내분비-교란 효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Henson 및 Chedrese, 2004; Ketata 등, 2007; Rodriguez 등, 2007). 카드뮴(Cd)이 EDC로 작용하는 예상되는 기작은 Cd가 Zn를 대체하여 내재 에스트로겐의 작용을 모방하거나 저해함으로써 DNA 결합 Zn-핑거 모티프를 방해하는 것이다(Henson 및 Chedrese, 2004). 이들 데이터만으로 T. 자포니쿠스(T. japonicus)에서 금속에 의한 Vg 발현 유도 기작을 모두 알 수는 없으나 Cd-유도된 발현은 금속-Vg 상호작용을 시사한다.

결론적으로 본 발명은 T. 자포니쿠스(T. japonicus)로부터 유래하는 Vg 유전자 서열 및 그것의 자세한 분석을 처음 보고하는 것이다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg는 발생의 상이한 단계에서 달리 발현되었다. Cd-유도된 Vg 유전자의 상향조절은 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg를 바이오 마커로서 유용하다는 점을 나타낸다.

따라서, 한 양태에서 본 발명은 신규한 요각류 유래의 비텔로제닌 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 요각류는 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus)이지만 이에 제한되지 않는다. 더 바람직하게는 본 발명의 요각류 유래의 비텔로제닌은 SEQ ID NO:2 서열을 가진다.

다른 양태에서, 본 발명은 요각류 유래 비텔로제닌 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2 아미노산 서열을 암호화하는 어떤 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 SEQ ID NO:1 서열을 가진다. 당업자는 SEQ ID NO:2 아미노산 서열로 미루어 다양한 축퇴 서열을 함유하는, 이를 암호화하는 다수의 서로 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 요각류 유래 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 내분비 교란물질 검출용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본 발명은 요각류 유래 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 제공한다.

또 다른 양태에서 본 발명은 요각류 유래 비텔로제닌 단백질 발현량의 증감을 지표로 하여 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법으로서, 상기 발현량의 증가는 내분비 교란물질 오염 증가를 의미하는 방법을 제공한다. 본 양태에서 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:

요각류 생체 표본에서 비텔로제닌을 전사하는 mRNA 또는 비텔로제닌 단백질의 발현량을 측정하는 단계, 상기 단계에서 측정된 발현량과 내분비 교란물질에 오염되지 않은 지역의 요각류 생체 표본에서 비텔로제닌을 전사하는 mRNA 또는 비텔로제닌 단백질의 표준 발현량을 비교하는 단계, 및 전 단계에서 비교한 발현량의 차이를 기초로 내분비 교란물질 존재 정도를 판단하는 단계.

다른 양태에서 본 발명의 요각류 유래 비텔로제닌 단백질 발현량의 증감을 지표로 하여 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법에서 요각류는 미성숙 암컷 또는 수컷일 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명의 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법에 사용되는 요각류는 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus)이다.

바람직하게는 본 발명의 방법에 사용되는 비텔로제닌 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가진다.

또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 비텔로제닌을 전사하는 mRNA는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 내분비 교란물질은 금속일 수 있으며, 이 경우 금속은 카드뮴인 것이 특히 바람직하다.

이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.

<실시예>

재료 및 방법

1. T. 자포니쿠스(T. japonicus) 배양 및 유지

UV-처리하고 여과된 인공 바닷물에서 표준 방법을 사용하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus)를 배양하고 유지하였다(염분 32ppt, 온도 20 ℃, 12시간 명: 12 시간 암의 광주기). 해조류(algae)인 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica)를 먹이로 제공하였다. 생물종의 정체는 형태적 특성 및 미토콘드리아 게놈 서열의 서열 유사성에 의하여 확인하였다(Jung 등, 2006).

2. 통계학적 분석

통계학적으로 유의한 관찰에 대하여 분산의 일방 분석(ANOVA), 및 그 후 Tukey의 다중 범위 비교 테스트를 사용하여 데이터를 분석하여 발생의 상이한 단계 및 임신한 암컷 T. 자포니쿠스(T. japonicus) 상이한 연령군 사이의 평균을 비교하였다. Student's t-테스트를 사용하여 금속 노출 실험 관찰값의 유의수준을 측정하였다. P<0.05를 유의한 것으로 간주하였다. SPSS 버젼 12.0 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 통계 분석에 사용하였다.

실시예 1: T. 자포니쿠스 ( T. japonicus ) Vg 유전자 시퀀싱

1.1. 클로닝 및 시퀀싱 분석 방법

유전자 시퀀서 20(GS20, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 사용하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus)로부터 약 400,000 ESTs(평균 판독 길이 100 bp)를 얻었다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) EST 데이터베이스 내의 모든 가능한 Tigriopus Vg 클론을 검색하기 위하여 본 발명에서는 다른 Vg 대응물에 대하여 local blast를 수행하는 BioEdit 소프트웨어를 사용하였다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 클론을 스크리닝하기 위하여 Sequencher 4.7 소프트웨어 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였다. 이 방법을 사용하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 유전자의 몇몇 컨티그를 동정하였다.

상기 데이터로부터 얻은 Vg cDNA 서열의 보존된 단편으로부터 축퇴성 프라이머를 디자인하였다. 이들 프라이머를 사용하여, 성체 Tigriopus 암컷 샘플로 다음 조건: 94 ℃/4 분; 98 ℃/25 초, 55 ℃/40 초, 72 ℃/90 초 45 사이클; 및 72 ℃/10 분에서 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 겔로부터 분리하였고, pCR2.1 TA벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 내로 클로닝하고 ABI PRISM 3700 DNA 분석기를 사용하여 시퀀싱하였다. 전장 Tigriopus Vg cDNA를 얻기 위하여 GeneRacer 키트(Invitrogen)를 사용하였다. 5'-RACE(5'GSP1, 5'GSP2 및 5'GSP3)에 사용된 프라이머는 표 1에 정리되어 있다. PCR의 제 1 라운드 증폭 및 네스티드(nested) PCR은 Seo 등(2006)에 의하여 기술된 바에 따라 수행하였다. 3'- 미지의 서열을 얻기 위하여 제 1 가닥 cDNA를 폴리(A) mRNA, 올리고(dT) 앵커 프라이머(Invitrogen) 및 Tigriopus Vg 암컷 mRNA를 사용하여 합성하였다. Tigriopus Vg cDNA의 3'-RACE 산물을 3'GSP1 프라이머 및 3'-RACE 어댑터 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 증폭하였다. 5 ㎕의 반응 혼합물은 0.1 ㎍의 cDNA 주형, 10 μM의 각 프라이머, 10 μM의 각 dNTP, 및 LA Taq DNA 폴리머라제 (5U/μL, TaKaRa, Shiga, Japan)로 구성되었다. 제 2 네스티드 증폭은 3'GSP2 프라이머 및 3'-RACE 어댑터 프라이머를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭 조건은 어닐링 온도가 58 ℃, 60 ℃, 62 ℃인 것을 제외하고는 상기에 기재한 것과 동일하였다. 최종 PCR 산물을 1% 아가로스/TBE 겔로부터 분리하고, pCR2.1TA 벡터 내로 클로닝 한 후 상기 기재된 바와 같이 시퀀싱하였다.

Vg 유전자의 전장 서열을 DNA Walking SpeedUp^TM 키트(Seegene, Seoul, Korea)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 결정하였다. 요약하면, Seegene 키트로부터의 DW-ACP 프라이머 세트 및 일련의 네스티드 프라이머들 (5'GSP4-5'GSP9, 표 1)을 사용하여 상기 방법을 사용하여 얻은 바와 같은 서열을 연장하였다. Taq 폴리머라제 PCR 키트 및 상기 기재한 조건을 사용하여 DNA walking 반응을 수행하였다. 다양한 증폭 단계로부터 얻어진 서열을 한 컨티그(contig)에서 조합하였다. 올리고뉴크레오티드 프라이머 합성 및 서열 분석에 관한 작업은 Bionics에서 수행하였다(Seoul, Korea). 다음 표는 본 실시예에서 사용된 올리고머들의 서열을 나타낸다.

1.2. 클로닝 및 시퀀싱 결과

전장 T. 자포니쿠스(T. japonicus) cDNA는 1842 aa를 암호화하는 5529 bp의 오픈 리딩 프레임 (ORP)을 함유하는 5632bp였다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg는 폴리(A) 신호 서열 (AATAAA)를 3'-UTR에 함유하였다(도 1). 전장 cDNA 서열을 GeneBank에 등록하였다(수탁 번호 EU416312). ClustalX를 사용하여 추론되는 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 아미노산 서열을 다른 곤충의 Vg 서열들과 얼라인하였다. Blast 검색 결과는 vitellogenin1 유전자와 아미노산 잔기 37 % 동일성 및 56 % 포지티브를 나타냈고 기생적 연어 기생충으로부터의 vitellogenin2 유전자와 23 % 동일성 및 42 % 포지티브를 나타냈다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg cDNA를 보기 위하여, T. 자포니쿠스(T. japonicus)에 대한 GS 20 서열 데이터로 얼라인 하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg cDNA의 80 % 이상의 커버리지를 발견하였다. GS 20 시퀀서에 의한 400,000 EST 중 다수의 히트 컨티그 (hit contigs)(12,430)와 히트 싱글레톤(hit singleton)(13,633) 및 넌히트 컨티그 (nonhit contigs)(14,524) 및 넌히트 싱글레톤(nonhit singleton)(47,047)을 얻었다. 그러므로, Vg에 대한 상동체를 포함하는 요각류 상동체를 발견하기 위한 이 같은 접근법은 효율적일 수 있다. 이는 요각류들이 다른 종들, 특히 무척추동물에 대해 다소 낮은 유사성을 보이기 때문이다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 유전자는 연어 기생충 Vg에 대하여 조차 낮은 유사성을 보인다. 그러나, 몇몇 모티프에 대해서는 다소 높은 유사성을 보인다(데이터는 나타내지 않음). 요각류로부터의 Vg 서열을 더 많이 알게 되면 Vg 유전자 및 유전자 산물 구조를 현재보다 더 잘 비교하고 대조할 수 있을 것이다.

T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg의 추론된 아미노산 서열은 이론적 pI 값이 8.76을 가지며 계산된 분자량은 209.9 kDa이었다. 또한, 비텔로제닌 N 도메인(2-572 aa), DUF1943 (606-915 aa) 및 VWD 도메인(1060-1240) 같은 기능적 모티프를 함유하였다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 내에 포스비틴(phosvitin) 및 폴리세린 도메인은 없었다. 프로모터 서열은 ER 반쪽 부위 (GGTCA), MRE(TGCGTC) 및 TATA 박스가 존재하는 것으로 나타났다(도 2).

실시예 2: 계통발생학적 분석

2.1. 분석 방법

24 가지 종(연어 기생충 종들 및 Tigriopus를 포함하는 14 종류의 공충과 10 종류의 갑각류)으로부터의 아미노산 서열로 Bayesian 분석을 사용하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg의 계통발생학적 분석을 수행하였다. 모든 서열은 다중 얼라인먼트 방법에 의하여 ClustalX(버젼 1.83)로 얼라인하였다. 격차(gap)와 결손자료 (missing data)는 분석으로부터 완전히 배제하였다. 생성된 데이터 매트릭스를 nexus 포맷으로 전환하여 일반 시간 가역성 (general time reversible: GTR) 모델을 사용하여 Bayesian 프로그램(버전 3.1.1)으로 분석하였다. Markov chain Monte Carlo (MCMC) 방법을 4개 체인에 대하여 설정하였고 1,000,000 세대를 수행하였다. 샘플링 빈도를 매 100 세대마다 설정하였다. 분석 후, 최초 1000 세대를 번인(burn-in)으로서 삭제하고 보존 트리(consensus tree)를 구성하였다. 언루트된 (unrooted) 계통발생수를 TreeView 버젼 6.6으로 가시화하였다.

2.2. 계통발생학적 상호관계

T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 유전자의 위치를 결정하기 위하여, 절지동 물 종들로부터 23 가지 다른 Vg 아미노산 서열을 사용하여 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg의 Bayesian 분석을 수행하였다. 언루트된 (unrooted) 방사상 트리는 요각류의 Vg 유전자가 다른 육각류나 십각류의 것과는 구분되는 것으로 나타났다(도 3). 티그리오푸스(Tigriopus) Vg는 다른 육각동물 및 십각동물과 비교하여 연어 기생충과 가까운 유연관계를 나타내었다. 분기군에서 계통수 위상의 견고성을 나타내는 것을 강하게 지지하는 값들이 있었다.

실시예 3: 상이한 발생 단계에서 Vg 발현

티그리오푸스(Tigriocus) Vg 유전자의 발현 패턴을 실시간 RT-PCR을 사용하여 발생의 상이한 단계에서 연구하였다. 세 가지의 노플리우스(nauplius) 단계 (N1, N2-5, N6), 4 가지의 코페포다(copepodid) 단계 (C2, C3, C4, C5) 및 성체 숫컷과 암컷을 연구하였다. SuperScript^TM III 역전사효소 (Invitrogen)를 사용하여 전체 반응 부피 20 ㎕에서 각 샘플로부터의 2 ㎍ 전체 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 실시간 RT-PCR 증폭을 위하여는 반응 당 1 ㎕의 cDNA, T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 및 β-액틴 유전자의 0.2 μM 프라이머 세트를 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94 ℃/4 분; 94 ℃/30 초, 55 ℃/30 초, 72 ℃/30 초 35 사이클; 및 72 ℃/7 분. 특정 산물의 증폭을 확인하기 위하여 다음 매개변수로 용융 곡선 사이클을 수행하였다: 95 ℃/분, 55 ℃/분, 80 사이클의 사이클당 0.5 ℃ 증가하는 55 ℃/10 초. 구체적 PCR 산물을 검출하기 위하여 SYBR

Green(Invitrogen)을 사용하였다. SYBR

Green의 증폭 및 검출은 MyiQ(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 수행하였다. 티그리오푸스(Tigriocus) β-액틴 유전자(AF466280)을 참조 유전자로 사용하여 샘플 사이의 발현 수준을 표준화하였다. 데이터는 MyiQ 광학 시스템 소프트웨어 버젼 1.0(Bio-Rad)을 사용하여 (형광이 임계값 위에서 검출되고 인풋 표적 분량이 증가함에 따라 선형적으로 감소하는 PCR 사이클 수인) C_T로서 수집하였다. 각 샘플의 C_T를 사용하여 △C_T 값(표적 유전자 C_T - β-액틴 C_T)을 계산하였다. 상대적인 유전자 발현의 변화 배수를 Livak 및 Schmittgen의 2^{-△△ C} _T 방법(2001)에 의하여 측정하였다. 각 실험에서 세 가지 샘플을 사용하였고 최종적으로는 각 샘플로부터의 PCR 플레이트에서 발현을 3 개 한 벌인 웰에서 측정하였다.

T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 노플리우스 단계에서 Vg 유전자의 전사체가 거의 검출되지 않았다(도 4). 단지 코페포다 단계 C5 후에 측정 가능한 Vg mRNA가 기록되었다. 성체 수컷 및 암컷 사이의 전사체 농도는 유의하게 상이하였다. 암컷 Vg 발현은 수컷에서나 다른 발생 단계에서의 것과 비교하여 통계적으로 (P<0.05) 높게 나타났다. 실제로, 암컷 요각류는 수컷보다 270배 더 Vg를 발현하였다.

상이한 연령군의 알을 밴 암컷 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 Vg 발현이 도 5에 나타난다. 알을 밴지 4 주된 시점에서 가장 높은 발현 수준이 관찰되었다. 다른 기간군과 비교하여 제 3 주 및 제 4 주에서 유의하게 (P<0.01) 높게 발현되었다. Vg 발현은 알을 밴 암컷의 10 주 동안의 연구 기간을 통하여 기록하였다. 이 연구를 바탕으로 판단하면 알을 밴지 3 내지 8 주 동안 암컷은 Vg 합성에 활성을 더 많이 나타낸다. 알 밴 기간이 1 주인 것과 10 주인 것 사이를 비교할 때 Vg 발현의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 결론적으로, 종(bell) 모양의 발현 패턴이 분명하였다.

실시예 4: 금속에 노출된 요각류의 Vg 발현

4.1. 금속 노출 후 요각류의 Vg 발현 측정

내분비 교란 물질로 알려진 (Henson 및 Chedrese, 2004) 카드뮴을 포함한 미량 금속에 노출된 요각류의 Vg 전사체의 발현을 연구하기 위하여 약 200 개체의 성체 요각류(성별 혼합)를 다음 농도: 은은 AgNO₃로서 10 ㎍/L, 비소는 NaAsO₂로서 5㎎/L, 카드뮴은 CdCl₂로서 12.5 ㎎/L, 구리는 CuSO₄로서 1.5 ㎎/L의 미량 금속에 노출시켰다. 모든 금속염은 99 % 이상 순도로 Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 여기에서 사용된 농도는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)에 대하여 종전에 보고된 선택된 금속의 LC₅₀ 및 NOEC 값(Lee 등, 2007, 2008)에 기초한다. 정지 재생 노출(static renewal exposure) 조건이 이어졌으며 50 %의 노출 물을 24 시간 후 교체하였다. 대조군의 요각류는 노출 없이 유지하였다. 24 시간 및 96 시간 후 각 군으로부터 요각류 샘플을 수집하여 상기된 바와 같이 정량적 실시간 RT-PCR을 사용하여 Vg 발현 분석에 대하여 처리하였다. 노출에 대하여 세 세트를 실행하여 PCR 플레이트에서 각 세트로부터의 샘플을 반복된 3개 한 벌로 분석하였다.

4.2. 미량 금속 노출의 영향

24시간 및 96 시간의 미량 금속 노출이 Vg 발현에 미치는 영향이 도 6 에 나타난다. 단지 96 시간 동안의 카드뮴 노출은 유의한 유도를 유발하였다(P<0.01). 대조군과 비교한 발현량의 차이는 24 및 96 시간 동안의 다른 금속들 및 24 시간 카드뮴 노출에서는 유의하지 않았다.

실시예 5: T. 자포니쿠스( T. japonicus )의 Vg 에 특이적인 항체 제조

항원으로 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 Vg 중 SEQ ID NO:1 위치 1024 - 1065 부분에 의하여 코딩되는 펩티드를 사용하여 공지된 방법에 따라 항-자포니쿠스(T. japonicus) Vg 래빗 항체를 제조하였다. 래빗에 제 0 주에 완전 Freund's 아주번트를 주사하여 사전-면역 처리하고, 제 4 주, 제 6 주 및 제 8 주 세 차례에 걸쳐 불완전 Freund's 아주번트 중의 항원 500 ㎍을 각 래빗에 주사하였다. 제 5 주 및 제 7 주에 시험 채혈을 하여 ELISA 시험을 수행하고 제 9 주에 심장 천공을 수행하여 채혈하고 ELISA 시험을 수행하였다.

제조된 항체는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 Vg에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

도 1은 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus)의 비텔로제닌의 cDNA 서열(GenBank 접수번호 EU416312)을 도시한다. 밑줄친 서열(AATAAA)은 폴리(A) 신호 서열이고, 별표(*)는 종결 코돈의 위치를 나타낸다.

도 2는 5'-인접 영역, 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2 및 TATA 박스를 나타내는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 비텔로제닌의 뉴클레오티드의 위치 번호는 전사개시 위치로부터 부여하였고, 음의 숫자는 5'-인접 영역을 나타낸다. 엑손의 뉴클레오티드는 굵은 글씨체로 표시하였다. 보존적 전사 인자 결합 부위는 밑줄로 표시하였고 BCM Serch Launcher(http://searchlauncher.bcm.edu/seq-search/gene-search.html)의 NNPP/진핵생물을 사용하여 결정하였다. MRE=Metal response element (금속 반응 인자)

도 3은 비텔로제닌 아미노산 서열의 베이스의(Bayesian) 계통수이다. 사용된 서열은 다음과 같다: Apis mellifera (NP_001011578), Pimpla nipponica(AAC32024), Encarsia formosa (AAT48601), Nasonia vitripennis (XP001607388), Blattella germanica (CAA06379.2), Homalodisca coagulata (AAZ06771), Riptortus clavatus (AAB72001), Spodoptera litura (ABU68426), Graptopsaltria nigrofuscata (BAA85987), Leucophaea maderae (BAB19327), Bombyx mandarina (BAB32642.2), Athalia rosae (BAA22791), Antheraea pernyi (ABS19573), Actias selene (ABP63663), Homarus americanus (ABO09863), Marsupenaeus japonicus (BAD98732), Litopenaeus vannamei (AAP76571.2), Cherax quadricarinatus (AAG17936), Metapenaeus ensis (AAN40700), Portunus trituberculatus (AAX94762), Pandalus hypsinotus (BAD11098), Macrobacchium rosenbergii(BAB69831), Lepeophtheirus salmonis (ABU41134).

도 4a는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 상이한 발생 단계를 나타내는 현미경 사진이며, 도 4b는 T. 자포니쿠스(T. japonicus)의 여러 발생 단계에서 비텔로제닌 발현량을 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 단계 1 내지 6은 노플리우스 단계이고, 두 번째 줄의 다섯 단계(7 내지 11)은 코페포다 단계를 나타낸다(Seo 등 참조).

도 5는 상이한 연령군의 T. 자포니쿠스(T. japonicus) 암컷의 Vg mRNA 발현을 나타낸다. 발현량은 알을 밴 후 암컷 코페포다의 정량적 실시간 RT-PCR에 의하여 측정하였다. 각 실험에서 동일 조건의 세 벌의 샘플을 전개하여 각 개별 샘플에 대하여 PCR 세 벌 샘플을 분석하였다. 값은 9 개의 반복 시험의 평균값이다. T. 자포니쿠스(T. japonicus) β-액틴 유전자를 하우스키핑 유전자 대조군으로 사용하여 발현량을 정상화하였다.

도 6은 미량 금속 노출이 T. 자포니쿠스(T. japonicus) Vg 발현량에 끼치는 영향을 나타내는 그래프이다. 실시간 RT-PCR에 의한 발현량 측정을 위하여 노출 후 24시간 및 96 시간에 샘플을 수집하였다. 각 금속에 대하여 약 200여 마리의 성별 불문의 코페포드로 구성된 세 개의 세트를 사용하였다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> VITELLOGENIN PROTEIN FROM COPEPOD AND METHOD FOR DETEMINING ENDOCRINE DISRUPTOR CONTAMINATION USING THE SAME <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5692 <212> DNA <213> Tigriopus japonicus <220> <221> CDS <222> (1)..(5526) <400> 1 attgttttga cc atg aag tct atc gtt gct ttg gct cta ttt gtc 33 Met Lys Ser Ile Val Ala Leu Ala Leu Phe Val 1 5 10 agt gtt gcc ttg tgc aac tct acc gcc cat tac ggt tgg att cct aac 81 Ser Val Ala Leu Cys Asn Ser Thr Ala His Tyr Gly Trp Ile Pro Asn 15 20 25 cat gag ctc acc ttc agg tgg acc acc tcc cag atc acg ggt ctg gag 129 His Glu Leu Thr Phe Arg Trp Thr Thr Ser Gln Ile Thr Gly Leu Glu 30 35 40 gag atc cgt gct cag tat ggt ggt atg gag ttg agc tcc atc atc agg 177 Glu Ile Arg Ala Gln Tyr Gly Gly Met Glu Leu Ser Ser Ile Ile Arg 45 50 55 gtc caa gtc ttc ccc gac tac tcg ctc cgc atc aag ttt gag aac ccc 225 Val Gln Val Phe Pro Asp Tyr Ser Leu Arg Ile Lys Phe Glu Asn Pro 60 65 70 75 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1905 Thr Leu Leu Pro Leu Thr Arg Val Ile Glu Gly Lys Met Ser Ser Lys 620 625 630 635 ccc atg gct cgc tcc atg gct gtc tac tcc ctg aag cgc ctg gcc aag 1953 Pro Met Ala Arg Ser Met Ala Val Tyr Ser Leu Lys Arg Leu Ala Lys 640 645 650 ttg gaa ccc act gtg gtg cga ccc atc ctt ttg gct ctg att gac aac 2001 Leu Glu Pro Thr Val Val Arg Pro Ile Leu Leu Ala Leu Ile Asp Asn 655 660 665 ctc gct gaa cac act gaa gtc cga att gcc gcc gtg gcc gtc ctg ccc 2049 Leu Ala Glu His Thr Glu Val Arg Ile Ala Ala Val Ala Val Leu Pro 670 675 680 tgg agc cag cct tcc gtg gcc gag ctt caa aag atg gcc ttg cgt agc 2097 Trp Ser Gln Pro Ser Val Ala Glu Leu Gln Lys Met Ala Leu Arg Ser 685 690 695 tgg ttt gag ccc tcc aag caa gtt gcc tcc ttc atg tac tcg acc ctg 2145 Trp Phe Glu Pro Ser Lys Gln Val Ala Ser Phe Met Tyr Ser Thr Leu 700 705 710 715 aaa tat ttg cct gag act gag gtg cct gaa ttg aag ccc att ggc ttg 2193 Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Glu Val Pro Glu Leu Lys Pro Ile Gly Leu 720 725 730 aag gcc aag act ctt ttg cac ttg gtg aag 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aag act ccc gct gct ctt gct caa ctc aag atg 2577 Gln Asn Arg Ser Gly Lys Thr Pro Ala Ala Leu Ala Gln Leu Lys Met 845 850 855 ctt ggt ctg gaa act ttc tac gct ctg gac gtc aag acc tac gtt gag 2625 Leu Gly Leu Glu Thr Phe Tyr Ala Leu Asp Val Lys Thr Tyr Val Glu 860 865 870 875 att ttg aac cta gtt tcg gag aag ctt cgc ggt gct gag ttg tct gaa 2673 Ile Leu Asn Leu Val Ser Glu Lys Leu Arg Gly Ala Glu Leu Ser Glu 880 885 890 gga aag acc ttc caa aag act cgt ctg caa aat ctg ctg aac ttg gaa 2721 Gly Lys Thr Phe Gln Lys Thr Arg Leu Gln Asn Leu Leu Asn Leu Glu 895 900 905 tcc ttt ggc ccc tct gaa gct ggt ttc ctt ctg tac gtg cgc aag act 2769 Ser Phe Gly Pro Ser Glu Ala Gly Phe Leu Leu Tyr Val Arg Lys Thr 910 915 920 gtt ccc gtg gtt ttg gcc tac aag gga tct tac tct acc cgc act gaa 2817 Val Pro Val Val Leu Ala Tyr Lys Gly Ser Tyr Ser Thr Arg Thr Glu 925 930 935 tct ctg gaa tcc agc gac tct gag aag tac ttc aag gcc gaa atc aag 2865 Ser Leu Glu Ser Ser Asp Ser Glu Lys Tyr Phe Lys Ala Glu Ile Lys 940 945 950 955 ccc att gcc gac atc aag gtg gaa acc acc ttc ggt gtt gtg tct cct 2913 Pro Ile Ala Asp Ile Lys Val Glu Thr Thr Phe Gly Val Val Ser Pro 960 965 970 ttc acc aag caa ttc gtt ggt gcc gga gtt gag atg ggt ctc cat gcc 2961 Phe Thr Lys Gln Phe Val Gly Ala Gly Val Glu Met Gly Leu His Ala 975 980 985 aat gga tgt gct gcc gtc aag gct gag att aac aag ccg ggt caa ctg 3009 Asn Gly Cys Ala Ala Val Lys Ala Glu Ile Asn Lys Pro Gly Gln Leu 990 995 1000 acc ttg act ttg aag aag cca gag caa atc aac agc aag gtt gaa ctc 3057 Thr Leu Thr Leu Lys Lys Pro Glu Gln Ile Asn Ser Lys Val Glu Leu 1005 1010 1015 atc cat gtg ttt gtc aag ccc tac acc gtg act cga gat ctg act cgt 3105 Ile His Val Phe Val Lys Pro Tyr Thr Val Thr Arg Asp Leu Thr Arg 1020 1025 1030 1035 ttg gtg ccc act tgc aag gac tcc agc gcc aag acc atc atg tcc aag 3153 Leu Val Pro Thr Cys Lys Asp Ser Ser Ala Lys Thr Ile Met Ser Lys 1040 1045 1050 gaa ccc atc aag caa gag ttc aag ctc ggc gag aga ttc ggc gtg gac 3201 Glu Pro Ile Lys Gln Glu Phe Lys Leu Gly Glu Arg Phe Gly Val Asp 1055 1060 1065 ctg aat gcc aag ttt gcc acc gac tac aga cat ttc gac ttt gga tat 3249 Leu Asn Ala Lys Phe Ala Thr Asp Tyr Arg His Phe Asp Phe Gly Tyr 1070 1075 1080 atc atc aac aag atg tct tac caa aac ttc caa tct gct ctt cac act 3297 Ile Ile Asn Lys Met Ser Tyr Gln Asn Phe Gln Ser Ala Leu His Thr 1085 1090 1095 gga ctc atg gtt ccc tcc atc aga tac ttc tcc ttc caa ctt gtt tgg 3345 Gly Leu Met Val Pro Ser Ile Arg Tyr Phe Ser Phe Gln Leu Val Trp 1100 1105 1110 1115 gat gtt gag gct tct caa acc aaa gaa att aga act aga atc tct tct 3393 Asp Val Glu Ala Ser Gln Thr Lys Glu Ile Arg Thr Arg Ile Ser Ser 1120 1125 1130 gtc cgt ggc caa cac atg gaa ggt ggt gac ttt gaa ttg gtc tca gag 3441 Val Arg Gly Gln His Met Glu Gly Gly Asp Phe Glu Leu Val Ser Glu 1135 1140 1145 gac aac atc act cag gag gag caa ttg agg agg atc tgc ggc gaa tct 3489 Asp Asn Ile Thr Gln Glu Glu Gln Leu Arg Arg Ile Cys Gly Glu Ser 1150 1155 1160 tat caa aat caa aga gac gct gaa atg tgc caa caa caa gct ctt ggt 3537 Tyr Gln Asn Gln Arg Asp Ala Glu Met Cys Gln Gln Gln Ala Leu Gly 1165 1170 1175 caa ctc gag cgt gct gct gaa acc gtt caa gac atc tgc gag tct ggc 3585 Gln Leu Glu Arg Ala Ala Glu Thr Val Gln Asp Ile Cys Glu Ser Gly 1180 1185 1190 1195 cct ctg gcc gag gag aag aaa cgc gtg tgt agg aag gcc gtt cat gtt 3633 Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Arg Val Cys Arg Lys Ala Val His Val 1200 1205 1210 tgc gaa caa gcc aag cgg atc tgt gaa gag tcc cgc cgt caa gag atg 3681 Cys Glu Gln Ala Lys Arg Ile Cys Glu Glu Ser Arg Arg Gln Glu Met 1215 1220 1225 gag atc tgt caa gag aag aaa gac caa tgc ttg agc aag cgt cgc acc 3729 Glu Ile Cys Gln Glu Lys Lys Asp Gln Cys Leu Ser Lys Arg Arg Thr 1230 1235 1240 atc caa cac atg gaa aga acc ctc cgt ggt caa caa ggt gga gat gga 3777 Ile Gln His Met Glu Arg Thr Leu Arg Gly Gln Gln Gly Gly Asp Gly 1245 1250 1255 tac att cat ggt ctc aac att gaa tct tcc ctt cgc tct gct tac cgc 3825 Tyr Ile His Gly Leu Asn Ile Glu Ser Ser Leu Arg Ser Ala Tyr Arg 1260 1265 1270 1275 gga gag cgt agg gtc gag ctt gtg agc gtc ttt gga cgc aag gtc agc 3873 Gly Glu Arg Arg Val Glu Leu Val Ser Val Phe Gly Arg Lys Val Ser 1280 1285 1290 aac aac aac aaa gag atc aag act ttc gtt gac atc aag atg gtc acc 3921 Asn Asn Asn Lys Glu Ile Lys Thr Phe Val Asp Ile Lys Met Val Thr 1295 1300 1305 cct gaa cat ccc gtt tac gaa gtg gag gct gtc agt gag acc aag ttg 3969 Pro Glu His Pro Val Tyr Glu Val Glu Ala Val Ser Glu Thr Lys Leu 1310 1315 1320 ccc gag gtc atg tac cga tgg aac ttg gac tcc ctt ttg aag gag gac 4017 Pro Glu Val Met Tyr Arg Trp Asn Leu Asp Ser Leu Leu Lys Glu Asp 1325 1330 1335 atc aac atg aag aac aag gtc gtt atc aag ttt ggt cgt caa agt ggc 4065 Ile Asn Met Lys Asn Lys Val Val Ile Lys Phe Gly Arg Gln Ser Gly 1340 1345 1350 1355 gag aag cac acc att gag ctc aag acc aac tgg gag aag act gaa gca 4113 Glu Lys His Thr Ile Glu Leu Lys Thr Asn Trp Glu Lys Thr Glu Ala 1360 1365 1370 caa agg cag gcc gtt cgc gaa tcg ccc gag ttc aag aag tgc aat gac 4161 Gln Arg Gln Ala Val Arg Glu Ser Pro Glu Phe Lys Lys Cys Asn Asp 1375 1380 1385 gag ttc caa gct gga cgt ctt ttg tcc tct gtg tgc atg gag gct cgc 4209 Glu Phe Gln Ala Gly Arg Leu Leu Ser Ser Val Cys Met Glu Ala Arg 1390 1395 1400 cac caa gct gcc tct gtc gac aag gtc caa ttc aag atc cag gtt ccc 4257 His Gln Ala Ala Ser Val Asp Lys Val Gln Phe Lys Ile Gln Val Pro 1405 1410 1415 tcc ttc atg agg cat tcc atc tgg gga caa cga ttt atg tcc gct gtt 4305 Ser Phe Met Arg His Ser Ile Trp Gly Gln Arg Phe Met Ser Ala Val 1420 1425 1430 1435 gag ggc tat ctg atg atg aac tat ggt gtt gct cgt caa tcc ttg gct 4353 Glu Gly Tyr Leu Met Met Asn Tyr Gly Val Ala Arg Gln Ser Leu Ala 1440 1445 1450 ggt gat cgt tct act gaa agt ctg gag ggt gag ttg cga gtg tct cga 4401 Gly Asp Arg Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gly Glu Leu Arg Val Ser Arg 1455 1460 1465 tct ggc cgc act gcc gag ctg aag atc acc tct ccc gtc gag atg aag 4449 Ser Gly Arg Thr Ala Glu Leu Lys Ile Thr Ser Pro Val Glu Met Lys 1470 1475 1480 tac caa aag atc act ttg ccc tat gcc atc cgt ggt ttc atg ccc ctg 4497 Tyr Gln Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Ala Ile Arg Gly Phe Met Pro Leu 1485 1490 1495 tct ctc cgt aat gga gtg ttc cac cgt ctg gtt caa aag gtc acc cgt 4545 Ser Leu Arg Asn Gly Val Phe His Arg Leu Val Gln Lys Val Thr Arg 1500 1505 1510 1515 gac caa gct cct gcc agc tgt cgc att gat ccc gag tgg att agc acc 4593 Asp Gln Ala Pro Ala Ser Cys Arg Ile Asp Pro Glu Trp Ile Ser Thr 1520 1525 1530 ttc gac aac aag acc tac aag tac tca ttg aac act tgt gaa cat ctt 4641 Phe Asp Asn Lys Thr Tyr Lys Tyr Ser Leu Asn Thr Cys Glu His Leu 1535 1540 1545 ttg ttc aag gat tgc tcc aac aag agg cct ttg gct gtc ttg gct gaa 4689 Leu Phe Lys Asp Cys Ser Asn Lys Arg Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu 1550 1555 1560 ggt gtc agt gat gcc tac aag aat gtc aag gtc atc ctt gga acc aac 4737 Gly Val Ser Asp Ala Tyr Lys Asn Val Lys Val Ile Leu Gly Thr Asn 1565 1570 1575 att gtc acc atg aac tgg aac aat ggc aag gtt gac atc aag ctc aat 4785 Ile Val Thr Met Asn Trp Asn Asn Gly Lys Val Asp Ile Lys Leu Asn 1580 1585 1590 1595 ggt gaa cac aag gaa gtc cgt gtg gga gag ctc ttc gtc aag aag tcc 4833 Gly Glu His Lys Glu Val Arg Val Gly Glu Leu Phe Val Lys Lys Ser 1600 1605 1610 tcc aag act gga tat gtc gtg ctg aac atc ttc cgc acc aag gac tct 4881 Ser Lys Thr Gly Tyr Val Val Leu Asn Ile Phe Arg Thr Lys Asp Ser 1615 1620 1625 gtt gtg tcc gtc tac aat ccc gtc gaa ggg ctt gag gtc ttc tac aat 4929 Val Val Ser Val Tyr Asn Pro Val Glu Gly Leu Glu Val Phe Tyr Asn 1630 1635 1640 gga aag atg atc gaa att gtg gcc cct caa atc ttg cac aac cgt gct 4977 Gly Lys Met Ile Glu Ile Val Ala Pro Gln Ile Leu His Asn Arg Ala 1645 1650 1655 tgc ggc ctc tgc ggc gat ctg aac ctt gag aac act gcc gat ttg caa 5025 Cys Gly Leu Cys Gly Asp Leu Asn Leu Glu Asn Thr Ala Asp Leu Gln 1660 1665 1670 1675 acc ccc aag caa tgc ttg atg cgt cac aac cgt ttc aat gct tac acc 5073 Thr Pro Lys Gln Cys Leu Met Arg His Asn Arg Phe Asn Ala Tyr Thr 1680 1685 1690 tac atg atc aag aag aac ggt tgc cct gga gtg ccc gct gaa gat cga 5121 Tyr Met Ile Lys Lys Asn Gly Cys Pro Gly Val Pro Ala Glu Asp Arg 1695 1700 1705 gag 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Asp Lys His Arg Val Pro 1805 1810 1815 acc atg tgc tct tcg gac ttc agt gaa tca gag gag ttc gct cgc aac 5505 Thr Met Cys Ser Ser Asp Phe Ser Glu Ser Glu Glu Phe Ala Arg Asn 1820 1825 1830 1835 tac cga acc acc ccc aga tat tg attgagtcac gcacaacgga ttcacgatat 5558 Tyr Arg Thr Thr Pro Arg Tyr 1840 tgtcggctat ttatttctaa ataccatgaa aacattcaaa ttaggaaaac tgtaagcggc 5618 aaaatttcta aattgatttt tattgcataa taaaacaatt ttgaaccaaa aaaaaaaaaa 5678 aa 5680 <210> 2 <211> 1842 <212> PRT <213> Tigriopus japonicus <400> 2 Met Lys Ser Ile Val Ala Leu Ala Leu Phe Val Ser Val Ala Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ser Thr Ala His Tyr Gly Trp Ile Pro Asn His Glu Leu Thr Phe 20 25 30 Arg Trp Thr Thr Ser Gln Ile Thr Gly Leu Glu Glu Ile Arg Ala Gln 35 40 45 Tyr Gly Gly Met Glu Leu Ser Ser Ile Ile Arg Val Gln Val Phe Pro 50 55 60 Asp Tyr Ser Leu Arg Ile Lys Phe Glu Asn Pro Lys Phe Val Val Val 65 70 75 80 Asn Lys Asp Leu Pro Ile Val His Gly Arg Pro Gln Ile Pro Glu Gly 85 90 95 Ser Gln Glu Leu Pro Glu Glu Phe Arg Arg Pro Leu Glu 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1740 Leu Phe Lys Lys Glu Glu Asn Arg Ile Cys Phe Ser Lys Arg Gln Ile 1745 1750 1755 1760 Arg Val Cys Ser Gly Asn Ser Arg Pro Glu Ile Met Lys Ile Asp Val 1765 1770 1775 Leu Asp Tyr Ala Cys Leu Ile Trp Pro Ser Thr Lys Ala Glu Gln Phe 1780 1785 1790 Leu Ala Arg Ala Lys Ala Gly Glu Ile Ile Asp Glu Leu Ile Ala Leu 1795 1800 1805 Pro Thr Val Tyr Ser Asp Lys His Arg Val Pro Thr Met Cys Ser Ser 1810 1815 1820 Asp Phe Ser Glu Ser Glu Glu Phe Ala Arg Asn Tyr Arg Thr Thr Pro 1825 1830 1835 1840 Arg Tyr <210> 3 <211> 1740 <212> DNA <213> Tigriopus japonicus <400> 3 tggagatgga gttcaatgat ggatagatgt tttttgagag gaatcctggt caggactgac 60 tgatggttat ctcgtcacgg ttggggttct ctctcttcaa tgatcgttac tttggtcatc 120 ttttgggata atccagtaaa agtcgctttt tgacttttca agttcaatgt tcacccgatt 180 cccaagacgg tctaaagtct cgtaattgct tagactgaaa tcaatgtttc taatcggtga 240 tttttttttc aaaggcacaa aaactgaatg aagcagaaac tgtctcattg cagtttgatc 300 ttgagatgaa tggctggaag cagttgagat tttggctatc aaagtgaaaa tgataaataa 360 ttttcacttt acaagttctg agttgcaagt caatcgttct attcatattt tggaataaaa 420 cgttggagat ttttatgtaa ataaaataat agggaggaat acctacactt tatgtgacaa 480 gagttatttc aaactagatg aaagttgaaa ctcttagaca atgaggagtg taaagtttaa 540 atgctaatac ttaaaatttt aataaaaagc cccctcaaaa aagaaaacaa gttaactgac 600 catttgccac aaagatggac atggaatgac atattgtttt actgcctcat tattgcccat 660 caaaggaaag ttatatcata atttggaaca atttcaaaag cagacttacc aaagaagatt 720 aattcgtacc aaagcttact taagaatgac acacctcaaa aaattcgtga tcaaatggaa 780 ccaaacagaa acacaaatga ccaaaaagtt gtaaaagcaa gagaagtaac atcgggagga 840 caaacttatc tgttaggctt ttatggcaca taaaaataaa agaaaaccaa ggaagctcct 900 cattttgcgc tcaaacaaga tggtgaaatt ttccttttga cgaaagcaac aataccgatc 960 aaacttctat tgtttattga agttttctct ttctgataac aattattatt attagtttat 1020 tgcaatgcat tagcatcaga ttcgtcacaa aaattaaggt gaaggtttga caattggcaa 1080 aggcaggagt tttgtgcgtt taggtgatat tccagatttt cacacattat gtagtgattt 1140 gaatcaaaga tggtacgaca cacttctcct cggtattttg ggttggacgg ttattaggtc 1200 tgcacaaaaa aaaagaacaa aacaatgaga aataggccaa tactcaagca aaaatatcac 1260 attttgcctc ttcgcaacaa acaagcatta gcaactagaa gtgatgagta aggttaaatt 1320 tgttggtacg aaagaacaaa acgaatgaat caatgacatc aagtcttaat gaaagacaaa 1380 aaatgggatt gacatgtctc aggccagatt tctgcaaaca aatcaaaatt aaatgtttca 1440 gttcgggtat aaaagggtag ggaagacgag tccaaattgt cagtcaatta ggctcgtcca 1500 atagagatcc gctattgttt tgaccatgaa gtctatcgtt gctttggctc tatttggtaa 1560 gtaacagcaa tcgtcgatga gagaaatcat tcaagttggc catcctattc acgtcccatg 1620 ggtggttctc ttttccttct cactttacag tcagtgttgc cttgtgcaac tctaccgccc 1680 attacggttg gattcctaac catgagctca ccttcaggtg gaccacctcc cagatcacgg 1740 1740 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gDNA1 <400> 4 gctttggtac gaattaatct tctttgg 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gDNA2 <400> 5 gactttagac cgtcttggga atcg 24 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP1 primer <400> 6 tccttcagac aactcag 17 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP2 primer <400> 7 cttgacgtcc agagcgtaga aag 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP3 primer <400> 8 tcgacaaact tctggctgta gatg 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP4 primer <400> 9 gctgcagaag cggccataaa tcc 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP5 primer <400> 10 ggtattggtt gtagctggtg gagg 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP6 primer <400> 11 cacaagactt ggtctcctcg tgg 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP7 primer <400> 12 caacaatctt ggtcttcaac tcgc 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP8 primer <400> 13 gaagctcttg gctaccttca ggg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5GSP9 primer <400> 14 ctcaactcca taccaccata ctg 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3GSP1 primer <400> 15 caagactgga tatgtcgtgc tg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3GSP2 primer <400> 16 aacccccaaa ccgacaatag c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vg RT-F primer <400> 17 atggtgaaca caaggaagtc cg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vg RT-R primer <400> 18 agaagacctc aagcccttcg ac 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b actin RT-F primer <400> 19 atggtgtcac ccacactgtg cc 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b actin RT-R primer <400> 20 tgtggtggtg aagctgtagc ctc 23

Claims (15)

1. 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus) 유래의 비텔로제닌 단백질.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서 SEQ ID NO:2 서열을 가지는 비텔로제닌 단백질.
4. 티그리오푸스 자포니쿠스 유래 비텔로제닌 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:1 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
6. 티그리오푸스 자포니쿠스 유래 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 내분비 교란물질 검출용 조성물.
7. 티그리오푸스 자포니쿠스 유래 비텔로제닌 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체.
8. 티그리오푸스 자포니쿠스 유래 비텔로제닌 단백질 발현량의 증감을 지표로 하여 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법으로서, 상기 발현량의 증가는 내분비 교란물질 오염 증가를 의미하는 방법.
9. (a) 티그리오푸스 자포니쿠스 생체 표본에서 비텔로제닌을 전사하는 mRNA 또는 비텔로제닌 단백질의 발현량을 측정하는 단계;

   (b) 단계 (a)에서 측정된 발현량과 내분비 교란물질에 오염되지 않은 지역의 티그리오푸스 자포니쿠스 생체 표본에서 비텔로제닌을 전사하는 mRNA 또는 비텔로닌 단백질의 표준 발현량을 비교하는 단계; 및

   (c) 단계 (b)에서 비교한 발현량의 차이를 기초로 내분비 교란물질 존재 정도를 판단하는 단계를 포함하는 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 티그리오푸스 자포니쿠스는 미성숙 암컷 또는 수컷인 방법.
11. 삭제
12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 비텔로제닌 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법.
13. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 비텔로제닌을 전사하는 mRNA는 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열을 가지는 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법.
14. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 내분비 교란물질은 금속인 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 금속은 카드뮴인 내분비 교란물질 오염 정도를 측정하는 방법.

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