KR20080016940A - 구조체, 다공체, 센서, 그리고, 구조체의 제조방법 및검체의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의하면, 중간 기공을 가진 신규의 구조체가 제공된다. 본 발명은 중간 기공을 복수개 구비한 구조체에 있어서, 수상 골격부(dendritic framework) 및 해당 골격부의 길이 방향을 교차하는 방향에서 해당 골격부를 관통하는 중간 기공을 가지는 구조체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 신규의 구조체를 이용하는 다공체, 센서 및 검체의 검출방법을 제공한다.

Description

구조체, 다공체, 센서, 그리고, 구조체의 제조방법 및 검체의 검출방법{STRUCTURE, POROUS BODY, SENSOR, PROCESS OF STRUCTURE AND DETECTING METHOD FOR SPECIMEN}
본 발명은 복수의 중간 기공(mesopore)을 가지는 신규의 구조체, 다공체, 센서, 그리고, 구조체의 제조방법 및 검체의 검출방법에 관한 것이다.
다공체로서는, 종래부터 제올라이트 및 실리카 겔이 알려져 있다. 알루미노 규산염으로 이루어진 제올라이트는 흡착제 및 이온 교환재로서, 또한 촉매로서 실용화되고 있다. 이 제올라이트는 결정성이고, 균일한 기공 크기를 가지며, 우수한 특성을 가지지만, 그의 기공 크기는 약 1㎚ 이하로 작기 때문에, 제올라이트는 기공 크기보다 큰 유기 화합물의 흡착제 등에는 이용될 수 없다. 또, 실리카 겔은 제올라이트보다 큰 기공 크기를 가지지만, 그 기공 크기 분포는 광범위하고, 이것은 실리카겔의 구조의 제어가 문제로 되고 있다.
이러한 배경에 의해, 제올라이트보다 기공 크기가 크고 또 기공 크기가 균일한 기공이 규칙적으로 배열되어 있는 메조포러스(mesoporous) 재료로 불리는 재료가 개발되어 왔다. 메조포러스 재료는 계면활성제를 이용해서 제조되며, SiO2, TiO2, ZrO2 등의 산화물로 이루어진 메조포러스 재료가 보고되어 있다.
또, 메조포러스의 외형으로는, 분기 부분을 가지지 않은 도 15에 나타낸 바와 같은 입상의 것인 외형(J. Am. Chem. Soc., 126, 2004, 7440-7441; 비특허문헌 1) 및 도 16에 나타낸 바와 같은 분기 구조를 가진 외형(이하 "수상"(dendritic)이라 칭함)(Chem. Commu., 1998, 2461-2462; 비특허문헌 2)이 보고되어 있다.
이하, 메조포러스 재료를 지칭할 경우, 도 15에 나타낸 입상 메조포러스 재료 및 도 16에 나타낸 수상 메조포러스 재료 등의 메조포러스 재료의 전체 고형 부분을 특히 메조포러스 재료의 "골격부"(framework)로서 칭할 것이다. 메조포러스 재료의 기공 형상은 상기 골격부를 관통하는 튜브(즉, 관) 또는 상기 골격부 내에 구속된 구형인 것으로 공지되어 있다.
전술한 것처럼, 메조포러스 재료에 관해서는 활발한 연구가 진전되고 있었지만, 메조포러스 재료의 주된 구조로서는, 상기 비특허 문헌 1 및 2에 기재되어 있는 것만 공지되어 있었다. 이와 같이 해서, 바이오센서 등의 기능성 디바이스에 이용될 신규의 구조체를 가진 메조포러스 재료가 강력히 요망되어 왔다.
발명의 개시
본 발명자는 중간 기공을 가지는 구조체를 얻을 목적으로 구조 제어에 관해서 열심히 검토를 실시한 결과, 신규의 구조체가 제조될 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
중간 기공이란 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)에 의해 규정된 바와 같이 기공 크기가 2㎚ 이상 50㎚ 이하인 기공을 의미한다. IUPAC에 따르면, 기공 크기가 2㎚ 미만인 기공이 중간 기공으로서 규정되어 있고, 기공 크기가 50㎚보다 큰 기공이 거대 기공으로 규정되어 있다.
본 발명의 목적은 중간 기공을 가지는 신규의 구조체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규의 구조체를 이용한 다공체, 센서 및 검체의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 복수의 중간 기공을 구비한 구조체에 있어서,
수상 골격부를 포함하되, 상기 수상 골격부는 해당 골격부의 길이 방향을 교차하는 방향으로 해당 골격부를 관통하는 중간 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 구조체가 제공된다.
상기 중간 기공은 상기 골격부의 길이 방향에 직교하고 있는 것이 바람직하다.
상기 수상 골격부는 해당 골격부의 분기된 부분의 상호 연결에 의해 거대 기공을 형성하는 것이 바람직하거나, 또는
서로 인접한 골격부 간에 거대 기공 크기의 공동(void)이 형성되어 있는 것이 바람직하다.
상기 중간 기공은 바람직하게는 육각형의 대칭형상으로 배열되어 있다.
상기 중간 기공은 바람직하게는 해당 중간 기공의 80% 이상이 최대치를 포함하고 폭 10㎚의 범위 내에 있는 미세 기공 크기 분포를 가진다.
상기 중간 기공 내에 생체 물질이 담지되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 복수의 입자로 형성된 다공체로서, 상기 입자는 전술한 구조체로 이루어진 다공체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 검체를 검출하는 센서에 있어서, 상기 다공체와 전극으로 이루어지고, 상기 검체와 상기 중간 기공 내에 담지된 상기 생체 물질과의 반응에 기초한 전기적 출력 신호를 검출하는 것을 특징으로 하는 센서가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 검체의 검출방법에 있어서,
상기 구조체의 중간 기공 내에 생체 물질을 담지시킨 센서를 준비하는 공정;
검체를 함유한 유체를 상기 센서에 부여하는 공정; 및
상기 생체 물질과 상기 검체와의 반응에 기초한 출력 신호를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 검체의 검출방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 새로운 기능 재료로서의 응용이 가능한 구조체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 컬럼 등에 적절한 다공체를 제공하는 것이 가능하다. 또한, 센서로서 이용했을 경우, 종래의 센서보다 감도가 높은 센서를 제공하는 것이 가능하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 따른 중간 기공을 가지는 구조체는 수지상이다. 수지상이란, 골격부의 구조가 단순히 분기된 구조, 즉, 분기된 형상을 가지는 형상뿐만 아니라, 골격부가 연속적으로 분기되어 있는 형상을 포함하는 개념이다. 본 발명은 또한 일 실시형태로서 도 1A의 모식도, 및 도 2A의 SEM 현미경 사진 및 도 2A의 것보다 더욱 고차의 변형으로서 취해진 도 2B의 SEM 현미경 사진에 나타낸 바와 같은 3차원 망상 구조체를 형성하는 수지상 골격부를 포함한다. 3차원 망상 구조체를 채용하는 실시형태에 대해서는 도 1A, 도 1B, 도 1C, 도 2A 및 도 2B를 참조해서 이하에 설명한다.
(골격부)
서로 인접하여 3차원 망상 구조체를 형성하는 부분인 수지상 골격부(12) 내의 공동(11)은 거대 기공, 즉, 직경이 50㎚ 이상인 원의 면적 이상인 소정 방향에서의 돌출 영역을 가진 기공을 확보하는 공동이 바람직하며; 즉, 공동(11)의 크기는 바람직하게는 50㎚보다 크고, 더욱 바람직하게는 100㎚ 이상 700㎚ 이하이다. 특히, 분기된 골격부가 연결되어 거대 기공을 형성하는 도 3에 표시한 바와 같은 경우의 골격부의 공간은 바람직하게는 거대 기공의 기공 크기는 50㎚ 이상, 더욱 바람직하게는 100㎚ 이상 700㎚ 이하인 것이 바람직하다.
도 1B는 골격부(12)의 일부를 나타낸 확대도이고, 도 1C는 골격부(12)의 표면(14) 및 상기 방향(16)을 따른 구역(17)을 나타낸 확대도이다. 도 1B 및 도 1C에 도시한 바와 같이, 중간 기공(13)은 길이 방향(15)을 교차하는 방향(16)에서 골격부(12)를 관통한다. 중간 기공(13)은 상기 표면(14)상에 그의 개구를 가진다. 중간 기공 간의 부분을 구성하는 골격부 자체는 서로 중간 기공을 분리하는 "벽"을 형성한다.
본 발명의 구조체는 거시적으로는 입상 혹은 막 형상을 취할 수 있지만, 도 2A에 나타낸 바와 같은 입자의 형상을 이용하는 것이 바람직하다.
(중간 기공의 형상, 기공 크기, 배치 및 길이)
중간 기공의 기공 크기는 해당 중간 기공의 단면 형상이 원형인 경우에는 직경이고 해당 중간 기공의 단면 형상이 타원형 등의 변형된 원형인 경우에는 길이이다. 중간 기공을 가진 분말 구조체에 대해서는 질소 가스 흡착의 측정을 실시하고, 그 측정 결과로부터, BJH(Berret-Joyner-Halenda)법에 의거해서 기공 크기 분포를 유도해낸다.
본 발명에서 바람직하게 사용되는 구조체의 기공 크기 분포는 단일의 최대치를 보이고, 관련된 기공 크기 분포에서 중간 기공의 60% 이상은 상기 최대치를 비롯한 10㎚의 폭을 가진 범위 내이다. 후술하는 실시예에 따르면, 예를 들어, 미세 기공의 80% 이상의 기공 크기가 최대치로부터 ±5㎚의 범위 내, 즉, 최대치를 비롯한 10㎚의 폭을 가진 범위 내이다. 더욱 바람직하게는, 미세 기공의 90% 이상은 10㎚의 폭을 가진 범위 내이다.
본 발명에서 사용되는 중간 기공의 기공 크기는 2㎚ 이상 50㎚ 이하, 더욱 바람직하게는 10㎚ 이상 30㎚ 이하이다. 본 발명에 따른 구조체의 용도의 종류에 따르면, 예를 들어 본 발명에 따른 구조체가 바이오센서에 적용될 경우, 기공 크기는 항체 등의 생체 물질이 중간 기공 속으로 도입될 수 있도록 바람직하게는 10㎚ 이상이고, 생체 물질의 입체구조의 안정화의 관점에서 바람직하게는 30㎚ 이하이다.
중간 기공의 형상은 하나의 개구로부터 다른 개구까지 단조 증가하거나 불연속적으로 변화하도록 될 수 있다.
중간 기공의 주기성의 정보는 X선 회절(XRD) 측정으로부터 얻을 수 있다. 단면에 대해서 법선 방향에서 본 중간 기공의 형태는 도 4A에 표시된 바와 같은 매트릭스 형태 또는 도 4B에 표시된 바와 같은 육각형으로 대칭인 형태로 제한되지 않고, 다른 규칙 혹은 불규칙적인 형상일 수도 있다. 본 실시형태에 따른 구조체는 XRD 측정에 있어서 1㎚ 이상의 구조 주기에 대응하는 각도 영역에 적어도 1개의 회절 피크를 가지며; 이것은 중간 기공이 규칙적으로 배열되어 있는 것을 의미한다.
중간 기공 간의 상호 분리는 1㎚ 내지 4㎚ 정도이다. 더욱 바람직하게는, 복수의 인접한 중간 기공은 연장부의 동일 방향을 공유하는 것이 더욱 바람직하지만, 이들 중간 기공의 방향은 중간 기공을 따라 어디로든 복수의 방향으로 분기될 수 있다.
중간 기공의 길이는 바람직하게는 50㎚ 이상 내지 500㎚ 이하이다. 바이오센서 등의 반응 분야로서 중간 기공을 이용하는 관점으로부터, 중간 기공의 길이는 더욱 바람직하게는 50㎚ 이상 300㎚ 이하이다.
중간 기공(13)은 도 1B에 나타낸 바와 같이 골격부(12)의 길이 방향(15)을 따라 균일하게 정렬되어 있다. 중간 기공(13)은 바람직하게는 골격부(12)의 길이 방향(15)으로 가능한 한 수직방향으로 정렬된다. 전자 현미경으로 관찰가능한 소정의 면적, 예를 들어 500㎚×500㎚ 면적에 있어서, 중간 기공의 90% 이상이 바람직하게는 수직 방향을 따라 정렬된다.
(구성 재료)
골격부(12), 즉, 중간 기공의 기공 벽을 구성하는 재료로서는, 예를 들어, 산화 규소, 산화 티탄 혹은 산화 주석 등의 산화물이 바람직하다. 또, 이러한 재료는 예컨대 실리카와 같은 무기 재료 및 예컨대 벤젠 혹은 에틸렌 등의 유기 재료로 구성된 하이브리드 재료일 수 있다.
중간 기공의 기공 내벽에 실란 커플링제 등으로 이루어진 피복층을 형성할 수 있거나, 또는 중간 기공 내에 효소, 항체, DNA 등을 도입해서, 그 속에 담지시킬 수도 있다. 예를 들어, 기공 표면(기공 내벽)은 실란 커플링제로 수식(modified)될 수 있거나, 또는 산화물을 형성할 수 있는 금속을 함유하는 금속염의 수용액에 의해 수식될 수도 있다.
(구조체의 제조방법)
본 발명의 일 실시형태에 따른 중간 기공을 가지는 구조체를 제조할 목적으로, 구조체의 골격부를 형성하는 물질, 계면활성제 및 배향 제어제를 함유하는 반응용액을 가수분해 촉매의 존재하에서 120℃로 가열해서, 수열합성 조건하에서 계면활성제를 함유하는 구조체를 형성하고 나서, 해당 구조체로부터 계면활성제를 제거한다.
먼저, 제조된 반응 용액을 가수분해 촉매에 첨가하고 실온 부근에서 교반하고 나서, 수시간 내지 수일간의 범위에서 원료 물질의 축중합 반응을 일으키게 한다.
이어서, 용액 중에 생성된 침전물을 회수해서, 세정한 후에 건조시킨다. 그 후, 상기 침전물로부터 계면활성제를 제거한다. 이와 같이 해서, 골격부의 길이 방향을 교차하는 방향을 따라 상기 골격부를 관통하는 중간 기공을 가진 구조체를 얻는다.
상기 골격부의 원료가 되는 물질로는 할로겐 화합물, 칼코겐 화합물 혹은 금속 알콕사이드를 들 수 있다. 중간 기공의 기공 벽을 산화 규소로 형성하는 경우에는, 금속 알콕사이드인 테트라에톡시실란이나 테트라메톡시실란이 바람직하게 이용된다.
계면활성제로서는, 폴리에틸렌 옥사이드를 친수기로서 함유하는 블록 공중합체 등의 비이온성 계면활성제가 바람직하게 이용된다.
배향 제어제로는 수상 골격부의 길이 방향을 교차하도록 계면활성제를 배향시킬 수 있는 유기물이면 되고; 이러한 유기물의 예로는 n-데칸(C10H22)을 들 수 있다. 본 발명에 이용되는 배향 제어제의 상세한 기전에 대해서는 연구 중이지만; 계면활성제의 배향이 골격부의 길이 방향을 교차하는 방향을 따를 경우, 엔트로피의 관점에서 안정한 상태를 생기게 할 수도 있다. 반응 시간을 수시간 내지 수일간으로 설정하고, 반응시의 온도를 120℃로 설정함으로써, 입자를 형성하기 전에 산화 규소가 적층되거나 반응이 진행중인 산화 규소 입자들이 상호 결합하므로, 수상 성장으로 되는 것이라고 추측된다. 120℃의 온도는 용액을 가열하는 노의 분위기 온도이지만, 용액은 내압 용기 속에 배치되어, 실질적으로 용액의 온도는 주위의 분위기 온도와 같게 된다.
이와 같이 해서 얻어진 수상 구조체는 용액 중에 침전되므로, 원심분리기에 의해 회수될 수 있다. 그리고, 회수된 침전물은 공기 건조 등에 의해서 건조시킨다.
회수한 침전물로부터 마이셀을 형성하고 있는 계면활성제를 제거함으로써, 다공체를 얻을 수 있다. 또, 계면활성제의 제거 방법은 미세 기공 구조를 파괴하지 않고 계면활성제를 제거할 수 있는 방법인 한 특히 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법의 예로는, 용제 중에 계면활성제를 용해시켜 제거시키는 방법이나, 초임계 상태의 유체를 부여해서 기공으로부터 계면활성제를 밀어내는 방법, 또한 오존을 이용해서 계면활성제를 산화시켜 제거하는 방법 등을 들 수 있다. 보다 바람직한 것은 산소를 함유하는 분위기 중에서 구조체를 소성함으로써 계면활성제를 제거하는 방법이며, 이 방법에서는 구조체를 공기 중 550℃에서 5시간 소성하므로, 메조포러스 구조를 거의 파괴하는 일없이 계면활성제를 제거할 수 있다. 소성온도와 시간은 미세 기공 벽 또는 골격을 형성하는 재료와 사용하는 계면활성제에 따라 적절하게 선택된다.
또, 전술한 방법을 기초로 해서 얻어진 구조체에 이하의 공정을 부가적으로 적용함으로써, 생체 물질 담지체를 제조할 수도 있다.
구체적으로는, 상기 공정은 생체 물질을 함유하는 용액 중에 상기 중간 기공을 가지는 구조체를 침지하고 교반함으로써 다공체의 기공에 생체 물질을 흡착시키는 방법을 의미한다. 또, 생체 물질을 상기 중간 기공에의 도입을 용이하게 하기 위해서, 중간 기공의 미세 기공 표면(기공 벽면)에 작용기(예를 들어, 아미노기 또는 카복실기)를 도입해도 되며; 이와 같이 해서, 기공 벽 표면에 위치하는 작용기와 생체 물질이 서로 전기적으로 상호작용하기 때문에 생체 물질이 중간 기공에 용이하게 도입되는 것이라고 생각된다.
예를 들어, 실란 커플링제로 미세 기공 표면을 수식하는 방법이나, 산화물을 형성할 수 있는 금속을 함유하는 금속염의 수용액에 의해 미세 기공 표면을 수식하는 방법이 있다. 또한, 실란 커플링제는 일반적으로 화학식 R-Si-X3로 표시되는 화합물로, 그 분자 중에 2개 이상의 다른 작용기를 가지고 있다. 상기 X는 무기 재료로 이루어진 다공체 표면과 반응할 수 있는 부위를 의미한다. 예를 들어, 문헌[Journal of Sol-Gel Science, 1989, 662]에는 메조포러스 재료가 산화 규소인 경우가 기술되어 있고; 미세 기공 표면에 위치하는 실란올기의 수소 원자가 유기 규소기로 치환되어 Si-O-Si-R 결합을 형성하므로, 미세 기공 표면에 유기물 R의 층을 형성하며; X의 예로는, 클로로기, 알콕시기, 아세톡시기, 이소프로페녹시기, 아미노기 등이다. 물론, 실란 커플링제가 미세 기공 표면과 반응해서 R의 층을 형성할 수 있는 한, X가 3작용기인 것뿐만 아니라, X가 2작용기나 1작용기인 실란 커플링제도 이용할 수 있다. R은 아미노기, 카복실기 또는 말레이미드기 등의 유기기이다.
또, 산화물을 형성할 수 있는 원소를 함유하는 금속염의 수용액에 의해 미세 기공 표면을 수식할 경우에는, 해당 산화물층을 형성할 수 있는 원소로서 티탄, 알루미늄, 지르코늄, 주석 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 메조포러스 실리카를 옥시 질산 지르코늄의 수용액으로 처리함으로써, 표면에 지르코늄의 산화물층을 형성하는 것이 가능하다.
도 5A 및 도 5B는 생체 물질을 중간 기공 속에 담지한 구조체를 예시한 모식도이다.
도 5A 및 도 5B는 생체 물질(23)이 중간 기공의 기공 벽(22)에 둘러싸여 담지되어 있는 상태의 도면을 나타내고 있다. (12)는 도 1A, 도 1B 및 도 1C에 나타낸 골격부를 의미한다. 이러한 생체 물질 담지체를 바이오센서로서 이용할 경우에는, 도 5B에서 확대해서 나타낸 바와 같이, 생체 물질(23)과 특이적 친화성을 가진 물질(24)과 생체 물질(23)이 서로 반응하는 현상을 이용한다.
본 발명자는, 효소 반응이나 항원-항체 반응의 반응 장으로서 적절한 구조체를 검토하고 있고, 본 발명에 따른 구조체가 이러한 반응장으로서 적합한 것을 발견하였다.
본 발명에 이용되는 생체 물질로서는, 항체, 항체 단편, DNA, 단백질, 효소 등이다. 또, 생체 물질에는, 단쇄 DNA, Fab 항체 등의 활성 부위를 포함하는 단편 등도 포함된다. DNA 단편은 동식물이나 미생물로부터 추출해서, 원하는 형상으로 절단한 단편이어도 되고, 또는, 유전자 공학적 혹은 화학적으로 합성된 것이라도 된다.
물질(24)의 예로는 항원, 항체 단편, DNA, 단백질, 효소 등을 들 수 있다. 예를 들어, 생체 물질(23)이 항체인 경우에는, 생체 물질과 특이적인 친화도를 가지는 물질(24)이 항원이다.
도시되어 있지 않지만, 중간 기공의 기공 벽(22)의 내면을 생체 물질(23)과 연결하는 앵커를 마련하는 것도 바람직하다.
이 앵커는 생체 물질의 큰 구조 변화를 억제해서 그 생체 물질의 구조를 안정적으로 유지하는 효과를 가진다. 앵커를 구성하는 성분으로서는 중간 기공을 가지는 구조체를 구성하는 재료와 같은 구성 재료인 것이 바람직하다. 상기 앵커는 생체 물질에 결합하는 부위로서 수산기, 아마이드기, 아미노기, 피리딘기, 유레아기, 우레탄기, 카복실기, 페놀기 등을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 아조기, 하이드록실기, 말레이미드기, 실란 유도체 또는 아미노 알킬렌기 등의 작용기를 가지고 있는 화합물이어도 된다.
개개의 중간 기공은 1개 이상의 생체 물질을 수용할 수 있다. 따라서, 상기 중간 기공은 각각 생체 물질을 고정화하는 데 적당한 크기를 가질 필요가 있다.
중간 기공의 크기와 해당 중간 기공에 고정되는 생체 물질의 크기가 서로 적합화할 경우, 생체 물질의 표면은 중간 기공의 기공 벽에 근접하기 때문에, 생체 물질은 중간 기공의 기공 벽에 의한 반데르 바알스 힘에 의해 중간 기공 내에 흡착된다. 따라서, 생체 물질의 입체 구조는 보다 한층 유지되어, 입체 구조의 변화에 기인한 생체 물질의 실활(deactivation)이 더욱 억제될 수 있다. 또한, 활성 유닛은 반데르 바알스 힘뿐만 아니라, 정전적 결합, 수소결합 및 이온 결합 등의 비공유 결합에 의해 중간 기공 내에 유지될 수도 있다.
(본 발명에 따른 구조체를 이용한 기능성 디바이스)
다음에, 본 발명에 따른 구조체를 이용한 기능 디바이스에 대해 설명한다.
전술한 바와 같이, 중간 기공에 생체 물질을 담지한 구조체는 기능성 디바이스로서의 바이오센서에 적용될 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시형태에 따른 검체의 검출방법에 대해 설명한다.
우선, 전술한 구조체의 중간 기공 내에 생체 물질을 담지시킨 센서를 준비하고, 해당 센서에 검체를 함유하는 유체(액체, 기체)를 제공한다. 그러면, 검체를 함유하는 유체는 수상 구조체의 공동이나 거대 기공을 관통하면서, 중간 기공 내에 침입해서, 중간 기공 내에 담지된 생체 물질과 반응한다. 수상 골격부를 가지는 구조체의 공동이나 거대 기공은 각각 유체에 대한 컨덕턴스가 크기 때문에, 유체가 수상 골격부를 가지는 구조체 전체에 균일하게 도달하고, 또한, 상기 공동 및 거대 기공에 연통하는 중간 기공 내에 도달한다. 중간 기공의 길이 방향과 골격부의 길이 방향이 서로 평행한 경우, 골격부의 측벽에 대한 중간 기공의 개구는 발생 확률이 매우 낮으므로, 검체가 중간 기공 내에 침입할 확률이 매우 낮아진다. 본 발명에 있어서, 중간 기공의 길이 방향과 골격의 길이 방향이 서로 교차함으로써, 구조체의 다수의 중간 기공 내에서 발생하는 생체 물질과 검체와의 반응에 기초한 출력 신호가 검출되므로, 감도가 향상한다.
검체의 검출 원리는, 상세하게는, 항원과 항체 간의 항원-항체 반응, 싱글 DNA와 다른 싱글 DNA 간 등의 특이적 결합 반응 또는 기타 반응 등을 이용하는 것이다. 어느 경우에 있어서나, 전류, 전압, 광량, 질량 및 열량 등의 물리량의 변화를 이용해서, 표적 물질을 검출한다. 검출 기기의 예로는 효소 전극, 과산화 수소 전극, ISFET(Ion Sensitiｖe Field Effect Transistor), 광섬유, 서미스터, 수정 진동자 및 표면 플라스몬 공명기 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 구조체는 바이오센서 이외의 기능 디바이스로서 흡착제나 분리제와 같은 컬럼으로서 이용될 수 있다. 이 경우에는, 전술한 본 실시 형태의 구조체로 이루어진 입자를 다수 준비하고, 이들 입자를 성형해서 다공체를 제작하면 된다.
그리고, 이 다공체와 전자 전달 소자를 조합함으로써 전극을 설치하면, 상기 물리량의 변화를 전기적 출력 신호로서 검출할 수 있다.
도 1A, 도 1B 및 도 1C는 본 발명에 따른 구조체의 모식도;
도 2A 및 도 2B는 본 발명에 따른 구조체를 주사형 전자현미경으로 관찰한 사진;
도 3은 거대 기공의 형태를 나타낸 모식도;
도 4A 및 도 4B는 중간 기공의 배치를 나타낸 모식도;
도 5A 및 도 5B는 본 발명에 따른 구조체에 생체 물질을 담지시킨 경우를 나타낸 모식도;
도 6은 실시예 1에서 제조된 메조포러스 실리카의 X선 회절의 결과를 나타낸 그래프;
도 7은 본 발명에 따른 구조체를 주사형 전자현미경으로 본 사진;
도 8은 본 발명에 따른 구조체의 중간 기공을 주사형 전자현미경으로 관찰한 사진;
도 9는 실시예 1에서 제조된 다공체의 중간 기공에 퍼옥시다제를 고정화해서 톨루엔 중에서 효소 반응을 수행한 경우의 전화율과 경과 시간과의 관계를 나타낸 그래프;
도 10은 실시예 1에서 제조된 다공체의 중간 기공에 퍼옥시다제를 고정화해서 70℃에서 열처리를 수행한 경우의 효소의 상대 활성과 열처리 시간과의 관계를 나타낸 그래프;
도 11은 실시예 1에서 제조된 다공체의 중간 기공에 퍼옥시다제를 고정화해서, 소정의 온도에서 30분간 열처리를 수행한 경우의 상대 활성의 온도 의존성을 나타낸 그래프;
도 12는 본 발명에 따른 구조체를 바이오센싱 소자로서 적용한 경우를 나타낸 모식도;
도 13은 본 발명에 따른 구조체를 바이오센싱 소자에 적용할 수 있는 반응 기구를 나타낸 도면;
도 14는 본 발명에 따른 구조체를 바이오센싱 소자로서 적용한 경우를 나타낸 모식도;
도 15는 종래의 메조포러스 재료의 일례를 나타낸 사진;
도 16은 종래의 메조포러스 재료의 다른 예를 나타낸 사진.
이하, 실시예를 참조해서 본 발명을 상세히 설명한다.
( 실시예 1)
본 실시예에서는 중간 기공의 기공벽 재료가 실리카인 구조체에 대해 설명한다.
우선, 비이온 계면활성제, 즉, 트라이블록 코폴리머(EO20PO70EO20; HO(CH2CH2O)20(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)20H) 2.40g을 순수 76.5㎖에 용해시켰다. 또, 얻어진 수용액에 36중량% 농염산 7.5㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하였다. 이어서, 이 수용액에 배향 제어제로서 n-데칸을 13.9g 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다.
또, 이 혼합 용액에 가수분해 촉매로서 NH4F 0.027g 및 테트라에톡시실란(TEOS) 5.10g을 첨가하여 전구체 용액을 제조하였다. 전구체 용액의 최종 조성(몰비)은 TEOS:HCl:EO20PO70EO20:NH4F:n-데칸=25:90:0.4:0.7:100이 되도록 하였다.
상기 전구체 용액을 40℃에서 20시간 교반하고, 120℃에서 48시간 반응시켰다. 이와 같이 해서 얻어진 백색 침전물은 순수로 충분히 세정하고, 진공 건조시켰다.
이와 같이 해서 얻어진 분말 시료를 공기 중 550℃에서 소성하고, 미세 기공 내부로부터 계면활성제를 분해·제거하여, 중공의 미세 기공을 형성하였다. 계면활성제 등의 유기물의 제거는 적외 흡수스펙트럼 측정법에 따라 확인되었다.
이와 같이 해서 합성된 메조포러스 실리카 분말을 X선 회절법에 의해 평가한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 면간격 11.7㎚의 육각형 구조의 (100) 면에 귀속하는 회절 피크를 시작으로 해서, (110), (200) 및 (210)면에 귀속하는 회절 피크 를 확인하였다. 이들 결과는 이 메조포러스 실리카의 미세 기공 구조가 높은 규칙성을 가진 육각형 배열을 가지고 있는 것을 나타내고 있다.
77 K에서 질소 흡-탈착 등온선 측정을 실시한 결과, 흡착 등온선 형상은 IUPAC 분류에 따르면 IV형인 것으로 확인되었다. B.E.T.법에 의거해서 산출된 비표면적은 700 ㎡/g으로 되고, 또한 미세 기공 용량은 1.88㎖/g으로 되었다. 또, 이 흡착 등온선의 결과로부터, BJH법에 의거해서 미세 기공 크기를 산출하였다. 따라서, 본 실시예에서 합성한 메조포러스 실리카의 미세 기공 크기 분포는 14.3㎚에서 단일의 피크를 가지는 좁은 분포를 보였다. 90% 이상의 중간 기공이 극대치를 포함한 10㎚ 이내의 범위 내에 있도록 기공 크기 분포를 가지는 구조체를 얻었다.
다음에, 주사형 전자현미경(SEM)에 의해서 관찰을 수행하여, 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이 다수의 분기한 막대 형상의 구조체(수상 골격부를 가지는 구조체)가 형성되어 있었다.
이 분기한 막대 형상의 구조체의 공동(골격부 간의 공동)에는 300 내지 500㎚의 거대 기공, 혹은 거대 기공 크기의 공동이 형성된 것으로 판명되었다.
또, 더욱 고배율로 SEM 관찰을 수행한 바, 도 7에 나타낸 바와 같이, 수상 구조체의 길이 방향을 교차하는 방향으로 직경 14㎚의 관 형상의 중간 기공이 배향하고 있는 것으로 판명되었다. 도 7에 있어서, (11)은 수상 골격부에 의해 형성된 거대 기공의 기공 크기를 나타내고 있다. 또, 그 구조체의 단면도에서는, 도 8에 나타낸 바와 같이, 균일한 관 형상의 중간 기공이 벌집형상(즉, 육각형으로 대칭 인) 패킹한 미세 기공 구조를 형성하고 있었다. 단, 관찰 동안에 전자선에 의해 중간 기공 구조가 파괴되는 일은 없었다.
이상 설명한 바와 같이, 서로 기공 크기가 상이한 2종의 미세 기공, 즉, 수상 골격부의 일부 간에 형성된 거대 기공과 골격부에 형성된 중간 기공을 가지는 구조체(이하, "계층적인 구조체"라고 칭할 경우가 있음)를 합성할 수 있었다.
( 실시예 2)
다음에, 실시예 1에서 제작한 구조체(메조포러스 실리카)의 중간 기공 내에 산화환원 효소의 일종인 서양 고추냉이 퍼옥시다제(이하, "HRP"라 약칭함; 평균 직경 = 4.8㎚, 등전점(IEP) = 7.2)를 고정화시켰다. 이어서, 유기용매에 대한 내성과 열에 대한 내성을 측정하였다. 또한, 용액의 확산성에 대해서도 검토하였다.
(1) 중간 기공 내의 효소 고정화
5mM 인산 완충 용액(pH=7.4)을 이용해서 HRP 용액을 5 ㎎/㎖ 조제하고, 이 효소 용액 1㎖ 중에, 상기 합성된 메조포러스 실리카를 10 ㎎ 첨가하였다. 이 혼합 용액은 4℃, 20시간의 조건하에서 쉐이커를 이용해서 교반하였고, 이에 따라, HRP는 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에 흡착되었다.
반응 종료 후, 반응 용액을 4℃, 10분, 20000g에서 원심분리하고, HRP-메조포러스 실리카 침전물은 순수로 3회 세정하였다. 이때, 원래의 효소 용액과 상기 얻어진 상청액의 각각을 UV-Vis 흡광도 측정을 실시하였다. HRP의 403㎚에 있어서의 흡수 극대를 이용해서, 흡착 전후의 농도 변화로부터 HRP의 메조포러스 실리카에의 흡착량을 산출하였다. 세정 후의 효소-고정화 메조포러스 실리카는 10시간의 진공 동결 건조를 실시하여, 분말 시료를 얻었다. HRP의 흡착량은 메조포러스 실리카 1g에 대해 252 ㎎/g으로 높았다. 또, 인산 완충 용액의 pH를 변화시킴으로써, HRP의 흡착량이 변화하였다. 이들 결과로부터, HRP와 메조포러스 실리카의 미세 기공은 정전적 상호작용에 의해서 HRP를 고정화하고 있는 것이라고 생각된다.
미세 기공 내에 HRP의 도입은 HRP 흡착 후의 메조포러스 실리카에 대해서 수행된 질소 흡착 측정에 있어서 그 미세 기공에 대한 흡착량이 감소된 사실에 의해 확인되었다.
(2) 유기용매에 대한 내성
메조포러스 실리카에 고정화된 HRP의 유기용매 중에서의 효소 활성을 평가하기 위해서, 산화제로서 t-부틸하이드로퍼옥사이드를 이용한, 톨루엔 중에서의 1,2-다이아미노벤젠의 산화 반응을 이용하였다.
1,2-다이아미노벤젠의 50mM 무수 톨루엔 용액 8㎖와 t-부틸하이드로옥사이드의 1.1M n-데칸 2㎖를 혼합해서 혼합 용액을 제조하였다. 이 혼합 용액 1㎖에 HRP-고정화 메조포러스 실리카 10㎎을 가하여 37℃에서 반응을 개시하고, 1,2-다이아미노벤젠의 산화에 의해서 생성된 1,2-다이나이트로벤젠의 470㎚ 흡광도를 측정하여 경시 변화를 구하였다. 이와 같이 해서, 용매로서의 톨루엔 중에서의 HRP의 효소 활성을 결정하였다.
비교 시험으로서, HRP 그 자체를 0.5 ㎎ 조제하여, 상기의 산화 반응을 수행하고, 상기와 마찬가지로 방법으로 470㎚ 흡광도의 상승을 측정하였다. 얻어진 결과를 도 9에 나타낸다. HRP(유리 HRP)만으로는 톨루엔 중에 있어서의 산화 반응은 전혀 일어나지 않았지만(플롯 90), HRP를 고정화한 메조포러스 실리카에서는, 매우 높은 활성을 나타냈다(플롯 91). 이것은 톨루엔에 HRP를 첨가한 직후에 HRP가 변성되었기 때문인 것으로 생각되며, 메조포러스 실리카에 HRP를 고정화함으로써 높은 안정성을 발현하고 있는 것을 알 수 있었다.
(3) 열에 대한 내성
HRP-고정화 메조포러스 실리카(플롯 101) 및 고정화하고 있지 않은 통상의 HRP(플롯 100)를 인산 완충 용액 중 70℃에서 0 내지 2시간 열처리한 후에, 잔존하는 효소 활성을 측정하고, 얻어진 결과를 도 10에 나타낸다. 메조포러스 실리카 내에 고정화된 HRP의 열안정성은 페놀의 산화 분해 속도를 측정함으로써 결정하였다. 페놀의 정량은 4-아미노안티피린 비색법을 이용하였다.
상기 HRP 흡착에 의해서 조제한 HRP-고정화 메조포러스 실리카 10 ㎎에 50mM 아세트산 나트륨 완충 용액(pH=4.0) 400㎕를 가하여 용액을 제조하고, 이와 같이 해서 제조한 4개의 동일한 용액을 70℃에서 30분, 60분, 90분 및 120분간 각각 가열하였다. 이들 각 용액을 원심 분리하고, HRP-고정화 실리카를 순수로 2회 세정하고 나서, 이 HRP-고정화 실리카에 50mM Tris-HCl(하이드록시메틸아미노메탄 염산염) 완충 용액(pH=7.5) 400㎕, 5000 ppm 페놀 수용액 8㎕ 및 30% 과산화수소수 2㎕를 첨가하고, 이와 같이 해서 얻어진 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시키고; 원심분리 후, 상청액 150㎕를 가하고, 1M의 글리신 수용액(pH=9.6)으로 조제한, 1% 헥사사이아노페레이트 150㎕와 1% 4-아미노안티피린 300㎕를 가하고, 이 혼합물을 교반하고, 그 후, 신속하게 500㎚ 부근의 흡광도를 측정하였다.
고정화되어 있지 않은 HRP의 효소 활성은 70℃에서 30분의 열처리에 의해 반감되고, 2시간 후에는 초기의 효소 활성의 단지 약 10%였다. 이에 대해서, HRP-고정화 메조포러스 실리카에서는 열에 대한 높은 안정화 효과가 확인되었고; 70℃에서 2시간의 열처리 후에도 90% 이상의 효소 활성을 유지하고 있었다.
도 11은 상기 페놀 산화 반응에 의거한 HRP의 온도 의존성 측정 결과를 나타낸다. HRP(플롯 110) 및 고정화 HRP(플롯 111)는 25℃ 내지 100℃에서 각각 30분간 전처리한 후 효소 활성을 측정하였다. 통상의 HRP의 잔존 활성은 70℃에서 30분의 조건하에 0%였고, 계층적 메조포러스 실리카에 고정화된 HRP는 동일 조건하에서도 50% 이상의 활성을 나타내었고, 또, 100℃에서 처리한 후에도 0%로 되는 일없이 약 40%의 효소 활성을 유지하고 있었다.
(4) 용액 확산성
다음에, 거대 기공 혹은 골격부의 이웃하는 부분 간에 거대 기공 크기의 공동의 존재에 의해 흡착 물질의 내부 확산이 변화하는 것을 검토하였다. 구체적으로는, 본 발명에 따라 조제된 계층적인 다공질(porous) 재료와 거대 기공을 가지지 않는 단분산성의 메조포러스 재료를 합성하고, 이들 재료를 원판 형상의 펠릿으로 성형하여, 이들 각 재료의 HRP 흡착 거동을 연구하였다.
상기 합성 방법에 따라 합성된 계층적 다공질 실리카의 소성 분말과 거대 기공을 가지지 않은 단분산성의 메조포러스 실리카의 소성 분말(비특허문헌 1의 입자)을 각각 0.2g의 양으로 칭량하였다. 칭량하여 취한 재료를 각각 정제 성형용 가압기에 의해 직경 15 ㎜, 두께 1 ㎜의 원반 형상의 펠릿으로 성형하였다.
5mM의 인산 완충 용액(pH=7.4)을 이용해서 HRP 용액을 5 ㎎/㎖ 조제하고, 이 HRP 용액 5㎖ 중에 각 펠릿 형상 메조포러스 실리카를 놓았다. 각 혼합 용액을 4℃에서 48시간 쉐이커를 이용해서 천천히 진탕하여, HRP를 각 메조포러스 실리카에 흡착시켜, 각 HRP 용액의 403㎚에 있어서의 흡수 파장의 변동으로부터 흡착량의 경시 변화를 측정하였다. 계층적인 메조포러스 실리카는, 흡착 개시로부터 약 1시간의 경과 시간에서 상대 흡착량 80% 이상을 나타냈다. 이 흡착량은 성형 전의 소성 분말의 흡착량과 거의 같은 값이었다.
그러나, 수상 골격부를 갖추지 않고, 거대 미세 기공도 가지지 않는 메조포러스 재료는, 펠릿 형상으로 성형함으로써 흡착 속도가 크게 감소하였다. 이들 결과는 본 발명의 계층적인 메조포러스 재료가 성형 펠릿 중에 있어서도 거대 기공을 유지하고 있어, 높은 내부 확산 속도를 유지하고 있는 사실에 기인하는 것으로 본 발명자는 고찰하고 있다. 한편, 수상 골격부를 갖추지 않은 메조포러스 재료에서는, 그들 재료 자체가 성형에 의해 조밀하게 되었기 때문에, 흡착 속도가 상당히 감소한 것이라고 생각된다.
비교예 1(중간 기공에의 효소 고정화)
비교예로서 막대 형상 입자의 장축 방향으로 평행하게 관 형상 미세 기공이 형성되어 있는 SBA-15를 합성하고, HRP의 흡착 및 유기용매 중의 안정화 효과를 측정하였다. SBA-15의 합성 방법은 문헌[Science, No. 279, p. 548]에 기재되어 있다.
합성된 SBA-15를 X선 회절법에 의해 평가한 결과, 면간 거리 9.8㎚의 육각형 구조의 (100)면에 귀속하는 회절 피크가 확인되었다. 또, 질소 흡착 등온선 측정으로부터, 상기 합성한 SBA-15는 800 ㎡/g의 비표면적과 7.4㎚의 미세 기공 크기를 가지는 것으로 확인되었다.
합성한 SBA-15에 대해 실시예 1과 같은 HRP 흡착 실험을 실시하였다. HRP의 흡착량은 25 ㎎/g으로 되어, 본 발명자가 합성한 계층적인 메조포러스 실리카에 비해 1/10배 이하의 매우 낮은 흡착량을 나타낸 것으로 판명되었다. 또, HRP 흡착 후의 시료를 이용한 질소 흡착 등온선 해석으로부터, HRP의 흡착 전후로 SBA-15의 미세 기공 용적은 감소되지 않은 것으로 확인되었고, HRP가 SBA-15의 미세 기공 내에 거의 흡착하고 있지 않은 것으로 판명되었다.
다음에, 각 메조포러스 실리카에 있어서의 HRP의 시간-의존성 흡착량을 측정한 결과, 포화 흡착량에 이르는 시간이 본 발명에 따른 거대 기공을 가진 계층적인 메조포러스 실리카에 있어서 매우 짧았다.
비교예 2(유기용매에 대한 내성)
또, SBA-15를 이용해서, 상기 방법에 의해 HRP의 유기용매 안정성을 측정하여, 본 발명에 따른 계층적인 메조포러스 실리카와 비교를 실시하였다. SBA-15에 고정화된 HRP에 의한 효소 활성이 단지 약간인 것으로 관찰되었다. 그러나, SBA-15에 고정화된 HRP에 의하면, 반응 개시 후 서서히 반응 생성물인 1,2-다이나이트로벤젠이 확인되었다. 이에 대해서, 계층적인 메조포러스 실리카에서는 반응 개시 직후부터 SBA-15에서 확인된 양의 10배 이상의 양으로 1,2-다이나이트로벤젠이 확인되었다.
이와 관련해서, SBA-15에서는 막대 형상 입자의 장축 방향으로 평행하게 관 형상 미세 기공 크기가 형성되고 있고; 이 때문에, 관 형상 미세 기공의 애스펙트비가 크므로, 외부로부터 미세 기공의 내부로 그리고 미세 기공 내부로부터 외부로의 HRP나 기질의 확산이 나빠지고; 또, 표면에 있어서의 미세 기공의 개구부의 수가 적다. 따라서, HRP나 기질의 도입이 늦어지게 된다. 이들 결과로부터, 본 발명자가 합성한 계층적인 메조포러스 실리카는 거대 기공 등을 가지기 때문에 단백질이나 기질의 내부 확산이 우수하고 생체 물질 등의 담지체로서 우수하다는 점이 밝혀졌다.
( 실시예 3)
본 실시예는 실시예 1에서 제작한 계층적인 메조포러스 실리카의 표면을 지르코늄의 산화물로 수식하고, 산화 환원 효소의 일종인 글루코스 옥시다제(이하, "GOD"라 약칭함, 직경=8.0㎚, IEP=4.6)를 고정화시켜, 열에 대한 안정성을 측정한 사례이다.
옥시질산 지르코늄 이수화물 10g을 순수 90㎖에 첨가하고, 실온에서 용해시켜, 10 중량%의 옥시질산 지르코늄 수용액을 조제하였다. 이 용액에 실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카를 첨가하고, 20시간 침지시켰다. 그 후, 이 혼합물로부터 원심분리에 의해 상청액을 없애고, 순수로 세정하고, 실온에서 건조시켰다.
지르코늄으로 수식한 계층적인 메조포러스 실리카를 X선 회절법에 의해 평가한 결과, 수식전과 거의 같은 회절 패턴을 나타내어, 중간 기공의 주기 구조가 파 괴되지 않은 것을 확인하였다. 또, X선 광전자 분광분석(XPS)에 의해서 실리카 표면의 화학 결합 상태를 측정한 결과, Zr-O에 기인하는 피크가 확인되어 실리카 표면에 지르코늄의 산화물층이 형성되어 있는 것을 확인하였다.
이어서, 지르코늄으로 수식한 후의 계층적인 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에 GOD를 고정화하고, 페놀의 산화 분해 반응에 의거해서 안정화 효과를 측정하였다.
5mM의 인산 완충 용액(pH=5.0)을 이용해서 GOD의 5 ㎎/㎖ 용액을 조제하고, 이 GOD 용액 1㎖ 중에 상기 지르코늄으로 수식한 계층적인 메조포러스 실리카 10 ㎎을 첨가하였다. 이 혼합 용액을 4℃, 20시간의 조건하에서 쉐이커를 이용해서 교반하여, GOD를 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에 고정화시켰다. 흡착 후, 상기 반응 용액에 대해서 4℃, 10분, 20000g에서 원심분리를 실시하여, GOD 고정화 실리카를 얻었다. GOD 고정화 전후의 상청액에 있어서의 280㎚의 흡수 극대치로부터, 메조포러스 실리카에의 GOD 흡착량을 산출하였다. GOD 흡착량은 120 ㎎/g 이상이었다. 미세 기공 내에 도입된 효소 분자의 존재는 질소 흡착 측정 장치에 의해 그 미세 기공에의 흡착량이 감소한 것으로 확인되었다. 또, 지르코늄으로 수식되어 있지 않은 메조포러스 실리카에 대해서는 GDO가 거의 흡착되지 않았다.
상기 GOD 흡착에 의해서 조제한 GOD-고정화 메조포러스 실리카 및 GOD-고정화 SBA-15의 각 10 ㎎에, 50mM 아세트산 나트륨 완충 용액(pH=4.0) 400㎕를 가해서 용액을 조제하고; 이와 같이 해서 조제한 상기 GOD-고정화 물질의 각각의 동일한 용액 4개를 70℃에서 30, 60, 90, 120분간 각각 가열하였다. 가열 후, 상기 각 용 액에 대해 원심분리를 실시하여, GOD-고정화 실리카를 순수로 2회 세정하고 나서, 이 GOD-고정화 실리카에 50mM Tris-HCl 완충 용액(pH=7.5) 400㎕, 10% β-D-글루코오스 수용액 100㎕, 5000 ppm 페놀 수용액 8㎕ 및 100μ/㎖의 HRP 용액 100㎕를 가하고, 이와 같이 해서 얻어진 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시키고, 원심분리 후, 실시예 2와 마찬가지 방법으로 500㎚ 부근의 흡광도를 측정하였다.
고정화되어 있지 않은 GOD의 반응 활성은 70℃, 30분의 열처리에 의해 0%로 감소되었다. 이에 대해서, 메조포러스 실리카에 고정화된 GOD에서는, 열에 대한 높은 안정화 효과를 가지는 것으로 확인되었고, 70℃에서 120분의 열처리 후에도 70% 이상의 효소 활성이 유지되었다.
또, 열처리를 실시하지 않은 GOD-고정화된 계층적인 메조포러스 실리카를 이용해서 37℃에서의 페놀 분해의 경시 변화를 측정하였다.
상기 GOD 흡착에 의해서 조제한 GOD-고정화 메조포러스 실리카 10 ㎎에, 50mM Tris-HCl 완충 용액(pH=7.5) 400㎕ 및 β-D-글루코오스 수용액 100㎕를 가하고, 또, 5000 ppm 페놀 수용액 8㎕ 및 100μ/㎖의 HRP 용액 100㎕를 가하였다. 이와 같이 조제한 용액을 37℃에서 소정 시간 반응시켰다. 원심분리 후, 실시예 2와 마찬가지 방법으로 500㎚ 부근의 흡광도를 측정하였다. 이와 같이 해서 얻어진 결과로부터, 30분 후의 페놀 분해 농도에 대한 상대 활성을 산출하였다. 계층적인 메조포러스 실리카에 고정화된 GOD는 5분간의 반응에 대해 100%의 상대 활성을 나타냈다.
이들 결과로부터, 거대 기공을 가지는 계층적인 메조포러스 실리카는 그 거 대 기공에 의한 높은 내부 확산을 제공하면서, 동시에 중간 기공 내에 고정화된 효소는 높은 안정화 효과를 달성하고 있는 것으로 밝혀졌다.
또, 실시예 1과 마찬가지 방식으로, 펠릿 형상의 계층적인 메조포러스 실리카와 거대 미세 기공을 가지지 않은 펠릿 형상의 단분산성의 메조포러스 실리카를 이용해서 GOD의 흡착 실험을 수행하였다. 상기 방법에 따른 옥시질산 지르코늄 수용액에 이들 펠릿을 각각 침지시켜 지르코늄 처리를 실시한 후, GOD의 시간 의존성 흡착 거동을 측정하였다. 실시예 1과 마찬가지 방식으로, 본 발명에 따른 펠릿 형상의 계층적인 메조포러스 실리카는 성형 전의 분말에 비해서 흡착 거동에 변화가 없었다. 그러나, 거대 미세 기공을 가지지 않은 단분산성의 메조포러스 실리카의 펠릿에서는 거의 GOD가 흡착되어 있지 않았다. 이것은, 펠릿 형상의 단분산성 메조포러스 실리카에 있어서, 그의 입자들이 조밀하게 충전되어 있기 때문에 내부 확산이 감속되어, 중간 기공 내에 GOD를 충분히 확산시킬 수 없었기 때문인 것으로 생각된다.
( 실시예 4)
본 실시예는 실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카의 표면을 실란 커플링제에 의해서 수식해서, α-아밀라제를 공유결합에 의해서 해당 실리카 표면에 고정화시킨 사례이다.
실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카 1.0g을 3-아미노프로필 트라이에톡시실란의 10%(ｖ/ｖ)의 톨루엔 용액 50㎖에 첨가하고, 이와 같이 해서 얻어진 용액을 질소 분위기 하에서 120℃에서 48시간 교반하였다. 반응 후, 침전물 을 여과하여, 톨루엔, 메탄올 및 다이클로로메탄으로 세정한 후, 실온에서 건조시켰다.
다음에, 이와 같이 해서 얻어진 건조 시료 1.0g을 인산 완충 용액(pH=6.6)을 이용해서 조제한 2.5% 글루타르알데하이드 용액 25㎖에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반하였다. 얻어진 침전물은 순수로 4회 이상 세정하고, 그 후 실온에서 건조하였다.
글루타르알데하이드로 수식한 계층적인 메조포러스 실리카를 X선 회절법에 의해 평가한 결과, 수식 전과 거의 같은 회절 패턴을 나타내고 있으므로, 중간 기공 구조가 파괴되지 않은 것으로 확인되었다. 또, FT-IR에 의해서 실리카 표면에 도입한 작용기의 동정을 실시한 결과, R-CH=N, C=O 및 -CHO에 기인하는 피크가 각각 확인되었으므로, 실리카 표면에 Si(CH2)3N=CH(CH2)3CHO가 공유결합되어 있는 것으로 확인되었다.
이어서, 수식완료된 계층적인 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에 α-아밀라제를 고정화하고, 전분의 말토오스로의 가수분해 반응에 의거해서 안정화 효과를 측정하였다.
50mM의 인산 완충 용액(pH=6.0)을 이용해서 α-아밀라제 용액 1 ㎎/㎖를 조제하고, 이 용액 1㎖ 중에 상기 방법에 따라 합성·수식한 계층적인 메조포러스 실리카 0.2g을 실시예 1과 마찬가지 방법으로 펠릿 형상으로 성형한 것을 첨가하였다. 이 혼합 용액은 4℃, 20시간의 조건하에서 쉐이커에 의해 침지시켜, α-아밀 라제를 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에 흡착시켰다. 반응 종료 후, 펠릿을 여과하고, 순수로 3회 세정하였다. 이때, 원래의 효소 용액과 상청액에 대해 UV-Vis 흡광도 측정을 실시하였다. α-아밀라제의 280㎚에 있어서의 흡수 극대를 이용해서, 흡착 전후의 농도 변화로부터 메조포러스 실리카에의 흡착량을 산출하였다. α-아밀라제의 흡착량은 140 ㎎/g으로 높았다. 표면 수식을 실시하지 않았던 분말 상태의 계층적인 메조포러스 실리카 및 펠릿 형상으로 성형한 단분산성 메조포러스 실리카에의 동일 조건하에서의 α-아밀라제의 흡착 실험에서는 거의 흡착 거동을 나타내지 않았다. 따라서, 거대 기공에 의한 높은 내부 확산에 의해서, α-아밀라제가 실리카 표면에 수식한 -CHO 및 α-아밀라제의 -NH2와의 결합을 통해서 실리카 표면에 고정화된 것이라고 생각된다.
이어서, 펠릿 형상의 아밀라제-고정화 메조포러스 실리카 및 고정화되어 있지 않은 아밀라제를 아세트산 나트륨 완충 용액 중 25℃ 내지 70℃에서 각각 열처리한 후, 효소 활성을 측정하였다.
상기 아밀라제-고정화 메조포러스 실리카 10 ㎎에 50mM 아세트산 나트륨 완충 용액(pH=5.0) 400㎕를 가하여 용액을 조제하고, 이와 같이 해서 조제한 용액을 25℃ 내지 70℃에서 각각 30분 처리하였다. 가열 후, 각 용액에 대해서 원심분리를 실시하여, 아밀라제-고정화 실리카를 순수로 2회 세정하였다. 동일한 50mM 아세트산 나트륨 완충액을 이용해서, 0.125%의 가용성 전분을 조제하고, 이 전분 용액 300㎕를 세정 후의 아밀라제-고정화 실리카에 첨가하고, 이 혼합물을 40℃에서 15분 반응시켰다. 반응 종결 후, 원심분리에 의해 상청액을 얻고, 이 상청액에 0.5N 아세트산 1㎖ 및 옥소-칼륨 용액(0.015% 요오드-0.15% 요오드화 칼륨 용액) 3㎖를 가하고, 이 상청액을 충분히 교반하고 나서, 700㎚ 흡수 극대를 측정하였다. 통상의α-아밀라제의 상대 활성은 60℃, 30분의 조건하에서 20%를 나타내었지만, 계층적 메조포러스 실리카에 고정화된 α-아밀라제에서는 동일 조건 하에서 90% 이상의 상대 활성을 나타내어, 안정화 효과가 확인되었다.
( 실시예 5)
본 실시예는 실시예 1에서 제작한 계층적인 메조포러스 실리카의 중간 기공 표면에 단쇄 DNA를 도입한 사례이다. 또, 본 실시예는 하이브리다이제이션 반응을 이용해서, 단쇄 DNA 간의 특이적 반응을 광학적으로 검출하는 바이오센싱 소자의 일례이며, 도 12는 바이오센싱 소자의 구성의 일례를 나타낸 모식도이다.
하이브리다이제이션은 핵산의 하이브리드 형성 또는 핵산 분자 하이브리다이제이션을 의미하며, 핵산의 1차 구조 상동성, 즉 염기 서열의 상동성을 조사하는 방법, 또는 상동성 염기 서열을 가지는 핵산을 검출하는 방법으로서 이용된다. 하이브리다이제이션은 2개의 단쇄 핵산이 상보성 염기쌍 간(A-T, G-C)에 수소결합을 상호 형성하여 이중 나선의 이중쇄 핵산을 형성하는 성질을 이용하는 것이다.
실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카 및 비교예 1에서 사용한 SBA-15를 10%의 3-아미노프로필트라이에톡시실란의 95% 에탄올 수용액에 1시간 침지하고 나서, 원심분리기를 이용해서 미반응 용액을 제거하였다. 에탄올에 의한 세정 후, 질소 분위기하 120℃에서 1시간 반응시켜, 메조포러스 실리카의 기공 표 면에 아미노기를 도입하였다.
또한, 아미노기가 도입된 계층적인 메조포러스 실리카를 1mM의 GMBS 다이메틸설폭사이드 용액에 2시간 침지한 후에, 다이메틸설폭사이드로 세정하여, 메조포러스 실리카의 기공 표면에 말레이미드기를 도입하였다. 이들 작용기의 도입은 FT-IR에 의해서 확인되었다.
DNA 자동 합성기를 이용해서 티올기가 도입된 DNA 프로브를 합성한 후, 고속 액체 크로마토그래피로 DNA 프로브를 정제하였다.
DNA 프로브: HS-(CH2)6-O-PO2-O-5'-서열번호: 1-3'
다음에, 합성·정제된 2μM의 DNA 프로브 용액 10㎕, HEPES 완충 용액(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄 설폰산; 10mM, pH=6.5) 40㎕와 첨가제(에틸렌글리콜) 50㎕를 함께 혼합해서, 반응 용액을 조제하였다. 이 혼합 용액을 말레이미드기가 도입된 계층적인 메조포러스 실리카에 첨가하고, 이와 같이 해서 얻어진 혼합물을 실온에서 2시간 방치함으로써, 메조포러스 실리카 표면에 단쇄 DNA를 고정화하였다.
이 DNA 프로브-고정화 메조포러스 실리카를 도 12에 나타낸 칩 기판의 홈에 충전하고, 그 외의 유로를 도 12에 나타낸 바와 같이 배치함으로써, 바이오센싱 소자를 제작하였다. 이 도면에 있어서, (101)은 기판이고, (102)는 본 실시예에 따라 제작한 DNA 프로브-고정화 계층적 메조포러스 실리카이다. (103) 및 (104)는 각각 용액 도입관이며, (105)는 그들 용액을 도입한 후의 용액 배출관이다.
DNA 자동 합성기를 이용해서, DNA 프로브와 상보적인 염기 배열을 가지고, 그의 5'말단이 텍사스 레드로 형광 표지된 DNA 표적을 합성하였다. 다음에, 0.1μM의 DNA 표적 용액 80㎕, 20×SSC(0.3M 구연산 나트륨, 3.0M 염화 나트륨) 17㎕ 및 10% 도데실 황산나트륨 수용액 3㎕를 함께 혼합하였다. 이와 같이 혼합해서 조제한 하이브리다이제이션 용액을 도 12에 나타낸 용액 도입관(103)을 통해 화살표(123)로 표시된 방향으로 도입하였다. 소정 시간 정지 상태로 체류시킨 후, 용액 배출관(105)으로부터 화살표(125)로 표시된 방향으로 용액을 배출하였다.
소정 시간의 하이브리다이제이션 반응 후, 20×SSC의 100배 희석액을 세정액으로서 세정액 도입관(104)으로부터 화살표(124)로 표시된 방향으로 도입하고, 세정을 실시하였다. 다음에, 마이크로어레이용 스캐너를 이용해서, DNA 프로브-고정화 부분의 형광 강도(하이브리다이제이션 시그널)와 DNA 프로브가 고정화되어 있지 않은 시료의 형광 강도(배경 시그널)를 측정하였다.
DNA 프로브-고정화 SBA-15는 하이브리다이제이션 시그널이 작고, 높은 형광 강도비(하이브리다이제이션 시그널/배경 시그널)를 달성할 수 없었고, 또, 하이브리다이제이션 반응에 의한 형광 강도의 시간 변화를 측정한 바, 포화 강도에 이를 때까지의 시간도 긴 것으로 확인되었다. 이에 대해서, DNA 프로브-고정화 계층적 메조포러스 실리카는 매우 단시간에 하이브리다이제이션 반응이 완료되었고, 우수한 형광 강도비를 달성하고 있었다. 이들 결과는 계층적인 메조포러스 실리카의 중간 기공 내에의 DNA 프로브의 높은 흡착량이 형광 시그널을 증가시키고, 또한, 거대 기공에 의한 우수한 내부 확산이 단시간에 하이브리다이제이션 반응의 완료에 연결된 것으로 추측된다.
이상의 결과로부터, 본 실시예에서는 상기의 생체 물질을 고정화한 계층적인 메조포러스 실리카를 이용함으로써, 고감도 검출을 단시간에 수행할 수 있는 바이오센싱 소자의 제작이 가능해지는 것으로 확인되었다.
( 실시예 6)
본 실시예에서는, 실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카의 미세 기공 내에, 마우스 단클론성 항체(항원은 사람의 혈청 알부민이었음)를 고정화시키고, 항원과 항체 간의 특이적 결합 반응을 이용해서, 표적 물질의 검출 및 측정을 수행하였다.
실시예 1에서 합성한 계층적인 메조포러스 실리카 10 ㎎ 및 비교예 1에서 사용한 SBA-15의 10 ㎎에, 마우스 단클론성 Fab형 항체를 순수로 1 ㎎/㎖로 조제한 용액 10㎖를 첨가하였다. 이와 같이 해서 제조한 각 용액을 4℃에서 6시간 교반함으로써, 메조포러스 실리카의 중간 기공 내에 항체를 고정화시키고 나서, 순수로 3회 세정하였다. 상기 항체-고정화 메조포러스 실리카에, 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지한 사람의 혈청 알부민("HRP-HSA"라 약칭함) 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 소정 시간(1 내지 4시간) 반응시켰다. 비특이적으로 흡착된 HRP-HSA를 제거하기 위해서, 이 항원-항체-고정화 메조포러스 실리카를 순수로 수회 세정하고 나서, 동결 진공 건조를 실시하여, 이 건조 시료를 37℃에서 임의의 시간 방치하였다. 다음에, 50mM Tris-HCl(pH=7.5) 400㎕, 5000 ppm 페놀 수용액 8㎕ 및 30% 과산화수소수 2㎕를 가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 원심분리 후, 실시 예 2와 마찬가지로 500㎚ 부근의 흡광도를 측정하여, 고정화된 항체에 특이적으로 결합한 HSA에 표지된 HRP의 효소 활성을 측정하였다.
또, 상기 계층적인 메조포러스 실리카에 대해서, HRP-HSA에 대한 항체가 아닌 비특이적인 마우스 면역글로불린 항체(마우스 Ig)를 전술한 방법과 마찬가지 방식으로 고정화하였다. 이어서, 상기 HSA에 특이적으로 결합된 항체를 이용한 경우와 비특이적인 항체를 이용한 경우 간의 흡광도 차이를 전술한 순서에 의해 측정하였다. 그 결과, 비특이적 마우스 Ig는 본 실시예에 따른 마우스 단클론성 Fab형 항체-고정화 메조포러스 실리카보다 HRP 활성이 명백하게 작은 것으로 확인되었다. 이들 결과로부터, 메조포러스 실리카에 항체가 고정화되어 한편, 메조포러스 실리카에의 항체의 고정화 후에도, 미세 기공 내에서 항원-항체 반응이 일어난 것으로 확인되었다.
상기 항체-고정화 메조포러스 실리카에 HRP-HSA 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 소정 시간(1 내지 4시간) 반응시킴으로써, 항원-항체 반응의 경시 변화를 측정하였다. 그 결과, 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에서 확인된 것처럼, 계층적인 메조포러스 실리카를 이용한 경우에 대해서만, 높은 항원-항체 반응 속도를 확인하였다. 이것은 비특이 흡착에 의해 미세 기공 외에 흡착한 HRP-HAS 등의 미세 기공 내에 고정화되어 있지 않은 HRP-HSA가 외부 환경의 영향에 의해 변성되어 버려, 안정화되지 않았기 때문인 것으로 생각된다.
또, 상기에서 얻어진 항체 고정화 메조포러스 실리카와 고정화하고 있지 않은 마우스 단클론성 항체 분말을 건조 상태에서 37℃에서 3주간 보존하여, 각각의 항원-항체 반응에 의한 HRP 활성의 경시 변화를 측정하였다. 37℃에서 건조 상태에서 보존을 개시하기 직전의 상기 실리카와 분말의 각각의 결합 활성을 100으로 규정하였다. 고정화되어 있지 않은 마우스 단클론성 항체는 1주일 후에는 상대 활성이 0으로 되어, 완전하게 실활되었다. 한편, 계층적인 메조포러스 실리카에 고정화된 마우스 단클론성 항체의 항원-항체 반응은 3주일 후에도 90% 이상의 상대 활성을 나타내었다.
( 실시예 7)
본 실시예는 실시예 1에서 합성된 바와 같은 계층적 메조포러스 실리카를 전극 상에 합성하고, 또한 글루코스옥시다제(GOD) 및 매개체(mediator)를 중간 기공 내에 고정화시키고, 글루코오스 농도를 측정한 사례이다. 전극으로서는, 카본 전극 및 백금 전극을 이용하였다.
트라이블록 코폴리머(EO20PO70EO20; HO(CH2CH2O)20(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)20H) 2.40g을 순수 76.5㎖에 용해시켰다. 또한, 얻어진 수용액에 36중량% 농염산을 7.5㎖ 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하였다. 이어서, 이 수용액에 n-데칸을 13.9g 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 또, 이 혼합 용액에 가수분해 촉매로서 NH4F를 0.027g 및 테트라에톡시실란(TEOS)을 5.10g 첨가하여 전구체 용액을 제조하였다. 최종적인 전구체 용액의 조성(몰비)은 TEOS:HCl:EO20PO70EO20:NH4F:n-데칸=25:90:0.4:0.7:100을 충족시키도록 제조하였다.
상기 전구체 용액을 40℃에서 20시간 교반하고, 120℃에서 48시간 반응시켰 다. 이와 같이 해서 얻어진 백색 침전물을 순수로 충분히 세정하였다. 이 백색 침전물에 에탄올을 적절하게 가하고, 3000rpm 내지 6000rpm에서 원심분리를 실시함으로써, 페이스트 형상의 계층적 메조포러스 실리카를 얻었다. 얻어진 시료를 카본 전극 상에 도포하고, 실온에서 건조하고, 공기 중에서 500℃에서 소성하여, 미세 기공 내로부터 계면활성제를 분해·제거해서, 카본 전극 상에 계층적 메조포러스 실리카를 합성하였다.
상기 전극으로부터 샘플링한 메조포러스 실리카 분말을 X선 회절법에 의해 평가한 결과, 실시예 1과 마찬가지 방법으로 육각형 구조의 (100)면에 귀속되는 회절 피크를 시작으로 해서, (110), (200), (210)면에 귀속되는 회절 피크를 확인하였다.
5mM의 아세트산 나트륨 완충 용액(pH=7.4)을 이용해서 5 ㎎/㎖의 GOD 용액을 조제하고, 이 효소 용액 10㎖ 중에 상기 합성한 메조포러스 실리카 카본 전극을 침지하였다. 이 용액을 4℃, 20시간의 조건하에 쉐이커를 이용해서 천천히 교반하고, 따라서, GOD를 전극 상의 메조포러스 실리카 미세 기공 내에 흡착시켰다. 전극 상의 GOD-메조포러스 실리카는 순수로 3회 세정하여, GOD-고정화 전극을 얻었다. GOD-고정화 전후의 상청액에 있어서의 280㎚의 흡수 극대치로부터, 카본 전극만에의 흡착을 배경으로서 차감함으로써, 메조포러스 실리카에 대한 GOD의 흡착량을 산출하였다. GOD의 흡착량은 230 ㎎/g 이상이었다. 시료 건조 후, 시료는 매개체를 중간 기공 내에 담지하기 위해서, 50㎖의 MOPS 완충액으로 조제한 100mM의 페리시안화 칼륨 용액 100㎖에 12시간 실온에서 정지상태에서 체류시켰다. 침지 후, 원심분리 및 순수에 의한 세정을 행하고, 실온에서 건조시킴으로써, 글루코오스 측정용 GOD 전극을 작성하였다.
도 13에 나타낸 반응 기구를 이용해서, 글루코오스의 농도를 측정하였다. 이 기구를 이용함으로써, 혈액 중의 혈당치 등을 측정하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 혈액 중의 글루코오스가 센서부에 도달하면, 글루코오스와 GOD가 서로 반응하고, 그 반응시, 글루코오스는 전자를 방출해서 글루콘산으로 전환된다. 글루코오스로부터 방출된 전자는 페리시안 이온([Fe(III)(CN)6]3 -)에 의해 포획된다. 전자를 포획한 페리시안 이온([Fe(III)(CN)6]3 -)은 페로시안 이온([Fe(II)(CN)6]4 -)으로 전환된다. 이러한 반응이 일어나고 있는지의 여부를 작용 전극(131)으로 검출한다. 작용 전극에는 전압이 미리 인가되고 있고, 대향 전극(132)은 페로시안 이온([Fe(II)(CN)6]4 -)의 전자를 받지 못하지만, 해당 대향 전극에서는 수소 이온(H＋)이 전자를 받아, 산소(O2)와 함께 물(H2O)을 생성한다. 이때의 전류치를 측정함으로써, 글루코오스량을 구해서 혈당치를 판정할 수 있다.
글루코오스 농도의 측정은 다음과 같이 행하였다. 도 14에 나타낸 항온 셀에, 50mM의 MOPS 완충 용액을 넣고 일정 온도에서 유지하였다. 효소-고정화 입자(130)를 가진 작용 전극(131)으로서 상기 합성한 GOD-고정화 카본 전극을 이용하고 대향전극(132)에는 백금 전극을 이용하였다. 카본 전극에 소정의 전압을 인가하고, 전류가 정상으로 된 후, 글루코오스를 함유하는 시료를 첨가해서 전류의 증 가를 측정한 결과, 높은 전류치를 얻을 수 있었다. 또, 표준의 글루코오스 용액 시료를 이용해서 전류치를 측정한 결과, 글루코오스 농도의 증가에 따라서, 전류치가 직선적으로 증가하는 것이 확인되었다. 이것에 따라, 글루코오스 농도를 판별해서, 혈당치를 측정하는 것이 가능한 바이오센서를 제공할 수 있다.
( 실시예 8)
본 실시예는 실시예 1에서 합성한 계층적 메조포러스 실리카를 전극 상에 합성하고, 또한, 그 속에 글루코오스 옥시다제(GOD) 및 매개체를 고정화시켜, 글루코오스 농도를 측정한 사례이다.
계층적 메조포러스 실리카는 전술한 실시예와 같았다. 매개체로서는 페로센카복실산을 이용하였다. 페로센카복실산은 중간 기공의 표면에 공유결합으로 고정화되어, GOD를 중간 기공에 담지하였다.
페로센카복실산의 고정화는 다음과 같이 이루어진다. 우선, 소성에 의해 중간 기공을 형성한 메조포러스 실리카-코팅 전극을 실란 커플링제에 의해 실릴화하였다. 테플론(등록상표) 용기 중에 (3-아이오도프로필)트라이메톡시실란(IPTMS)의 20mM 다이클로로메탄 용액을 준비하였다. 이 용액에 전극을 침지시키고 나서, 질소 분위기 하 실온에서 4시간 교반하였다. 얻어진 전극을 다이클로로메탄과 에탄올로 세정하고, 80℃에서 건조하였다.
이와 같이 요오드-프로필실릴화된 전극은 0.13mM의 페로센카복실산 수용액과 0.17mM의 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드 수용액의 혼합 용액 중에 침지시키고, Ar 분위기하에서 천천히 교반하여, 실리카 표면에 페로센카복실산을 고정화하 였다. 실리카 표면에의 IPTMS의 도입 및 에스테르 결합에 의한 페로센카복실산의 고정화는 각각 FT-IR로 확인하였다. 이들 스텝에 의해, 페로센카복실산을 공유결합에 의해 실리카 표면에 고정화하였다.
또, 항온 셀에 pH=7.4의 PBS를 넣고 상기에서 조제한 GOD-고정화 카본 전극을 침지시키고 나서, 질소-버블링을 실시하면서 5분간 교반하였다. 참조 전극으로서 Ag/AgCl 전극을 이용하고, 카운터로서 백금선을 이용하였다. 전극에 100 mV에서 600 mV까지의 전압을 스윕(sweep)하고, 산화 전류가 정상이 된 후, 전압을 내려 CV 곡선을 얻었다. 또, 주사 속도는 1 mV/s로 설정하였다. 글루코오스의 농도가 증가될 때마다, 전류를 측정하여 포화 전류치를 구하였다. 이때의 산화-환원 전위의 피크는 220 mV였다. 이것에 의해, 매개체에 페로센카복실산을 이용해도, 바이오센서에 응용할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 페로센카복실산을 부유시킨 상태에서의 산화-환원 전위는 220 mV보다 컸다.
혈중 물질이 전극에 의해서 산화/환원될 때의 산화-환원 전위는 예를 들어 아스코르빈산에서는 500-600 mV, 헤모글로빈에서는 300-400 mV이다. 따라서, 피크 전류를 정확하게 측정하기 위해서는, 이들 산화-환원 전위의 피크와는 오버랩하지 않고, 보다 저전위에 피크가 있는 매개체를 이용하는 것이 중요하다.
즉, 중간 기공에 매개체를 공유결합에 의해 고정화시켜 이용하는 것이 부유시키는 것보다도 저전위로 피크를 시프트시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 그 시프트 이유는 음의 전기장에 의해 지배되고 있던 메조포러스 실리카에서 매개체가 산화되기 용이할 수 있고, 또한, 매개체가 표면에 고정화되어 있어 전자의 도 약(hopping)이 일어나, 효율적으로 전자를 전극에 옮기는 것이 가능하게 되었기 때문인 것으로 생각된다. 그 이유는 다른 효소에 대해서도 마찬가지일 수 있다.
이상 설명한 것처럼, 본 발명에 따르면, 중간 기공을 가지는 신규의 구조체를 얻을 수 있다. 또, 본 발명에 따른 메조포러스 재료는, 내부 확산이 우수하여 생체 물질의 고정화제나 컬럼제의 정밀도 증가 등에 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 중간 기공을 가지는 구조체는 예를 들면 바이오센서 등에 이용할 수 있다.
본 출원은 2005년 6월 7일자로 출원된 일본국 특허출원 제2005-166754호의 우선권을 주장하며, 이 기초 출원은 참조로 본 명세서에 원용된다.
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Claims (10)

  1. 복수의 중간 기공을 구비한 구조체에 있어서,
    수상 골격부(dendritic framework)를 포함하되, 상기 골격부는 해당 골격부의 길이 방향을 교차하는 방향으로 해당 골격부를 관통하는 중간 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 구조체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중간 기공은 상기 골격부의 길이 방향에 직교하고 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 수상 골격부는 해당 골격부의 분기된 부분의 상호 연결에 의해 거대 기공을 형성하거나, 또는
    서로 인접한 골격부 간에 거대 기공 크기의 공동(void)이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 중간 기공은 육각형의 대칭형상으로 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 중간 기공은, 해당 중간 기공의 80% 이상이 최대치를 포함하고 폭 10㎚의 범위 내에 있는 미세 기공 크기 분포를 가지는 것을 특징으로 하는 구조체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 중간 기공 내에 생체 물질이 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  7. 복수의 입자로 형성된 다공체로서, 상기 입자는 제1항에 따른 구조체로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공체.
  8. 검체를 검출하는 센서에 있어서,
    제 7항에 따른 다공체와 전극으로 이루어지고, 상기 검체와 상기 중간 기공 내에 담지된 상기 생체 물질과의 반응에 기초한 전기적 출력 신호를 검출하는 것을 특징으로 하는 센서.
  9. 검체의 검출방법에 있어서,
    제 1항에 따른 구조체의 중간 기공 내에 생체 물질을 담지시킨 센서를 준비하는 공정;
    검체를 함유한 유체를 상기 센서에 부여하는 공정; 및
    상기 생체 물질과 상기 검체와의 반응에 기초한 출력 신호를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 검체의 검출방법.
  10. 효소를 담지하는 다공체 및 상기 효소로부터 전달된 전자를 전극에 전달하는 전자 전달 물질을 포함하되,
    상기 전자 전달 물질은 상기 다공체 위에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 효소 전극.
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