CN101166693B - 结构、多孔体、传感器、制造结构的方法以及样品的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有中孔的新结构。本发明提供的结构具有多个中孔，其中，所述结构具有树枝状骨架和在与骨架的纵向相交的方向上贯穿骨架的中孔。本发明还提供多孔材料、传感器以及利用该新结构检测样品的方法。

Description

结构、多孔体、传感器、制造结构的方法以及样品的检测方法
技术领域
本发明涉及具有多个中孔(mesopore)的新结构，多孔材料，传感器，制造该结构的方法和检测样品的方法。
背景技术
作为多孔材料，沸石和硅胶向来是已知的。由铝硅酸盐构成的沸石实践上已经用作吸附剂和离子交换材料，此外还用作催化剂。沸石是结晶的，具有均一的孔径，并具有优异的性能；然而，其孔径为约1nm那么小或更小，因此沸石不能用作大于该孔径的有机化合物的吸附剂等。硅胶的孔径比沸石的大；然而，其孔径分布广泛范围大，这带来控制硅胶结构的问题。
由于这样的背景，已开发出称之为中孔材料的材料，其中规律地排列有大于沸石的孔并且孔径均一的孔。中孔材料通过利用表面活性剂进行生产，并且已报导了由氧化物例如SiO2、TiO2和ZrO2形成的中孔材料。
作为中孔材料的外观形状，报导了以下形状：如图15中所示的没有分枝部分并且是颗粒的外观形状(J.Am.Chem.Soc.，126，2004，7440-7441(非专利文件1))，以及如图16中所示具有分枝结构(以下称作“树枝状”)的外观形状(Chem.Commu.，1998，2461-2462(非专利文件2))。
以下，当指称中孔材料时，中孔材料(例如图15中所示的颗粒状中孔材料和图16中所示的树枝状中孔材料)的全部固体部分，将被特别称为该中孔材料的“骨架”。中孔材料的孔形状已知是贯通该骨架的管状或者是限制于该骨架内的球状。
如上所述，已经开展对中孔材料的积极研究，但是作为中孔材料的主要结构，仅仅已知非专利文件1和2中描述的那些。因此，强烈需求要用于功能装置如生物传感器的具有新结构的中孔材料。
发明内容
本发明人锐意研究结构控制，目的是获得具有中孔的结构，结果通过发现可以被制造的新结构而完成本发明。
中孔的意思是孔径为2nm或更高并且50nm或更低的孔，如IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)所定义的。根据IUPAC，孔径小于2nm的孔被定义为微孔，孔径大于50nm的孔被定义为大孔。
本发明的一个目的在于提供一种具有中孔的新结构。
本发明的另一目的在于提供一种多孔材料、利用该新结构的传感器和检测样品的方法。根据本发明的一个方面，提供一种具有多个中孔的结构，包括：
树枝状骨架，其具有在与骨架的纵向相交的方向上贯穿骨架的中孔。
中孔优选与骨架的纵向垂直。
树枝状骨架优选通过骨架的分枝部分相互连接形成大孔，或者
在彼此相邻的骨架之间优选形成大孔尺寸化的空间。
优选地，中孔以六角形对称排列。
优选地，中孔的孔径分布为，其中80％或更多的中孔落入宽度为10nm并包括最大值的范围内。
生物材料优选被支撑在中孔中。
根据本发明的另一方面，提供形成多个颗粒的多孔材料，其包含由上述结构组成的颗粒。
根据本发明的再一方面，提供用于检测样品的传感器，该传感器由上述多孔材料和电极组成，并且基于样品和支撑在中孔中的生物材料之间的反应来检测电输出信号。
根据本发明的又一方面，提供一种检测样品的方法，包括以下步骤：
制备传感器，其中生物材料被支撑在上述结构的中孔中；
将含有样品的流体加到该传感器上；和
基于生物材料和样品之间的反应来检测输出信号。
根据本发明，可以提供能够用作新功能材料的结构。例如，可以提供适于柱等的多孔材料。而且，当作为传感器使用时，可以提供灵敏度高于传统传感器的传感器。
附图说明
图1A、1B和1C是本发明结构的示意图；
图2A和2B是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的照片；
图3是说明大孔形状的示意图；
图4A和4B是说明中孔构造的示意图；
图5A和5B是说明其中本发明结构被制成用于支撑生物材料的情况的示意图；
图6是显示实施例1中所制得的中孔硅石(silica)的X射线衍射结果的曲线图；
图7是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的照片；
图8是用扫描电子显微镜观测的本发明结构的中孔的照片；
图9是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材料的中孔中并且在甲苯中进行酶反应时，转化率和经过时间之间关系的曲线图；
图10是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材料的中孔中并且在70℃下进行热处理时，酶的相对活性与热处理时间之间关系的曲线图；
图11是表示当过氧化物酶被固定于实施例1中所制得的多孔材料的中孔中并且在预定温度下进行30分钟热处理时，相对活性的温度依赖性的曲线图；
图12是说明其中本发明结构用作生物传感元件的情况的示意图；
图13是说明其中本发明结构可以用作生物传感元件的反应机理的图解；
图14是说明其中本发明结构用作生物传感元件的情况的示意图；
图15是表示一种传统中孔材料实例的照片；和
图16是表示另一种传统中孔材料实例的照片。
具体实施方式
本发明的具有中孔的结构是树枝状的。树枝状是这样的概念，其不仅包括其中骨架结构只是具有分枝结构的形状，即分枝状，还包括其中骨架呈连续分枝的形状。作为一个实施方案，本发明还包括形成三维网络结构的树枝状骨架，如图2A的SEM显微照片和图2B的SEM显微照片(以比图2A更高的放大率拍摄)、以及图1A的示意图中所示。以下将参考图1A、1B、1C、2A和2B来描述采用三维网络结构的实施方案。
(骨架结构)
在树枝状骨架12(其多个部分彼此相邻而形成三维网络结构)中的空间11优选为大孔，即，确保孔在某一方向上的投影面积等于或大于直径为50mm或更大的圆的面积的空间；换句话说，空间11的尺寸优选大于50nm，更优选为100nm或更大并且700nm或更小。具体而言，如图3所示，其中分枝的骨架经过连接形成大孔，在这种情况下，骨架中的空间优选是这样的，使得大孔的孔径为50nm或更大，更优选为100nm或更大并且700nm或更小。
图1B是表示骨架12一部分的放大图，图1C是表示骨架12的表面14和沿上述方向16的截面17的放大图。如图1B和1C中所示，中孔13在与纵向15相交的方向16上贯穿骨架12。中孔13在表面14上具有其开口。构成中孔之间的部分的骨架本身形成“壁”，将中孔彼此分开。
本发明的结构宏观上可以呈颗粒状或薄膜状，但是优选使用如图2A中所示的颗粒状。
(中孔的形状、孔径、构造和长度)
如果中孔的截面形状是圆，则中孔的孔径是直径，如果中孔的截面形状是诸如椭圆的变形圆，则孔径是最长轴的长度。对具有中孔的粉末状结构进行氮气吸附测量，从该测量结果，根据Berret-Joyner-Halenda(BJH)方法得到孔径分布。
优选用于本发明的结构的孔径分布表现出单一最大值，并且在相关的孔径分布中60％或更多的中孔落入宽度为10nm并包括该最大值的范围内。根据随后要描述的实施例，例如，80％或更多的细孔的孔径落入最大值±5nm的范围内，即，在宽度为10nm并包括最大值的范围内。更优选地，90％或更多的细孔落入宽度为10nm的范围内。
用于本发明的中孔的孔径为2nm或更大并且50nm或更小，更优选为10nm或更大并且30nm或更小。取决于本发明的结构的应用类型，例如，当本发明结构用于生物传感器时，孔径优选为10nm或更大，使得诸如抗体的生物材料可以被引入到中孔中，从生物材料结构的稳定性角度来看，优选为30nm或更小。
中孔形状可以是这样，使得其孔径单一性地增加，或者从其一个开口向另一个开口不连续地变化。
中孔周期性的信息可以从X-射线衍射(XRD)测量获得。在与截面正交的方向看到的中孔的构造不限于如图4A中所示的矩阵构型，或者如图4B中所示的六角形对称构型，还可以是其它规则或不规则的构型。根据本发明实施方案的结构在XRD测量中在角区域有至少一个衍射峰，相当于1nm或更大的结构周期性；这意味着中孔是规则排列的。
中孔之间的相互间距是1nm-4nm的量级。更优选多个相邻的中孔具有相同的延伸方向；然而，这些中孔的方向可以在沿中孔方向的某处分枝为多个方向。
中孔的长度优选为50nm或更大并且500nm或更小。从利用中孔作为生物传感器等的反应区域的角度来看，中孔长度更优选为50nm或更大并且300nm或更小。
中孔13沿着骨架12的纵向15均匀排列，如图1B中所示。中孔13优选尽可能垂直于骨架12的纵向15进行排列。在可用电子显微镜观测的面积上，例如500nm×500nm的面积上，优选90％或更多的中孔沿着该垂直的方向排列。
(组成材料)
作为组成骨架12的材料，即，中孔的孔壁，氧化物例如硅氧化物、钛氧化物或锡氧化物是优选的。这样的材料可以是由诸如硅石的无机材料和诸如苯或乙烯的有机材料组成的混合材料。
由硅烷偶联剂等制成的涂层可以形成于中孔的孔内壁上，或者酶、抗体、DNA等可以被引入到其中要被支撑的中孔中。例如，孔表面(孔内壁)可以用硅烷偶联剂或者用含有能形成氧化物的金属的金属盐的水溶液进行改性。
(制造结构的方法)
根据本发明一个实施方案，为了制造具有中孔的结构，在水解催化剂存在下，将含有用于形成该结构的骨架的材料、表面活性剂和取向控制剂的反应溶液加热到120℃，使得在水热合成条件下形成含有表面活性剂的结构，然后将表面活性剂从所述结构中除去。以下将具体说明。
首先，向所制备的反应溶液中加入水解催化剂，在大致室温下搅拌，然后，在几小时到几天的时间内，使原料进行缩聚反应。
然后，收集溶液中所制得的沉淀物，洗涤，然后干燥。然后，将表面活性剂从所述沉淀物中除去。以此方式获得具有中孔的结构，所述中孔沿着与骨架的纵向相交的方向贯穿骨架。
为骨架原料的材料包括卤素化合物、硫族化合物或金属醇盐。当中孔的孔壁用硅氧化物形成时，优选使用是作为金属醇盐的四乙氧基硅烷和四甲氧基硅烷。
作为表面活性剂，优选使用非离子表面活性剂，例如含有聚环氧乙烷作为亲水基团的嵌段共聚物。
取向控制剂可以是能调节表面活性剂的方向以使其与树枝状骨架的纵向相交的有机物质；这样的有机物质的实例可以包括正癸烷(C10H22)。在本发明中使用的取向控制剂的详细机理处于研究中；当表面活性剂的取向沿着与骨架的纵向相交的方向时，将产生在熵方面稳定的状态。可以想象，通过将反应时间设置为几小时到几天，以及将该反应时间的温度设置为120℃，硅氧化物在其形成颗粒之前进行叠层，或者经历反应的硅氧化物颗粒相互键合，从而形成树枝状生长。120℃的温度是用于加热所述溶液的炉的环境大气温度；该溶液被置于压力容器中，并且该溶液的温度基本与环境大气温度相同。
由此获得的树枝状结构可以用离心分离机进行收集，因为其在溶液中沉淀。所收集的沉淀通过空气干燥等进行干燥。
多孔材料可以通过从所收集的沉淀中除去形成胶束的表面活性剂而获得。对于除去表面活性剂的方法并没有特别的限定，只要所述方法是能够除去表面活性剂而不破坏细孔结构的方法即可。这样的方法的实例可以包括：将表面活性剂溶于溶剂中从而除去的方法，通过使用超临界态流体从孔中挤压出表面活性剂的方法，以及通过使用臭氧氧化以除去表面活性剂的方法。更优选通过在含氧气氛中煅烧该结构而除去表面活性剂的方法；在该方法中，该结构在空气中在550℃下煅烧5小时，结果可以除去表面活性剂而基本没有破坏中孔结构。煅烧温度和时间则根据用于形成细孔壁或骨架的材料以及所用表面活性剂而适当地进行选择。
通过向基于上述方法获得的结构额外应用以下步骤，可以生产生物材料载体。
具体而言，所述步骤是指其中具有中孔的结构被浸泡于含有生物材料的溶液中、并且该生物材料通过搅拌被吸附于多孔材料的孔中的方法。为了便于将所述生物材料引入到中孔中，官能团(例如氨基或羧基)可以引入到中孔的细孔表面(孔壁表面)上；通过这种方式，生物材料易于被引入到中孔中，确信因为位于孔壁表面的官能团和生物材料发生电相互作用。
例如，存在其中细孔表面用硅烷偶联剂进行改性的方法，和其中细孔表面用含有能形成氧化物的金属的金属盐的水溶液进行改性的方法。所述硅烷偶联剂一般是用化学式R-Si-X3表示的化合物，并且在其分子中具有两个或多个不同的官能团。X表示能与由无机材料制成的多孔材料的表面进行反应的位点。例如，在Journal of Sol-GelScience，1989，662中，描述了其中中孔材料是硅氧化物的情况；位于细孔表面的硅烷醇基的氢原子被有机硅基团所取代，形成Si-O-Si-R键，从而在细孔表面上形成有机物质R的层；X的实例包括氯基、烷氧基、乙酰氧基、异丙氧基和氨基。当然，可以使用其中X是双官能团或单官能团的硅烷偶联剂，以及其中X是三官能团的硅烷偶联剂，只要所述硅烷偶联剂能与细孔表面进行反应形成R的层即可。R表示有机基团，例如氨基、碳基或马来酰亚胺基。
当细孔表面用含有能形成氧化物的元素的金属盐的水溶液进行改性时，钛、铝、锆、锡等可以被用作能形成相关氧化物层的元素。例如，通过用硝酸氧锆的水溶液处理中孔硅石，可以在表面上形成锆氧化物层。
图5A和5B是说明在中孔中支撑生物材料的结构的示意图。
图5A和5B表示一种状态，其中生物材料23被要支撑的中孔的孔壁22所环绕。数字标记12表示图1A、1B和1C中所示的骨架。当这样的生物材料载体用作生物传感器时，应用这样的现象，其中生物材料23与对该生物材料23具有特异性亲和力的材料24彼此反应，如图5B的放大图中所示。
本发明人已研究适合用作酶反应和抗原-抗体反应的反应区的结构，并已发现本发明的结构适合用作这样的反应区。
用于本发明的生物材料是抗体、抗体片段、DNA、蛋白质、酶等。所述生物材料还包括含有单链DNA的活性部位的片段和Fab抗体等。所述DNA片段还可以是从动物、植物和微生物中提取出来并剪切为期望形状的那些片段，或者是由遗传工程制得或化学合成出来的那些。
材料24的实例可以包括抗原、抗体片段、DNA、蛋白质和酶。例如，当生物材料23是抗体时，与所述生物材料具有特异性亲和力的材料24是抗原。
尽管没有表示出来，但优选设置一个锚定物(anchor)，以将中孔的孔壁22的内表面与生物材料23相连接。
该锚定物具有抑制生物材料大的结构改变并由此稳定地维持该生物材料的结构的作用。构成锚定物的成分优选是与组成具有中孔的结构的材料相同的组成材料。作为用于键合所述生物材料的位点，所述锚定物优选具有羟基、酰胺基、氨基、吡啶基、脲基、尿烷基、碳基、酚基等。而且，所述锚定物还可以是具有官能团例如偶氮基、羟基、马来酰亚胺基、硅烷衍生物或氨基亚烷基的化合物。
每个中孔可以容纳一种或多种生物材料。因此，要求每个中孔具有适于固定所述生物材料的尺寸。
当中孔的尺寸和要被固定在中孔中的生物材料的尺寸相互适应时，则所述生物材料的表面靠近中孔的孔壁，从而使得生物材料由于中孔孔壁的范德华力而被吸附于中孔中。从而生物材料的构造进一步被保持，从而进一步抑制了生物材料由于构造改变而引起的去活化。所述活性单元可以通过非共价键，例如静电结合、氢键和离子键以及范德华力而保持在中孔中。
(使用本发明结构的功能装置)
以下将描述使用本发明结构的功能装置。
如上所述，在中孔中支撑生物材料的结构可以用于作为功能装置的生物传感器中。
换句话说，将详细描述根据本发明一个实施方案的检测样品的方法。
首先，制备传感器，其中生物材料支撑于上述结构的中孔中，并且所述传感器装备有含有样品的流体(液体或气体)。然后，含有样品的流体在经过树枝状结构的空间和大孔时渗入中孔中，并与支撑于中孔中的生物材料进行反应。具有树枝状骨架的结构的空间和大孔分别具有大的对流体而言的传导性，从而使得流体均匀地到达具有树枝状骨架的整个结构，而且，还到达与所述空间和大孔连通的中孔。当中孔的纵向和骨架的纵向相互平行时，中孔在骨架侧壁上开口的发生概率非常低，从而使得样品渗入到中孔中的概率变得非常低。在本发明中，中孔的纵向和骨架的纵向互相交叉，因此，基于在该结构的大量中孔中发生的生物材料和样品之间的反应，检测到输出信号，从而提高灵敏度。
详细而言，样品的检测原理利用在抗原和抗体之间的抗原-抗体反应、特异性键合反应(例如在单一的DNA和另一单一的DNA之间的键合反应)、或者其它反应。无论如何，通过利用物理量例如电流、电压、光通量、质量和热量的变化来检测目标材料。检测装置的实例可以包括酶电极、过氧化氢电极、ISFET(离子敏场效应晶体管)、光学纤维、热敏电阻、石英振荡器和表面等离振子共振器。
本发明结构可以用作吸附剂或分离剂的柱，用作除生物传感器以外的功能装置。在这种情况下，制备由本发明实施方式的上述结构制成的大量颗粒，并且所述颗粒可以被压制，从而生产多孔材料。
当通过结合多孔材料与电子转移元件而安装电极时，物理量的上述变化可以作为电输出信号加以检测。
以下，将结合实施例详细描述本发明。
实施例
(实施例1)
在本实施例中，将描述其中中孔的孔壁材料是硅石的结构。
首先，2.40g非离子表面活性剂，即，三嵌段共聚物(EO20PO70EO20；HO(CH2CH2O)20(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)20H)溶于76.5ml纯水中。此外，向所获得的水溶液中加入7.5ml 36重量％浓盐酸，并在室温下搅拌30分钟。然后，向水溶液中加入13.9g正癸烷，作为取向控制剂，并在室温下搅拌2小时。
此外，向该混合溶液中加入0.027g NH4F作为水解催化剂和5.10g四乙氧基硅烷(TEOS)以制备前体溶液。使该前体溶液的最终组成(摩尔比)满足以下比例：TEOS∶HCl∶EO20PO70EO20∶NH4F∶正癸烷＝25∶90∶0.4∶0.7∶100。
该前体溶液在40℃下搅拌20小时，然后在120℃下反应48小时。由此获得的白色沉淀用纯水充分洗涤，并在真空下干燥。
由此获得的粉末样品在550℃下在空气中煅烧，从而表面活性剂被分解，并从细孔的内部除去，形成中空的细孔。通过红外吸收光谱测量方法检查有机物质例如表面活性剂的除去情况。
通过X射线衍射方法评价由此合成的中孔硅石粉末，结果如图6中所示，鉴定到一个归属为晶面间距为11.7nm的六角形结构的(100)面的衍射峰，以及归属为(110)、(200)和(210)面的衍射峰。这些结果表明，中孔硅石的细孔结构具有高规则性设置的六角形排列。
在77K下进行氮吸附-解吸等温测量，结果，吸附等温线的形状被鉴定为按照IUPAC分类的IV型。基于B.E.T.方法得到的比表面积和细孔体积分别为700m2/g和1.88ml/g。根据吸附等温线的结果，基于BJH方法得到细孔尺寸。因而在本实施例中合成的中孔硅石的细孔尺寸分布表现为狭窄的分布，在14.3nm处有一个单峰。获得的结构的孔尺寸分布为，使得90％或更多的中孔落入包括最大值的10nm的范围内。
接下来，用扫描电子显微镜(SEM)进行观察，发现形成具有大量分枝的棒状结构(具有树枝状骨架的结构)，如图2A和2B中所示。
在分枝的棒状结构中的空间(在骨架中的空间)中，发现形成300到500nm的大孔或大孔尺寸化的空间。
用更高的放大倍数进行SEM观察，如图7中所示，发现直径为14nm的管状中孔沿着与树枝状结构的纵向交叉的方向取向。在图7中，数字标记11表示由树枝状骨架形成的大孔的孔尺寸。如图8中所示，在该结构的截面中形成细孔结构，其中均一的管状中孔为蜂巢(即，六角形对称)堆积。值得注意的是，在观察过程中该中孔结构不被电子束所破坏。
如上所述，能够合成具有孔尺寸彼此不同的两类细孔(即，在树枝状骨架的部分之间形成的大孔和在骨架中形成的中孔)的结构(以下称为分级(hierarchical)结构，视具体情况而定)。
(实施例2)
辣根过氧化物酶(以下缩写为HRP；平均直径＝4.8nm，等电点(IEP)＝7.2)，一种氧化还原酶，被固定在实施例1中制得的结构(中孔硅石)的中孔中。然后测量对有机溶剂的耐受性和耐热性。此外还研究了溶液扩散性。
(1)酶在中孔中的固定
通过使用5mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)制备5mg/ml HRP溶液，并将10mg合成的中孔硅石加入到1ml酶溶液中。所混合的溶液在4℃和20小时条件下用振动器搅拌，从而使HRP吸附在中孔硅石的细孔中。
反应完成后，使反应溶液在4℃下以20000g离心分离10分钟，并用纯水洗涤HRP-中孔硅石沉淀物三次。对原始的酶溶液和所获得的上清液进行紫外-可见光吸光度测量。通过利用HRP在403nm处的吸收最大值，由在吸附前和吸附后之间的浓度变化得到吸附到中孔硅石上的HRP的量。固定有酶的中孔硅石在洗涤后进行真空冻干10小时，得到粉末样品。相对于1g中孔硅石而言，HRP的吸附量高至252mg/g。通过改变磷酸盐缓冲溶液的pH，HRP的吸附量发生改变。根据这些结果，确信HRP和中孔硅石的细孔彼此静电相互作用，从而固定HRP。
通过以下事实确认HRP引入到细孔中，在HRP吸附后对中孔硅石进行的氮吸附测量中，吸附到细孔中的氮减少。
(2)对有机溶剂的耐受性
为了评价固定在中孔硅石中的HRP在有机溶剂中的酶活性，使用1，2-二氨基苯在甲苯中的氧化反应，其中使用叔丁基过氧化氢作为氧化剂。
通过混合8ml 50mM 1，2-二氨基苯的无水甲苯溶液与2ml 1.1M叔丁基过氧化氢的正癸烷溶液来制备混合的溶液。向1ml该混合溶液中加入10mg固定有HRP的中孔硅石，在37℃下开始反应；测量由1，2-二氨基苯的氧化而产生的1，2-二硝基苯的470-nm吸光度，以观察时间变化。从而HRP在作为溶剂的甲苯中的酶活性得以确定。
作为对比测试，制备0.5mg HRP本身，进行上述氧化反应，用与上述相同的方式测量470-nm吸光度的增加。所得结果表示在图9中。单独用HRP(游离的HRP)，在甲苯中没有发生氧化反应(曲线90)，但是用固定于中孔硅石中的HRP，显示出很高的活性(曲线91)。这确信是因为在HRP加入甲苯中后HRP立即变性，并发现，HRP固定在中孔硅石中获得高稳定性。
(3)耐热性
固定有HRP的中孔硅石(曲线101)和通常的非固定的HRP(曲线100)在磷酸盐缓冲溶液中在70℃下热处理0到2小时，之后测量其剩余的酶活性；所得结果表示在图10中。通过测量苯酚的氧化分解率来测定固定在中孔硅石中的HRP的热稳定性。为了定量测定苯酚，使用4-氨基安替比林比色法。
向10mg通过上述HRP吸附制备的固定有HRP的中孔硅石中加入400μl 50mM乙酸钠缓冲溶液(pH＝4.0)，以制备溶液；由此制备的四份相同的溶液在70℃下分别加热30、60、90或120分钟。对每份溶液都进行离心分离，并用纯水洗涤该固定有HRP的硅石两次；然后将400μl 50mM Tris-HCl(羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲溶液(pH＝7.5)、8μl 5000ppm的苯酚水溶液和2μl 30％过氧化氢溶液加入该固定有HRP的硅石中，使由此获得的反应混合物在37℃下反应30分钟；离心分离后，加入150μl上清液，并加入150μl 1％六氰铁酸盐和300μl 1％4-氨基安替比林，两者都用1M的甘氨酸水溶液(pH＝9.6)制备，并搅拌该混合物；之后快速测量在约500nm的吸光度。
在70℃下热处理30分钟使未固定的HRP的酶活性降低一半，在2小时后，只有初始酶活性的大约10％。相反，证实固定有HRP的中孔硅石对热具有高稳定效果；在70℃下热处理2小时后还存在90％或更高的酶活性。
图11表示基于苯酚氧化反应的HRP的温度依赖性测量的结果。HRP(曲线110)和固定的HRP(曲线111)分别在25℃到100℃下预先处理了30分钟，之后测量酶活性。通常的HRP在70℃和30分钟条件下的剩余活性为0％，但固定在分级中孔硅石中的HPR在相同的条件下表现出50％或更高的活性，并且即使在100℃下处理后也保持约40％的酶活性，而没有下降到0％。
(4)溶液扩散性
接下来，研究在骨架邻近部分之间的大孔或大孔尺寸化的空间的存在如何改变该吸附的材料的内扩散。具体而言，根据本发明制备分级多孔材料，并且合成没有大孔的单分散的中孔材料，将这些材料压制成圆片状的丸粒(pellet)，并研究这些材料每种的HRP吸附行为。
称取量为0.2g的根据上述合成方法合成的分级多孔硅石的每种煅烧粉末和没有大孔的单分散的中孔硅石(非专利文件1的颗粒)的煅烧粉末。通过压片机将每种所称量的材料压制成直径为15mm和厚度为1mm的圆片状的丸粒。
通过使用5mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)制备5mg/ml的HRP溶液，并将每种丸状的中孔硅石置于5ml的HRP溶液中。每种混合的溶液用振动器在4℃下缓慢振动48小时，HRP因而吸附在每个中孔硅石中，根据HRP溶液在403nm的吸收强度变化来测量在每种HRP溶液中的吸附量的时间变化情况。在从吸附开始起约1小时的流逝时间时，分级中孔硅石表现相对吸附量为80％或更多。该吸附量与压制前煅烧粉末的吸附量大致相同。
然而，既没有树枝状骨架也没有大孔的中孔材料在压制成丸粒后吸附率明显降低。本发明人解释为，这些结果是由于以下事实造成的，本发明的分级中孔材料即使在压制的丸粒中也保持着大孔，从而保持着高的内扩散速率。另一方面，在没有树枝状骨架的中孔材料中，压制使得材料本身的密度太高，结果吸附率确实降低。
对比实施例1(酶固定在中孔中)
作为对比实施例，合成SBA-15，其中与棒状颗粒的长轴方向平行形成管状细孔，并测量HRP吸附和在有机溶剂中的稳定效果。SBA-15的合成方法描述在Science，No.279，第548页中。
通过X射线衍射法评价所合成的SBA-15，结果鉴定到归属为晶面间距9.8nm的六角形结构的(100)面的衍射峰。根据氮吸附等温测量，发现所合成的SBA-15的比表面积为800m2/g并且细孔尺寸为7.4nm。
对所合成的SBA-15进行与实施例1中相同的HRP吸附实验。发现HRP的吸附量为25mg/g，表现出非常小的吸附量，是本发明人合成的分级中孔硅石中吸附量的1/10或更少。根据HRP吸附后对样品的氮吸附等温分析，发现SBA-15的细孔体积从HRP吸附之前到之后没有降低，并发现HRP几乎没有吸附在SBA-15的细孔中。
接下来测量HRP在各中孔硅石中的时间依赖性的吸附量，结果发现，在本发明具有大孔的分级中孔硅石中达到饱和吸附量的时间非常短。
对比实施例2(对有机溶剂的耐受性)
也使用SBA-15，通过上述方法测量HRP的有机溶剂稳定性，与本发明的分级中孔硅石比较。由于HRP被固定到SBA-15中，仅观察到轻微的酶活性。然而，用固定到SBA-15中的HRP，在开始反应后逐渐鉴定出反应产物，1，2-二硝基苯。相反，在分级中孔硅石中，从开始反应后立即鉴定出1，2-二硝基苯的量为在SBA-15中发现的量的10倍或更多倍。
就此而论，在SBA-15中，与棒状颗粒的长轴方向平行地形成管状细孔；因此管状细孔的长宽比较大，从而使得HRP或底物从外部扩散到细孔的内部和从细孔的内部扩散到外部较差；并且表面上的细孔开口数较少。从而使得HRP或底物的引入较慢。这些结果表明，本发明人合成的分级中孔硅石在蛋白质或底物的内扩散方面是优异的，并且作为生物材料等的载体是优异的，因为该分级中孔硅石具有大孔等。
(实施例3)
本实施例是这种情况，其中，用锆的氧化物改性实施例1中制得的分级中孔硅石的表面，固定一种氧化还原酶——葡萄糖氧化酶(缩写为GOD，直径＝8.0nm，IEP＝4.6)，并测量对热的稳定性。
向90ml纯水中加入10g硝酸氧锆二水合物，并在室温下溶解，以制备10重量％的硝酸氧锆的水溶液。向该溶液中加入在实施例1中合成的分级中孔硅石，并浸泡20小时。之后，通过离心分离，从该混合物中除去上清液，用水洗涤该混合物并在室温下干燥。
通过X射线衍射方法评价用锆改性的分级中孔硅石，结果发现表现出与改性以前几乎相同的衍射图案，证明没有破坏中孔的周期性结构。通过X射线光电子光谱法(XPS)测量硅石表面的化学键合状态，结果鉴定出归属为Zr-O的峰，证明在硅石表面上形成了锆氧化物层。
随后将GOD固定在已用锆改性的分级中孔硅石的细孔中，并基于苯酚的氧化分解反应测量稳定效果。
使用5mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝5.0)制备5mg/ml的GOD溶液，并向1ml的该GOD溶液中加入10mg用锆改性的分级中孔硅石。所混合的溶液在4℃和20小时条件下用振动器搅拌，以将GOD固定在中孔硅石的细孔中。吸附后，在4℃下以20000g对反应溶液进行离心分离10分钟，产生固定有GOD的硅石。从GOD固定之前和之后在上清溶液中的280-nm吸收最大值得到吸附于中孔硅石中的GOD量。GOD的吸附量为120mg/g或更多。用氮吸附测量设备，根据细孔中吸附量的降低来确定引入到细孔中的酶分子的存在。GOD几乎不吸附到没有用锆改性的中孔硅石中。
向各10mg通过上述GOD吸附制备的固定有GOD的中孔硅石和固定有GOD的SBA-15中加入400μl 50mM乙酸钠缓冲溶液(pH＝4.0)，以制备溶液；由此制备的每种上述固定有GOD的物质的四份相同的溶液在70℃下分别被加热30、60、90或120分钟。加热后，对每份溶液都进行离心分离，并用纯水洗涤该固定有GOD的硅石两次；然后将400μl 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)、100μl 10％β-D-葡萄糖的水溶液、8μl 5000ppm的苯酚水溶液和100μl 100μ/ml HRP溶液加入该固定有GOD的硅石中，使由此获得的反应混合物在37℃下反应30分钟；离心分离后，以与实施例2中相同的方式测量在约500nm的吸光度。
在70℃下热处理30分钟使未固定的GOD的相对活性降低到0％。相反，证实固定在中孔硅石中的GOD对热具有高稳定效果；在70℃下热处理120分钟后还存在70％或更高的酶活性。
通过使用没有进行热处理的固定有GOD的分级中孔硅石来测量苯酚在37℃下分解的时间变化。
向10mg通过上述GOD吸附制备的固定有GOD的中孔硅石中加入400μl 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.5)和100μl β-D-葡萄糖的水溶液，并且还加入8μl 5000ppm苯酚的水溶液和100μl 100μ/mlHRP溶液。使由此制备的溶液在37℃下反应预定的时间。离心分离后，以与实施例2中相同的方式测量在约500nm的吸光度。从由此获得的结果，得到30分钟后对苯酚分解浓度的相对活性。对于5分钟的反应，固定在分级中孔硅石中的GOD表现出100％的相对活性。
这些结果表明，具有大孔的分级中孔硅石由于其大孔而具有高的内扩散，同时，固定在中孔中的酶获得高的稳定效果。
以与实施例1中相同的方式，通过使用丸状的分级中孔硅石和丸状的单分散的中孔硅石(没有大孔)进行GOD吸附实验。根据上述方法将这些丸粒分别浸泡在硝酸氧锆的水溶液中，以进行锆处理，然后测量GOD的时间依赖性的吸附行为。以与实施例1中的相同方式，根据本发明的丸状分级中孔硅石与压制前的粉末相比，没有表现出吸附行为的变化。然而，GOD几乎没有吸附到没有大孔的单分散的中孔硅石的丸粒上。这确信是因为在该丸状的单分散的中孔硅石中，其颗粒被致密压紧，从而使内扩散减慢，导致GOD在中孔中不充分地扩散。
(实施例4)
本实施例是这种情况，其中，用硅烷偶联剂改性实施例1中合成的分级中孔硅石的表面，并且将α-淀粉酶通过共价键固定在硅石表面上。
向50ml 10％(v/v)3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中加入1.0g在实施例1中合成的分级中孔硅石，由此获得的溶液在氮气氛中在120℃下搅拌48小时。反应后，过滤出沉淀物，用甲苯、甲醇和二氯甲烷洗涤，并在室温下干燥。
接下来，将1.0g这样干燥的样品溶于25ml 2.5％使用磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.6)制备的戊二醛溶液中，并在室温下搅拌1小时。所获得的沉淀用纯水洗涤四次或更多次，之后在室温下干燥。
通过X射线衍射方法评价用戊二醛改性的分级中孔硅石，结果发现表现出与修饰以前几乎相同的衍射图案，证明没有破坏中孔结构。通过FT-IR鉴定引入硅石表面上的官能团，结果鉴定出归属为R-CH＝N、C＝O和-CHO的峰，证明Si(CH2)3N＝CH(CH2)3CHO共价键合到硅石表面上。
随后，将α-淀粉酶固定在已经被改性的分级中孔硅石的细孔中，基于淀粉到麦芽糖的水解反应来测定稳定效果。
通过使用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.0)来制备1mg/ml的α-淀粉酶溶液，并在1ml该溶液中加入0.2g根据上述方法合成并改性的分级中孔硅石，以与实施例1中相同的方式压制成丸粒。所混合的溶液在4℃和20小时条件下用振动器进行浸泡，以将α-淀粉酶吸附在中孔硅石的细孔中。反应完成后，过滤出丸粒，并用纯水洗涤三次。对原始的酶溶液和上清液进行紫外-可见光吸光度测量。通过使用α-淀粉酶的280nm吸收最大值，根据从吸附之前到之后的浓度改变，得到吸附到中孔硅石中的量。所吸附的α-淀粉酶的量高至140mg/g。在相同条件下α-淀粉酶吸附到没有进行表面改性的粉末状分级中孔硅石和压制的丸状单分散中孔硅石中的吸附实验几乎没有表现出吸附行为。因而确信认为，由于归因于大孔的高的内扩散，α-淀粉酶通过改性硅石表面的-CHO和α-淀粉酶的-NH2之间的键合而被固定在硅石表面上。
随后，固定有淀粉酶的丸状中孔硅石和非固定的淀粉酶在25℃到70℃下在乙酸钠缓冲溶液中进行热处理，然后进行酶活性测定。
向10mg上述固定有淀粉酶的中孔硅石中加入400μl 50mM乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.0)，以制备溶液；由此制得的溶液在25℃到70℃下分别热处理30分钟。加热后，对各溶液进行离心分离，并用纯水洗涤固定有淀粉酶的硅石两次。使用相同的50mM乙酸钠缓冲溶液，制备0.125％可溶性淀粉溶液，并将300μl淀粉溶液加入洗涤后的固定有淀粉酶的硅石中，并使该混合物在40℃下反应15分钟。反应结束后，通过离心分离获得上清液，将1ml 0.5N乙酸和3ml碘-钾溶液(0.015％碘-0.15％碘化钾溶液)加入该上清液中，并充分搅拌该上清液，然后测量700-nm吸光度最大值。通常的α-淀粉酶在60℃和30分钟的条件下表现出20％的相对活性，但固定在分级中孔硅石中的α-淀粉酶在相同的条件下表现出90％或更大的相对活性，从而证实稳定效果。
(实施例5)
本实施例是这样的情况，其中，单链DNA被引入在实施例1中制得的分级中孔硅石的中孔表面上。本实施例是利用杂交反应光学探测单链DNA之间的特异性反应的生物传感元件的实例，图12是说明生物传感元件的构造的实例的示意图。
杂交是指形成核酸杂合体或核酸分子杂交，是用于研究核酸的一级结构同源性，即碱基序列同源性的方法，或者检测具有同源碱基序列的核酸的方法。杂交利用以下特性，两个单链的核酸在互补的碱基对(A-T，G-C)之间相互形成氢键，从而形成双螺旋的双链核酸。
在实施例1中合成的分级中孔硅石和在对比实施例1中使用的SBA-15在3-氨基丙基三乙氧基硅烷在95％乙醇水溶液的10％溶液中浸泡1小时，然后用离心分离器除去未反应的溶液。用乙醇洗涤后，在氮气氛中在120℃下进行反应1小时，从而将氨基引入到中孔硅石的孔表面上。
此外，将已引入氨基的分级中孔硅石浸泡在1mM GMBS的二甲亚砜溶液中达2小时，然后用二甲亚砜洗涤，从而将马来酰亚胺基团引入到中孔硅石的孔表面上。这些官能团的引入通过FT-IR进行鉴定。
其中引入了硫醇基团的DNA探针通过使用DNA自动合成仪来合成，然后通过高效液相色谱法来纯化该DNA探针。
DNA探针：HS-(CH2)6-O-PO2-O-5′-SEQ ID NO：1-3′
然后，将10μl 2μM所合成和纯化的DNA探针的溶液、40μlHEPES缓冲溶液(N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸；10mM，pH＝6.5)和50μl添加剂(乙二醇)混合在一起，以制备反应溶液。向该混合的溶液中加入已引入马来酰亚胺基团的分级中孔硅石，由此获得的混合物在室温下静置2小时，单链DNA因而固定到中孔硅石的表面上。
将固定有DNA探针的中孔硅石装入图12所示的芯片基板上的槽中，其它通道如图12所示进行布置，从而制成生物传感元件。在该图中，数字标记101表示基板，102表示根据本实施例制备的固定有DNA探针的分级中孔硅石。数字标记103和104分别表示溶液引入管，105表示已经引入的溶液的溶液排放管。
通过使用自动DNA合成仪合成具有与该DNA探针互补的碱基序列的DNA目标，并且其5′末端用得克萨斯红进行荧光标记。然后将80μl 0.1μM DNA目标的溶液、17μl 20×SSC(0.3M柠檬酸钠，3.0M氯化钠)和3μl10％十二烷基硫酸钠的水溶液混合在一起。通过混合而制得的该杂交溶液沿箭头123所示的方向通过图12所示的溶液引入管103引入。在稳定状态停留预定的时间后，该溶液沿箭头125所示的方向从溶液排放管105排放出去。
在杂交反应进行预定的时间后，将一百倍稀释的20×SSC溶液作为洗涤溶液从洗涤溶液引入管104沿箭头124所示的方向注入，并进行洗涤。然后，通过使用用于微阵列的扫描器，测量固定有DNA探针的部分的荧光强度(杂交信号)和其中没有固定DNA探针的样品的荧光强度(背景信号)。
固定有DNA探针的SBA-15的杂交信号小，不能获得高的荧光强度比(杂交信号/背景信号)；测量由于杂交反应引起的荧光强度随时间的变化情况，还发现达到饱和强度的时间较长。相反，固定有DNA探针的分级中孔硅石在非常短的时间内完成杂交反应，并获得优异的荧光强度比。这些结果确信地作如下理解：DNA探针在分级中孔硅石的中孔中的高吸附量增加了荧光信号，由于大孔引起的优异的内扩散导致杂交反应在短时间内完成。
在本实施例中，由上述结果证明，通过使用其中已固定有上述生物材料的分级中孔硅石，可以制成能够在短时间内完成高灵敏探测的生物传感元件。
(实施例6)
在本实施例中，在实施例1中合成的分级中孔硅石的细孔中固定小鼠单克隆抗体(抗原是人血清白蛋白)，通过利用抗原和抗体之间的特异性结合反应，对目标材料进行检测和测定。
分别向10mg在实施例1中合成的分级中孔硅石和10mg在对比实施例1中使用的SBA-15中加入10ml 1mg/ml用纯水制得的小鼠Fab型单克隆抗体的水溶液。由此制得的溶液分别在4℃下搅拌6小时，从而将抗体固定在中孔硅石的中孔中，然后用纯水洗涤三次。向该固定有抗体的中孔硅石中加入辣根过氧化物酶标记的人血清白蛋白(缩写为HRP-HSA)溶液的溶液，并使该混合物在室温下反应预定的时间(1到4小时)。为了除去非特异性吸附的HRP-HSA，用纯水洗涤固定有抗原-抗体的中孔硅石几次，然后真空冻干，使干燥的样品在37℃下静置任选的一段时间。然后向该样品中加入400μl 50mMTris-HCl(pH＝7.5)、8μl 5000ppm苯酚的水溶液和2μl 30％过氧化氢溶液，并使该混合物在37℃下反应30分钟。在离心分离后，以与实施例2中相同的方式测量在约500nm的吸光度，从而测定用特异性键合到固定的抗体上的HSA标记的HRP的酶活性。
另外，以与上述相同的方式，将不是HRP-HSA抗体的非特异性小鼠免疫球蛋白抗体(小鼠Ig)固定到分级中孔硅石上。然后，按照上述过程，测量其中使用与HSA特异性键合的抗体的情形和其中使用非特异性抗体的情形之间的吸光度差异。结果发现，非特异性小鼠Ig的HRP活性明显小于根据本实施例的固定有小鼠Fab型单克隆抗体的中孔硅石。由这些结果证明，抗体被固定在中孔硅石中，并且即使在抗体固定在中孔硅石后，在细孔中仍发生抗原-抗体反应。
向上述固定有抗体的中孔硅石中加入HRP-HSA溶液，并使该混合物在室温下反应预定的时间(1到4小时)，从而测定抗原-抗体反应的时间变化情况。结果，如实施例2、3和4中所证明的那样，只有在使用分级中孔硅石的情况下才鉴定出高的抗原-抗体反应速率。这确信是因为，外在的环境作用使没有固定在细孔中的HRP-HSA(例如通过非特异性吸附而吸附到细孔外面的HRP-HSA)变性，因而HRP-HSA没有被稳定化。
以上获得的固定有抗体的中孔硅石和非固定的小鼠单克隆抗体粉末分别以干燥状态在37℃下存放3周，并分别检测由于抗原-抗体反应引起的HRP活性随时间的变化情况：以上硅石和粉末以干燥状态在37℃下开始存放之前之际各自的结合活性被定义为100。非固定的小鼠单克隆抗体的相对活性在一周后成为零，即完全失活。另一方面，固定在分级中孔硅石中的小鼠单克隆抗体的抗原-抗体反应即使在三周后也表现出90％或更高的相对活性。
(实施例7)
本实施例是这样的情况，其中，在电极上合成与实施例1中所合成的相同的分级中孔硅石，进一步将葡萄糖氧化酶(GOD)和介质固定在中孔中，并测定葡萄糖浓度。使用碳电极和铂电极作为电极。
在76.5ml纯水中溶解2.40g三嵌段共聚物(EO20PO70EO20；HO(CH2CH2O)20(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)20H)。进而，向所获得的水溶液中加入7.5ml 36重量％的浓盐酸，并在室温下搅拌30分钟。然后，向水溶液中加入13.9g正癸烷，并在室温下搅拌2小时。进而，向该混合溶液中加入0.027g NH4F作为水解催化剂和5.10g四乙氧基硅烷(TEOS)以制备前体溶液。使该前体溶液的最终组成(摩尔比)满足以下比例：TEOS∶HCl∶EO20PO70EO20∶NH4F∶正癸烷＝25∶90∶0.4∶0.7∶100。
该前体溶液在40℃下搅拌20小时，然后在120℃下反应48小时。由此获得的白色沉淀用纯水充分洗涤。向该白色沉淀中适当加入乙醇，并在3000rpm到6000rpm下进行离心分离，以产生糊状分级中孔硅石。将所获得的样品涂敷到碳电极上，在室温下干燥，在空气中在500℃下煅烧以分解并从细孔内部除去表面活性剂，从而在碳电极上合成分级中孔硅石。
以与实施例1中相同的方式，通过X射线衍射方法评价从电极上取样的中孔硅石粉末，结果鉴定出归属为六角形结构的(100)面的衍射峰，以及归属为(110)、(200)和(210)面的衍射峰。
通过使用5mM乙酸钠缓冲溶液(pH＝7.4)制备5mg/ml GOD溶液，并将合成的中孔硅石碳电极浸泡在10ml该酶溶液中。该溶液在4℃和20小时条件下用振动器缓慢搅拌，从而使GOD吸附在电极上中孔硅石的细孔中。用纯水洗涤电极上的GOD-中孔硅石三次，产生固定有GOD的电极。从GOD固定之前和之后上清液的280nm吸收最大值，通过减去仅吸附到作为背景的碳电极上的量，得到吸附到中孔硅石上的GOD的量。GOD的吸附量为230mg/g或更多。在干燥该样品后，为了将介质支撑在中孔中，使该样品在稳定状态下在室温下在100ml 100mM用50ml MOPS缓冲溶液制备的铁氰酸钾溶液中停留12小时。浸泡后，进行离心分离并用纯水洗涤，在室温下干燥，得到用于检测葡萄糖的GOD电极。
通过利用图13所示的反应机理，测定葡萄糖的浓度。利用该机理，可以测定血液等中的血糖水平。具体而言，当血液中的葡萄糖到达传感器时，葡萄糖和GOD相互反应，并且在反应时间内，葡萄糖释放电子，转变成葡糖酸。从葡萄糖释放的电子被氰化铁离子([Fe(III)(CN)6]3-)所捕获。捕获电子的氰化铁离子([Fe(III)(CN)6]3-)转变成氰化亚铁离子([Fe(II)(CN)6]4-)。工作电极131检测该反应发生与否。事先将电压施加到该工作电极上，对电极132不接受氰化亚铁离子([Fe(II)(CN)6]4-)的电子，但氢离子(H+)接受对电极上的电子，与氧(O2)配合产生水(H2O)。通过测量此时的电流值，得到葡萄糖的量，并可以确定血糖水平。
如下测定葡萄糖浓度。在如图14所示的恒温电池中放有50mMMOPS缓冲溶液，并保持在预定温度。所合成的固定有GOD的碳电极用作工作电极131，具有固定有酶的颗粒130，铂电极用作对电极132。将预定的电压施加到碳电极上，在电流变得稳定后，加入含有葡萄糖的样品，测量电流值的增加，获得高电流。额外地，使用标准葡萄糖溶液样品来测量电流值，结果发现电流值随着葡萄糖浓度增加而线性增加。因此可以得到能够测定葡萄糖浓度并测定血糖水平的生物传感器。
(实施例8)
本实施例是这样的情况，其中，在电极上合成与实施例1中所合成的相同的分级中孔硅石，进一步在其中固定葡萄糖氧化酶(GOD)和介质，并测定葡萄糖浓度。
分级中孔硅石与上述工作实施例中的相同。用二茂铁羧酸作为介质。二茂铁羧酸以共价键固定到中孔的表面，从而将GOD支撑到中孔上。
二茂铁羧酸的固定包括以下步骤。将涂敷有中孔硅石的电极(其中已经通过煅烧形成中孔)用硅烷偶联剂进行硅烷化(sililated)。在Teflon(商品名)容器中制备20mM(3-碘丙基)三甲氧基硅烷(IPTMS)的二氯甲烷溶液。将电极浸入该溶液中，然后在氮气氛下在室温下搅拌4小时。用二氯甲烷和乙醇洗涤所得到的电极，并在80℃下干燥。
然后将这样碘-丙基硅烷化的电极浸入0.13mM二茂铁羧酸水溶液和0.17mM N，N′-二环己基碳二亚胺水溶液的混合溶液中，并在Ar气氛下缓慢搅拌，从而将二茂铁羧酸固定到硅石表面上。通过FT-IR分别确认IPTMS向硅石表面上的引入和二茂铁羧酸通过酯键的固定。通过这些步骤，完成了通过共价键将二茂铁羧酸固定到硅石表面上。
将pH 7.4的PBS放入恒温电池中。将以上制备的固定有GOD的碳电极浸入其中，然后用氮鼓泡搅拌5分钟，其中使用Ag-AgCl电极作为参比电极并且使用铂线作为对电极。在电极上扫过100mV到600mV的电压。氧化电流变得稳定，然后减低电压，从而获得CV曲线。扫描速率设定为1mV/s。每次提高葡萄糖的浓度，都测量电流，从而确定饱和电流值。所得的氧化-还原电势的峰值为220mV。从而确认，使用二茂铁羧酸的介质可以用于生物传感器中。同时，在允许二茂铁羧酸漂浮的状态下的氧化-还原电势大于220mV。
当血液中的物质被电极氧化/还原时，对于抗坏血酸而言，氧化-还原电势例如为500-600mV；对于血红蛋白而言，为300-400mV。因此，为了正确测量电流的峰值，使用不与这些氧化-还原电势峰重叠、而是在较低电势下有峰的介质是重要的。
也就是说，利用共价键将介质固定在中孔上好于使其漂浮，因为所述峰会移向较低电势。该移动的原因似乎是，所述介质在负电场支配下的中孔硅石中易于氧化，并且介质固定在表面上导致电子跳跃，这可以有效地使电子转移到电极上。该原因也适于其它酶。
如上所述，根据本发明，可以获得一种具有中孔的新结构。另外，本发明的中孔材料在内扩散方面是优异的，可以应用于固定生物材料的试剂，用于增加柱材料的精度，等等。本发明的具有中孔的结构例如可以应用于生物传感器等。
序列表自由文本
<210>1
<223>探针的碱基序列部分
本申请要求2005年6月7日提交的日本专利申请号2005-166754的优先权，通过引用将其内容并入本文。

Claims (9)

1.一种具有多个中孔的中孔硅石结构，包括：
具有中孔的树枝状骨架，
其中，在500nm×500nm面积内可观察到的90％以上的所述中孔沿垂直于所述骨架纵向的方向贯穿所述骨架。
2.根据权利要求1的结构，其中，所述树枝状骨架通过骨架的分枝部分相互连接形成大孔，或者
在彼此相邻的骨架之间形成大孔尺寸化的空间。
3.根据权利要求1的结构，其中，所述中孔为六角形对称排列。
4.根据权利要求1的结构，其中，所述中孔的孔径分布为，其中80％或更多的中孔落入宽度为10nm并包括最大值的范围内。
5.根据权利要求1的结构，其中，生物材料被支撑在中孔中。
6.一种由多个颗粒形成的多孔材料，包含由根据权利要求1的结构组成的颗粒。
7.一种用于检测样品的传感器，该传感器由根据权利要求6的多孔材料和电极组成，并且基于样品和支撑在中孔中的生物材料之间的反应来检测电输出信号。
8.一种检测样品的方法，包括以下步骤：
制备传感器，其中生物材料被支撑在根据权利要求1的结构的中孔中；
将含有样品的流体加到该传感器上；和
基于生物材料和样品之间的反应来检测输出信号。
9.一种酶电极，含有支撑酶的多孔材料和用于将从该酶转移来的电子转移到该电极上的电子转移物质，
其中，所述多孔材料为根据权利要求6所述的多孔材料，
其中，所述电子转移物质被固定在所述多孔材料上。
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