KR20080014034A

KR20080014034A - 섬유 기재 표면 코팅 방법

Info

Publication number: KR20080014034A
Application number: KR1020077029147A
Authority: KR
Inventors: 토르스텐 몬타크; 울프 바우스; 마르핀 카로스; 토마스 슈브코브스키; 폴커 슈벤데만; 리카르트 바우어; 크리스틴 멘더라; 클라우스 볼슈바일러; 한스-게오르크 르메르; 그레고르 브로트
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-02-13
Also published as: JP2008545895A; TW200702518A; EP1891261A2; CA2610785A1; WO2006131478A3; AU2006256765A1; US20090117796A1; WO2006131478A2; BRPI0611240A2; MX2007014908A

Abstract

본 발명은 직물 기재 또는 가죽으로부터 선택된 섬유 기재를 1종 이상의 하이드로포빈을 사용하여 코팅하는 방법에 관한 것이다.

Description

섬유 기재 표면 코팅 방법{METHOD FOR COATING FIBRE SUBSTRATE SURFACES}

본 발명은 1종 이상의 하이드로포빈을 사용하여 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재의 표면을 코팅하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 코팅 섬유 기재 및 본 발명에 따른 섬유 기재를 사용하여 의복을 제조하는 방법에 관한 것이다.

WO 02/59413은, 푹신한 촉감으로 사용될 수 있도록, 직물, 예를 들어 폴리에스테르, 폴리아크릴, 폴리아미드를, 단백질 또는 폴리펩티드, 특히 물에 용해시킨 산화 울로 처리하는 방법에 관해 기술하고 있다. 그러나, WO 02/59413에 따라 마감 처리된 직물은 처음에 매우 좋지 않은 촉감을 가지고 있음이 종종 관찰된다. 또한, 1단계 방법으로 균일하게 도포하는 것이 어려울 수 있음도 관찰된다(10면). 균일한 도포에 있어서의 이러한 어려움을 극복하기 위해, 에피클로로히드린을 사용하는 매우 복잡한 다단계 방법이 구제책으로서 제시되고 있다. 그러나, 에피클로로히드린을 사용하는 것은 일반적으로 바람직하지 않다.

본 발명의 목적은 상기 선행 기술의 단점을 극복할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이러한 목적이 문두에서 정의한 본 발명의 방법에 의해 실현됨을 발견하였다.

문두에서 정의한 본 방법은, 평탄화 또는 텍스쳐 처리될 수 있는 하나 이상의 표면으로 시작한다. 코팅하고자 하는 표면은 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재의 일부를 형성한다.

본 발명의 목적에 있어서, 직물 기재는 직물 섬유, 직물 중간 생성물 및 최종 생성물과, 이로부터 제조된 완성품이며, 이는 의류 산업용 직물 뿐만 아니라 예를 들어 카페트, 그 밖의 가정용 직물 및 산업용 직물 구조체를 포함한다. 이는 비성형 구조체, 예를 들어 스테이플, 선형 구조체, 예컨대 트와인, 필라멘트, 얀, 라인, 스트링, 레이스, 브레이드, 코디지, 및 3차원 구조체, 예를 들어 펠트, 직포, 루프형 니트(formed-loop knits), 부직포 및 안솜을 포함한다. 직물 기재는 천연 재료, 예를 들어 면, 양모 또는 아마, 또는 혼합물, 예컨대 면/폴리에스테르, 면/폴리아미드의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 목적에 있어서, 직물(들)은 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드 및 특히 폴리에스테르 또는 천연 재료와 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드 및 특히 폴리에스테르의 혼합물이다.

본 발명의 목적에 있어서, 가죽은 무두질하고 마감 처리한 동물 원피(hide) 및 소위 상가죽을 지칭한다.

본 발명의 목적에 있어서, 코팅은 본 발명에 따라 코팅하고자 하는 기재 면적의 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상을 커버하는 1종 이상의 하이드로포빈으로 된 단분자층을 지칭한다. 섬유 기재 커버 정도는 종래의 방법, 예를 들어 미시적 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 섬유 기재 표면을 코팅하기 위해 1종 이상의 하이드로포빈을 사용한다. 1종의 하이드로포빈이 사용되거나, 다수종의 상이한 하이드로포빈의 혼합물이 사용될 수 있다.

하이드로포빈은 필라멘트형 진균류, 예를 들어 스키조필럼 커뮨(Schizophyllum commune)의 특징인 잘 알려진 단백질, 바람직하게는 소형 펩티드이다. 이 단백질은 일반적으로 8개의 시스테인 단위를 포함한다. 하이드로포빈은 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 그러나, 화학적 및/또는 생물공학적 제조 방법을 이용하여 비천연 하이드로포빈을 합성하는 것도 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "하이드로포빈(hydrophobin)"이란 용어는 하기 일반 구조식 (I)의 단백질을 의미한다.

X_n-C¹-X₁ _-50-C²-X₀ _-5-C³-X₁ _-100-C⁴-X₁ _-100-C⁵-X₁ _-50-C⁶-X₀ _-5-C⁷-X₁ _-50-C⁸-X_m (I)

상기 식에서, X는 20개의 천연 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 어느 하나일 수 있다. 각각의 X는 동일하거나 상이할 수 있다. X 다음에 표시된 지수는 각 경우에 아미노산의 수를 나타내며, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌을 나타내고, 단, C로 표시되는 아미노산 중 적어도 4개는 시스테인이며, 지수 n 및 m은 독립적으로 0∼500, 바람직하게는 15∼300 범위의 자연수이다.

본 발명의 일 실시형태는, (유리 표면의 코팅 후) 비코팅 유리 표면 상에 동일한 크기의 물방울에 의해 형성된 접촉각에 비해, 물방울(5 ㎕)의 접촉각을 20˚ 이상, 바람직하게는 25˚이상, 더 바람직하게는 30˚이상 증가시키는 특성(각각의 측정은 실온에서 이루어짐)을 갖는 것을 특징으로 하는 하이드로포빈을 사용한다.

C¹ 내지 C⁸로 표시되는 아미노산은 시스테인인 것이 바람직하나; 이들은 또한 유사한 부피의 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신으로 치환될 수도 있다. 그러나, C¹ 내지 C⁸ 위치 중 4개 이상, 바람직하게는 5개 이상, 더 바람직하게는 6개 이상, 특히 7개 이상이 시스테인으로 구성된다. 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 시스테인은 환원형으로 존재하거나 서로 디설파이드 가교 결합을 형성할 수 있다. 특히 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더 바람직하게는 3개, 가장 바람직하게는 4개의 분자내 디설파이드 가교 결합을 포함하는, C-C 가교 결합의 분자내 형성이 특히 바람직하다. 전술한 바와 같이 시스테인이 유사한 부피의 아미노산으로 치환되는 경우, 상기 C 위치가 쌍대 치환에 관여하는 것이 바람직한데, 그 이유는 서로 간에 분자내 디설파이드 가교 결합이 형성될 수 있기 때문이다.

시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌이 X로 표시된 위치에 이용될 경우, 상기 일반식에 있어서 개개의 C 위치의 넘버링은 그에 따라 변경될 수 있다.

하기 일반식 (II)의 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

X_n-C¹-X₃ _-25-C²-X₀ _-2-C³-X₅ _-50-C⁴-X₂ _-35-C⁵-X₂ _-15-C⁶-X₀ _-2-C⁷-X₃ _-35-C⁸-X_m (II)

상기 식에서, X, C와, X 다음에 표시된 지수는 각각 상기에 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 0∼300 범위의 수를 나타내며, 상기 단백질은 전술한 접촉각 변화가 추가 특징이고, 또한 C로 표시된 아미노산 중 적어도 6개는 시스테인이다. C로 표시된 아미노산 전부가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.

하기 일반식 (III)의 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

X_n-C¹-X₅ _-9-C²-C³-X₁₁ _-39-C⁴-X₂ _-23-C⁵-X₅ _-9-C⁶-C⁷-X₆ _-18-C⁸-X_m (III)

상기 식에서, X, C와, X 다음에 표시된 지수는 각각 상기에 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 0∼200 범위의 수를 나타내며, 상기 단백질은 전술한 접촉각 변화가 추가 특징이다.

잔기 X_n 및 X_m은 하이드로포빈에 자연적으로 연결될 수 있는 펩티드 서열일 수 있다. 그러나, 잔기 X_n 및 X_m 중 어느 하나 또는 둘 다 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 펩티드 서열일 수 있다. 이것은 또한, 하이드로포빈에 자연적으로 존재하는 펩티드 서열이 하이드로포빈에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장된 X_n 및/또는 X_m 잔기를 포함한다.

X_n 및/또는 X_m이 하이드로포빈에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열일 경우, 그러한 서열의 길이는 일반적으로 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 35개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 100개 이상의 아미노산이다. 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 이러한 유형의 잔기는 이하에서 융합 파트너 부분으로 칭해지기도 한다. 이것은 상기 단백질이 자연에서는 이러한 형태로 함께 존재하지 않는 융합 파트너 부분과 하이드로포빈 부분 1개로 구성된다는 사실을 분명하게 표현하기 위한 것이다.

상기 융합 파트너 부분은 다수의 단백질로부터 선택될 수 있다. 다수의 융합 파트너 부분을 하나의 하이드로포빈 부분에, 예를 들어 하이드로포빈 부분의 아미노 말단(X_n) 또는 카르복시 말단(X_m)에 연결시키는 것도 가능하다. 그러나, 예를 들어, 2개의 융합 파트너 부분을 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 한 위치(X_n 또는 X_m)에 연결시키는 것도 가능하다.

특히 적절한 융합 파트너 부분은 미생물, 특히 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 자연적으로 존재하는 단백질이다. 그러한 융합 파트너 부분의 예로는 서열 yaad(서열 번호 15 및 16), yaae(서열 번호 17 및 18) 및 티오레독신이 있다. 상기 서열의 단지 일부분, 바람직하게는 70%∼99%, 더 바람직하게는 80%∼98%를 포함하거나, 상기 서열과 비교하여 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변경된, 상기 서열의 단편 또는 유도체 역시 매우 적합하다(모든 %는 아미노산 수를 기준으로 한다).

본 발명에 따라 사용되는 단백질은, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 또는 예를 들어 글루타르알데히드에 의한 화학적 가교 결합에 의해 그 폴리펩티드 서열이 추가로 변형될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질의 특성 중 하나는 표면을 이 단백질로 코팅할 경우 표면 특성이 변화된다는 것이다. 표면 특성에 있어서의 변화는 표면을 단백질로 코팅하기 전과 후에 물방울의 접촉각을 측정하고 두 측정값 간의 차이를 측정하여 실험적으로 측정할 수 있다.

당업자라면 기본적으로 접촉각 측정 방법을 알고 있을 것이다. 접촉각 측정을 위한 정확한 실험 조건은 실험 부분에서 기술한다.

지금까지 알려진 하이드로포빈의 하이드로포빈 부분에 있어서의 극성 및 비극성 아미노산의 위치는 보존되어 있어서, 특징적인 소수성 플롯을 형성한다. 생물물리학적 특성 및 소수성에 있어서의 차이에 기인하여, 지금까지 알려진 하이드로포빈은 두 가지 부류, 즉 I형 및 II형으로 분류되어 있다(Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437).

I형 하이드로포빈의 조립된 막은 고온(예컨대, 80℃)에서 소듐 n-도데실 설페이트(SDS)의 1 중량% 수용액에서도 극도의 불용성을 나타내며, 진한 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 포름산을 사용해야만 다시 해리시킬 수 있다. 이와는 달리, II형 하이드로포빈의 조립형은 안정성이 더 적다. 이들은 단지 60 중량%의 에탄올 또는 1 중량%의 SDS(각각 물에서, 실온에서)를 사용해서 다시 용해시킬 수 있다.

아미노산 서열의 비교는 시스테인 C³과 시스테인 C⁴ 사이의 영역의 길이가 I형 하이드로포빈에서보다 II형 하이드로포빈에서 확실히 더 짧다는 사실을 보여준다. 또한, II형 하이드로포빈은 I형 하이드로포빈보다 하전된 아미노산을 더 많이 보유한다.

본 발명을 구현하는 데 있어서 특히 바람직한 하이드로포빈은 유형 dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2의 것이며, 이들은 하기 서열 목록에서 구조적 특징이 제시된다. 이들은 단지 그 일부분 또는 유도체일 수도 있다. 동일하거나 상이한 구조의 다수의 하이드로포빈, 바람직하게는 2개 또는 3개의 하이드로포빈을 서로, 또, 하이드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 적절한 해당 폴리펩티드 서열에 연결하는 것도 가능하다.

그 밖에도 본 발명을 실시함에 있어서 특히 적합한 것은 서열 번호 20, 22, 24에 제시된 폴리펩티드 서열을 가지는 융합 단백질과, 또한 이것을 코딩하는 핵산 서열, 구체적으로 서열 번호 19, 21, 23에 따른 서열이다. 특히 바람직한 실시형태는, 서열 번호 22, 22 또는 24에 제시된 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 전체 아미노산 중 1개 이상, 최대 10개, 바람직하게는 5개, 더 바람직하게는 5%가 치환, 삽입 또는 결실되어 있으나 여전히 출발 단백질의 생물학적 특성의 50% 이상을 보유하는 단백질을 더 포함한다. 본 명세서에서 본 발명에 따라 사용된 단백질의 생물학적 특성은 상기 접촉각의 변화가 20˚ 이상인 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따라 사용되는 단백질은 통상의 펩티드 합성 기법, 예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성법으로 화학적으로 제조할 수 있다.

천연 하이드로포빈은 적절한 방법을 이용하여 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 이에 관해서는 예를 들어 문헌[Woesten et al., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882를 참조할 수 있다.

바람직하게는 융합 단백질은, 융합 파트너를 코딩하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열과, 하이드로포빈 부분을 코딩하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열을 조합하여, 조합된 핵산 서열의 유전자 발현에 의해 숙주 유기체에서 원하는 단백질이 생성되도록 하는 유전 공학 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 제조 방법은 본 출원인의 선행 출원 DE 102005007480.4에 개시되어 있다.

전술한 제조 방법에 적합한 숙주 유기체 또는 생산 유기체로는 원핵 생물(고세균 포함) 또는 진핵 생물, 특히 호염성 박테리아 및 메탄 생성균(methanococci)을 비롯한 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포, 더 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzea), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 락토바실러스(lactobacilli), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), SF9(또는 관련 세포) 등을 들 수 있다.

본 발명에 유용한 하이드로포빈은, 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에, 본 발명에 따라 사용되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성체와, 또한, 상기 발현 구성체 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 더 포함한다.

사용된 발현 구성체는 특정 코딩 서열의 5'쪽 상류의 프로모터와 특정 코딩 서열의 3'쪽 하류의 종결 서열과, 또한 경우에 따라, 각각 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 통상적인 추가 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다.

"작동 가능한 연결(operative linkage)"이란 각각의 조절 요소가 코딩 서열을 발현하는 데 필요한 기능을 충족할 수 있도록, 프로모터, 코딩 서열, 종결 서열과, 경우에 따라, 추가 조절 요소가 순차적으로 배열되어 있는 것을 의미한다.

작동 가능하게 연결할 수 있는 서열의 예로는 표적화 서열과, 또 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등이 있다. 그 밖의 조절 요소는 선별 마커, 증폭 신호, 복제 기점 등을 포함한다. 적절한 조절 서열에 관해서는, 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.

상기 조절 서열 이외에도, 실제적 구조 유전자의 상류에 상기 서열의 천연 조절 요소가 존재할 수도 있으며, 경우에 따라, 천연 조절 요소가 차단되어 유전자의 발현이 증대될 수 있도록 천연 조절 요소를 유전적으로 변형시킬 수 있다.

바람직한 핵산 구성체는 또한 프로모터에 기능적으로 연결되어 있고 핵산 서열의 발현을 증대시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 전술한 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 조절 요소 또는 종결 서열 등의 유용한 추가 서열을 DNA 서열의 3' 말단에 삽입시킬 수도 있다.

핵산 서열은 1 카피 이상이 구성체 내에 존재할 수 있다. 상기 구성체는 또한, 경우에 따라 상기 구성체의 선별을 목적으로, 추가적인 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 영양 요구성 보완 유전자를 포함할 수 있다.

본 방법에 유용한 조절 서열은, 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, 람다-PR 또는 임람다-P 프로모터 등의 프로모터에 존재하며, 상기 프로모터는 그램 음성 박테리아에 유용하게 사용된다. 그 밖의 유용한 조절 서열은, 예를 들어 그램 양성 프로모터 amy 및 SP02, 효모 또는 진균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 존재한다.

조절을 위해 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다.

숙주 유기체에서 핵산 구성체를 발현시키기 위해, 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 파지에 핵산 구성체를 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는, 플라스미드 및 파지뿐 아니라 그 자체로서 공지되어 있는 다른 모든 벡터, 예를 들어 SV40, CMV, 배큘로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스, 트랜스포존, IS 엘리먼트, 파지미드, 코스미드 및 선형 또는 원형 DNA와, 또한 아그로박테리아 시스템을 더 포함한다.

이러한 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 또는 염색체를 통해 복제할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 추가 양태를 구성한다. 적절한 플라스미드의 예로는 이. 콜라이용 플라스미드, 즉 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스용 플라스미드, 즉 plJ101, plJ364, plJ702 또는 plJ361, 바실러스용 플라스미드, 즉 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리아용 플라스미드, 즉 pSA77 또는 pAJ667, 진균류용 플라스미드, 즉 pALS1, plL2 또는 pBB116, 효모용 플라스미드, 즉 2알파, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23, 또는 식물용 플라스미드, 즉 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이 있다. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드 중 선택된 일부에 해당된다. 그 밖의 플라스미드도 그 자체로서 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN　0 444 904018)]에서 찾아볼 수 있다.

핵산 구성체는, 존재하는 다른 유전자를 발현시키기 위해, 숙주 유기체 및 유전자(들)의 선택에 따라 최적 발현을 위해 선택되는, 발현 증대를 위한 3' 말단 및/또는 5' 말단의 조절 서열을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 조절 서열들은 유전자 및 단백질 발현이 특이적으로 일어나도록 하기 위한 것이다. 숙주 유기체에 따라, 이것은, 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과발현되는 것, 또는 유전자가 즉시 발현 및/또는 과발현되는 것을 의미할 수 있다.

도입된 유전자의 발현은 조절 서열 또는 인자에 의해 긍정적으로 영향을 받아서 증대될 수 있는 것이 바람직하다. 따라서 조절 요소는 프로모터 및/또는 인핸서 등의 강력한 전사 신호를 이용하여 전사 수준을 증대시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 이 외에도, 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증대시키는 것도 가능하다.

또 다른 형태의 벡터로서, 핵산 구성체 또는 핵산을 포함하는 벡터를 선형 DNA의 형태로 미생물에 도입하여 이종성 또는 상동성 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈으로 통합되도록 하는 것이 바람직할 수도 있다. 상기 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터로 구성되거나 핵산 구성체 또는 핵산으로만 구성될 수 있다.

유기체에서의 이종성 유전자의 최적 발현을 위해서는, 그 유기체에서 이용되는 특정 코돈 이용 방식에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 바람직하다. 코돈 이용 방식은 해당 유기체의 다른 공지 유전자의 컴퓨터 분석을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.

적절한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 종결 또는 폴리아데닐화 신호에 적절한 프로모터를 융합하여 발현 카세트를 제조한다. 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.　F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], 문헌[T. J. Silhavy, M.　L.　Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 문헌[Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기법을 상기 목적에 이용한다.

적절한 숙주 유기체에서의 발현을 위해서는, 재조합 핵산 구성체 또는 유전자 구성체를, 그 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주 특이적 벡터에 삽입시키는 것이 바람직하다. 벡터는 그 자체로 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]으로부터 정보를 입수할 수 있다.

벡터를 이용하여, 예를 들어 적어도 하나의 벡터로 형질전환되고 본 발명에 따라 사용되는 단백질의 제조에 이용될 수 있는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 전술한 재조합 구성체는 적절한 숙주 시스템에 도입하여 발현시키는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 상기 핵산이 특정 발현 시스템에서 발현되도록 하기 위해, 당업자에게 공지된 통상의 클로닝법 및 형질감염법, 예를 들어 공침전법, 원형질 융합법, 전기천공법, 레트로바이러스 형질감염법 등을 이용하는 것이 바람직하다. 적절한 시스템은, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.　Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997] 또는 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.

상동성 재조합 미생물을 제조하는 것도 가능하다. 이를 위해, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 유전자의 적어도 일부분, 또는 서열을 변형시키기 위해, 예를 들어 기능을 파괴하기 위해(넉아웃 벡터), 경우에 따라 하나 이상의 아미노산 결실, 아미노산 추가 또는 아미노산 치환이 도입된 코딩 서열의 적어도 일부분을 포함하는 벡터를 제조한다. 도입된 서열은, 예를 들어 관련 미생물 유래의 상동체이거나, 포유동물, 효모 또는 곤충 기원에서 유래된 것일 수도 있다. 대안으로, 상동성 재조합에 사용되는 벡터는, 상동성 재조합의 경우, 내인성 유전자가 돌연변이되거나 다른 방식으로 변경되지만, 여전히 기능성 단백질을 코딩하도록 디자인될 수 있다(예를 들어, 내인성 단백질의 발현이 변화되도록 상류 조절 영역을 변경할 수 있다). 본 발명에 따라 사용되는 유전자의 변경된 부분은 상동성 재조합 벡터 내에 존재한다. 상동성 재조합에 적합한 벡터의 구성에 대해서는, 예를 들어 문헌[Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503]에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 핵산 또는 핵산 구성체에 적합한 재조합 숙주 유기체는 기본적으로 어떠한 원핵 또는 진핵 유기체도 될 수 있다. 박테리아, 진균류 또는 효모 등의 미생물이 숙주 유기체로서 사용되는 것이 바람직하다. 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아, 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae) 과, 슈도모나스과(Pseudomonadaceae) 과, 리조비아(Rhizobiaceae) 과, 스트렙토마이세스(Streptomycetaceae) 과 또는 노카디아(Nocardiaceae) 과 박테리아를 사용하는 것이 바람직하고, 에스케리키아 속, 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 노카디아 속, 부르크홀더리아(Burkholderia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 아그로박테리아(Agrobacterium) 속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 박테리아를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

융합 단백질의 제조 방법에 사용되는 유기체는, 숙주 유기체에 따라, 당업자에게 공지된 방법으로 생육 또는 배양한다. 미생물은 통상, 일반적으로 당 형태의 탄소원, 일반적으로 유기 질소원 형태의 질소원, 예컨대 효모 추출물 또는 염(예컨대, 황산암모늄염, 미량 원소의 염, 예컨대 철염, 망간염 및 마그네슘염)과, 경우에 따라 비타민을 포함하는 액상 배지에서, 산소를 공급하면서, 0℃∼100℃, 바람직하게는 10℃∼60℃의 온도에서 배양한다. 이와 관련하여, 영양 배지액의 pH는 고정값으로 유지할 수 있으며, 즉, 배양 도중에 조절할 수 있고 조절하지 않을 수도 있다. 배양은 회분식, 반회분식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 영양분은 발효 초반부에 초기에 공급하거나 반연속식 또는 연속식으로 추후에 공급할 수 있다. 효소는 실시예에 기재된 방법으로 유기체로부터 분리하거나, 미정제 추출물로서 반응에 사용할 수 있다.

단백질 생산 미생물을 배양하고, 경우에 따라 단백질의 발현을 유도하며, 상기 단백질을 배양액으로부터 분리하여, 단백질 또는 생물학적 활성을 갖는 이의 기능성 단편을 재조합 방식으로 제조하는 방법 역시 적합하다. 단백질은 상기 방식으로 필요에 따라 산업적 규모로 제조할 수도 있다. 재조합 미생물은 공지의 방법으로 배양하고 발효시킬 수 있다. 박테리아는, 예를 들어 TB 배지 또는 LB 배지에서 온도 20∼40℃ 및 pH 6∼9에서 증폭시킬 수 있다. 적절한 배양 조건에 대해서는, 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세히 기재되어 있다.

단백질이 배양 배지로 분비되지 않는다면, 세포를 파괴하고, 공지된 단백질 분리 방법으로 용해물로부터 생성물을 얻는다. 세포는, 필요에 따라 고주파 초음파를 이용하거나, 예를 들어 프렌치(French) 압력 셀에서와 같이 고압을 이용하거나, 삼투압 분해를 이용하거나, 계면활성제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의하거나, 균질화기를 이용하거나, 또는 상기 방법 중 2 이상의 방법을 병용하여 파괴할 수 있다.

단백질은 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 예컨대 Q 세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피 등의 공지된 크로마토그래피법을 이용하고, 또한, 한외 여과, 결정화, 염석, 투석 및 네이티브(native) 겔 전기영동 등의 다른 통상적인 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어 문헌[Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York] 또는 문헌[Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.

cDNA를 특정 뉴클레오티드 서열만큼 연장함으로써, 변경된 폴리펩티드 또는 융합 단백질(이것은 예를 들어 정제를 간소화하는 데 이용됨)을 코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 재조합 단백질을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 유형의 적절한 변형의 예로는 앵커로서 작용하는 "태그", 예컨대 6-히스티딘 앵커로서 알려진 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인식될 수 있는 에피토프가 있다[참고 문헌: Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor(N.Y.) Press]. 적절한 다른 태그로는, 예를 들어 HA, 칼모듈린-BD, GST, MBD; 키틴-BD, 스트렙타비딘-BD-아비-태그, 플래그(Flag)-태그, T7 등이 있다. 이러한 앵커들은, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼에 패킹될 수 있거나 미량적정 평판 또는 다른 지지체 상에서 이용될 수 있는, 중합체 매트릭스 등의 고체 지지체에 단백질을 부착시키는 데 이용될 수 있다. 해당 정제 프로토콜은 시판되는 친화성 태그 공급업자로부터 입수할 수 있다.

전술한 바와 같이 제조된 단백질은 융합 단백질로서 바로 이용할 수 있거나, 또는 융합 파트너 부분을 절단 및 제거한 후, "순수한" 하이드로포빈으로서 이용할 수 있다.

융합 파트너 부분을 제거하고자 한다면, 하이드로포빈 부분과 융합 파트너 부분 간의 융합 단백질에 잠재적 절단 부위(프로테아제에 대한 특이적 인식 부위)를 포함시키는 것이 바람직하다. 적절한 절단 부위로는 특히, 생물정보학 도구를 이용하여 쉽게 결정할 수 있는 것과 같은, 하이드로포빈 부분에도 융합 파트너 부분에도 존재하지 않는 펩티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 메티오닌에 대한 BrCN 절단, 또는 Xa 인자, 엔테로키나제 절단, 트롬빈, TEV(담배 식각 바이러스 프로테아제) 절단을 이용한 프로테아제 매개 절단이 특히 적절하다.

본 발명에 따라 표면 코팅에 하이드로포빈을 이용할 경우, 하이드로포빈은 물질로 이용할 수 있다. 상기 하이드로포빈은 수성 제제로서 이용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 구현하기 위해 사용되는 하이드로포빈의 선택은 제한되지 않는다. 1종의 하이드로포빈 또는 다수의 상이한 하이드로포빈을 사용할 수 있다. 예를 들어, yaad-Xa-dewA-his(서열 번호 19) 또는 yaad-Xa-rodA-his(서열 번호 21)과 같은 융합 단백질을 사용하는 것도 가능하다.

전술한 바와 같이, 하이드로포빈은 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재의 표면을 코팅하기 위해 본 발명에 따라 사용된다.

전술한 바와 같은 하이드로포빈은, 예를 들어 에피클로로히드린과 같은 강한 알킬화 화합물 또는 DMDHEU와 같은 가교제를 사용할 필요 없이, 직물 기재 또는 가죽으로부터 선택된 섬유 기재의 표면을 코팅하기 위해 본 발명에 따라 사용된다.

본 발명은 또한 1종 이상의 하이드로포빈을 사용하여 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재를 코팅하는 방법을 제공한다. 하이드로포빈, 섬유 기재, 직물 기재 및 가죽과 또한 코팅 방법은 모두 상기 정의한 바와 같다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 코팅하고자 하는 섬유 기재를 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 1종 이상의 수성 제제, 바람직하게는 수성 염액(liquor)과 접촉시켜 수행된다.

상기 염액의 비는, 예를 들어 10:1 ~ 1,000:1의 범위, 바람직하게는 70:1 ~ 500:1의 범위일 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 코팅하고자 하는 섬유 기재를 배출 공정(exhaust process)에 의해 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 1종 이상의 수성 제제, 바람직하게는 수성 염액과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 코팅하고자 하는 섬유 기재를 패딩 공정에 의해 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 1종 이상의 수성 제제, 바람직하게는 수성 염액과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태는 섬유 기재, 특히 직물 기재를, 예를 들어 탱크에서 또는 바람직하게는 패드 맹글(pad mangle)을 이용하여 하이드로포빈과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태는 섬유 기재, 특히 직물 기재를 0℃ ~ 90℃ 범위, 바람직하게는 실온 ~ 85℃ 범위의 온도에서 하이드로포빈과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태는 섬유 기재, 특히 직물 기재를, 예를 들어 탱크에서 또는 바람직하게는 패드 맹글을 이용하여 하이드로포빈과 접촉시킨 후, 예를 들어 20℃ ~ 120℃ 범위의 온도에서 건조시키는 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태는 섬유 기재, 특히 직물 기재를, 예를 들어 탱크에서 또는 바람직하게는 패드 맹글을 이용하여 하이드로포빈과 접촉시킨 후, 예를 들어 20℃ ~ 120℃ 범위의 온도에서, 예를 들어 5초 ~ 15분, 바람직하게는 최대 5분 범위의 시간 동안 건조시키는 것을 포함한다. 적절한 건조 온도 범위는, 예를 들어 20℃ ~ 120℃, 바람직하게는 최대 105℃이다. 온도를 낮출수록 건조 시간은 더 길어지며, 그 역도 마찬가지다.

본 발명에 따라, 섬유 기재를 패드 맹글에 의해 하이드로포빈과 접촉시키기 위해, 예를 들어 도포 속도를 0.1 ~ 10 m/min, 바람직하게는 1 ~ 5 m/min의 범위로, 롤에 대해, 접촉 압력을 0.5 ~ 4 bar, 바람직하게는 1 ~ 3 bar의 범위로 선정하는 것이 가능하다.

본 발명의 일 실시형태는 섬유 기재, 특히 가죽을, 섬유 기재에, 예를 들어 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 수성 제제를 1회 이상 분무하여 도포함으로써 하이드로포빈과 접촉시키는 것을 포함한다.

수성 제제는, 예를 들어 1 ~ 24시간, 바람직하게는 12 ~ 17시간의 범위로 섬유 기재에 작용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 수성 제제는, 용매로서 물을 사용하거나, 또는 물과 수혼화성 유기 용매의 혼합물을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 수혼화성 유기 용매의 예로는 수혼화성 1가 또는 다가 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, n-프로판올, i-프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤을 들 수 있다. 이는 또한 에테르 알코올일 수 있다. 예로는 (폴리)에틸렌 또는 (폴리)프로필렌 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르의 모노알킬 에테르를 들 수 있다. 상기 수혼화성 유기 용매의 성질 및 양은 그 자체로 중요하지 않으며, 본 발명에 따라 사용된 수성 제제를 기준으로 하여, 예를 들어 1 중량% ~ 50 중량% 범위일 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용된 수성 제제는, 본 발명에 따라 사용된 수성 제제를 기준으로 하여, 무기염, 예를 들어 NaCl 0.1 ~ 5 중량%를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시형태는 강한 알킬화 화합물, 예컨대 에피클로로히드린을 사용하지 않고 본 발명의 방법을 수행하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 실시형태는 가교제, 예컨대 N,N-디메틸올-4,5-디히드록시에틸렌우레아(DMDHEU)를 사용하지 않고 본 발명의 방법을 수행하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용된 수성 제제, 바람직하게는 염액을 제조하기 위해, 합성된 그대로, 단리된 그대로 및/또는 정제된 그대로의 하이드로포빈 수용액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 이의 순도에 따라, 합성물에 기인한 보조제의 잔류물을 더 포함할 수 있다. 그러나, 또한, 예를 들어 동결 건조에 의해 물질로서 하이드로포빈을 초기에 단리하고 이를 단지 제2 단계에서 제제화하는 것도 물론 가능하다.

본 발명의 방법에 사용된 수성 제제 중 하이드로포빈의 요구 농도는 코팅하고자 하는 표면의 성질 및/또는 예정된 용도에 따라 결정될 수 있다. 그러나, 비교적 더 낮은 농도의 하이드로포빈도 의도된 효과를 실현하기에 충분할 것이다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 1종 이상의 하이드로포빈을 1 mg/l ~ 10 g/l로 포함하는 1종 이상의 수성 제제를 사용한다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에서 사용된 수성 제제 및 특히 염액은 pH가 3 ~ 9 범위, 바람직하게는 4 ~ 8 범위이다.

본 발명의 일 실시형태는 코팅하고자 하는 섬유 기재를 하이드로포빈과 접촉시키기 전에 전처리한 후에야 하이드로포빈과 접촉시키는 것을 포함한다.

전처리의 예는 몇 분 동안 물로, 바람직하게는 이온이 완전히 제거된 물로, 더 바람직하게는 5분 ~ 5시간 범위의 시간 동안 헹구는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 본 발명에 따라 코팅하고자 하는 섬유 기재 표면을 1종 이상의 활성 물질을 포함하는 또 다른 수성 제제와 접촉시켜 전처리하는 것을 포함한다. 활성 물질은 유기 화학 물질, 예를 들어 음이온, 양이온 또는 비이온 계면활성제, 또는 효소, 예컨대 프로테아제 또는 리파제로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 본 발명에 따라 코팅하고자 하는 섬유 기재를 표백하여 본 발명에 따라 전처리하는 것을 포함한다. 이 실시형태는 코팅하고자 하는 섬유 기재가 면 또는 면-합성 섬유 혼합물을 포함하는 경우에 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 수성 제제는 경우에 따라 추가 성분들, 예를 들어 첨가물 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분들의 예로는 산 또는 염기, 예를 들어 카르복실산 또는 암모니아, 완충제 시스템, 중합체, 무기 입자, 예컨대 SiO₂ 또는 실리케이트, 염료와 같은 착색제, 방향제 또는 살생물제를 포함한다. 첨가물의 또 다른 예는 DE-A　101　60　993에, 특히 섹션 [0074] 내지 [0131]에 기재되어 있다.

본 발명의 방법은 섬유 기재의 코팅 표면, 바람직하게는 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 방오 코팅을 포함하는 코팅된 직물 기재 또는 가죽을 제공한다.

코팅은 일반적으로 코팅 표면에 1 이상의 하이드로포빈 단분자층을 포함한다.

직물 기재 및 가죽으로부터 선택되며 본 발명에 따라 처리된 섬유 기재는 개선된 푹신한 촉감과 시각적으로 균일한 코팅을 가질 뿐만 아니라, 방오성이 있다.

오물은 통상 고체 및/또는 액체 물질에 의한 경질 표면의 바람직하지 않은 임의의 유형의 오염을 지칭한다. 오물의 예로는 지방, 오일, 단백질, 음식 찌꺼기, 먼지 또는 때를 포함한다. 오염은 또한 석회 퇴적물, 예를 들어 물의 경도로 인해 형성되는 마른 물자국을 포함할 수 있다. 그 밖의 예로는 개인 관리용 세정제 및 케어제의 잔류물 또는 물의 경도와 관련하여 상기 세정제 및 케어제로부터 형성될 수 있고, 예를 들어 직물 기재 또는 가죽과 같은 섬유 기재의 표면 상에 퇴적물을 형성할 수 있는 불용성 석회 비누의 잔류물을 포함한다.

방오 효과는 주로 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어 하이드로포빈으로 처리된 표면과 미처리 표면을, 물로 헹궈 오물이 분리될 가능성에 대해 비교함으로써 판단할 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 수성 제제는, 예를 들어 하나 이상의 하이드로포빈을 물 및/또는 하나 이상의 전술한 용매와 혼합하여 제조될 수 있다. 경우에 따라, 추가 성분들, 예를 들어 첨가제 및/또는 보조제가 첨가될 수 있는데, 이 경우 하이드로포빈 및 물, 경우에 따라 용매 및 경우에 따라 하나 이상의 추가 성분들이 첨가되는 순서는 중요하지 않다.

본 발명에 따른 제제는 일반적으로 강한 알킬화 화합물, 예컨대 에피클로로히드린 또는 가교제, 예컨대 DMDHEU를 포함하지 않으며, 분해 없이 장시간 동안 저장이 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 전술한 방법에 의해 코팅된 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재를 제공한다. 상기 섬유 기재는 뛰어난 방오성 뿐만 아니라, 우수한 세척력과 마찰 견뢰도를 보유하며, 또한 좋은 촉감을 보유한다. 이는, 예를 들어 가정용 직물, 예컨대 침장, 드레이프 및 커튼, 목욕 및 위생용 직물 및 또한 식탁보를 제조하는 데, 또한 실외용 직물, 예컨대 천막, 텐트, 보트 덮개, 트럭 방수천, 카브리올렛 지붕천을 제조하는 데, 특히 의류 제품, 예컨대 구두, 재킷, 코트, 바지, 풀오버, 스타킹, 벨트, 또한 가정용 직물, 예컨대 침장, 드레이프 및 커튼, 목욕 및 위생용 직물 및 또한 식탁보를 제조하는 데 유용하다. 본 발명에 따라 코팅된 가죽은 의류 제품, 예컨대 부츠를 제조하는 데, 또한 산업 용도의 가죽 제품을 제조하는 데 특히 유용하다.

이하에서는 하기 실시예를 통해 본 발명을 설명하고자 한다.

파트 　A:

본 발명에 따라 사용되는 하이드로포빈의 제조 및 테스트

실시예 1

yaad - His ₆ / yaaE - His ₆ 의 클로닝을 위한 예비 작업

올리고뉴클레오티드 Hal570 및 Hal571(Hal 572/Hal 573)을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 박테리아 바실러스 섭틸리스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 바실러스 섭틸리스 yaaD/yaaE 유전자의 코딩 서열과, 각각의 경우에 그 말단에 위치한 NcoI 및 BglII 제한 절단 부위를 포함하였다. 상기 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 퀴아젠으로부터 입수하여 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 BglII로 미리 선형화한 벡터 pQE60으로 클로닝하였다. 이와 같이 하여 얻은 벡터 pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5를 각각 YAAD::HIS₆ 및 YAAE::HIS₆로 구성된 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

실시예 2

yaad 하이드로포빈 DewA - His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 416 및 KaM 417을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 주형 DNA는 사상균 아스퍼질러스 니둘란스의 게놈 DNA였다. 얻어진 PCR 단편은 하이드로포빈 유전자 dewA의 코딩 서열 및 N-말단의 Xa 인자 프로테인아제 절단 부위를 포함하였다. 이 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여, 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 미리 선형화한 pQE60YAAD#2 벡터로 클로닝하였다.

이와 같이 하여 얻은 벡터 #508은 YAAD::Xa::dewA::HIS₆로 구성된 융합 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

실시예 3

yaad 하이드로포빈 RodA - His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 434 및 KaM 435를 이용하여, 플라스미드 #513을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

실시예 4

yaad 하이드로포빈 BASF1 - His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #507을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열 - 하이드로포빈 BASF1(첨부물 참조)이었다.

KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 5

yaad 하이드로포빈 BASF2 - His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #506을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 인공적으로 합성된 DNA 서열 - 하이드로포빈 BASF2(첨부물 참조)였다.

KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 6

yaad 하이드로포빈 SC3 - His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM464 및 KaM465를 이용하여, 플라스미드 #526을 플라 스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다. 이용된 주형 DNA는 스키조필럼 커뮨 cDNA(첨부물 참조)였다.

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

실시예 7

재조합 이. 콜라이 균주 yaad 하이드로포빈 DewA - His ₆ 의 발효

15 ㎖ 그라이너 튜브에서, LB 액상 배지 3 ㎖에, yaad 하이드로포빈 DewA-His₆를 발현하는 이. 콜라이 균주를 접종하였다. 37℃, 200 rpm의 진탕기에서 8 시간 동안 배양하였다. 각 경우, 배플이 구비되어 있고 LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유) 250 ㎖를 포함한 2개의 1 ℓ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에, 사전 배양물 1 ㎖를 접종하여, 37℃, 180 rpm의 진탕기에서 9 시간 동안 배양하였다. 20 ℓ 용량의 발효기에서, LB 배지(100 ㎍/㎖의 암피실린 함유) 13.5 ℓ에, 사전 배양물 0.5 ℓ(OD₆₀₀ _nm 1:10, H₂O에 대하여 측정)를 접종하였다. OD₆₀ _nm 약 3.5에서 100 mM IPTG 140 ㎖를 첨가하였다. 3 시간 후, 발효기를 10℃로 냉각시키고, 원심분리로 발효액을 제거하였다. 세포 펠릿을 추가 정제에 사용하였다.

실시예 8

재조합 하이드로포빈 융합 단백질의 정제

(C-말단 His ₆ 태그를 보유하는 하이드로포빈 융합 단백질의 정제)

세포 펠릿 100 g(하이드로포빈 100∼500 mg)에, 총 부피 200 ㎖가 되도록 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 재현탁시켰다. 이 현탁액을 울트라투락스(Ultraturrax) 타입 T25(Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik)로 10분 동안 처리하고, 이어서 핵산의 분해를 위해, 벤조나제(Merck, Darmstadt; 주문 번호 1.01697.0001) 500 유닛과 함께 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 파괴하기 전에, 유리 카트리지(P1)를 사용하여 여과를 행하였다. 세포 파괴와 잔류 게놈 DNA의 전단을 위해, 1500　바에서 균질화기를 이용한 처리를 2회 행하였다(Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). 균질물을 원심분리하고(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000　g), 상청액을 얼음 위에 놓고, 펠릿을 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 100 ㎖에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁은 3회 반복하였으며, 3 회차에 사용된 인산나트륨 완충액은 1% SDS를 포함하였다. 재현탁 후, 상기 용액을 1 시간 동안 교반하고, 이어서 최종 원심분리(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g)를 행하였다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 하이드로포빈은 최종 원심분리 후 상청액에 존재하였다(도 1). 이 실험은 하이드로포빈이 해당 이. 콜라이 세포 내에 아마도 봉입체 형태로 존재함을 보여준다. 하이드로포빈 함유 상청액 50 ㎖를, 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 50　㎖ 니켈-세파로스 고성능 17-5268-02 컬럼(Amersham)에 적용하였다. 이 컬럼을 50　mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 세척하고, 그 후 하이드로포빈을 200 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 용출시켰다. 이미다졸의 제거를 위해, 용액을 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)에 대해 투석하였다.

도 1은 그와 같이 제조된 하이드로포빈 HP1의 정제 상태를 도시한다:

레인 1: 니켈-세파로스 컬럼에 적용된 용액(1:10 희석)

레인 2: 통과액(flow-through) = 세척 단계의 용출액

레인 3∼5: 용출 분획의 OD₂₈₀ 피크

도 1의 하이드로포빈은 분자량이 약 53 kD이었다. 작은 밴드 중 몇 개는 하이드로포빈의 분해 생성물을 나타낸다.

실시예 9

성능 테스트: 유리 위 물방울의 접촉각 변화에 의한 하이드로포빈 HP1 의 특성 분석

기재:

유리(창문 유리, 독일 만하임 소재의 Sueddeutsche Glas):

하이드로포빈 농도: 100 ㎍/㎖

50 mM 아세트산나트륨(pH 4) + 0.1 중량%의 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 수용액 중에서, 유리 슬라이드를 15시간 동안 항온 처리하고(온도 80℃), 이어서 코팅하고 증류수로 세척하며, 이어서 80℃의 1 중량% n-도데실 황산나트륨(SDS) 수용액 중에서 10분 동안 항온처리한 후 증류수로 세척하였다.

이렇게 하여 수득가능한 샘플을 (실온에서) 공기 건조시키고, 실온에서 5 ㎕ 물방울의 접촉각(단위: ˚)을 측정하였다.

접촉각 측정은 Dataphysics Contact Angle System OCA 15+에서 소프트웨어 SCA 20.2.0.(2002년 11월)을 사용하여 행하였다. 측정은 제조업자의 설명서에 따라 행하였다.

미처리 유리의 경우 접촉각이 30±5˚였고, 실시예 8의 기능성 하이드로포빈(yaad-dewA-his₆)으로 코팅된 유리의 경우 접촉각이 67±5˚였다.

파트 B:

섬유 기재 표면을 코팅하기 위한 하이드로포빈 HP1 의 용도

수중 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조된 하이드로포빈(융합 단백질) HP1 (yaad-Xa-dewA-his)(서열 번호 19)의 용액을 용도 테스트에서 이용하였다. 용액 중 하이드로포빈 HP1의 농도는 100　mg/l(0.02 중량%)였다.

B.1 본 발명에 의한 직물 기재의 코팅:

백색 폴리에스테르 직물(평량 226 g/m²)을 이온이 완전히 제거된 물로 45분 동안 먼저 헹군 후, 0.02 중량% HP1 수용액에 침지하여 80℃에서 17시간 동안 처리하였다. 이어서, 이와 같이 처리된 폴리에스테르 직물을 완전히 이온이 제거된 물로 1분 동안 헹구고 실온에서 건조시켜 본 발명에 따라 처리된 기재 PES-HP1을 얻었다. 이는 매우 좋은 촉감을 보유하였다.

B.2 본 발명에 의한 직물 기재의 코팅:

상기 처리를 80℃가 아닌 실온에서 수행하는 것을 제외하고는 B.1을 반복하였다.

본 발명에 따라 처리된 기재 PES-HP2를 얻었다. 이는 매우 좋은 촉감을 보유 하였다.

사용된 오물:

테스트용 오물로서 하기의 것을 사용하였다:

트리올레인

립스틱

사용된 엔진 오일

본 발명에 따라 처리된 다수의 기재 PES-HP1에 전술한 오물 중 1종을 dm²당 오물 약 0.1 g으로 사용하여 18시간 동안 각각 오염시켰다.

테스트 세척 조성물의 제조 및 본 발명의 PES-HP1의 세척

하기 성분들을 함께 혼합하여 테스트 세척 조성물 1을 얻었다:

나트륨 n-도데실벤젠술포네이트 5 g

몰당 평균 7 당량의 산화에틸렌으로 에톡시화된 C₁₃-C₁₅ 옥소 공정 알코올 혼합물 5 g

NaOH(pH 7.9, M_w 70,000 g/mol)로 중화시킨, 40 중량% 아크릴산(70 중량%)과 말레산(30 중량%)의 랜덤 공중합체 수용액 5.8 g

염석 비누 1.4 g

Tylose CR 1500 p 카르복시메틸셀룰로스 1.2 g

Na₂CO₃ 14 g

제올라이트 A 30 g

과붕산나트륨 사수화물 21 g

테트라나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트 6 g

메타규산나트륨 오수화물 3.6 g

Na₂SO₄ 7 g.

본 발명에 따라 처리한 후 오염시킨 PES-HP1 샘플을, 3회의 전세척 사이클과 1회의 주 세척 사이클을 이용하여, 미국 Atlas사의 Launder-O-Meter에서 세척하였다. 사용된 물은 경도 3 mmol/l(Ca : Mg : HCO₃ 4:1:8), 액비 12.5:1, 테스트 세척 조성물 1/l의 투여량 4.5 g, 수온 40℃였다. 총 세척 시간은 30분으로 하였다.

트리올레인과 엔진 오일 오염은 완전히 제거되었고, 립스틱 찌꺼기는 확대경 하에서만 눈에 보일 정도의 극히 적은 양만 남았다.

DNA 및 폴리펩티드 서열의 서열명을 표시한 서열 목록

dewA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 1
dewA 폴리펩티드 서열	서열 번호 2
rodA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 3
rodA 폴리펩티드 서열	서열 번호 4
hypA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 5
hypA 폴리펩티드 서열	서열 번호 6
hypB DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 7
hypB 폴리펩티드 서열	서열 번호 8
sc3 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 9
sc3 폴리펩티드 서열	서열 번호 10
basf1 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 11
basf1 폴리펩티드 서열	서열 번호 12
basf2 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 13
basf2 폴리펩티드 서열	서열 번호 14
yaad DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 15
yaad 폴리펩티드 서열	서열 번호 16
yaae DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 17
yaae 폴리펩티드 서열	서열 번호 18
yaad-Xa-dewA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 19
yaad-Xa-dewA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 20
yaad-Xa-rodA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 21
yaad-Xa-rodA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 22
yaad-Xa-basf1-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호 23
yaad-Xa-basf1-his 폴리펩티드 서열	서열 번호 24

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Recombinant preparation of hydrophobins <130> AE 20040837 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 405 <212> DNA <213> basf-dewA <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> <400> 1 atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt 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100 105 110 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 3 <211> 471 <212> DNA <213> basf-rodA <220> <221> CDS <222> (1)..(471) <223> <400> 3 atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288 Gly Leu 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Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> basf-HypB <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> <400> 7 atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48 Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96 Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144 His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192 Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80 atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288 Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 95 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Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His 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ttg ccg ggc ggt 144 Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45 gag agc acg acg atg cgc cgt ttg atc gat acg tat caa ttc atg gag 192 Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu 50 55 60 ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80 gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288 Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 95 cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 100 105 110 cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384 Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu 115 120 125 cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432 Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly 130 135 140 gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt 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432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct 960 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc 1008 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag 1056 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 cac 1395 His 465 <210> 22 <211> 465 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-rodA-his <400> 22 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 His 465 <210> 23 <211> 1407 <212> DNA <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <223> <400> 23 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg 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gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag 1248 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 1296 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat 1392 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 cac cat cac cat cac 1407 His His His His His 465 <210> 24 <211> 469 <212> PRT <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <400> 24 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu 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Claims

1종 이상의 하이드로포빈을 사용하여 직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재를 코팅하는 방법.

제1항에 있어서, 섬유 재료를 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 1종 이상의 수성 제제와 접촉시키는 것인 방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 패드 맹글(pad mangle)에서 수행되는 방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1 mg/l ~ 10 g/l의 범위로 1종 이상의 하이드로포빈을 포함하는 1종 이상의 수성 제제를 사용하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 기재를 전처리한 후 하이드로포빈과 접촉시키는 것인 방법.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유 기재를 하이드로포빈과 접촉시킨 후, 20 ~ 120℃ 범위의 온도에서 건조시키는 것인 방법.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 코팅된 섬유 기재.

제7항에 따른 하나 이상의 섬유 기재를 사용하여 제조된, 의류용 또는 산업용 가죽 제품, 산업용 직물, 가정용 직물, 의복.

직물 기재 및 가죽으로부터 선택된 섬유 기재의 표면을 코팅하기 위한 하이드로포빈의 용도.