KR20080010402A - 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는고도의 다공질 중합체 물질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공유 그래프팅된 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 (a) 소적 상 및 연속 상을 포함하고 단량체를 함유하는 유화액 조성물을 제조하는 단계, (b) 유화액을 경화시키는 단계, 및 (c) 물/소적 상을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 분자 종에 그래프팅할 수 있는 작용성 단량체를 포함하는 고도의 다공질 물질의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 (i) 고도의 다공질 물질을 적합한 용매 매질중 생물학적 활성 종의 용액에 노출시키는 단계, (ii) 활성화제를 선택적으로 첨가하는 단계, (iii) 선택적으로 가열하는 단계, (iv) 다공질 물질을 용매 매질로 세정하여 그래프팅되지 않은 종을 제거하는 단계를 포함하는, 고도의 다공질 중합체 물질에 생물학적 활성 분자 종을 그래프팅하는 방법에 관한 것이다. 공유 그래프팅된 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질은, 예컨대 이종성 촉매로서, 바이오센서에, 크로마토그래피를 위해, 생물의학 장치 및 임플란트에 사용될 수 있다.

Description

공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질{HIGHLY POROUS POLYMERIC MATERIALS COMPRISING BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES VIA COVALENT GRAFTING}
본 발명은 다공질 물질에 결합된 생물학적 활성 분자 종(biologically active molecular species)을 포함하는 고도의 다공질 물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 활성 분자를 공유적으로 그래프팅할 수 있는 고도의 다공질 물질을 제조하는 방법, 및 다공질 물질에 상기 생물학적 활성 분자를 그래프팅하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 물질을 이종성 촉매, 바이오센서(biosensor), 크로마토그래피, 생물의학 장치 및 임플란트(implant)에 적용함에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명에 따라 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 물질에 기초한 임의의 생물학적 및 생화학적 활성 장치에 관한 것이다.
생물학적 활성 분자 종, 예컨대 효소는 이전부터 소수성-소수성 상호작용에 의해 소수성 다공질 중합체 물질상에 고정화되어 왔다(러켄스타인(E. Ruckenstein) 및 왕(X. Wang)의 문헌[Biotech, and Bioeng., Vol 42 pg 821 (1993)]). 이러한 물리적 흡착(physisorption)은 비공유적이고, 생물학적 활성 분자 종(효소)은 그의 활성 일부를 보유하지만, 물리적 흡착의 성질은 생물학적 활성 분자 종이 중합체 지지체로부터 제거되어(걸러져서) 시스템의 활성이 후속적인 재사용에 의해 떨어지도록 한다. 이는 또한 효소가 중합체 비이드상에 비-공유적 물리적 흡착 과정을 통해 고정화된 시판용 시스템, 예컨대 노보자임(Novozyme) 435의 경우에 보여질 수 있다.
생물학적 활성 분자 종은 또한 중합체 상으로, 예를 들면 아가로즈의 유도체상으로 공유적으로 고정화되어 왔다(프로스트(R. G. Frost) 등의 문헌[Biochimica et Biophysica Acta, 670, pg 163, (1981)]). 이는 생물학적 또는 생화학적 활성의 보유를 유도할 수 있다. 그러나, 이들 시스템은 비-다공질이거나 매우 점성의 중합체 겔이고, 생물-촉매작용 과정에서 반응물로 의도되거나 상기 고정화된 생물학적 활성 분자 종과 상호작용하는 화합물의 분산이 심각하게 방해된다.
따라서, 생물학적 활성 분자 종이 고체 지지체의 표면으로부터 걸러지지 않아 생물학적 또는 생화학적 활성의 손실을 유도하는 안정성 문제를 일으키지 않도록, 생물학적 활성 분자 종, 예를 들면 단백질 및 효소를 고체 지지체에 고정화시키는 효과적인 방법이 여전히 요구되고 있다. 추가로, 고체 지지체 물질이 가능한한 다공질이면서 동시에 고정화, 및 후속적인 생물학적 및 생화학적 작용에 이용될 수 있도록 가능한한 넓은 표면적을 갖게 하기 위해 기계적 완전성(integrity)을 유 지하는 것이 또한 요망된다. 더욱이, 높은 공극률은, 생물학적 활성 분자 종이 상호작용하거나, 반응하거나, 반응을 유발하도록 의도되는 화합물의 액체 흐름에 고정화된 효소가 노출되는 적용분야에 유리할 것이다.
놀랍게도, 고정화된 생물학적 활성 분자 종의 우수한 활성 및 안정성은 상기 종을 고도의 다공질 중합체 지지체에 공유 그래프팅을 통해 고정화시킴으로써 달성될 수 있음이 밝혀졌다. 상기 방식에서, 생물학적 활성 분자 종은 공유 분자 결합에 의해 고도의 다공질 중합체 지지체에 결합되고, 따라서 상기 물질은 그래프팅된다. 일단 이러한 방식으로 그래프팅되면, 생물학적 활성 분자 종은 일종의 분해반응 없이는 지지체로부터 더이상 제거되지 않고, 따라서 그의 생물학적 활성을 보유한다.
또한 본 발명은 a. 소적 상 및 연속 상을 포함하고 단량체를 함유하는 유화액 조성물을 제조하는 단계, b. 유화액을 경화시키는 단계, 및 c. 물/소적 상을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 상기 생물학적 활성 분자 종에 그래프팅할 수 있는 작용성 단량체를 포함하는 고도의 다공질 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
단량체와 별도로, 유화액 조성물은 또한 가교결합 단량체, 작용성 단량체, 중합 개시제, 계면활성제 및 물을 함유할 수 있다.
유화액의 경화는, 예를 들면 열적으로 또는 광-화학적으로 수행될 수 있다.
물/소적 상의 제거는 유리하게는, 예를 들면 증발, 동결-건조, 흡인하의 여과에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 a. A) 5 내지 95중량%의 작용성 단량체, B) 5 내지 80중량%의 가교결합 단량체, C) 0 내지 10중량%의 중합 개시제, D) 0 내지 20중량%의 계면활성제, E) 0 내지 90중량%의, 작용성 또는 가교결합 단량체 이외의 단량체(여기서, 중량 백분율은 A, B, C, D 및 E의 총 중량에 대한 것임), 및 F) 74 내지 93 부피%의, 소적 상을 구성하는 액체 또는 액체 조성물(여기서, 부피%는 A, B, C, D 및 E를 포함하는 연속 상, 및 소적 상의 총 부피에 대한 것임)을 포함하는 조성물로부터의, 소적 상 및 연속 상으로 이루어진 유화액을 제조하는 단계, b. 유화액을 경화시키는 단계, 및 c. 물/소적 상을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 분자 종을 공유적으로 그래프팅할 수 있는 고도의 다공질 중합체 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, 고도의 다공질 중합체 물질이라는 용어는 총 공극 부피에 있어서 74% 보다 큰 공극률을 갖는 임의의 중합체 물질을 지칭한다. 특히, 이러한 물질은 고 내부 상 유화액(High Internal Phase Emulsions: HIPE)의 중합에 의해 제조될 수 있고, 중합된 것은 당분야에 폴리-HIPE로서 공지되어 있다(바비(D. Barby) 및 하크( Z. Haq)의 문헌[Eur. Pat. Appl. 60138, 1982]). 상기 기재된 방법으로부터 생성된 고도의 다공질 물질은 단일체(monolithic) 물질이고, 즉 상기 방법에 의해 1조각의 물질이 생성된다. 대조적으로, 생물학적 활성 종이 그래프팅되어 있는 공지의 중합체 물질은 일반적으로 비이드(bead) 또는 그레인(grain)의 형태이다.
본 발명의 제 1 방법은 다양한 단량체를 포함하는 적합한 유화액 조성물을 제조하는 단계 및 후속적으로 단량체 상을 경화시키거나 가교결합하는 단계를 포함한다.
폴리-HIPE는 고 내부 상(HIPE)의 중합으로부터 생성된다. HIPE는 소적 상이 총 부피의 74% 보다 많이 차지하는 유화액이다(리산트(KJ. Lissant)(편집)의 문헌[Emulsions and Emulsion Technology Part 1, Marcel Dekker, New York, 1974, chapter 1]). HIPE의 경우 연속 상은, 중합될 수 있으며 전형적인 셀 구조를 폴리-HIPE에 제공하는 단량체를 함유한다. 중합체의 수축은 유화액 소적 구조에 기인하여 거시적 수준에서 발생할 수 없다. 그 결과로서, 수축은 소적 사이의 연속 상에서 발생하고 상호연결 윈도우가 셀 벽에 나타남으로써, 폴리-HIPE가 액체 및 기체 매질을 완전히 투과할 수 있고 이에 따라 그의 단일체 형태로 유동 통과(flow-through) 적용시 이용가능하도록 한다.
2가지 유형의 폴리-HIPE가 존재하고, 가장 흔한 것은 역 유화액("유중수적형(water in oil)" 유화액으로 지칭됨)으로부터 제조된 것이고 나머지는 정상 유화액("수중유적형(oil in water)" 유화액)으로부터 제조된다.
역 유화액으로부터 제조된 폴리-HIPE중 연속 상은 단량체, 바람직하게는 소수성 단량체, 가장 바람직하게는 소적 상과 혼화되지 않는 단량체를 함유하는 상이다. 본 발명의 실시예에 기재된 스타이렌 및 아크릴레이트-기제 폴리-HIPE는 이러한 유형의 폴리-HIPE에 속한다. 가교결합제로서 지칭되는, 중합가능한 잔기를 1개 보다 더 많이 갖는 1종 이상의 단량체가 사용되어야 한다. 소적 상과 혼화되는 단량체가 이용될 수 있지만, 이들의 소적 상에서의 부분적 용해로 인해 완전히 중합되지 않을 수 있다. 연속 상은 1종 이상의 계면활성제, 바람직하게는 비-이온성 계면활성제를 함유하여 유화액의 안정성을 향상시킨다. 연속 상은 1종 이상의 중합될 수 없는 종, 바람직하게는 소적 상과 혼화되지 않는 화학물질, 가장 바람직하게는 소수성 용매(종종 포로겐(porogen)으로 지칭됨)를 함유할 수 있는데, 이는 거친 성질을 더해주고 개방-셀 구조에 보다 많은 공극을 생성함으로써 폴리-HIPE의 표면적을 증가시키기 위해 사용되기 때문이다(하인니(P. Hainey), 훅삼(I. M. Huxham), 로와트(B. Rowatt), 쉐링턴(D. C. Sherrington), 및 테틀리(L. Tetley)의 문헌[Macromolecules, 1991, 24, 117]; 바르베타(A. Barbetta) 및 카메론(N. R. Cameron)의 문헌[Macromolecules, 2004, 37, 3202]).
역 유화액으로부터 제조된 폴리-HIPE중의 소적 상은 친수성 액체 매질, 바람직하게는 친수성 용매, 가장 바람직하게는 물이다. 이는 연속 상, 광-개시제 또는 이들 둘다와의 혼화성을 감소시킴으로써 유화액을 안정화시킬 목적의 염 또는 화학물질을 함유할 수 있지만, 이들은 연속 상 뿐만 아니라 두 상 모두에 함유될 수 있다. 이는 최종적으로 연속 상과의 계면에서 부분적으로 중합될 수 있는 1종 이상의 단량체, 바람직하게는 연속 상에도 존재하는 단량체를 함유할 수 있다.
정상 유화액으로부터 제조된 폴리-HIPE중의 연속 상은 단량체, 바람직하게는 친수성 단량체, 가장 바람직하게는 소적 상과 혼화되지 않는 단량체를 함유하는 상이다. 일예는 아릴 에터 설폰 잔기로 종결된 매크로단량체(macromonomer)이다. 1개 보다 많은 중합가능한 잔기(가교결합기로 지칭됨)를 갖는 1종 이상의 단량체가 사용되어야 한다. 소적 상과 혼화되는 단량체가 이용될 수 있지만, 소적 상에서의 이의 부분적인 용해에 기인하여 완전히 중합되지는 않을 것이다. 연속 상은 유화액 안정성을 향상시키기 위해 1종 이상의 계면활성제, 바람직하게는 이온성 계면활성제를 함유한다. 연속 상은 1종 이상의 중합될 수 없는 종, 바람직하게는 소적 상과 혼화되지 않는 화학물질, 가장 바람직하게는 친수성 용매, 예컨대 물(종종 포로겐으로 지칭됨)을 함유할 수 있는데, 이는 거친 성질을 더해주고 개방-셀 구조에 보다 많은 공극을 생성함으로써 폴리-HIPE의 표면적을 증가시키기 위해 사용되기 때문이다.
정상 유화액으로부터 제조된 폴리-HIPE에서 소적 상은 소수성 액체 매질, 바람직하게는 소수성 용매이다. 이의 예는 석유 에터, 헥산, 및 초임계 이산화탄소이다. 이는 연속 상과의 혼화성을 감소시킴으로써 유화액을 안정화시킬 목적의 화학물질을 함유할 수 있다. 이는 1종 이상의 개시제, 예컨대 유리 라디칼 개시제 또는 광-개시제, 또는 이들 둘다의 혼합물을 함유할 수 있지만, 이들은 연속 상 뿐만 아니라 두 상 모두에 포함될 수 있다. 이는 최종적으로 연속 상의 계면에서 부분적으로 중합될 수 있는 1종 이상의 단량체, 바람직하게는 연속 상에도 존재하는 단량체를 함유할 수 있다.
HIPE는 단일체가 건조시 붕괴되지 않는 한 소적 상의 제거후 74% 이상 다공질인 중합체를 수득하는, 소적 상에 대한 이들의 높은 부피 비(74% 이상)로 정의된다. 99%의 공극률을 갖는 폴리-HIPE의 예가 존재한다(에스퀘나(J. Esquena), 생커(G. S. R. R. Sankar), 및 솔란(C. Solans)의 문헌[Langmuir, 2003, 19, 2983.]). 이러한 물질은 셀을 상호연결시키는 윈도우에 기인하여 단일체 형태하에 액체 매질 및 기체에 매우 투과성이다.
원칙적으로, 반응시 중합체 물질을 형성하는 임의의 분자는 본 발명에 따른 단량체로서 사용될 수 있다. 고 내부 상 유화액의 연속 상에서 가용성인 단량체를 선택하는 것이 유일하게 중요하다. 유기 상이 연속 상인 HIPE의 유중수적형 오일의 경우, 이러한 단량체는 바람직하게는 유기 상에서 가용성이고 물에서 불용성이어야 한다. 수중유적형 HIPE에 대해 반대 사항이 적용된다.
가교결합 단량체는 그의 작용기가 중합동안에 2개 이상의 중합체 쇄 사이에 가교결합을 형성하여 가교결합된 망상구조를 형성하도록 하는 단량체이어야 한다. 이러한 가교결합 단량체의 선택은 상기 기재된 단량체에 대한 경우와 마찬가지로 연속 상에서의 용해도에 기초해야 한다.
본 발명과 관련하여, 작용성 단량체는 중합에 참여할 수 있는 1종 이상의 화학 잔기, 및 제 2 단계에서 생물학적 활성 분자 종과 반응하여 생물학적 활성 분자 종을 중합체 물질에 그래프팅시키는 1종 이상의 다른 화학 잔기를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 그래프팅할 수 있는 화학 잔기는, 생물학적 활성 분자 종을 그래프팅할 수 있는 다른 분자와 중간 단계에서 반응할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 가교결합 단량체 및 작용성 단량체 둘다인 단량체가 사용된다. 따라서, 이러한 단량체는 2종 이상, 바람직하게는 3개의 중합가능한 기, 및 생물학적 활성 종과 반응할 수 있는 화학 잔기를 포함한다. 이러한 단량체는 상기 언급된 성분 A, B, C, D 및 E의 총 중량에 대하여 5 내지 95중량%의 양으로 사용될 수 있다.
이는 화학식 1a) P-G(여기서, P는 중합에 관여하는 화학 잔기를 나타내고 G는 후속적으로 생물학적 활성 분자 종을 직접적으로 또는 간접적으로 그래프팅하기 위해 사용되는 화학 잔기임), 또는 다르게는 화학식 1c) P-X-G(여기서, P 및 G는 상기 기재된 바와 같고, X는 임의의 스페이서 기를 나타내고, 여기서 스페이서 기는 친수성이거나 소수성일 수 있음)로 표시될 수 있다. 예로는 알킬-, 퍼플루오로알킬, 에틸렌글리콜 또는 다른 올리고-에터가 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 작용성 단량체는 활성 에스터 기, 가장 바람직하게는 하기 화학식 2의, n-하이드록시 석신이미드에 기초한 활성화된 에스터 기를 함유한다:
Figure 112007078375630-PCT00001
생물학적 활성 분자 종을 그래프팅하기 위해 사용될 수 있는 작용기의 다른 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 말레이미드, 티올, 아이소티오시아네이트, 요오도아세트아미드, 2-피리딜 유도체, 아자이드, 옥심, 에폭사이드, 아이소시아네이트 및 알데하이드가 포함된다.
이들 작용성 단량체의 선택은 또한 부분적으로는, 상기 기재된 바와 같이 단량체 및 가교결합 단량체의 경우에서처럼, 단량체 상에서의 이들의 용해도에 기초 해야 한다.
하기 화학식 3에 개략적으로 도시된 바와 같이 n-하이드록시석신이미드-기제 단량체의 P 및 G의 기 사이에 스페이서 기를 도입하는 것이 가능하다.
Figure 112007078375630-PCT00002
이러한 방식으로, 소수성은 비제한적으로 3개 이상의 메틸렌 기의 알킬 쇄 등으로 이루어진 스페이서 기(X)를 선택함으로써 조정될 수 있다. 추가로, 친수성은 비제한적으로 다양한 길이의 n(CH2CH2O)n의 에틸렌 옥사이드 단위와 같은 본래 친수성인 스페이서 기(X)를 선택함으로써 조정될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 단량체, 가교결합 단량체 및 작용성 단량체는 비닐계 불포화기를 함유하고, 바람직하게는 스타이렌계, 보다 바람직하게는 메트아크릴계, 가장 바람직하게는 아크릴계이다.
본 발명에 따라 사용된 개시제는 수용성 또는 유기 가용성일 수 있고, 전체적으로 양쪽 상중 하나에, 또는 상들 사이에 분배되어 첨가될 수 있고, 유화액 형성 이전, 도중 또는 이후에 첨가될 수 있다.
1종 이상의 개시제 또는 개시제 부분이 조합되어 사용된다면, 이들은 필요에 따라 함께 또는 별도로 첨가될 수 있다. 개시제는 광개시제 및/또는 열 개시제 및/또는 산화환원 반응 개시제일 수 있다.
개시제는 단량체를 중합하기에 효과적인 양으로 존재해야 한다. 전형적으로, 개시제는 총 연속 상을 기초로 약 0.005 내지 약 20중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 15중량%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10중량%의 양으로 존재해야 한다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 개시제는, 예를 들면 광개시제 또는 열 개시제일 수 있다.
광개시제는 제한되지 않지만 하기 예들을 포함한다: 아세토페논, 아니소인, 안트라퀴논, 안트라퀴논-2-설폰산, 나트륨 염, 트라이카보닐크로뮴, 벤질, 벤조인, 벤조인 에틸 에터, 벤조인 아이소부틸 에터, 벤조인 메틸 에터, 벤조페논, 벤조페논/1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 50/50 블렌드, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카복실산 이무수물, 1,4-벤조일바이페닐, 2-벤질-2-(다이메틸아미노)-4'-모폴리노부티로페논, 4,4'-비스(다이에틸아미노)벤조페논, 4,4'-비스(다이메틸아미노)벤조페논, 3-캄포퀴논, 2-클로로티오잔텐-9-온, (큐멘)사이클로펜타디에닐철(II), 헥사플루오로포스페이트, 다이벤조수베레논, 다이에톡시아세토페논, 4,4'-다이하이드록시벤조페논, 2,2-다이메톡시-2-페닐아세토페논, 4-(다이메틸아미노)벤조페논, 4,4'-다이메틸벤질, 2,5-다이메틸벤조페논, 3,4-다이메틸벤조페논, 다이페닐(2,4,6-트라이메틸벤조일)포스핀 옥사이드/2-하이드록시-2-메틸프로피오페논, 50/50 블렌드, 4'-에톡시아세토페논, 2-에틸안트라퀴논, 페로센, 3'-하이드록시아세토페논, 4'-하이드록시아세토페논, 3-하이드록시벤조페논, 4-하이드록시벤조페논, 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논, 2-메 틸벤조페논, 3-메틸벤조페논, 메틸벤조일포메이트, 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-모폴리노프로피오페논, 페난트렌퀴논, 4'-페녹시아세토페논, 티오잔텐-9-온, 트라이아릴설포늄 헥사플루오로안티모네이트 염, 트라이아릴설포늄 헥사플루오로포스페이트 염.
열 개시제는 제한되지 않지만 하기 예들을 포함한다: 3급-아밀 퍼옥시벤조에이트, 4,4-아조비스(4-시아노발레산), 1,1'-아조비스(사이클로헥산카보나이트릴), 2,2'-아조비스아이소부티로나이트릴(AIBN), 벤조일 퍼옥사이드, 2,2-비스(3급-부틸퍼옥시)부탄, 1,1-비스(3급-부틸퍼옥시)사이클로헥산, 2,5-비스(3급-부틸퍼옥시)-2,5-다이메틸헥산, 2,5-비스(3급-부틸퍼옥시),2,5-다이메틸-3-헥신, 비스(1-(3급-부틸퍼옥시)-1-메틸에틸)벤젠, 1,1-비스(3급-부틸퍼옥시)-3,3,5-트라이메틸사이클로헥산, 3급-부틸 하이드로퍼옥사이드, 3급-부틸 퍼아세테이트, 3급-부틸 퍼옥사이드, 3급-부틸 퍼옥시벤조에이트, 3급-부틸퍼옥시 아이소프로필 카보네이트, 큐멘 하이드로퍼옥사이드, 사이클로헥사논 퍼옥사이드, 다이큐밀 퍼옥사이드, 라우로일 퍼옥사이드, 2,4-펜탄디온 퍼옥사이드, 퍼아세트산.
개시제는 단독으로 또는 다른 개시제, 환원제 및/또는 촉매와 함께 사용될 수 있다. 산화환원 반응 중합 시스템에서 유용한 환원제 및 촉매는 공지되어 있고, 소정의 개시제에 대한 특정 환원제 또는 촉매의 선택은 당분야의 기술 수준에 속한다.
산화환원 반응 시스템에 유용한 환원제의 예로는 제1철, 바이설파이트, 티오설페이트, 및 다양한 환원당 및 아민이 포함된다. 편리하게는, 아스코브산, 아황 산수소나트륨 및/또는 N,N,N',N'-테트라메틸렌다이아민이 환원제로서 사용된다.
사용되는 경우 환원제 또는 촉매는 전형적으로 중합 개시가 요망되는 때, 즉 일반적으로 유화액이 형성된 이후에 도입된다. 개시제는 개시제가 수용성인지 유용성인지에 따라 수성 상 또는 오일 상에 첨가될 수 있다. 수용성 및 유용성 개시제의 조합 또한 사용될 수 있다.
선택적으로, 내부 수성 상은 안정한 유화액의 형성시 계면활성제를 도와주는 수용성 전해질을 포함할 수 있다. 수용성 전해질로는 무기 염(1가, 2가, 3가 또는 이의 혼합물), 예를 들면 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 및 중금속 염, 예컨대 할라이드, 설페이트, 카보네이트, 포스페이트 및 이의 혼합물이 포함될 수 있다. 이러한 전해질로는, 예를 들면 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 염화리튬, 염화마그네슘, 염화칼슘, 황산마그네슘, 염화알루미늄 및 이의 혼합물이 포함될 수 있다. 1가 음이온에 의한 1가 또는 2가 염, 예컨대 할라이드가 바람직하다.
본 발명에 따른 추가의 실시양태는 a. 고도의 다공질 물질을 적합한 용매 매질중 생물학적 활성 분자 종의 용액에 노출시키는 단계, b. 활성화제를 선택적으로 첨가하는 단계, c. 선택적으로 가열하는 단계, d. 다공질 물질을 용매 매질로 세정하여 그래프팅되지 않은 종을 제거하는 단계를 포함하는, 제 1 방법에 따라 제조된 고도의 다공질 중합체 지지체에 생물학적 활성 분자 종을 공유 그래프팅하는 방법이다.
다르게는, 생물학적 물질의 그래프팅은 단량체의 중합과 함께 일어날 수 있 다. 이러한 절차를 위한 선결조건은 중합 공정이 생물학적 물질의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않고 생물학적 물질의 포함이 유화 또는 중합 공정의 안정성에 실질적으로 영향을 주지 않는 조건이 적용되어야 한다는 것이다.
상기 단계 b)에서 선택적으로 사용되는 활성화제는 다공질 물질 및 생물학적 활성 종 사이의 반응을 향상시키는 화합물, 예컨대 촉매 또는 개시제이다.
본 발명과 관련하여, 생물학적 활성 분자 종은 일단 고도의 다공질 중합체 지지체에 그래프팅되면 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 생물학적 시스템과 상호작용하거나, 생물학적 시스템과 반응하거나, 생화학적 기작을 통해 생물학적 또는 화학적 종의 반응을 일으킬 수 있는 임의의 생물학적이거나, 생물-유도되거나, 또는 생물-유사성 분자 종을 지칭한다.
이러한 생물학적 활성 분자 종으로는, 제한되는 것은 아니지만, 핵산, 뉴클레오타이드, 올리고-사카라이드, 펩타이드, 펩타이드 핵산 및 당단백질, 프로테오글리칸, 항체, 지질 또는 임의의 상기 물질의 유사체가 포함된다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 생물학적 활성 분자 종은 단백질 또는 효소이고, 여기서 당분야에 공지된 효소는 생물-촉매 단백질로 지칭된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 생물학적 활성 분자 종은 상이한 종의 혼합물, 예컨대 단백질의 혼합물, 효소 및 단백질의 혼합물이고, 가장 바람직하게는 효소의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 2종 이상의 효소의 고정화시, 당분야에 효소의 단계식(cascade) 합성으로 공지된 바와 같이 다단계 생물-촉매화된 반응을 수행하는 것이 가능하다.
제 2 방법의 단계 i) 및 iii)에서 사용되는 용매 매질은 생물학적 활성 분자 종의 안정한 용액을 형성할 수 있는 임의의 용매 시스템일 수 있다. 용매 매질은 물 또는 유기 용매, 보다 바람직하게는 수성 완충 용액 또는 유기 용매와 수성 완충액의 혼합물일 수 있다. 단계 i) 및 iii)에서 사용되는 용매 매질은 동일하거나, 상이한 용매 매질이 단계 iii)에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 이종성 촉매작용에 적용하기 위한, 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 생물-촉매 활성이 10회, 보다 바람직하게는 50회, 가장 바람직하게는 100회의 반응 및 세정 주기 이후 원래 활성의 90% 이상을 유지하는 이종성 촉매작용에서의 상기 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바이오센서, 크로마토그래피, 생물의학 장치 및 임플란트 뿐만 아니라 본 발명에 따른 임의의 생물학적 또는 생화학적 활성 장치에서의, 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 일부 화학물질의 존재 또는 부재를 화학물질의 존재 또는 부재와 정량적으로 또는 정성적으로 연관되는 검출가능한 신호로 전환시키기 위해 분석을 목적으로 하는, 공유 그래프팅을 통해 생물학적 활성 분자를 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질의 용도에 관한 것이다.
도 1/10은 비교예 1의 주사 전자 현미경사진이다.
도 2/10은 비교예의 주사 전자 현미경사진이다.
A. 비교예 2
B. 비교예 3
C. 비교예 4
D. 비교예 5
도 3/10은 석신이미드 에스터를 함유하는 폴리-HIPE의 주사 전자 현미경사진이다.
A. 실시예 4
B. 실시예 6
C. 실시예 7
D. 실시예 8
도 4/10은 단백질 측정 시험을 위한 보정 곡선이다.
도 5/10은 형광 폴리-HIPE의 사진이다(왼쪽에서 오른쪽으로 비교예 2, 및 실시예 1, 2 및 4로부터의 폴리-HIPE). 노출 시간: 500ms. 확대: x 1.6.
도 6/10은 비교예 2(a, 흑색) 및 실시예 2(b. 적색)로부터의 입방체의 라만(Raman) 스펙트럼(둘다 rAce-GFP에 노출됨), 및 용액중 rAce-GFP의 라만 스펙트럼(c, 청색)의 겹침을 나타낸다. 세기는 정규화되지 않았다.
도 7/10은 노보자임 N525L(수성 용액중 CAL-B)에 의한 파라-나이트로페닐 아 세테이트의 가수분해에 대한 활성 곡선이다.
도 8/10은 다공질 지지체상의 CAL-B 활성의 정량을 위한 유동-셀(flow-cell) 셋-업(set-up)을 나타낸다.
도 9/10은 상이한 지지체상에서의 CAL-B(N525L)에 의한 파라-나이트로페닐 아세테이트의 가수분해를 나타낸다. 활성은 지지체 그램수로 정규화되었다.
도 10/10은 상이한 지지체상에서의 CAL-B(N525L)에 의한 파라-나이트로페닐 아세테이트의 가수분해를 나타낸다. 활성은 지지체에 초기에 존재하는 CAL-B의 밀리그램수로 정규화되었다.
모든 화학물질은 별도의 지시가 없는 한 수여받은 그대로 사용하였다.
사용된 UV-방사선 경화 시스템은 1600M D-벌브(bulb)가 구비된 퓨전(Fusion) DRSE-120QNL 방사선 조사장치였다. 총 UV 세기 (A+B+C)는 1.0J/cm2(벨트 속도: 20 피트/분)으로 설정되었다.
주사 전자 현미경은 필립스(Philips) XL30CP였다. 샘플을 모두 금-코팅하여 전도성을 증진시키고, 탄소 페이스트와 함께 알루미늄 스터브(stub)에 장착시키고, 전자 비임을 배율에 의거하여 5 내지 20kV로 설정하였다.
형광 광학 현미경은 라이카(Leika) CC-12 카메라와 커플링된 라이카 MZFLIII이었다. 청색 필터를 사용하였다(480 ± 50nm). 폴리-HIPE 샘플을 흑색 배경을 갖는 유리 슬라이드 위에 놓았다.
UV-가시성 분광광도계는 유동 셀에 의해 사용하기 위해 연동식 펌프(peristaltic pump)를 포함하는 히타치(Hitachi) U-2000였다. 400nm에서의 흡광도를 모니터링하고, 값을 매 10초마다 취하였다.
비교예 1
비교예 1은 고 내부 상 유화액으로부터 열 중합된 고도의 다공질 물질을 제조하는 회분식 방법의 생성물이다.
스타이렌[4.5ml, 알드리치(Aldrich)], 다이비닐벤젠(0.5ml, 알드리치), 및 SPAN80(이는 소르비탄 모노-(Z)-9-옥타데세노에이트임)(1.0ml, 알드리치)를 50ml의 넓은 목(wide-necked) 플라스틱 병에 넣고, 직사각형 PTFE 패들이 구비되고 오버헤드 교반기 모터에 연결된 강철 교반 막대로 300rpm에서 교반하였다. 질소 플럭스를 병에 대해 유지시켰다. 과황산칼륨(0.22g, 알드리치) 및 염화칼슘(0.50g, 무수, 알드리치)이 함유된 탈이온되고 탈기된 물(45ml)을 일정한 교반하에 적가하여(대략 1ml/분) HIPE를 형성하였다. 수성 상을 첨가하는 동안, 진행중인 HIPE의 표면 아래에서만 교반을 유지하도록 병을 낮추어 물 포켓(pocket)이 형성되지 않도록 하였다. 모든 수성 상이 첨가되면, 교반을 추가로 10분 동안 지속하여 가능한한 균일한 유화액을 생성하였다. 이어서, 병을 질소가 유입되고 60℃로 가열된 오븐내에 48시간 동안 넣어두었다. 병을 절단하고, 중합체의 관형 조각을 속슬렛(Soxhlet) 장비에 넣고, 24시간 동안 물(200ml)로 세척한 다음 24시간 동안 아세톤(200ml)으로 세척하였다. 이어서, 단일체를 약한 진공하에 50℃에서 24시간 동안 오븐내에서 건조시켰다.
중합체는 단단하고 부서지기 쉬웠으며, 이는 순수 스타이렌계 폴리-HIPE의 경우 전형적이다. 물 대체에 의해 측정된 비교예 1의 밀도는, 1:9의 연속 상/소적 상 비로 기대되는 바와 같이 대략 0.09g/cm3이었다. 질소 흡수에 의해 측정되고 브루나우어-에멧-텔러(Brunauer-Emmet-Teller) 모델 면적을 적용한 전형적인 표면적은 4m2/g이었다. 도 1은 폴리-HIPE를 특징짓는 개방-셀 구조를 보여주는 주사 전자 현미경사진이다.
비교예 2-5
비교예 2 내지 5는 다양한 비율의 주 단량체들을 포함하는 고 내부 상 유화액으로부터 광-중합된 고도의 다공질 물질을 제조하는 회분식 방법으로부터 생성된다. 중량 백분율은 연속 상의 총 중량에 대한 것이다(비교예 2-5에서 5.00g).
비교예 2의 경우, 2-에틸헥실 아크릴레이트(알드리치 제품, 표 1 참조), 아이소보닐 아크릴레이트(알드리치 제품, 표 1 참조), 트라이메틸올프로판 트라이아크릴레이트(알드리치 제품, 표 1 참조), SPAN80(이는 소르비탄 모노-(Z)-9-옥타데카노에이트임)(알드리치 제품, 표 1 참조) 및 다로큐어(Darocur) 4265, 다로큐어 TPO(다이페닐(2,4,6-트라이메틸벤조일)-포스핀 옥사이드)와 다로큐어 1173(2-하이드록시-2-메틸-1-페닐-1-프로파논)의 50/50 블렌드[시바 가이기(Ciba Geigy) 제품, 표 1 참조)를 50ml의 넓은 목 플라스틱 병에 넣고, 직사각형 PTFE 패들이 구비되고 오버헤드 교반기 모터에 연결된 강철 교반 막대로 300rpm에서 교반하였다. 질소 플럭스를 병에 대해 유지시켰다. 탈이온되고 탈기된 물(표 1)을 일정한 교반하에 적가하여(대략 1ml/분) HIPE를 형성하였다. 수성 상을 첨가하는 동안, 진행중인 HIPE의 표면 아래에서만 교반을 유지하도록 병을 낮추어 물 포켓이 형성되지 않도록 하였다. 모든 수성 상이 첨가되면, 교반을 추가로 10분 동안 지속하여 가능한한 균일한 유화액을 생성하였다. 2시간 이내에 중합되지 않으면, HIPE를 사용전에 10분 동안 다시 교반하여 균질한 소적 크기를 확보해야 하였다.
사각형의 PTFE 프레임을 사용하여 유리 플레이트상에 주형(주형 크기: 5cm의 변, 5mm의 두께)을 생성하였다. HIPE를 내부에 붓고, 제 2 유리 플레이트를 사용하여 주형을 폐쇄하였다. 주형을 1600M D 벌브가 구비된 퓨전 DRSE-120QNL 방사선 조사장치하에 100% 동력으로 초점을 맞춰서 20 피이트/분의 컨베이어(conveyer) 속도로 3회 각각의 변에 대해 다르게 통과시켰다(총 UV-선량: 6 x 1.0J/cm2). 광-중합된 HIPE를 레이저 블레이드(razor blade)를 사용하여 주형에서 제거하였다. 경화된 습성 샘플을 600ml의 비이크에서 100ml의 1:1(부피/부피) 아세톤/물 혼합물중에 침지시켰다. 느린 자기 교반을 1시간 동안 60℃하에 적용하였다. 이어서, 용액을 추가의 신선한 100ml 용액으로 대체하고, 60℃에서 1시간 동안 다시 교반하였다. 이 과정을 6회 반복하였다. 마지막 세척 동안, 1:3 아세톤/물 혼합물(부피/부피)을 사용하였다. 이어서, 습성 폴리-HIPE가 완전히 동결될 때까지 이를 -80℃의 동결기에서 동결시키고, 24시간 동안 동결-건조기에 넣어 5% 수축률 미만의 크기로 건성 폴리-HIPE를 수득하였다. 동결 건조없이 건조된 샘플은 40 내지 50%의 수축률을 나타내었다. 모든 경우, 샘플이 유기 완충 혼합물을 사용하여 다시 적셔지면 수축은 완전히 가역적이었다. 건성 폴리-HIPE에 의한 물 흡수는 일부 유기 용매가 수성 완충액 또는 물과 혼합되지 않는 한 매우 느렸다.
비교예 2 내지 5의 경우, 2-에틸헥실 아크릴레이트 및 아이소보닐 아크릴레이트의 양을 표 1에 따라 변화시켜, 아이소보닐 아크릴레이트 양의 증가 효과로서, 연질의 탄성 폴리-HIPE(비교예 2)부터 경질의 취성(脆性) 폴리-HIPE(비교예 5)를 수득하였다.
이들 예에서 제조된 건성 폴리-HIPE의 물 대체에 의해 측정된 전형적인 밀도는, 1:9의 연속 상/소적 상 비로 기대되는 바와 같이, 대략 0.10g/cm3이었다. 상기 면적으로서 측정된 전형적인 표면적은 대략 1.9m2/g이었다.
Figure 112007078375630-PCT00003
실시예 1-9
실시예 1 내지 9는 작용성 단량체 N-아크릴옥시석신이미드(NASI)를 비롯한 고도의 다공질 중합체이고, 따라서 생물학적 활성 종을 공유적으로 그래프팅할 수 있다.
실시예 4의 경우, 2-에틸헥실 아크릴레이트(알드리치 제품, 표 2 참조), 아이소보닐 아크릴레이트(알드리치 제품, 표 2 참조), 트라이메틸올프로판 트라이아크릴레이트(0.50g, 알드리치 제품), 계면활성제 SPAN80(0.65g, 알드리치 제품) 및 다로큐어 4265(0.35g, 시바 가이기로부터의 광개시제)를 50ml의 넓은 목 병에 넣고, 직사각형 PTFE 패들이 구비되고 오버헤드 교반기 모터에 연결된 강철 교반 막대로 300rpm에서 교반하였다. N-아크릴옥시석신이미드[아크로스(Acros) 제품, 표 2 참조]를 3부분으로 첨가하였는데, 충분한 용해가 달성되도록 시간을 준 후 다음 부분을 첨가하였다. 질소 플럭스를 병 위에 유지시키고, N-아크릴옥시석신이미드(아크로스 제품, 표 2 참조)를 함유한 탈이온화되고 탈기된 물(45g)을 일정한 교반하에 적가하여(대략 1ml/분) HIPE를 형성하였다. 수성 상을 첨가하는 동안, 진행중인 HIPE의 표면 아래에서만 교반을 유지하도록 병을 낮추어, 형성된 수 상의 소적이 1개 보다 많은 경우에 물 포켓(즉, 반응 혼합물이 비균질한 영역)이 형성되지 않도록 하였다. 모든 수성 상이 첨가되면, 교반을 추가로 10분 동안 지속하여 가능한한 균일한 유화액을 생성하였다. 2시간 이내에 중합되지 않으면, HIPE를 사용하기 이전에 10분 동안 다시 교반하여 최적의 소적 크기를 확보하였다.
상기 배합물을 비교예 2-5에 제시된 바와 같이 경화시킬 뿐만 아니라 생성된 고도의 다공질 작용성 중합체를 세척하고 건조시켰다. 밀도 및 표면적은 또한 비교예 2-5와 유사하였다.
실시예 1-3 및 5-9에 따른 폴리-HIPE를 동일한 방식으로 제조하였다. 실시예 1-5의 각각의 출발 물질의 양은 표 2에 제시되어 있다. 표 2에 제시되지 않은 양은 실시예 4에 기재된 바와 동일하다.
실시예 1 내지 4는 연속 상중 10%(w/w)의 아이소보닐 아크릴레이트를 함유하는 유화액으로부터 제조되었고, 여기서 중량 백분율은 연속 상을 구성하는 물질(즉, EHA, IBOA, NASI(소적 상중의 NASI는 제외됨), SPAN 80 및 다로큐어)의 총 중량에 대한 것이다. 이들은 연속 상, 소적 상 또는 이들 두 상 모두에 도입된 다양한 양의 N-아크릴옥시석신이미드를 함유한다.
실시예 5 내지 8은 연속 상중 30%(w/w)의 아이소보닐 아크릴레이트를 함유하는 유화액으로부터 제조되었다. 이들은 연속 상, 소적 상 또는 이들 두 상 모두에 도입된 다양한 양의 N-아크릴옥시석신이미드를 함유한다.
실시예 9는 연속 상중 40%(w/w)의 아이소보닐 아크릴레이트를 함유하는 유화액으로부터 제조되었다. N-아크릴옥시석신이미드는 단지 소적 상에만 도입될 수 는데; 그렇지 않으면 유화액은 안정화될 수 없었다. 표 2는 실시예 1-9를 제조하기 위해 만들어진 유화액 사이의 차이점을 요약한다.
Figure 112007078375630-PCT00004
도 3에서 실시예의 주사 전자 현미경사진은 N-아크릴옥시석신이미드의 혼입 효과를 보여준다. 이는, 이의 소적 상에서의 부분적인 용해도에 의해, 개방-셀 구조의 규칙성을 부분적으로 방해하고, 소적 상에 도입될 경우 셀 크기 분포를 확장시키고(도 3, 실시예 7), 연속 상내에만 도입될 경우 보다 얇은 셀 벽을 유도한다(도 3, 실시예 6).
브래드-포드( Brad - Ford ) 검정을 사용함에 의한 용액중 단백질 농도의 결정
브래드-포드 검정 단백질 측정 시험에 적합한, 바이오-래드(Bio-Rad)로부터의 단백질 검정 시약은 순수한 수성 완충액 또는 30%(v/v) 에탄올이 함유된 수성 완충액에서 단백질 또는 효소의 농도를 결정하기 위해 사용되었다.
단백질 용액을 물로 연속적으로 희석하여 0 내지 25㎍/ml 범위의 농도를 갖는 0.8ml의 샘플들을 준비하였다. 이어서 순수한 단백질 검정 시약(0.2ml)을 각각의 희석된 샘플에 첨가하였다. 시약은 단백질의 염기성 및 방향족 잔기와 신속히 반응하여 밝은 청색 착체를 형성하는 염료인 G-250 쿠마시 블루(Coomassie Blue)를 함유한다. 10분 동안 교반한 후, 샘플을 UV-가시성 분광광도계에 넣고, 595nm에서의 흡광도를 측정하였다(제로 흡광도는 단백질을 전혀 함유하지 않는 샘플로 설정되었다). 0 내지 20㎍/ml 범위의 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin: BSA)을 갖는 샘플을 사용하여 외부 보정 곡선을 측정하였다. 상기 곡선(도 4)을 사용하여 샘플에서 흡광도 및 단백질 양을 설명하였다.
녹색 형광성 단백질을 위한 완충액 교환 프로토콜
본 실시예에는, 석신이미드 에스터가 함유된 폴리-HIPE(실시예 1-9)상에 공유적으로 고정화하기 위한 재조합 녹색 형광성 단백질(rAce-GFP)을 제조하기 위해 사용된 방법이 기재되어 있다. 이는 주로 완충액을 바꾸고 첨가제를 제거하기 위해 단백질을 투석함(여기서 rAce-GFP는 전달됨)을 포함한다.
에브로겐(Evrogen)으로부터의 재조합 Ace-녹색 형광성 단백질을 사용하였다. Ace-GFP의 1개의 바이알(1mg/ml에서 0.10ml)을 5개의 폴리-HIPE 샘플(20㎍/샘플)에 대해 사용할 수 있었다. 1개의 바이알을 포스페이트 완충액(66mM, pH 8.0)에 대해 밀리포어 마이크로콘(Millipore Microcon) YM -10 원심분리 유닛(막의 분자량 제거: 10000)에서 투석하였다. 6회에 걸쳐 포스페이트 완충액(0.5ml)을 첨가한 다음 8000G에서 20분 동안 원심분리 시킨 후, 단백질 농축물을 에탄올(30%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 8.0)에 의해 2.0ml로 맞추었다.
실시예 10
실시예 10은 녹색 형광성 단백질(rAce-GFP)을 폴리-HIPE상에 상이한 적재량의 N-아크릴옥시석신이미드(실시예 1 내지 9)에 의해 공유적으로 그래프팅하는 방법을 설명한다. 비교예 2-4의 폴리-HIPE를 음성 대조군으로서 사용하였다. 고정화 방법은 각 폴리-HIPE에 대해 동일하다: 5mm 폴리-HIPE 입방체를 절단하고, 칭량하고 2.0ml의 에펜도르프(Eppendorf) 바이알내로 넣었다. 바이알을 투석된 rAce-GFP(0.40ml)로 충전시키고, 롤러 교반기에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 바이알 내용물을 5.5cm 직경의 페이퍼 필터에 붓고, 진공을 필터 유닛상에 적용하고, 에탄올(30%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0)을 폴리-HIPE 조각상에 적가하였다. 흡인은 중합체를 통해 용매를 구동시켜 신속한 세척을 가능하게 하였다. 20ml의 완충액을 각각의 조각에 대해 사용하고, 세척된 GFP 그래프팅된 폴리 HIPE 입방체를 에탄올(30%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0)에 저장하였다. rAce-GFP는 20ml의 용출 부피이후의 세척액에서 브래드-포드 시험을 사용하여 전혀 검출되지 않았다. 표 3은 어떤 폴리-HIPE가 고정화에 사용되었는지를 보여준다.
Figure 112007078375630-PCT00005
rAce-GFP에 노출되고 후속적으로 세척된 습성 폴리-HIPE 입방체를 흑색 백슬라이드(backslide)를 갖는 현미경 유리 슬라이드에 놓고, 청색 램프(발광: 480±50nm)하에 라이카 MZFLIII 형광 현미경으로 검사하였다. 라이카 CC-12 디지털 카메라로 사진을 찍었다. 단백질의 염기성 표면 잔기(주로 라이신일 것임)와 N-아크릴옥시 석신이미드의 활성화된 에스터 작용기 사이의 반응에 의해 발생될 것으로 생각되는 폴리-HIPE로부터의 사진(비교예 2, 및 실시예 1, 2, 및 4)은 도 5에서 볼 수 있고, 이는 폴리-HIPE에서의 작용성 단량체(NASI)의 양과 형광 사이의 명료한 관계를 보여준다. 비교예 2는 작용성 단량체를 함유하지 않고 형광을 나타내지 않았는데, 이는 rAce-GFP가 이러한 비-작용성 폴리-HIPE에 물리적으로 거의 또는 전혀 흡착할 수 없음을 제안한다.
단백질의 염기성 표면 잔기(예를 들면 라이신), 및 N-아크릴옥시석신이미드의 등가량의 적재에 의한 N-아크릴옥시석신이미드의 활성화된 에스터 작용기 사이의 반응에 의해 발생하는 것으로 생각되는 폴리-HIPE 상에서의 고정화 반응은, 폴리-HIPE중 아이소보닐 아크릴레이트 양이 증가할 경우, NASI의 석신이미드 에스터를 아마도 대부분의 단백질에 접근불가능하게 만드는 벌키한 아이소보닐 기의 입체 장애 효과에 기인하여 덜 효과적이다. 비-작용성 폴리-HIPE(비교예 2)의 입방체 및 rAce-GFP에 노출되고 후속적으로 세척된 N-아크릴옥시석신이미드-함유 폴리-HIPE(실시예 2)의 입방체를 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0) 및 에탄올(30%(v/v))이 함유된 페트리 디쉬에 놓았다. 각각의 입방체의 라만(Raman) 스펙트럼은 라만 레이저를 사용하여 524-532nm에서 취해졌고, rAce-GFP가 함유되지 않은 용액의 라만 스펙트럼과 비교하였다. 형광은 라만 효과에 대한 강한 경쟁 효과이고, 일반적으로 형광 물질에 라만 분광학을 사용하는 것은 가능하지 않다. 놀랍게도, 라만 레이저를 사용하여 도 6에서 폴리-HIPE 입방체 내부에서 형광을 결정하였는데, 이는 rAce-GFP 흡광이 레이저 파장으로부터 멀지 않기 때문이다. 비교예 2로부터의 입방체는 형광을 나타내지 않았고(흑색 스펙트럼), 이는 아크릴레이트-기제 폴리-HIPE 그 자체가 비형광성이고 이들이 rAce-GFP를 공유적으로 또는 물리적으로 고정화할 수 없음을 확인시켰다. 실시예 2로부터의 입방체(적색 곡선)는 레이저 파장(대략 505nm) 부근에서 중심을 갖고 용액중 rAce-GFP의 형광 피이크(청색 스펙트럼)에 상응하는 형광 피이크를 나타내었다.
이는 고도의 다공질 중합체, 예컨대 N-아크릴옥시석신이미드와 같은 작용성 단량체가 함유된 아크릴레이트-기제 폴리-HIPE가 단백질(이 경우 rAce-GFP)에 공유적으로 그래프팅될 수 있음을 입증하였다. 실시예 2로부터의 입방체의 두께를 통해 상이한 점들에 공초점 레이저를 집중시킴으로써, 형광이 일정하고 이에 따라 고정화가 입방체 부피 전체를 통해 균질하다는 것을 또한 보여주었다.
고정화를 위한 CAL -B의 제조(투석 및 완충액 교환)
본 단락에서는, 석신이미드 에스터가 함유된 폴리-HIPE 상에 공유적으로 고정화하기 위한 칸디다 안탁티카 리파아제 B(Candida Antarctica Lipase B: CAL-B)를 제조하는 방법이 설명되어 있다. 이는 완충액을 교환하고 첨가제를 제거하는 투석(CAL-B는 전달됨)을 주로 포함한다. 포스페이트 완충액(66mM, pH 8.0)으로 설명되는 상기 방법은 사용된 효소에 적합한 임의의 수성 완충액 및 임의의 pH에 적용될 수 있음을 주지해야 한다.
노보자임 N525L을 순수한 CAL-B의 공급원으로서 사용하였다. N525L을 글리세롤(50%(v/v))이 함유된 공지되지 않은 완충액(pH7.0)에 전달시켰다. 2개의 밀리포어 센트리콘 플러스(Millipore Centricon Plus)-20 원심분리 유닛(막의 분자량 제거: 20000)을 사용하여 완충액을 교환하고 글리세롤을 제거하였다. 각각의 튜브에 N525L(8mL) 및 포스페이트 완충액(9mL, 66mM, pH 8.0)을 적재한 다음, 2000G에서 20분 동안 8회 원심분리하였고, 이때 각각의 수행 후 포스페이트 완충액으로 부피를 17ml로 맞추었다. 그런 다음, 양쪽 튜브로부터의 CAL-B 농축액을 수거하고 포스페이트 완충액(66mM, pH 8.0)에 분산시켜 10.5mL의 최종 농도를 갖도록 하였다. 브래드-포드 단백질 측정을 수행하여 최종 용액중의 CAL-B 농도를 결정하였다.
실시예 11
실시예 11은 N-아크릴옥시석신이미드(실시예 4로부터)가 함유된 광-폴리-HIPE 상에 칸디다 안탁티카 리파아제 B(CAL-B)를 고정화하는 일반적 방법을 설명한다. 포스페이트 완충액(66 mM, pH 8.0)으로 설명되는 이 방법은 사용된 효소에 적합한 임의의 수성 완충액 및 임의의 pH에 적용될 수 있음을 주지해야 한다. 이 경우, 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66 mM, pH 7.0)을 저장 및 효소 활성 시험을 위한 완충액으로서 선택하지만, 지지되는 효소가 갖는 목적에 따라 다른 완충액 또는 용매가 사용될 수 있다.
실시예 4로부터의 폴리-HIPE의 조각을 절단하고 칭량하였다(일반적으로 100mg). 이를 CAL-B(1ml, 앞선 단락에서부터의 투석된 N525L), 포스페이트 완충액(3ml, 66mM, pH 7.0) 및 에탄올(1ml)이 함유된 10ml의 투명한 유리 샘플 병에 넣었다. 샘플 병을 4시간 동안 실온에서 롤러 교반기 상에서 진탕시켰다. 이어서, 샘플 병의 내용물을 5.5cm 직경의 페이퍼 필터에 붓고, 진공을 필터 유닛에 적용하고, 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0)의 혼합물을 폴리-HIPE 조각에 적가하였다. 흡인은 중합체를 통해 용매를 구동시켜 신속한 세척을 가능하게 하였다. 대략 50ml을 사용하여 폴리-HIPE를 세척하고, 이를 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0)에 저장하였다. 세척 분획물을 브래드-포드 시험하여 비-고정화된 CAL-B의 양 및 폴리-HIPE에 고정화된 AL-B의 양을 결정하였다. 추가로, 상기 고정화의 공유적 성질이 제공되면, 고정화된 CAL-B는 고정화된 효소 또는 중합체 매트릭스를 분해하는 조건이 사용되지 않는 한 전혀 제거될 수 없음을 주지해야 한다.
실시예 12
실시예 12는 파라-나이트로페닐 에스터 기질의 효소적 가수분해에 기초하여 노보자임 N525L로부터의 칸디다 안탁티카 리파아제 B(CAL-B) 상에서의 활성 시험을 설명한다.
파라-나이트로페닐 아세테이트(PNPA)를 기질로서 사용하여 CAL-B 가수분해 활성을 평가하였다. 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(1.9ml, 66mM, pH 7.0)을 2ml의 UV-가시성 석영 셀에 넣었다. 이어서, PNPA(0.1ml, 4 x 10-3 밀리몰, 무수 에탄올중 7.25mg/ml 용액)를 첨가하고, 히타치 UV-가시성 분광광도계에서 400nm에서의 흡광도 증가를 2분 동안 수행하여 완충액에서 배경 PNPA 화학 가수분해 속도를 측정하였다. 이어서, 물(0 내지 0.10ml의 다양한 부피)에 희석된 CAL-B를 첨가하고, 파라-나이트로페놀 방출에 기인한 400nm에서의 흡광도의 증가를, 선형에서 이탈될 때까지 수행하였다. 계산을 위해, 활성을 흡광도 증가 곡선의 기울기로부터 추론하고, 화학 가수분해 활성을 총 활성에서 차감하여 효소 가수분해 활성만을 정량화하였다. 도 7은 투석되고 희석된 노보자임 N525L의 다양한 양에 의한 활성 곡선을 보여준다.
실시예 13
실시예 13은 재현가능한 조건(지지체 중량, 유동-속도, 시간)하에 다양한 다공질 지지체(폴리-HIPE 상의 CAL-B, 비이드 상의 CAL-B)의 활성을 결정하기 위해 사용되는 셋-업을 설명한다. 이러한 셋-업을 사용하여 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행된 고정화 실험으로부터 수득된, 상이하게 지지된 CAL-B의 활성을 비교하였다.
실리콘 고무 튜빙(1.5mm 내부 직경)을 사용하여 저장기(10ml 유리 샘플 병) 위의 미니-칼럼(20mm의 길이, 5mm의 내부 직경)에 연결된 UV-가시성 석영 유동-셀(내부 부피; 1ml)에 의해 폐쇄된 루우프(loop)를 제조하였다. 유동-셀이 루프내에서 신속한 유동(30ml/분)을 제공하기 이전에 연동식 펌프를 튜빙 오른쪽에 놓았다. 다양하게 지지된 CAL-B를 미니-칼럼 유리 필터의 상부에 패킹하여 액체를 지지체를 통해 유동시킬 수 있었다. 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(9.50ml, 66mM, pH 7.0)을 루우프를 통해 재순환시켜 400nm에서의 제로 흡광도를 정의하였다. 이어서 PNPA(0.50ml, 20 x 10-3 밀리몰, 무수 에탄올중 7.25mg/ml 용액)를 반응 용기에 첨가하고, 파라-나이트로페놀 화학 가수분해에 기인한 40nm에서의 흡광도의 증가를 2분 동안 수행하였고, 이 순간부터 이는 선형이었다. 이어서, 지지된 CAL-B를 미니-칼럼에 첨가하고, 400nm에서의 흡광도 증가를 선형인 동안(전형적으로 1 내지 5분) 모니터링하였다.
패킹되어진 지지된 효소를 세정하고 재사용하여 시간내에서의 이들의 안정성 및 연속적인 사용에 대한 안정성을 평가하였다. 계산을 위해, 활성을 흡광도 증가 곡선의 기울기로부터 추론하고, 화학 가수분해 활성을 총 활성에서 차감하여 효소 가수분해 활성만을 정량화하였다.
실시예 14
실시예 14는 동일한 효소, 칸디다 안탁티카 리파아제-B(CAL-B, 노보자임 N525L로부터)가 함유된 몇몇 지지체 사이의 안정성을 비교하는 예이다.
기준으로서, 노보자임 N435를 사용하였다. 이는 폴리아크릴계 수지의 비이드상에 물리적으로 흡착된 CAL-B로 이루어 진다. CHN 분석에 의해 결정되는 CAL-B의 적재율은 대략 8%(w/w)(80mg CAL-B/비이드의 g)이고, N435 표면적은 105m2/g이었다.
제 2 기준으로서, 비교예 1에서 제조된 것과 유사한 스타이렌계 열 폴리-HIPE를 선택하였는데, 이는 이들 스타이렌 폴리-HIPE가 소수성 상호작용을 통해 물리적으로 효소에 흡착(비공유적 고정화)할 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문이다. CAL-B는 공유적 고정화를 위해 실시예 11에 기재된 바와 같이 이러한 폴리-HIPE상에 물리적으로 흡착되었다. 효소의 고정화 이후 세척 용액상에서 단백질 측정에 의해 결정된 CAL-B의 적재율은 대략 0.75%(w/w)(7.5mg CAL-B/폴리-HIPE의 g)이었다. 상기 지지체를 분말로서 사용되었다.
음성 대조군으로서, 실시예 4로부터의 폴리-HIPE(그래프팅된 CAL-B가 없음)를 사용하여, 상기 중합체 단독으로는 가수분해에 어떠한 효과도 갖지 않음을 입증하였다. 다른 음성 대조군은 실시예 11과 유사한 방법을 사용하여 CAL-B를 물리적으로 흡착하도록 시도되지만 고정화를 위한 용매로서 MES 완충액(100mM, pH 6.0)을 사용하는 실시예 1로부터의 폴리-HIPE였다. 흡착된 CAL-B는 전혀 검출되지 않았다. 이들 폴리-HIPE는 5mg의 단일체로서 사용하였다.
최종적으로 실시예 4로부터의 폴리-HIPE를 선택하여, 고정화용 용매로서 MES 완충액(100mM, pH 6.0)을 사용함을 제외하고는 실시예 11과 유사한 방법을 사용하여 CAL-B를 공유적으로 고정화시켰다. 효소의 고정화 이후 세척 용액상에서의 단백질 측정에 의해 결정된 CAL-B의 적재율은 대략 0.80%(w/w)(8.0mg CAL-B/폴리-HIPE의 g)이었다. 이들 폴리-HIPE는 5mg의 단일체로서 사용하였다.
각각의 지지체를 실시예 13에 지시된 바와 같이 다양한 양으로 시험하였다.
결과는 도 9 및 10에 요약되어 있다. 이들 도면은, 지지체의 그램(도 9) 및 고정화된 CAL-B의 밀리그램(도 10)에 의해 정규화된, 각각의 지지체 경우의 파라-나이트로페닐 아세테이트의 파라-나이트로페놀 및 아세트산으로의 가수분해에 대한 효소 활성을 보여준다.
이들 결과로부터 다음과 같은 3가지 분명한 결론이 내려졌다:
a) 시판용 CAL-B 노보자임 N435는, 흡착된 CAL-B가 함유된 열 스타이렌 및 공유적으로 고정화된 CAL-B가 함유된 광-폴리-HIPE에 의해 수득된 활성과 필적할만한 전체 활성(지지체의 그램당)을 가졌다. 이들 열 스타이렌 및 광-폴리-HIPE는 용액중 CAL-B에 필적할만한 활성(CAL-B의 밀리그램당)을 나타낸 반면(대략 50마이크로몰/분/노보자임 N525L에 대한 CAL-B의 mg), 노보자임 N435는 10배 이상 더 낮은 활성을 나타내었다. 이는 N435에 흡착된 CAL-B중 대부분이 기질에 접근하지 못했거나 용액중에서 CAL-B로서의 활성을 나타내지 못함을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 방법이 보다 적은 양의 효소를 사용한다는 점에서 효율적임을 보여준다.
b) 비-작용성 광-폴리-HIPE상에는 지방족 아크릴레이트-기제 배합물에 기인하여 CAL-B의 물리적 흡착이 존재하지 않았다. 추가로, 이들 폴리-HIPE는 에스터 가수분해에 대한 영향이 전혀 없었다.
c) 일정 시간 및 후속적인 재사용에 대한 공유 그래프팅된 CAL-B의 안정성은 물리적으로만 흡착된 지지체에 비해 매우 우수하였다. 파라-나이트로페닐 아세테이트의 가수분해를 위해 동일한 지지체를 10회 사용하여서도 활성의 감소(실험 재현성의 한계내에서)는 검출되지 않았다. 실시예 4의 폴리-HIPE에 지지된 CAL-B를 에탄올(20%(v/v))이 함유된 포스페이트 완충액(66mM, pH 7.0)에 3개월 동안 저장한 이후에도 활성의 감소는 검출되지 않았다.
실시예 15-18
이들 실시예는 계면활성제 유형 및 첨가제를 달리하면서 EHA:I BOA:TMPTA:NASI(11.65:65.82:8.19:14.34)의 고정된 몰 비를 기초로 한다. CaCl2의 첨가(실시예 15)는, 당분야의 기술자가 예상할 수 있듯이, HIPE상에서 안정화 효과를 나타내었다. 다른데서 보고되고[국제 특허출원 공개공보 제WO 97/45479호] 실시예 18에서 사용된 혼합된 계면활성제 시스템은 점성의 겔-유사 점조도 및 양호한 열 안정성을 갖는 HIPE를 생성하였다.
하이퍼머(Hypermer) B246의 사용은, 예기치 못하게, 폴리-HIPE에서의 NASI의 보유력을 증진시켜 실시예 16 및 17 둘다에서 84%의 적재 효율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이는 NASI가 또한 소적 상에 첨가되는 실시예 4(62%), 및 30% 내지 59% 범위의 적재 효율이 관찰되는 다른 모든 실시예와 비교하여 매우 우수하다.
실시예 15 내지 18은 실시예 1-9와 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 18은 질소 분위기하에 16시간 동안 60℃에서 열에 의해 중합되었다.
Figure 112007078375630-PCT00006
실시예 19
DERA 의 커플링
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) D-2-데옥시리보스-5-포스페이트 알돌라제(DERA) 세포 유리 추출물(에스케리치아 콜라이에서 과발현됨)(50ml)을, N-아크릴옥시석신이미드-공중합체 폴리-HIPE(1g)를 통해 6시간 동안 22℃ 및 pH 6.60에서 연속적으로 통과시켜 고정화시켰다. 중합체를 후속적으로 트라이에탄올아민 완충액(200ml, 5OmM, pH 7.25)으로 세척하여 고정화된 효소 DERA가 함유된 회백색의 중합체 단일체를 수득하였다.
i. 고정화전 용액중의 총 단백질 농도: 23.6mg/ml
ii. n-하이드록시석신아미드 작용성 중합체를 통해 6시간 유동된 후의 총 단백질 농도: 21.3mg/ml
iii. 단백질 농도를 이전에 기재된 바와 같은 브래드포드 검정에 의해 결정하였다.
iv. 폴리-HIPE상의 DERA의 결과적 적재량: 115mg/g
실시예 20
s- HNL 의 커플링
헤비아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis) s-하이드록시나이트릴 리아제(lyase)(s-HNL) 세포 유리 추출물[피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 과발현됨](50ml)을 N-아크릴옥시석신이미드-공중합체 폴리-HIPE(1g)을 통해 6시간 동안 22℃ 및 pH 5.75에서 연속적으로 통과시켜 고정화시켰다. 중합체를 후속적으로 MES 완충액(100ml, 5OmM, pH 5.80)으로 세척하여 고정화된 효소 s-HNL이 함유된 회백색의 중합체 단일체를 수득하였다.
i. 고정화전 용액중의 총 단백질 농도: 49.9mg/ml
ii. n-하이드록시석신아미드 작용성 중합체를 통해 6시간 유동된 후의 총 단백질 농도: 27.0mg/ml
iii. 단백질 농도를 이전에 기재된 바와 같은 브래드포드 검정에 의해 결정하였다.
iv. 폴리-HIPE상의 s-HNL의 결과적 적재량: 150mg/g
실시예 21
DERA -공중합
에스케리치아 콜라이 D-2-데옥시리보스-5-포스페이트 알돌라제(DERA) 세포 유리 추출물(에스케리치아 콜라이에서 과발현됨)(45ml; 1mg/ml 단백질 함량)을 폴리-HIPE내로 공중합하여 고정화시켰다.
폴리-HIPE를 NASI 및/또는 CaCl2의 수성 용액 또는 물 대신의 유기 상에 DERA 세포 유리 추출물을 첨가함을 제외하고 실시예 1 내지 12와 같이 형성하였다. 이어서, 폴리-HIPE의 생성된 조각을 인산칼륨 완충액(5 x 100ml, 5OmM, pH 7.00)으로 세정하여 고정화된 효소 DERA가 함유된 회백색의 중합체 단일체를 수득하였다.

Claims (16)

  1. 공유 그래프팅된(covalently grafted) 생물학적 활성 종(biologically active species)을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단일체(monolithic)인 고도의 다공질 중합체 물질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 공유 그래프팅된 생물학적 활성 종이 단백질이고, 바람직하게는 효소이며, 보다 바람직하게는 1군 이상의 효소인 고도의 다공질 중합체 물질.
  4. a. 소적 상 및 연속 상을 포함하고 단량체를 함유하는 유화액 조성물을 제조하는 단계,
    b. 상기 유화액을 경화시키는 단계, 및
    c. 상기 물/소적 상을 선택적으로 제거하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 활성 분자 종에 그래프팅할 수 있는 작용성 단량체를 포함하는 고도의 다공질 물질의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    단계 a.의 유화액 조성물이 가교결합 단량체, 작용성 단량체, 중합 개시제, 계면활성제 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질을 추가로 함유하는 방법.
  6. a. A, B, C, D 및 E의 총 중량에 대해, A. 5 내지 95중량%의 작용성 단량체, B. 5 내지 80중량%의 가교결합 단량체, C. 0 내지 10중량%의 중합 개시제, D. 0 내지 20중량%의 계면활성제, E. 0 내지 90중량%의, 작용성 또는 가교결합 단량체 이외의 단량체, 및 A, B, C, D 및 E를 포함하는 연속 상, 및 소적 상의 총 부피에 대해 F. 74 내지 93 부피%의, 소적 상을 구성하는 액체 또는 액체 조성물을 포함하는 조성물로부터의, 소적 상 및 연속 상으로 이루어진 유화액을 제조하는 단계,
    b. 상기 유화액을 경화시키는 단계, 및
    c. 상기 물/소적 상을 선택적으로 제거하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 활성 종을 공유적으로 그래프팅할 수 있는 고도의 다공질 중합체 물질의 제조 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 단량체, 가교결합 단량체 및 작용성 단량체가 비닐계 불포화기를 함유하는 방법.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 단량체가 활성 에스터 기를 함유하는 방법.
  9. a. 고도의 다공질 물질을 적합한 용매 매질중 생물학적 활성 종의 용액에 노출시키는 단계,
    b. 활성화제를 선택적으로 첨가하는 단계,
    c. 선택적으로 가열하는 단계,
    d. 상기 다공질 물질을 용매 매질로 세정하여 그래프팅되지 않은 종을 제거하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 고도의 다공질 중합체 물질에 생물학적 활성 종을 그래프팅하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 종의 용액에 사용된 용매 매질이 물이고, 보다 바람직하게는 수성 완충액인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 종의 용액에 사용된 용매 매질이 유기 용매인 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 종의 용액에 사용된 용매 매질이 물 및 유기 용매의 혼 합물이고, 보다 바람직하게는 수성 완충액 및 유기 용매의 혼합물인 방법.
  13. 이종성 촉매로서의, 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질의 용도.
  14. 촉매 활성이, 동일한 반응 조건하에 10회의 반응 및 세정 사이클 이후 원래의 활성의 90% 이상을 유지하는, 이종성 촉매로서의 제 1 항에 따른 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 물질의 용도.
  15. 바이오센서(biosensor), 크로마토그래피, 생물의학 장치 및 임플란트(implant)에 있어서, 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질의 용도.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 생물학적 활성 종을 포함하는 고도의 다공질 중합체 물질을 포함하는 생물학적 및 생화학적 활성 장치.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102131593A (zh) 2008-08-13 2011-07-20 长持续创新-L2I(有限责任公司) 用于结合活性分子到一个载体上的方法、通过所述方法获得的活性构件以及用于实施所述方法的化学组合物
EP2544664A1 (en) 2010-03-11 2013-01-16 Danmarks Tekniske Universitet Supported biologically active compounds
MX339181B (es) * 2010-03-30 2016-05-16 Surmodics Inc Foto reticulador degradable.
US9062245B2 (en) 2011-02-09 2015-06-23 Technion Research & Development Foundation Limited Liquid-retaining elastomeric compositions
US9180094B2 (en) 2011-10-12 2015-11-10 The Texas A&M University System High porosity materials, scaffolds, and method of making
US20160243277A1 (en) * 2013-09-23 2016-08-25 The Texas A & M University System Fast curing porous materials and control thereof
US10363215B2 (en) 2013-11-08 2019-07-30 The Texas A&M University System Porous microparticles with high loading efficiencies
IL245656B (en) 2016-05-16 2018-02-28 Technion Res & Dev Foundation Polymer structures with high absorption capacity
EP3491028A4 (en) 2016-06-26 2020-02-19 Technion Research & Development Foundation Limited POLYHIP POLYMERS PREPARED BY INTERFACIAL SEQUENTIAL POLYMERIZATION
IL247302B (en) 2016-08-16 2019-03-31 Technion Res & Dev Foundation Systems for releasing materials based on polymer emulsions
CN107164359B (zh) * 2017-06-30 2020-03-17 鲁东大学 一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法
IL253431A0 (en) 2017-07-11 2017-09-28 Technion Res & Dev Foundation Flexible compounds store liquids, their preparation processes and their uses
WO2019016816A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Technion Research & Development Foundation Limited HYDROGELS WITH EMULSION MATRIX DOUBLELY RETICULATED BY REVERSIBLE METAL COORDINATION
IL255404B (en) 2017-11-02 2018-10-31 Technion Res & Dev Foundation A zwitterionic hydrogel in the configuration of an internal multiphase emulsion

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3130924A1 (de) * 1981-08-05 1983-02-17 Röhm GmbH, 6100 Darmstadt Oberflaechenreiche systeme zur fixierung von nucleophile gruppen enthaltenden substraten
DE3629177A1 (de) * 1986-08-28 1988-03-17 Hoechst Ag Vernetzte polymerisate und verfahren zu ihrer herstellung
GB8729889D0 (en) * 1987-12-22 1988-02-03 Unilever Plc Bio-catalysts support systems
JPH08322915A (ja) * 1995-05-29 1996-12-10 Synbolon Corp 病原体の失活方法
JPH11322997A (ja) * 1998-05-14 1999-11-26 Dainippon Ink & Chem Inc 多孔質ビーズの製造方法
CA2514471C (en) * 2003-02-19 2013-09-10 Mcmaster University Composite materials comprising supported porous gels

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