CN101163789A - 通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含共价接枝的生物活性物质的高度多孔聚合材料。本发明还涉及制备包含能够接枝到生物活性分子物质的官能单体的高度多孔材料的方法,包括步骤:a)制备包括液滴相和连续相并包含单体的乳液组合物;b)固化所述乳液;c)可选地去除水/液滴相。本发明还涉及将生物活性分子物质共价接枝到这种高度多孔聚合材料上的方法,包括步骤:i)将所述高度多孔材料暴露于所述生物活性分子物质在合适的溶剂介质中的溶液中;ii)可选地添加活化剂;iii)可选地加热;iv)用溶剂介质清洗所述多孔材料以去除未接枝物质。这种包含共价接枝的生物活性物质的高度多孔聚合材料可例如用作非均相催化剂,也可在生物传感器、色谱、生物医学器件和植入物中应用。
Description
本发明涉及高度多孔材料,所述多孔材料包含与其连接的生物活性分子物质。本发明还涉及制备能够共价接枝生物活性分子的高度多孔材料的方法以及用于将所述生物活性分子接枝到多孔材料的方法。此外,本发明涉及这种通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔材料在非均相催化剂、生物传感器、色谱、生物医学器件和植入物中的应用。而且,本发明涉及基于根据本发明的通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔材料的任何生物和生化活性器件。
生物活性分子物质例如酶已经通过疏水-疏水相互作用被固定在疏水多孔聚合材料上(E.Ruckenstein and X.Wang,Biotech.And Bioeng.,Vol 42pg821(1993))。这种物理吸附是非共价性的,并且尽管生物活性分子物质(酶)保留了部分活性,但是物理吸附的特性使得生物活性分子物质可以从聚合载体去除(流失),从而使体系的活性随着后续重复使用而下降。这种情况还见于其中酶通过非共价物理吸附过程被固定在聚合物微球上的市售体系,例如Novozyme 435。
生物活性分子物质也已经被共价固定在例如琼脂糖衍生物的聚合物上(R.G.Frost et al,Biochimica et Biophysica Acta,670,pg163,(1981))。这可导致保留生物或生化活性。然而,这些体系是无孔或高度粘性聚合物凝胶,并且严重阻碍化合物的扩散,所述化合物是生物催化过程的期望反应物或可与固定化生物活性分子物质相互作用。
因此,需要一种有效的方法来将生物活性分子物质(例如,蛋白质和酶)固定在固体载体上,以使生物活性分子物质不从固体载体表面流失,从而不导致引起生物或生化活性损失的稳定性问题。此外,还期望固体载体材料的孔隙率尽可能高同时保持机械完整性,从而具有尽可能大的可用于固定化表面积,进而用于后续的生物和生化作用。此外,高孔隙率有利于以下应用:将固定化酶暴露于生物活性分子物质欲与之相互作用、反应或引起反应的化合物的液体流。
令人惊讶地发现,通过共价接枝将生物活性分子物质固定在高度多孔聚合载体,可以使固定化的生物活性分子物质获得优异的活性和稳定性。以此方式,生物活性分子物质通过共价分子键与高度多孔聚合载体结合,以使其被接枝。一旦以此方式接枝,生物活性分子物质在不存在某种降解反应的条件下不再从载体上被去除,从而可以保留其生物活性。
本发明还涉及制备包含能够接枝生物活性分子物质的官能单体的高度多孔材料的方法,包括如下步骤:
a.制备包括液滴相和连续相并包含单体的乳液组合物;
b.固化所述乳液;
c.可选地去除水/液滴相。
除了所述单体以外,乳液组合物还可包含交联单体、官能单体、聚合引发剂、表面活性剂和水。
乳液的固化可以例如通过热或光化学方式完成。
水/液滴相的去除可以例如通过蒸发、冷冻干燥、抽吸过滤来进行。
本发明的另一种实施方式涉及制备能够共价接枝生物活性物质的高度多孔聚合材料的方法,包括如下步骤:
a.由组合物制备包括液滴相和连续相的乳液,所述组合物包含:
A)5-95wt%的官能单体,
B)5-80wt%的交联单体,
C)0-10wt%的聚合引发剂,
D)0-20wt%的表面活性剂,
E)0-90wt%的不同于官能或交联单体的单体,以及
F)74-93vol%的构成液滴相的液体或液体组合物,
其中,重量百分比(wt%)是相对于A)、B)、C)、D)和E)的总重量,体积百分比(vol%)是相对于包含A)、B)、C)、D)和E)的连续相与液滴相的总体积;
b.固化所述乳液,以及
c.可选地去除水/液滴相。
在本文中,术语“高度多孔聚合材料”是指孔隙率大于74%(以总空洞体积计)的任何聚合材料。特别地,这种材料可以通过高内相乳液(High Internal Phase Emulsion,HIPE)的聚合来制备,聚合后的HIPE在本领域中被称为聚合HIPE(D.Barby&Z.Haq,Eur.Pat.Appl.60138,1982)。这些得自上述方法的高度多孔材料是整块材料,即该方法得到单块材料。相对而言,已知的具有接枝于其上的生物活性物质的聚合材料通常是微球或颗粒形式。
本发明的第一种方法包括以下步骤:制备包含各种单体的合适乳液组合物以及随后固化或交联单体相。
聚合HIPE由高内相乳液(HIPE)聚合制得。HIPE是其中液滴相占据超过74%的总体积的乳液(K.J.Lissant(Ed.),Emulsions and EmulsionTechnology Part 1,Marcel Dekker,New York,1974,Chapter 1)。对于HIPE,连续相包含可以聚合并使聚合HIPE具有典型的孔结构的单体。由于乳液液滴结构,无法在宏观上发生聚合物的收缩。结果,收缩在液滴之间的连续相中发生,孔壁中出现互连的窗口,以使聚合HIPE可完全渗透液体和气体介质,从而可以以整块形式用于流通应用。
存在两种聚合HIPE,最常见的是由反相乳液(通常称为“油包水”乳液)制备的那些,其它的是由常规乳液(“水包油”乳液)制备。
由反相乳液制备的聚合HIPE中的连续相是包含单体、优选疏水单体、最优选不与液滴相混溶的单体的相。本发明的实施例中描述的苯乙烯和丙烯酸酯基聚合HIPE属于此类聚合HIPE。必须使用至少一种具有多于一个可聚合部分的单体(称为交联剂)。可以使用不与液滴相混溶的单体,但这种单体因其部分溶于液滴相而不能完全聚合。连续相包含至少一种表面活性剂以增强乳液稳定性,优选非离子型表面活性剂。连续相可以包含至少一种不可聚合物质、优选不与液滴相混溶的化学物质、最优选疏水溶剂,这种物质通常称为孔原物(porogen),原因在于其用于通过在开放孔结构中增加粗糙度以及生成更多空洞来提高聚合HIPE的表面积(P.Hainey,I.M.Huxham,B.Rowatt,D.C.Sherrington,and L.Tetley,Macromolecules,1991,24,117;A.Barbetta and N.R.Cameron,Macromolecules,2004,37,3202)。
由反相乳液制备的聚合HIPE中的液滴相是亲水液体介质、优选亲水溶剂、最优选水。液滴相可以包含用于通过降低与连续相的混溶度来稳定乳液的盐或化学物质、光引发剂或两者的混合物,但这些物质也可以被包含于连续相,也可被包含于两个相中。最后,液滴相可以包含至少一种易于在与连续相部分的界面上聚合的单体,优选地,单体也存在于连续相。
由常规乳液制备的聚合HIPE中的连续相是包含单体、优选亲水单体、最优选与液滴相不混溶的单体的相。该单体的一个实例是被芳基醚砜封端的大分子单体。必须使用至少一种具有多于一个可聚合部分的单体(称为交联剂)。可以使用不与液滴相混溶的单体,但这种单体因其部分溶于液滴相而不能完全聚合。连续相包含至少一种表面活性剂以增强乳液稳定性,优选离子型表面活性剂。连续相可以包含至少一种不可聚合物质、优选不与液滴相混溶的化学物质、最优选亲水溶剂(例如,水),这种物质通常称为孔原物,原因在于其用于通过在开放孔结构中增加粗糙度以及生成更多空洞来提高聚合HIPE的表面积。
由常规乳液制备的聚合HIPE中的液滴相是疏水液体介质、优选疏水溶剂。其实例是石油醚、己烷和超临界二氧化碳。液滴相可以包含用于通过降低与连续相的混溶度来稳定乳液的化学物质。液滴相可以包含至少一种引发剂,例如自由基引发剂或光引发剂或两者的混合物,但这些物质还可以被包含于连续相,也可以包含于两个相中。最后,液滴相可以包含至少一种易于在与连续相部分的界面上聚合的单体,优选地,单体也存在于连续相。
通过相对于液滴相的高体积比(大于74%)来限定HIPE,这可使聚合物在去除液滴相后(如果干燥后整体不破碎)的孔隙率为至少74%。存在孔隙率为99%的聚合HIPE的实例(J.Esquena,G.S.R.R.Sankar,and C.Solans,Langmuir,2003,19,2983)。这种材料由于互连孔的窗口而在整块形式下对液体介质和气体的渗透性很好。
原则上,在本文中,可以使用可以反应形成聚合材料的任何分子作为单体。重要的仅仅是选择溶于高内相乳液的连续相的单体。对于有机相为连续相的油包水型HIPE,这种单体应当优选很好地溶于有机相而不溶于水相。对于水包油型HIPE则相反。
交联单体应当是这样一种单体:其官能团可在聚合过程中在两个或更多个聚合物链之间形成交联,因而形成交联网络。这些交联单体的选择应当基于在连续相中的溶解度,如同上述单体的情况。
在本文中,官能单体包含至少一个可以参与聚合的化学部分以及至少一个可以在第二步骤中与生物活性分子物质反应从而实现将生物活性分子物质接枝到聚合材料的其它化学部分。在本发明的一种实施方式中,能够接枝的化学部分可以在中间步骤中与其它分子反应,所述其它分子可以再接枝生物活性分子物质。在另一种实施方式中,使用既为交联单体也为官能单体的单体。因此,这样的单体包含至少两个(优选三个)可聚合基团以及可与生物活性物质反应的化学部分。这样的单体的用量相对于上述组分A、B、C、D和E的总重量可为5-95wt%。
这种单体可由结构通式1a)P-G表示,其中P为参与聚合的化学部分,G为随后用于直接或间接接枝生物活性分子物质的化学部分;或者,单体可由式1c)P-X-G表示,其中P和G如上所述,X为间隔基,所述间隔基可以是亲水的或疏水的。其实例是烷基、全氟烷基、乙二醇或其它低聚醚。
在一种优选实施方式中,官能单体包含活化酯基、最优选式2的基于n-羟基琥珀酰亚胺的活化酯基。
可用于接枝生物活性分子物质的官能团的其它实例包括但不限于,马来酰亚胺、硫醇、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、2-吡啶基衍生物、叠氮化物、肟、环氧化物、异氰酸酯和醛。
这些官能单体的选择也应当部分地基于其在单体相中的溶解度,如同上述单体和交联单体的情况。
如式3所示,可以在n-羟基琥珀酰亚胺基单体的P基与G基之间引入间隔基。
以此方式,可以通过选择间隔基X来调节疏水性,间隔基X例如包括但不限于,三个或更多个亚甲基的烷基链。此外,可以通过选择本身亲水的间隔基X来调节亲水性,所述间隔基例如但不限于,具有不同长度n的氧化亚乙基单元(CH2CH2O)n。
在本发明的另一种实施方式中,单体、交联单体和官能单体包含乙烯不饱和基,优选苯乙烯不饱和基、更优选甲基丙烯酸不饱和基、最优选丙烯酸不饱和基。
本发明使用的引发剂可溶于水或有机溶剂,可以整个添加至任一相或在两相之间分配,并且可以在乳液形成之前、期间或之后添加。
如果使用一种或组合使用更多种引发剂或多份引发剂,则可以根据需要将其一起添加或分别添加。引发剂可以是光引发剂和/或热引发剂和/或氧化还原引发剂。
引发剂应当以可使单体有效地聚合的量存在。通常,存在的引发剂的量基于整个连续相可为约0.005-约20wt%,优选约0.1-约15wt%,最优选约0.1-约10wt%。
可用于本发明的方法中的引发剂可以例如是光引发剂或热引发剂。
光引发剂包括但不限于以下实例:乙酰苯、茴香偶姻、蒽醌、蒽醌-2-磺酸及钠盐、三羰基铬、苯偶酰、苯偶姻、苯偶姻乙醚、苯偶姻异丁醚、苯偶姻甲醚、二苯甲酮、二苯甲酮/1-羟基环己基苯基甲酮混合物(50/50)、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、1,4-苯甲酰基二苯基、2-苯甲基-2-(二甲基氨基)-4’-吗啉丁酰苯、4,4’-二(二乙基氨基)二苯甲酮、4,4’-二(二甲基氨基)二苯甲酮、3-樟脑醌、2-氯噻吨-9-酮、(枯烯)环戊二烯基铁(II)、六氟磷酸盐、二苯并[a,b]环庚烯-5-酮(dibenzosuberenone)、二乙氧基乙酰苯、4,4’-二羟基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯、4-(二甲基氨基)二苯甲酮、4,4’-二甲基苯偶酰、2,5-二甲基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)膦氧化物/2-羟基-2-甲基苯丙酮混合物(50/50)、4’-乙氧基乙酰苯、2-乙基蒽醌、二茂铁、3’-羟基乙酰苯、4’-羟基乙酰苯、3-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、甲基苯甲酰基甲酸酯、2-甲基-4’-(甲基硫)-2-吗啉苯丙酮、菲醌、4’-苯氧基乙酰苯、噻吨-9-酮、六氟锑酸三芳基锍盐、六氟磷酸三芳基锍盐。
热引发剂包括但不限于以下实例:过氧苯甲酸叔戊酯、4,4-偶氮二(4-氰戊酸)、1,1’-偶氮二(环己烷碳腈)、2,2’-偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰、2,2-二(叔丁过氧基)丁烷、1,1-二(叔丁过氧基)环己烷、2,5-二(叔丁过氧基)-2,5-二甲基己烷、2,5-二(叔丁过氧基)-2,5-二甲基-3-己炔、二(1-(叔丁基过氧)-1-甲基乙基)苯、1,1-二(叔丁过氧基)-3,3,5-三甲基环己烷、叔丁基过氧化氢、过乙酸叔丁酯、过氧化叔丁基、过氧苯甲酸叔丁酯、叔丁过氧基碳酸异丙酯、枯烯过氧化氢、过氧化环己酮、过氧化二枯基、过氧化月桂酰、2,4-戊二酮过氧化物、过乙酸。
引发剂可以单独使用或与其它引发剂、还原剂和/或催化剂组合使用。用于氧化还原聚合体系的还原剂和催化剂是公知的,并且针对给定引发剂的还原剂或催化剂的选择属于本领域的现有技术。
用于氧化还原体系的还原剂的实例包括二价铁、亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐以及各种还原糖和胺。适宜地,使用抗坏血酸、亚硫酸氢钠和/或N,N,N’,N’-四亚甲基二胺作为还原剂。
当使用时,还原剂或催化剂通常在需要引发聚合时引入,即通常在已形成乳液之后引入。引发剂可添加至水相或油相,这取决于引发剂是水溶性还是油溶性。也可以使用水溶性引发剂与油溶性引发剂的组合。
可选地,内水相可以包括辅助表面活性剂形成稳定乳液的水溶性电解质。水溶性电解质包括无机盐(一价盐、二价盐、三价盐或其混合物),例如碱金属盐、碱土金属盐和重金属盐,如卤化物、硫酸盐、碳酸盐、磷酸盐及其混合物。这样的电解质例如包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化锂、氯化镁、氯化钙、硫酸镁、氯化铝及其混合物。优选具有一价阴离子的一价或二价盐,如卤化物。
本发明的另一种实施方式是将生物活性分子物质共价接枝到根据第一种方法制备的高度多孔聚合载体上的方法,包括如下步骤:
a.将所述高度多孔材料暴露于所述生物活性分子物质在合适的溶剂介质中的溶液中;
b.可选地添加活化剂;
c.可选地加热;
d.用溶剂介质清洗所述多孔材料以去除未接枝物质。
或者,生物材料的接枝可以与单体的聚合一起发生。这样做的前提条件是:采用聚合过程基本上不影响生物材料的活性的条件以及生物材料的引入基本上不影响乳液或聚合过程的稳定性。
可选地用于上述步骤b)的活化剂是可以强化多孔材料与生物活性物质之间的反应的化合物,例如催化剂或引发剂。
在本文中,生物活性分子物质是指如下的生物、生物衍生或仿生分子物质:一旦接枝到高度多孔聚合载体,即可以通过本领域技术人员已知的生化机理与生物体系相互作用、与生物体系反应或引起生物或化学物质反应。
这种生物活性分子物质可以包括但不限于:核酸、核苷酸、低聚糖、肽、肽核酸和糖蛋白质、蛋白聚糖、抗体、脂质或上述物质的类似物。
在本发明的一种优选实施方式中,生物活性分子物质是蛋白质或酶,其中酶在本领域中被称为生物催化蛋白质。
在本发明的另一种优选实施方式中,生物活性分子物质可以是不同物质的混合物,例如蛋白质的混合物、酶与蛋白质的混合物、最优选酶的混合物。在根据本发明对两种或更多种酶进行固定化时,可以进行在本领域中被称为酶促级联合成的多步生物催化反应。
在第二种方法的步骤i)和iii)中使用的溶剂介质可以是能够形成稳定的生物活性分子物质的溶液的任何溶剂体系。溶剂介质可以是水或有机溶剂,更优选水性缓冲液或有机溶剂与水性缓冲液的混合物。步骤i)和iii)中使用的溶剂介质可以与步骤iii)中使用的溶剂介质相同或不同。
本发明还涉及通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料用于非均相催化剂的用途。而且,本发明涉及在非均相催化剂中的这种用途:在10个、更优选50个、最优选100个反应和清洗周期后,生物催化活性保留了初始活性的90%或更高。
此外,本发明涉及通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料在生物传感器、色谱、生物医学器件和植入物以及根据本发明的生物或生化活性器件中的用途。
本发明还涉及通过共价接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料的分析用途,从而将某种化学物质的存在或不存在转化为可被检测到的信号,此信号与所述化学物质的存在或不存在定性地或定量地相关。
附图说明
图1为对比实施例1的扫描电子显微照片;
图2为对比实施例2-5(分别对应A-D)的扫描电子显微照片;
图3为实施例4、6-8(分别对应A-D)的包含琥珀酰亚胺酯的聚合HIPE的扫描电子显微照片;
图4为蛋白质测量试验的标准曲线;
图5为聚合HIPE荧光图(从左到右为对比实施例2以及实施例1、2和4的聚合HIPE),曝光时间:500ms,放大倍数:1.6;
图6为对比实施例2(a)和实施例2(b)的聚合HIPE方块的拉曼光谱(均暴露于rAce-GFP)以及rAce-GFP在溶液中的拉曼光谱(c),强度未标准化;
图7为用Novozym N525L(CAL-B水溶液)水解乙酸对硝基苯酯的活性曲线;
图8为用于定量在多孔载体上的CAL-B的活性的流动池;
图9示出了由在不同载体上的CAL-B(N525L)水解乙酸对硝基苯酯,活性以载体克数来标准化;
图10示出了由在不同载体上的CAL-B(N525L)水解乙酸对硝基苯酯,活性以最初存在于载体中的CAL-B毫克数来标准化。
实施例
除非另有说明,所有化学物质以收到时的状态使用。
所用的UV辐射固化系统是装有I600M D灯的Fusion DRSE-I20QNL辐射仪。总UV强度(A+B+C)设定为1.0J/cm2(带速:20英尺/分钟)。
扫描电子显微镜是Philips XL30CP。样品全部镀金以提高导电性,用碳胶固定在铝棒上,并根据放大倍数将电子束设定为5-20kV。
荧光光学显微镜是连接有Leika CC-12照像机的Leika MZFLIII。使用蓝色滤光器(480±50nm)。将聚合HIPE样品置于具有黑色背景的玻璃载片上。
UV-可见光分光光度计是Hitachi U-2000,其包括与流动池一起使用的蠕动泵。监测400nm下的吸光度,并且每隔10秒钟取一次值。
对比实施例1
对比实施例1是由高内相乳液热聚合来制备高度多孔材料的间歇方法的产物。
将苯乙烯(4.5ml,Aldrich)、二乙烯基苯(0.5ml,Aldrich)和SPAN80(其为去水山梨糖醇单-(Z)-9-十八烷酸酯)(1.0ml,Aldrich)置于50ml的广口塑料瓶中,并用装有矩形PTFE叶片的钢制搅拌棒以300rpm进行搅拌,该搅拌棒连接至项部的搅拌器马达。在瓶的上方保持氮气流。在恒定搅拌下,逐滴添加(约1ml/min)含有过硫酸钾(0.22g,Aldrich)和氯化钙(0.50g,无水,Aldrich)的去离子和除气水(45ml),以形成HIPE。随着水相的添加,将瓶降低以保持搅拌刚好位于正在生成的HIPE的表面之下,确保不形成水窝(water pocket)。添加完全部水相之后,继续搅拌另外10分钟,以制备尽可能均匀的乳液。然后将瓶置于充以氮气的烘箱,并在60℃下加热48小时。切开所述瓶,并将管状聚合物置入Soxhlet装置,然后用水(200ml)洗涤24小时,再用丙酮(200ml)洗涤24小时。然后,在50℃下,在低真空度的烘箱中干燥整块材料24小时。
所得聚合物坚硬且易碎,这是纯的苯乙烯聚合HIPE的典型特征。通过排水法来测定的对比实施例1的密度如同预期的约为0.09g/cm3,连续相与液滴相之比为1∶9。通过氮气吸收并采用Brunauer-Emmet-Teller模型区域测定的典型表面积约为4m2/g。图1为示出了表征聚合HIPE的开放孔结构的扫描电子显微照片。
对比实施例2-5
对比实施例2-5是由包含不同主要单体比例的高内相乳液光聚合来制备高度多孔材料的间歇方法的产物。重量百分比是基于连续相的总重量(在对比实施例2-5中为5.00g)。
对于对比实施例2,将丙烯酸2-乙基己酯(来自Aldrich,见表1)、丙烯酸异冰片酯(来自Aldrich,见表1)、三甲基丙烷三丙烯酸酯(来自Aldrich,见表1)、SPAN80(其为去水山梨糖醇单-(Z)-9-十八烷酸酯)(来自Aldrich,见表1)和Darocur 4265(DAROCUR TPO(二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)膦氧化物)与DAROCUR 1173(2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮)的50/50混合物)(来自Ciba Geigy,见表1)置于50ml的广口塑料瓶中,并用装有矩形PTFE叶片的钢制搅拌棒以300rpm进行搅拌,该搅拌棒连接至顶部的搅拌器马达。在瓶的上方保持氮气流。在恒定搅拌下,逐滴添加(约1ml/min)去离子和除气水,以形成HIPE。随着水相的添加,将瓶降低以保持搅拌刚好位于正在生成的HIPE的表面之下,确保不形成水窝。添加完全部水相之后,继续搅拌另外10分钟,以制备尽可能均匀的乳液。如果在2小时内不聚合,则必须在使用之前将HIPE再搅拌10分钟,以确保均匀的液滴尺寸。
使用方形PTFE框架在玻璃板上形成模(模尺寸:5cm边长,5mm厚)。倒入HIPE并用第二玻璃板封闭该模。在聚焦的装有100%功率的I600M D灯的Fusion DRSE-I20QNL辐射仪下,将模具从每侧交替通过3次(总UV剂量:6×1.0J/cm2),传送带速度为20英尺/分钟。用刀片从模上取下光聚合HIPE。将经固化的湿样品浸入600ml烧杯中的100ml的1∶1(vol/vol)的丙酮/水混合物中。在60℃下进行缓慢的磁搅拌1小时。然后用另外100ml的新鲜混合物替换该溶液,并在60℃下再搅拌1小时。重复此过程6次。在最后一次洗涤时,使用1∶3的丙酮/水混合物(vol/vol)。然后在-80℃的冷冻器中冷冻湿聚合HIPE,直到其完全冷冻,然后将其置于冷冻干燥器中24小时,得到尺寸收缩率小于5%的干燥聚合HIPE。不进行冷冻干燥而干燥的样品呈现40-50%的收缩率。在所有情况下,当用有机缓冲混合物再使样品变湿时,收缩是完全可逆的。除非水性缓冲液或水中混合了部分有机溶剂,否则干燥聚合HIPE对水的吸收是十分缓慢的。
对于对比实施例2-5,按照表1改变丙烯酸2-乙基己酯和丙烯酸异冰片酯的量,得到从柔软且具弹性(对比实施例2)到坚硬且具脆性(对比实施例5)的聚合HIPE,这是增大丙烯酸异冰片酯的量的效果。
通过排水法测定的在这些对比实施例中制备的干燥聚合HIPE的典型密度如同预期的约为0.10g/cm3,连续相与液滴相之比为1∶9。按照上述区域测定的典型表面积约为1.9m2/g。
表1.对比实施例2-5的配方
聚合HIPE | wt%(基于油相总重量) | 水∶油相比(水重) | ||||
EHA | IBOA | TMPTA | SPAN80 | Darocur4265 | ||
对比实施例2对比实施例3对比实施例4对比实施例5 | 60%(3.00g)40%(2.00g)30%(1.50g)20%(1.00g) | 10%(0.50g)30%(1.50g)40%(2.00g)50%(2.50g) | 10%(0.50g)10%(0.50g)10%(0.50g)10%(0.50g) | 13%(0.65g)13%(0.65g)13%(0.65g)13%(0.65g) | 7%(0.35g)7%(0.35g)7%(0.35g)7%(0.35g) | 9∶1(45g)9∶1(45g)9∶1(45g)9∶1(45g) |
实施例1-9
实施例1-9是包含官能单体N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NASI)因而能够共价接枝生物活性物质的高度多孔聚合物。
对于实施例4,将丙烯酸2-乙基己酯(来自Aldrich,见表2)、丙烯酸异冰片酯(来自Aldrich,见表2)、三甲基丙烷三丙烯酸酯(0.50g,来自Aldrich)、SPAN80(0.65g,来自Aldrich)和Darocur 4265(0.35g,来自Ciba Geigy的光引发剂)置于50ml的广口塑料瓶中,并用装有矩形PTFE叶片的钢制搅拌棒以300rpm进行搅拌,该搅拌棒连接至顶部的搅拌器马达。分三份添加N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(来自Acros,见表2),在所添加的一份完全溶解后在添加下一份。在瓶的上方保持氮气流。在恒定搅拌下,逐滴添加(约1ml/min)含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(来自Acros,见表2)的去离子和除气水(45g),以形成HIPE。随着水相的添加,将瓶降低以保持搅拌刚好位于正在生成的HIPE的表面之下,确保在存在多于一滴的水相的情况下不形成水窝(即反应混合物不均匀的区域)。添加完全部水相之后,继续搅拌另外10分钟,以制备尽可能均匀的乳液。如果在2小时内不聚合,则必须在使用之前将HIPE再搅拌10分钟,以确保最佳的液滴尺寸。
此配方的固化以及所得高度多孔官能聚合物的洗涤和干燥按照对比实施例2-5来进行。密度和表面积也类似于对比实施例2-5。
实施例1-3和5-9的聚合HIPE是以相同方式制备的。表2给出了实施例1-5的原材料的量。表2未给出的量与实施例4中所述的相同。
实施例1-4是由在连续相中包含10%w/w的丙烯酸异冰片酯的乳液来制备的,其中重量百分比相对于构成连续相的材料(即,EHA、IBOA、NASI(不包括液滴相中的NASI)、SPAN 80和DAROCUR)的总重量。它们包含引入连续相、液滴相或两者中的不同量的N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。
实施例5-8是由在连续相中包含30%w/w的丙烯酸异冰片酯的乳液来制备的。它们包含引入连续相、液滴相或两者中的不同量的N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。
实施例9是由在连续相中包含40%w/w的丙烯酸异冰片酯的乳液来制备的。只能将N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺引入液滴相,否则乳液无法稳定化。表2列出了制备实施例1-9的乳液的差异。
表2.实施例1-9的配方以及通过元素分析得到的琥珀酰亚胺酯的加载量
聚合HIPE | 重量 | 反应性基团 | NASI加载效率(%) | ||||
EHA | IBOA | NASI | 水中的NASI | 最大预期值(mmol/g) | 测量值(mmol/g) | ||
实施例1实施例2实施例3实施例4 | 2.75g2.50g3.00g2.50g | 0.50g0.50g0.50g0.50g | 0.250.50g0.50g | 0.375g0.375g | 0.370.740.501.18 | 0.170.440.220.74 | 45594462 |
实施例5实施例6实施例7实施例8 | 1.75g1.50g2.00g1.50g | 1 50g1.50g1.50g1.50g | 0.250.50g0.50g | 0.375g0.375g | 0.370.740.501.18 | 0.150.340.210.55 | 40464346 |
实施例9 | 1.50g | 2.00g | 0.375g | 0.50 | 0.14 | 30 |
图3中的实施例的扫描电子显微照片表明了加入N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的影响。N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺部分地破坏了开放孔结构的规则性并扩展了孔尺寸分布(当将其引入液滴相时)(图3,实施例7),并且导致孔壁变薄(当仅引入连续相时)(图3,实施例6),这是由于其在液滴相中部分溶解。
用Brad-Ford分析来测定溶液中的蛋白质浓度
使用来自Bio-Rad的蛋白质分析试剂(其可用于Brad-Ford分析蛋白质测量试验)来测定纯的水性缓冲液或包含至多30%v/v乙醇的水性缓冲液中的蛋白质或酶的浓度。
用水对蛋白质溶液进行一系列的稀释,以制备0.8ml的浓度范围为0-25μg/ml的样品。然后将纯的蛋白质分析试剂(0.2ml)添加至每个稀释样品中。试剂含有G-250考马斯蓝,其为一种染料,可与蛋白质的碱性和芳族残基快速反应形成亮蓝色络合物。搅拌10分钟之后,将样品置入UV-可见光分光光度计,并测量595nm下的吸光度(设定不含蛋白质的样品的吸光度为零)。使用含有0-20μg/ml的Bovine Serum Albumin(BSA)的样品测量外标曲线。用此曲线(图4)来关联吸光度与样品中的蛋白质量。
绿色荧光蛋白质的缓冲液交换方案
在本实施例中,描述了用于制备用于共价固定在包含琥珀酰亚胺酯的聚合HIPE(实施例1-9)上的重组绿色荧光蛋白质(rAce-GFP)的方法。该方法主要包括透析蛋白质以更换缓冲液并去除运输rAce-GFP的添加剂。
使用来自Evrogen的重组Ace-GFP。对于五个聚合HIPE样品(每个样品20μg),会使用一小瓶的Ace-GFP(在1mg/ml下为0.10ml)。在Millipore Microcon YM-10离心单元(膜的截止分子量:10000)中用磷酸盐缓冲液(66mM,PH8.0)对小瓶进行透析。添加六次磷酸盐缓冲液(0.5ml)之后,在8000G下离心20分钟,用含乙醇(30%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,PH8.0)使蛋白质浓度达到2.0ml。
实施例10
实施例10描述了将绿色荧光蛋白质(rAce-GFP)共价接枝到具有不同含量的N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的聚合HIPE(实施例1-9)上的方法。使用对比实施例2-4的聚合HIPE作为阴性对比。对于每种聚合HIPE,固定化方法均相同:切成5mm的聚合HIPE方块,称重并置入2.0ml的Eppendorf小瓶中。在小瓶中装入经透析的rAce-GFP(0.40ml),并放入滚筒搅拌器中搅拌4小时。然后将小瓶的内容物倒在直径为5.5cm的滤纸上,将过滤器单元抽真空并在聚合HIPE块上逐滴添加包含乙醇(30%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)。通过抽吸作用使溶剂通过聚合物来进行快速洗涤。对每块使用20ml的缓冲液,并将经洗涤的GFP接枝聚合HIPE方块保存在包含乙醇(30%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)中。洗脱体积达到20ml之后,使用Brad-Ford试验对洗涤物进行检测,未检测到rAce-GFP。表3示出了用于固定化的聚合HIPE。
表3.用于共价固定rAce-GFP的聚合HIPE
使用的聚合HIPE | IBOA含量 | 荧光 |
对比实施例2实施例1实施例2实施例3实施例4 | 10%w/w | 依赖于N-丙烯酰胺琥珀酰亚胺的加载量 |
对比实施例3实施例5实施例6实施例7实施例8 | 30%w/w | 依赖于N-丙烯酰胺琥珀酰亚胺的加载量,但弱于上组 |
对比实施例4实施例9 | 40%w/w | 无荧光 |
将暴露于rAce-GFP并随后洗涤的湿聚合HIPE方块置于具有黑色背景的玻璃载片上,并用Leika MZFLIII荧光显微镜在蓝灯(发射波长:480±50nm)下进行检测。用Leika CC-12数字照像机进行拍照。图5中可以看到对比实施例2以及实施例1、2、4的聚合HIPE的照片,这些聚合HIPE被认为发生了蛋白质的碱性表面残基(可能主要为赖氨酸)与N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的活化酯官能团之间的反应,这些照片清楚地表明了荧光与聚合HIPE中的官能单体(NASI)的量之间的关系。对比实施例2不含官能单体并不发荧光,意味着极少或没有rAce-GFP能够物理吸附在这种无官能聚合HIPE上。
当聚合HIPE中的丙烯酸异冰片酯的量提高时,可能是由于大体积异冰片基的位阻效应使NASI的琥珀酰亚胺酯难以接近大多数蛋白质,因此较之相等的N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的加载量,聚合HIPE上的固定化反应(被认为是由蛋白质的碱性表面残基(例如赖氨酸)与N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的活化酯官能团之间的反应产生的)不那么有效。将暴露于rAce-GFP并随后洗涤的无官能聚合HIPE(对比实施例2)和含N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的聚合HIPE(实施例2)的方块置于含有磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)和乙醇(30%v/v)的Petri盘中。用524-532nm的拉曼激光测量每个方块的拉曼光谱,并与不含rAce-GFP的溶液的拉曼光谱比较。荧光效应对拉曼效应形成强烈竞争,通常不能将拉曼光谱法用于荧光物质。令人惊讶地,图6中使用拉曼激光来测定聚合HIPE方块内的荧光,这是因为rAce-GFP吸收波长在激光波长附近。对比实施例2的方块为显示出荧光(黑色光谱),证明丙烯酸酯基聚合HIPE本身无荧光性,并且无法以共价或物理方式固定rAce-GFP。实施例2的方块(红色曲线)呈现出中心几乎位于激光波长的荧光峰(约505nm),并对应于溶液中的rAce-GFP的荧光峰(蓝色光谱)。
可证实,高度多孔聚合物(例如,包含例如N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的官能单体的丙烯酸酯基聚合HIPE能够共价接枝蛋白质(这里为rAce-GFP)。通过将共焦激光聚焦在实施例2的方块的厚度上的不同点上,还可以看出荧光是恒定的,因此表明固定化在整个方块体积上是均匀的。
制备用于固定化的CAL-B(透析和缓冲液交换)
本部分描述了制备用于共价固定在包含琥珀酰亚胺酯的聚合HIPE上的Candida Antarctica Lipase B(CAL-B)所用的方法。该方法主要包括透析蛋白质以更换缓冲液并去除运输CAL-B的添加剂。应当指出,尽管该方法通过磷酸盐缓冲液(66mM,PH8.0)来描述,但它适用于任何水性缓冲液以及对于所用的酶合适的任何pH。
使用Novozym N525L作为纯CAL-B的来源。
使用来自Evrogen的重组Ace-GFP。将N525L用未知缓冲液(pH7.0)运输,并含甘油(50%v/v)。使用两个Millipore Centricon Plus-20离心单元(膜的截止分子量:20000)来交换缓冲液并去除甘油。每个离心管中装入N525L(8ml)和磷酸盐缓冲液(9ml,66mM,pH8.0),然后在2000G下用20分钟离心8次,在每次离心后用磷酸盐缓冲液使体积达到17ml。然后从两个离心管收集CAL-B浓缩物,并分散在磷酸盐缓冲液(66mM,pH8.0)中,以使最终体积为10.5ml。进行Brad-Ford蛋白质测定,已确定最终溶液中的CAL-B浓度。
实施例11
实施例11描述了将Candida Antarctica Lipase B(CAL-B)固定在包含N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺的光聚合HIPE(来自实施例4)上的一般方法。应当指出,尽管该方法通过磷酸盐缓冲液(66mM,PH8.0)来描述,但它适用于任何水性缓冲液以及对于所用的酶合适的任何pH。这里,选择含有乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,PH7.0)作为存储和进行酶促活性试验的缓冲液,但可以根据被担载的酶的用途而使用其它缓冲液或溶剂。
将实施例4的聚合HIPE块切割并称重(通常100mg)。将其置入10ml的透明玻璃样品瓶中,该瓶中含有CAL-B(1ml,在前一部分中描述的经透析的N525L)、磷酸盐缓冲液(3ml,66mM,pH7.0)和乙醇(1ml)。用滚筒搅拌器中在室温下将样品瓶振荡4小时。然后将样品瓶的内容物倒在直径为5.5cm的滤纸上,将过滤器单元抽真空并在聚合HIPE块上逐滴添加包含乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)的混合物。通过抽吸作用使溶剂通过聚合物来进行快速洗涤。使用约50ml的溶剂来洗涤聚合HIPE,然后将其保存在包含乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)中。对洗涤级分进行Brad-Ford试验以确定未固定CAL-B的量以及固定在聚合HIPE中的CAL-B的量。此外,应当注意到,如果这种固定是共价性的,则在不使用降解固定化酶或聚合物基质的条件下,无法将被固定的CAL-B从聚合物上去除。
实施例12
实施例12描述了得自Novozym N525L的Candida Antarctica Lipase B(CAL-B)的活性试验,该试验基于对硝基苯基酯底物的酶促水解。
使用乙酸对硝基苯酯(PNPA)作为底物来评价CAL-B的水解活性。将包含乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(1.9ml,66mM,pH7.0)置入2ml的UV-可见光石英池中。然后,添加PNPA(0.1ml,4×10-3mmol,7.25mg/ml在无水乙醇中的溶液),然后在Hitachi U-2000 UV-可见光分光光度计中使400nm下的吸光度增加2分钟,从而测量缓冲液中的背景PNPA化学水解速率。然后添加稀释在水中的CAL-B(从0到0.10ml的各种体积),然后由于对硝基苯酚释放而引起400nm下的吸光度增加,直到观察到偏离线性。对于计算,根据吸光度增加曲线的斜率推导出活性,并且从总活性中减去化学水解活性以定量单独的酶促水解活性。图7示出了各种量的经透析和稀释的Novozym N525L下的活性曲线。
实施例13
实施例13描述了用于在可重复条件(载体重量、流率、时间)下确定各种多孔载体(聚合HIPE上的CAL-B,微球上的CAL-B)的活性的装置。该装置用来比较如实施例11所述进行的固定化实验所得的不同的担载型CAL-B的活性。
使用硅酮橡胶管道(内径1.5mm)由UV-可见光石英流动池(内部体积:1ml)、小柱(长度20mm,内径5mm)以及容器(10ml的玻璃样品瓶)构成闭合回路,其中流动池与小柱连接,小柱位于容器上方。蠕动泵设置在刚好在流动池之前的管道上,用于在回路中形成快速流动(30ml/min)。各种担载型CAL-B可填充在小柱玻璃过滤器的顶部,以使液体流动通过载体。包含乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(9.50ml,66mM,pH7.0)通过回路循环以确定400nm下的零吸光度。然后在反应容器中添加PNPA(0.50ml,20×10-3mmol,7.25mg/ml在无水乙醇中的溶液),然后使对硝基苯酚化学水解所引起的400nm下的吸光度增加从其呈线性开始进行2分钟。然后在小柱中添加担载型CAL-B,并且监测400nm下的吸光度增加(只要其为线性)(通常1-5分钟)。
可以将填充的担载型酶清洗并重复使用,以评价其随时间的稳定性以及经过连续使用后的稳定性。对于计算,根据吸光度增加曲线的斜率推导出活性,并且从总活性中减去化学水解活性以定量单独的酶促水解活性。
实施例14
实施例14是几种包含相同的酶Candida Antarctica Lipase B(CAL-B,来自Novozym N525L)的载体的稳定性比较实例。
作为参比,使用Novozym N435。Novozym N435由物理吸附在聚丙烯酸树脂微球上的CAL-B构成。通CHN分析确定CAL-B的加载量约为8%w/w(80mg CAL-B/g微球),N435表面积为105m2/g。
作为第二参比,选择苯乙烯热聚合HIPE(类似于对比实施例1所制备的聚合HIPE),因为已知这些苯乙烯聚合HIPE可以通过疏水相互作用物理吸附酶(非共价固定)。按照实施例11(为了共价固定化)所述将CAL-B物理吸附在此聚合HIPE。在将酶固定之后,通过对洗涤溶液进行蛋白质测定,确定CAL-B的加载量,该量约为0.75%w/w(7.5mg CAL-B/g聚合HIPE)。此载体以粉末形式使用。
作为阴性对比,使用未接枝CAL-B的实施例4的聚合HIPE来验证该聚合物本身并不对水解具有任何影响。另一种阴性对比是实施例1的聚合HIPE,通过类似于实施例11的方法(不同之处是用MES缓冲液(100mM,pH6.0)作为固定化用溶剂)在其上物理吸附CAL-B。检测不到吸附的CAL-B。这些聚合HIPE以5mg的整块使用。
最后,选择实施例4的聚合HIPE通过类似于实施例11的方法(不同之处是用MES缓冲液(100mM,pH6.0)作为固定化溶剂)来共价固定CAL-B。在将酶固定之后,通过对洗涤溶液进行蛋白质测定确定CAL-B的加载量,该量约为0.80%w/w(8.0mg CAL-B/g聚合HIPE)。这些聚合HIPE以5mg的整块使用。
以各种量如实施例13所述对每种载体进行试验。
结果示于图9和图10。这些图示出了每种载体将乙酸对硝基苯酯水解成对硝基苯酚和乙酸的酶活性,在图9中用载体克数标准化,在图10中用固定的CAL-B毫克数标准化。
从这些结果可以看出以下三点结论:
a)市售CAL-B Novozym N435的每克载体的总活性与含吸附的CAL-B的苯乙烯热聚合HIPE和含共价固定的CAL-B的光聚合HIPE的活性具有可比性。这些苯乙烯热聚合HIPE和光聚合HIPE的每毫克CAL-B的活性与溶液中的CAL-B具有可比性(对于Novozym N525L,约50μmol/min/mg CAL-B),而Novozym N435的活性要低10倍以上。这意味着,要么N435中的大多数吸附的CAL-B无法接近底物,要么它的活性不如溶液中的CAL-B。这表明,本发明的方法在利用较小量的酶方面是有效的;
b)脂族丙烯酸酯基配方使得在无官能光聚合HIPE上未物理吸附CAL-B。此外,这些聚合HIPE对酯水解不具有影响;
c)与CAL-B仅物理吸附的载体相比,共价接枝的CAL-B随时间和经后续重复使用的稳定性很好。用同一载体水解乙酸对硝基苯酯10次,未检测到活性下降(在实验重复性的限度内)。对于在实施例4的聚合HIPE上担载的CAL-B,在含乙醇(20%v/v)的磷酸盐缓冲液(66mM,pH7.0)中保存3个月,未检测到活性下降。
实施例15-18
这些实施例是基于固定的摩尔比EHA∶IBOA∶TMPTA∶NASI(11.65∶65.82∶8.19∶14.34)以及不同类似的表面活性剂和添加剂。本领域技术人员可以预期,CaCl2的添加(实施例15)对HIPE具有稳定效果。实施例18中使用了WO 97/45479报导的混合表面活性剂体系,制备的粘性凝胶状HIPE具有良好的热稳定性。
出乎意料地发现,使用Hypermer B246可以提高NASI在聚合HIPE中的保持力,使得实施例16和17中的加载效率达到84%。该值远高于实施例4(其中NASI也添加到液滴相中)中的62%,而对于所有其它实施例,测得的加载效率的范围为30-59%。
实施例15-18以与实施例1-9相同的方式进行。实施例18在60℃下在氮气氛中热聚合16小时。
聚合HIPE | wt%(基于油相总重量) | 水∶油相比 | ||||||||||
EHA | IBOA | TMPTA | Darocur | NASI | SPAN80 | Hypermer | AIBN | CTA | SDS | CaCl2 | (水重)9∶1(45.0g)9∶1(45.0g)9∶1(45.0g)9∶1(45.0g) | |
实施例15实施例16实施例17实施例18 | 50.0(2.50g)55.9(2.79g)54.3(2.50g)52.3(2.50g) | 10.0(0.50g)11.2(0.56g)10.9(0.50g)10.5(0.50g) | 10.0(0.50g)11.2(0.56g)10.9(0.50g)10.5(0.50g) | 42657.0(0.35g)7.8(0.39g)7.6(0.35g) | 10.0(0.50g)11.2(0.56g)10.9(0.50g)10.5(0.50g) | 13.0(0.65g)13.2(0.63g) | B2462.8(0.14g)5.4(0.25g) | 1.0(0.05g) | Cl1.0(0.05g) | 1.0(0.05g) | (水相中)(5.50g)(4.50g) |
CTA Cl:十六烷基三甲基氯化铵(25%aq,Aldrich);Hypermer B246:12-羟基硬脂酸-聚乙二醇嵌段共聚物(Uniquma);AIBN:偶氮二异丁腈(Fluka);SDS:十二烷基磺酸钠(Aldrich)
实施例19
结合DERA
通过以下方法将Escherichia coli D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯醛缩酶(DERA)无细胞提取物(在Escherichia coli中过度表达)(50ml)固定:在22℃、pH6.60下,使其连续通过一块N-丙烯酰氧琥珀酰胺共聚的聚合HIPE(1g),持续6个小时。然后用三乙醇胺缓冲液(200ml,50mM,pH7.25)洗涤聚合物,得到包含固定化酶(DERA)的灰白色聚合物整块材料。
i)固定前溶液中的总蛋白质浓度:23.6mg/ml
ii)流动通过n-羟基琥珀酰胺官能聚合物6小时后的总蛋白质浓度:21.3mg/ml
iii)如前所述通过Bradford分析来测定蛋白质浓度
iv)所得的DERA在聚合HIPE上的加载量:115mg/g
实施例20
结合s-HNL
通过以下方法将Hevea brasiliensis s-羟基腈裂合酶(s-HNL)无细胞提取物(在Pichia pastoris中过度表达)(50ml)固定:在22℃、pH 5.75下,使其连续通过一块N-丙烯酰氧琥珀酰胺共聚的聚合HIPE(1g),持续6个小时。然后用MES缓冲液(100ml,50mM,pH5.80)洗涤聚合物,得到包含固定化酶(s-HNL)的灰白色聚合物整块材料。
i)固定前溶液中的总蛋白质浓度:49.9mg/ml
ii)流动通过n-羟基琥珀酰胺官能聚合物6小时后的总蛋白质浓度:27.0mg/ml
iii)如前所述通过Bradford分析来测定蛋白质浓度
iv)所得的s-HNL在聚合HIPE上的加载量:150mg/g
实施例21
DERA共聚合
通过共聚合到聚合HIPE中来将Escherichia coli D-2-脱氧核糖-5-磷酸酯醛缩酶(DERA)无细胞提取物(在Escherichia coli中过度表达)(45ml,蛋白质含量1mg/ml)固定。
如实施例1-12所述形成聚合HIPE,不同之处是在有机相中添加DERA无细胞提取物而非水或CaCl2和/或NASI的水溶液。然后将得到的聚合HIPE块用磷酸钾缓冲液(5×100ml,50mM,pH7.00)洗涤,得到包含固定化酶(DERA)的灰白色聚合物整块材料。
Claims (16)
1.包含共价接枝的生物活性物质的高度多孔聚合材料。
2.如权利要求1的高度多孔材料,其中所述材料是整块材料。
3.如权利要求1或2的高度多孔聚合材料,其中所述共价接枝的生物活性物质是蛋白质、优选酶、更优选多种酶。
4.制备包含能够接枝到生物活性分子物质的官能单体的高度多孔材料的方法,包括如下步骤:
a.制备包括液滴相和连续相并包含单体的乳液组合物;
b.固化所述乳液;
c.可选地去除水/液滴相。
5.如权利要求4的方法,其中步骤a中的所述乳液组合物还包含交联单体、官能单体、聚合引发剂、表面活性剂和水中的至少一种。
6.制备能够共价接枝生物活性物质的高度多孔聚合材料的方法,包括如下步骤:
a.由组合物制备包括液滴相和连续相的乳液,所述组合物包含:
A 5-95wt%的官能单体,
B 5-80wt%的交联单体,
C 0-10wt%的聚合引发剂,
D 0-20wt%的表面活性剂,
E 0-90wt%的不同于官能或交联单体的单体,以及
F 74-93vol%的构成液滴相的液体或液体组合物,
其中,重量百分比是相对于A、B、C、D和E的总重量,体积百分比是相对于包含A、B、C、D和E的连续相与液滴相的总体积;
b.固化所述乳液,以及
c.可选地去除水/液滴相。
7.如权利要求4的方法,其中所述单体、交联单体、和官能单体包含乙烯不饱和基。
8.如权利要求4或5的方法,其中所述单体包含活化酯基团。
9.将生物活性物质共价接枝到如权利要求1-3中任何一项的高度多孔聚合材料上的方法,包括如下步骤:
a.将所述高度多孔材料暴露于所述生物活性物质在合适的溶剂介质中的溶液中;
b.可选地添加活化剂;
c.可选地加热;
d.用溶剂介质清洗所述多孔材料以去除未接枝物质。
10.如权利要求9的方法,其中在所述生物活性物质的溶液中使用的所述溶剂介质是水、更优选水性缓冲液。
11.如权利要求9的方法,其中在所述生物活性物质的溶液中使用的所述溶剂介质是有机溶剂。
12.如权利要求9的方法,其中在所述生物活性物质的溶液中使用的所述溶剂介质是水与有机溶剂的混合物、更优选水性缓冲液与有机溶剂的混合物。
13.如权利要求1-3中任何一项的包含生物活性物质的高度多孔聚合材料作为非均相催化剂的用途。
14.如权利要求1的包含生物活性物质的高度多孔材料作为非均相催化剂的用途,其中在相同的反应条件下,在10个反应和清洗周期后,催化剂活性保留了初始活性的90%以上。
15.如权利要求1-3中任何一项的包含生物活性物质的高度多孔聚合材料在生物传感器、色谱、生物医学器件和植入物中的用途。
16.包含如权利要求1-3中任何一项的包含生物活性物质的高度多孔聚合材料的生物和生化活性器件。
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