KR20080004075A

KR20080004075A - 호흡기계 약제 전달을 위한 서방형 다공성 미세입자 및 그제조 방법

Info

Publication number: KR20080004075A
Application number: KR1020060062558A
Authority: KR
Inventors: 권민정; 김정주; 이은성
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2006-07-04
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2008-01-09
Also published as: KR100908517B1

Abstract

본 발명은 호흡기계 약제 전달을 위한 서방형 다공성 미세입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자는 20 ㎛내외의 충분한 입경 크기로 대식세포에 의한 파괴를 줄이고, 사이클로덱스트린 유도체를 적정량 함유하여 다공성을 확보함은 물론 단백질 약물을 안정하고 균일하게 함유하여 폐심부까지 약물을 이동시킬 수 있으며, 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)를 함유함으로써 약물의 봉입효율이 우수할 뿐 아니라 약물의 초기 방출을 억제하여 장기간, 길게는 일주일간 지속 방출이 가능하므로 호흡기계 약물 전달 제형으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

호흡기계 약제 전달을 위한 서방형 다공성 미세입자 및 그 제조 방법{SUSTAINED-RELEASE POROUS MICROPARTICLE FOR PULMONARY DRUG DELIVERY AND PROCESS FOR PREPARARING THE SAME}

도 1은 비교예 1(a), 2(b), 4(c), 5(d), 6(e 및 f)(이때, f는 e의 확대도)에서 얻어진 다공성 미세입자에 대한 주사전자현미경(SEM) 사진이고,

도 2는 비교예 7(a) 및 실시예(b)에서 얻어진 다공성 미세입자에 대한 SEM 사진이고,

도 3은 비교예 4 내지 6에서 얻어진 다공성 미세입자의 시간에 따른 약물 방출 정도를 나타낸 그래프이고,

도 4는 비교예 8 및 실시예에서 얻어진 다공성 미세입자의 시간에 따른 약물 방출 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 호흡기계 약제 전달을 위한 서방형 다공성 미세입자 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

호흡기계 약제 전달(pulmonary drug delivery)은 전달 기관인 폐의 표면적이 넓고 흡수 장벽이 얇아 약제의 흡수 전달이 빠르고, 폐 점막이 고분자 물질에 대해서도 상당히 높은 투과성을 나타내며, 흡수된 약제가 간을 통과하지 않고 바로 전신순환됨으로 인해 속방형 약제의 투여경로로 적합하다. 또한, 이러한 호흡기계 약제 전달은 투여시 환자의 고통이 적은 장점이 있어 최근에는 호흡기를 통한 약제 전달 시스템 및 전달 매체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

예를 들면, 미국 특허 제6,254,854 B1호는 생분해성 고분자에 아미노산기를 도입하여 별도의 기공형성제의 사용 없이 5 ㎛ 이상의 평균입경 및 0.4 g/㎤ 이하의 밀도를 갖는 다공성 고분자 미립구를 제조하는 방법을 제시하였고, 대한민국 특허공개 제2003-58431호는 첨가제를 이용하여 평균입경 1-6 ㎛의 인슐린 미세결정을 제조하는 방법을 제시하고 있으며, 미국특허 공개 제2003/0068277 A1호는 다중 양이온제를 치료제와 복합화시켜 얻어진 흡입용 서방형 복합체 입자를 제시하였다. 또한, 국제공개 제W001/13891호는 카르복실레이트, 인지질 및 다가 염, 또는 이온성 성분의 선택적인 첨가를 통해 기재 전이온도를 변경하여 호흡기계 투여용 약제의 방출을 조절하는 방법을 제시하고 있고, 문헌 [D. A. Edwords 등, Science, 276, 1868-1871, 1997] 는 폐 심부의 상피세포까지 도달할 수 있고 폐의 섬모운동과 식세포 작용에 의해 제거되지 않는 0.4 g/㎤ 이하의 밀도 및 5 ㎛ 이상의 평균입경을 갖는 다공성 약제 입자를 제시하였으며, 국제공개 제2004/060351호는 3 ㎛의 평균입경을 갖는 다공성 입자로 이루어진 폐흡입용 제제를 제시하였다. 또한, 문헌 [A.I. Bot 등, Pharm. Res., 17, 275-283, 2000]에는 크로몰린 소듐(cromolyn sodium), 알부테롤 설페이트(albuterol sulfate), 포모테롤 퓨마레이트(formoterol fumarate)를 분무건조하여 제조한 다공성 미립구가 개시되어 있으며, 문헌 [H.K. Kim 등, J. Control. Release, 112, 167-174, 2006]에는 생분해성 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체를 이용하여 다공성 미립구를 제조하는 방법이 제시되어 있다.

그러나, 상기 기존 다공성 입자들은 대부분 속방형이거나 약물의 변성을 초래하여 1일 이상 약물방출을 지속하지 못하거나, 전달과정에서 대식세포에 의해 쉽게 파괴되어 생체 이용률이 떨어지거나 특정 조건에서만 지속방출을 나타내어 1일 이상의 장기지속 방출 제제로 개발되기에는 한계가 있었다.

이에, 본 발명자들은 기존 호흡기계 약제전달을 위한 미세입자들에서 나타난 문제점들을 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 활성성분인 단백질 약물과 함께 사이클로덱스트린, 점성질의 친수성 고분자, 생분해성 고분자, 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB) 및 수성코팅물질을 포함하는 서방형 다공성 미세입자가 5 ㎛이상의 입경 크기를 나타내어 폐의 섬모운동과 식세포 작용에 의한 파괴를 방지하면서 낮은 밀도로 인해 폐심부 상피세포에 신속히 이동하여 약물의 안정성 유지 및 지속 방출을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폐의 섬모운동과 식세포 작용에 의한 파괴를 방지할 수 있 을 정도의 입경 크기를 가지면서 폐심부 상피세포에 신속히 이동하여 약물의 안정성 유지 및 지속 방출을 나타내는, 호흡기계 약제 전달을 위한 서방형 다공성 미세입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다공성 미세입자를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 5 내지 100 ㎛의 평균입경을 가지며,활성성분인 단백질 약물과 함께 사이클로덱스트린 유도체, 점성질의 친수성 고분자, 생분해성 고분자, 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB) 및 수성코팅물질을 포함하는, 서방형 다공성 미세입자를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는

1) 사이클로덱스트린 유도체, 점성질의 친수성 고분자 및 단백질 약물을 물에 용해시켜 내부 수상을 제조하는 단계;

2) 생분해성 고분자 및 SAIB를 유기용매에 가하여 유기상을 제조하는 단계;

3) 상기 단계 1)에서 얻어진 내부 수상 조성물과 단계 2)에서 얻어진 유기상 조성물을 혼합하여 1차 에멀젼을 제조하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서 얻어진 1차 에멀젼을 수성코팅물질이 포함된 외부수성 연속상에 분사하는 단계를 포함하는, 상기 서방형 다공성 미세입자를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자는 5 내지 100 ㎛의 평균 입경을 가지면서, 활성성분인 단백질 약물과 함께 사이클로덱스트린 유도체, 점성질의 친수성 고분자, 생분해성 고분자, SAIB 및 수성코팅물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이러한 본 발명의 서방형 다공성 미세입자는,

2) 생분해성 고분자 및 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)를 유기용매에 가하여 유기상을 제조하는 단계;

3) 상기 단계 1)에서 얻어진 내부 수상과 단계 2)에서 얻어진 유기상을 혼합하여 1차 에멀젼을 제조하는 단계; 및

4) 수성코팅물질을 물에 용해시켜 얻어진 외부수성 연속상에 상기 단계 3)에서 얻어진 1차 에멀젼을 분사하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 상기 서방형 다공성 미세입자의 제조방법을 각 단계 별로 상세히 설명한다.

단계 1) 내부 수상 제조

상기 단계 1)에서는 활성성분인 단백질 약물, 사이클로덱스트린 유도체 및 점성질의 친수성 고분자를 물에 용해시켜 내부 수상을 제조하게 된다.

1-1) 활성성분

본 발명의 서방형 다공성 미세입자에 포함될 수 있는 활성성분인 단백질 약물로는 200 내지 100,000 범위의 분자량을 가지면서 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 생체활성 단백질이면 어느 것이나 가능하며, 예를 들면 인간 성장 호르몬, 인슐린(insulin), 소 성장 호르몬, 돼지 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 과립구-콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지-콜로니 자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(macrophage-colony stimulating factor; M-CSF), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 골격 형태발생 단백질(bone morphogenic protein), 인터페론(interferon), 아트라이오펩틴(atriopeptin), 종양 괴사 인자(TNF), 마크로파지 활성인자(macrophage activating factor), 인터루킨(interleukin), 종양 변성인자(tumor degenerating factor), 인슐린-유사성장인자(insulin-like growth factor), 표면성장 인자(epidermal growth factor), 조직 플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민 및 그 단편, 아포리포단백질-E, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 췌장 폴리펩타이드, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라지나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 오스테오제닉 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌(calcitonin), 카틸리지 유도 인자, 결합 조직 활성인자, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체형성호르몬 방출 호르몬 및 그 동족체, 신경 성장 인자, 파라타이로이드 호르몬, 씨크레틴, 조마토메딘, 아드레노코티코트로픽 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 타이로이드 자극 호르몬, 각종 바이러스, 박테리아 및 독소 등에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 각종 바이러스 유래 백신 항원, 휴미라(humira), 레미케이드(remicade), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 이들의 염 및 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다.

활성성분인 단백질 약물은 본 발명의 미세입자 건조중량을 기준으로 1 내지 40 중량%, 바람직하게는 5 내지 25 중량%로 포함될 수 있다.

1-2) 사이클로덱스트린 유도체

본 발명의 미세입자의 기공형성에 결정적인 역할을 하면서 화학구조상 존재하는 공동 내에 단백질 약물을 포접하여 착체를 형성함으로써 제형화 공정시 일어날 수 있는 약물의 변성을 방지하기 위해 사용되는 사이클로덱스트린 유도체는, 예를 들면 3-모노-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (3-mono-O-methyl-cyclodextrin), 2,6-디-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (2,6-di-O-methyl-cyclodextrin), 2,3,6-트 라이-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-methyl-cyclodextrin), 2-하이드록시에틸-사이클로덱스트린 (2-hydroxyethyl-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-사이클로덱스트린 (2-hydroxypropyl-cyclodextrin), 3-하이드록시프로필-사이클로덱스트린 (3-hydroxypropyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-글루코실-사이클로덱스트린 (6-O-Glucosyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-말토실-사이클로덱스트린 (6-O-maltosyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-디말토실-사이클로덱스트린 (6-O-dimaltosyl-cyclodextrin), 2,6-디-오르쏘-에틸-사이클로덱스트린 (2,6-di-O-ethyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-에틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-ethyl-cyclodextrin), 2,3-디-오르쏘-헥사노일-사이클로덱스트린 (2,3-di-O-hexanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-아세틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-acetyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-프로파노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-propanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-부타노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-butanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-헥사노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-hexanoyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-카복시메틸-사이클로덱스트린 (6-O-carboxymethyl-cyclodextrin), 황산화된 사이클로덱스트린 (sulfated cyclodextrin), 설포부틸-사이클로덱스트린 (sulfobutyl-cyclodextrin), 이들의 유도체, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 2-하이드록시프로필-사이클로덱스트린 및 설포부틸-사이클로덱스트린의 유도체인 베타-사이클로덱스트린 설포부틸 에테르 소듐(β-cyclodextrin sulfobutyl ether sodium, 상품명: 캡티솔(CAPTISOL))일 수 있다.

사이클로덱스트린 유도체는 활성성분 1 중량부를 기준으로 2 내지 5 중량부의 양으로 포함될 수 있으며, 이때 2 중량부 미만인 경우에는 입자에 기공이 거의 형성되지 않으며, 5 중량부 초과인 경우에는 미세입자 형성이 어려울 수 있다.

1-3) 점성질의 친수성 고분자

유기상과의 혼합시 단백질 약물의 변성을 차단하면서 내부 수상에 점성을 부여하여 단백질 약물의 초기 방출을 억제하고 지속 방출을 유도하기 위해 본 발명에 포함되는 점성질의 친수성 고분자는, 약 340 내지 300,000 범위의 중량평균 분자량을 가지면서 독성이 적어 생체적합성이 우수한 고분자들로, 예를 들면 전분(starch), 펙틴(pectin), 잔탄검(xanthan gum), 커드란(curdlan), 젤라틴(gelatin), 덱스트란(dextran), 히아루론산(hyaluronic acid), 이들의 염, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 전분, 히아루론산 또는 젤라틴, 더 바람직하게는 전분일 수 있다.

점성질의 친수성 고분자는 활성성분 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 0.5 중량부, 바람직하게는 0.05 내지 0.2 중량부로 포함될 수 있다.

단계 2) 유기상 제조

상기 단계 2)에서는 생분해성 고분자 및 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)를 유기용매에 가하여 유기상을 제조하게 된다.

2-1) 생분해성 고분자

미세입자 형성시 약물을 봉입시키는 매트릭스 역할을 하는 생분해성 고분자는 2,000 내지 100,000의 중량 평균 분자량을 갖는 것으로, 통상적으로 체내에 투여되어 정상적인 생체 대사 과정인 시트르산 회로(citric acid cycle)를 통해 물과 이산화탄소로 분해됨으로써 생체 적합성 및 생체 분해성이 뛰어난 것을 사용할 수 있다(S. J. Holland 등, J. Controlled Release, 4, 155-180, 1986). 이러한 생분해성 고분자의 대표적인 예로는 폴리아크릴로일 하이드록시에틸 전분(poly(acryloyl hydroxyethyl) starch), 폴리부틸렌 테레프탈레이트-폴리에틸렌글리콜의 공중합체, 키토산(chitosan) 및 그의 유도체, 폴리오르쏘에스터-폴리에틸렌글리콜의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 테레프탈레이트-폴리부틸렌 테레프탈레이트의 공중합체, 폴리세바식언하이드라이드(poly sebacic anhydride), 풀루란(pullulan) 및 그의 유도체, 전분 및 그의 유도체, 셀룰로오스 초산염(cellulose acetate) 및 그의 유도체, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리에스터(polyesters), 폴리하이드록시부티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리메타크릴산 에스터(polymethacrylic acid ester), 폴리오르쏘에스터(polyorthoester), 폴리비닐초산(polyvinyl acetate), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐부티랄(polyvinyl butyral), 폴리비닐포 말(polyvinyl formal), 단백질(예: 알부민, 카제인, 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 젤라틴, 호모글로빈, 트랜스페린, 제인), 및 이들의 혼합물 등이 있으며, 바람직하게는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체 및 폴리카프로락톤등이 포함될 수 있다. 특히, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체는 분자량 10,000 및 20,000인 경우 폐흡입시 생체내 대사 반감기가 각각 4일 및 14일로 다른 생분해성 고분자들과 비교하여 짧은 편이어서(J. M. Anderson 등, Adv. Drug Delivery Rev., 28, 5-24, 1997) 약물의 장기 투여시 고분자의 불완전한 분해로 인해 발생될 수 있는 부작용을 해소할 수 있다.

생분해성 고분자는 유기용매에 5 내지 60 %(w/v), 바람직하게는 10 내지 30 %(w/v)의 농도 범위로 사용될 수 있다.

2-2) 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)

SAIB는 단백질 약물에 대한 친화성 및 점성을 갖는 생분해성 고분자로서 본 발명에 포함되어 단백질 약물의 방출을 지연시키는 역할을 한다.

SAIB는 유기용매에 5 내지 60 %(w/v), 바람직하게는 10 내지 30 %(w/v)의 농도 범위로 사용될 수 있으며, 이때 생분해성 고분자에 대한 SAIB의 혼합 중량비는 1:0.1 내지 1:1 바람직하게는 1:0.5일 수 있고, SAIB의 혼합비가 1:1 초과인 경우에는 미세입자 형성이 불가능하다.

2-3) 유기용매

유기용매로는 생분해성 고분자 및 SAIB와의 상분리가 일어나지 않도록 하는 혼화성을 갖는 것으로, 예를 들면 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 디메틸설폭사이드, 디메틸폼아마이드, 클로로폼, 알코올, 아세톤 및 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다.

단계 3) 1차 에멀젼 제조

단계 3)에서는 단계 2)에서 얻어진 유기상에 단계 1)에서 얻어진 내부 수상을 첨가한 후 격렬하게 교반하여 1차 에멀젼(W/O, water-in-oil)을 제조하게 되는데, 이때 내부 수상과 유기상의 혼합 부피비는 1:3 내지 1:30, 바람직하게는 1:5 내지 1:15 범위일 수 있다.

단계 4) 2차 에멀젼 제조

단계 4)에서는, 단계 3)에서 얻어진 1차 에멀젼을 수성코팅물질을 포함하는 외부 수성 연속상(continuous phase)에 첨가하여 2차 에멀젼(W/O/W, water-in-oil-in-water)을 제조하며, 이렇게 얻어진 2차 에멀젼 중에 생성된 고형물을 여과 또는 원심분리 등에 의해 분리한 후 건조시켜 본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자를 제조하게 된다.

4-1) 수성코팅물질

수성코팅물질은 단계 3)에서 얻어진 1차 에멀젼을 외부 수성 연속상에 첨가시 상분리가 일어나지 않도록 하기 위해 사용되며, 이러한 수성코팅물질의 예로는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 세틸트라이메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate) 등이 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알코올이 포함될 수 있다. 특히, 폴리비닐알코올의 경우 10,000 내지 100,000, 바람직하게는 13,000 내지 50,000의 중량평균 분자량, 및 75 내지 95%, 바람직하게는 83 내지 89% 범위의 가수분해도를 갖는 것이 바람직하다.

수성코팅물질은 0.1 내지 5%(w/v), 바람직하게는 0.3 내지 2%(w/v) 농도 범위의 수용액(외부수성 연속상)으로 제조되어 사용된다.

4-2) 염화나트륨

본 발명의 미세입자 내 삼투압을 조절하기 위해, 상기 외부수상 연속상에 0.1 내지 10%(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 1.0%(w/v)의 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자는 20 ㎛내외의 충분한 입경 크기로 대식세포에 의한 파괴를 줄이고, 사이클로덱스트린 유도체를 적정량 함유하여 다공 성을 확보함은 물론 단백질 약물을 안정하고 균일하게 함유하여 폐심부까지 약물을 이동시킬 수 있으며, SAIB를 함유함으로써 약물의 봉입효율이 우수할 뿐 아니라 약물의 초기 방출을 억제하여 장기간, 길게는 일주일간 지속 방출이 가능하므로 호흡기계 약물 전달 제형으로 유용하게 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

2.5% 전분 수용액 1.0 ml에 캡티솔(CAPTISOL, CyDex 사) 200 mg 및 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA) 50 mg을 용해시켜 내부 수상 조성물을 제조하였으며, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체(락트산:글리콜산의 몰비 = 50:50) RG504H(분자량: 45,000, Boehringer Ingelheim 사) 300 mg 및 SAIB(Aldrich 사) 150 mg을 디클로로메탄 3 ml에 가하여 유기상 조성물을 제조하였다. 상기 유기상 조성물에 내부 수상 조성물을 가한 후 격렬하게 교반하여 1차 에멀젼을 제조하였으며, 0.5%(w/v) 폴리비닐알코올 및 0.9%(w/v) 소듐 클로라이드를 물에 녹여 만든 외부 수성 연속상 조성물에 상기 1차 에멀젼 용액을 200:1의 부피비로 분사한 후 4,000 rpm에서 5분 동안 교반시켜 2차 에멀젼을 제조하였다. 얻어진 2차 에멀젼을 3,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 고형물을 분리한 후 분리된 고형물을 동결건 조기에서 48시간 동안 건조시켜 본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 1

2.5% 전분 수용액 대신 0.25% 히아루론산 수용액을 사용하고, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체(락트산:글리콜산의 몰비 = 50:50) RG504H 300 mg 및 SAIB(Aldrich 사) 150 mg 대신 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체(락트산:글리콜산의 몰비 = 50:50) RG 502H(분자량: 7,800, Boehringer Ingelheim 사) 300 mg 및 RG504H 100 mg을 사용하는 것을 제외하고, 상기 실시예와 동일한 공정을 수행하여 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 2

캡티솔을 200 mg으로 사용하는 것을 제외하고, 상기 비교예 1과 동일한 공정을 수행하여 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 3

캡티솔을 300 mg으로 사용하는 것을 제외하고, 상기 비교예 1과 동일한 공정을 수행하였다.

그 결과, 과량의 캡티솔의 함유로 인해 미세입자가 형성되지 못하였다.

비교예 4

폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체 RG 502H 및 RG504H를 각각 150 mg으로 사용하는 것을 제외하고, 상기 비교예 2와 동일한 공정을 수행하여 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 5

0.25% 히아루론산 수용액을 1.5 ml로 사용하는 것을 제외하고, 상기 비교예 3과 동일한 공정을 수행하여 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 6

캡티솔을 250 mg으로 사용한 것을 제외하고, 상기 비교예 4와 동일한 공정을 수행하여 다공성 미세입자를 제조하였다.

비교예 7

캡티솔을 사용하지 않은 것을 제외하고, 상기 비교예 1과 동일한 공정을 수행하여 미세입자를 제조하였다.

비교예 8

SAIB를 사용하지 않은 것을 제외하고, 상기 실시예와 동일한 공정을 수행하여 미세입자를 제조하였다.

시험예 1: 약물의 봉입률(loading efficiency) 측정

상기 실시예, 및 비교예 1, 2 및 4 내지 8에서 제조된 다공성 미세입자를 대상으로 약물에 대한 봉입률을 다음과 같이 측정하였다.

상기 다공성 미세입자 10 mg씩을 취하여 각각 디클로로메탄 0.5 ml이 담긴 뚜껑 달린 시험관에 넣고 충분히 용해시킨 후, 여기에 6 M 염산 5 ml을 가하여 1 시간 동안 격렬히 교반하였다. 얻어진 용액을 5000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액 1 ml씩을 취하여 37℃ 진탕항온수조(shaking water bath)에서 24시간 동안 분당 60회 속도로 진탕하였다. 여기에 각각 1 M 수산화나트륨 용액 6 ml을 가하여 24시간 동안 동일조건으로 진탕한 후, 얻어진 반응생성물 50 ㎕씩을 4%(w/v) 소듐 바이카보네이트 (sodium bicarbonate) (pH 9.0) 125 ㎕ 및 0.5 %(w/v) 트라이나이트로벤젠설폰산 용액 50 ㎕과 혼합하여 2시간 동안 실온에 방치하였다. 얻어진 시험용액들을 대상으로 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 λ=450 nm에서 흡광도를 측정하여 약물 농도를 산출하였고, 산출된 약물농도를 근거로 계산된 미세입자 내 봉입된 약물의 양을 하기 수학식 1 및 2에 대입하여 미립입자 내 약물의 함유율 및 봉입효율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

약물 함유율(%) = (미세입자 내 봉입된 약물의 양/미세입자의 총량)×100

약물의 봉입 효율(%) = (미세입자 내 봉입된 약물의 양/제조에 사용된 약물의 양)×100

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 점성질의 친수성 고분자로 히아루론산을 사용한 비교예 1, 2 및 4 내지 6의 다공성 미세입자의 경우에는 약 60% 가량의 약물 봉입 효율을 갖는 반면, 사이클로덱스트린 유도체를 포함하지 않음으로 인해 비다공성 미세입자를 이룬 비교예 7, 점성질의 친수성 고분자로 전분을 사용한 비교예 8, 및 실시예의 다공성 미세입자의 경우에는 봉입 효율이 87 내지 91%까지 증가함을 확인하였다.

시험예 2: 입자의 다공성 관찰 및 평균입경 측정

상기 실시예, 및 비교예 1, 2 및 4 내지 8에서 제조된 다공성 미세입자를 대상으로 주사전자현미경(scanning electron microscope; SEM) 촬영을 통해 입자의 다공성 정도를 관찰하여 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었으며, 각 미세입자 표본집단을 무작위로 선정하여 직경을 측정함으로써 평균입경을 산출하여 하기 표 2에 나타내었다.

그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 사이클로덱스트린이 포함되지 않은 경우에는 미세입자의 다공성 확보가 어렵고(도 2, 비교예 7(a)), 사이클로덱스트린의 함량이 높아질수록 다공성이 높아짐을 확인하였으며(도 1, 비교예 1(a) 및 2(b)), 이로 인해 사이클로덱스트린의 함량이 너무 높은 비교예 3의 경우에는 입자 형성이 불가능함을 알 수 있다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 이러한 다공성은 사이클로덱스트린 유도체외에도 점성질의 친수성 고분자 및 생분해성 고분자의 함량 등에 의해서도 영향을 받는 것을 확인하였다(도 1, 비교예 4(c), 5(d), 6(e 및 f)). 한편, 도 2의 (b)에 나타낸 바와 같이, 실시예에서 제조된 본 발명의 다공성 미세입자는 호흡기계 약제 전달 제형으로 사용되기에 적합한 다공성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 고분자 미립구는 호흡기계 약제 전달 제형으로 사용되기에 적합한 20 ㎛ 내외의 평균입경을 가짐을 확인하였다.

시험예 3: 약물의 시험관내( in vitro ) 방출 실험

상기 실시예, 및 비교예 4, 5, 6 및 8에서 제조된 다공성 미세입자를 대상으로 다음과 같이 시험관내(in vitro) 조건에서 단백질 약물의 방출 속도를 확인하였다.

각 미세입자 40 mg을 0.033 M 인산염 수용액(pH 7.4, 0.01% 소듐아자이드, 0.02% 트윈 80) 10 ml이 든 시험관에 넣고 밀봉한 다음 37℃ 진탕항온수조에서 분당 60회 속도로 60일 이상 진탕하여 단백질 약물 방출을 확인하였다. 이때, 진탕과정 중 매 단위시간마다 방출된 약물이 포함된 방출액을 5 ml씩 취하고 새로운 인산염 용액을 동량으로 보충해 주었다. 얻어진 방출액을 대상으로 마이크로 BCA 시약 키트(micro BCA reagent kit, PIERCE사)를 사용하여 방출된 약물의 농도를 측정하였으며, 각 단위 시간별 누적 방출량을 산출하여 시간에 따른 약물 방출 속도를 도 3 및 4에 나타내었다.

그 결과, 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, SAIB를 포함하지 않은 비교예 4, 5, 6 및 8의 다공성 미세입자의 경우에는 4시간 이내의 속방형 방출을 나타낸 반면, SAIB를 사용한 실시예의 다공성 미세입자의 경우에는 약물 방출이 효과적으로 지연되어 7일 이상의 지속적인 서방형 방출을 나타냄을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 서방형 다공성 미세입자는 20 ㎛내외의 충분한 입경 크기로 대식세포에 의한 파괴를 줄이고, 사이클로덱스트린 유도체를 적정량 함유하여 다공성을 확보함은 물론 단백질 약물을 안정하고 균일하게 함유하여 폐심부까지 약물을 이동시킬 수 있으며, SAIB를 함유함으로써 약물의 봉입효율이 우수할 뿐 아니라 약물의 초기 방출을 억제하여 장기간, 길게는 일주일간 지속 방출이 가능하므로 호흡기계 약물 전달 제형으로 유용하게 활용될 수 있다.

Claims

5 내지 100 ㎛의 평균입경을 가지며, 활성성분인 단백질 약물과 함께 사이클로덱스트린 유도체, 점성질의 친수성 고분자, 생분해성 고분자, 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB) 및 수성코팅물질을 포함하는, 서방형 다공성 미세입자.
1) 사이클로덱스트린 유도체, 점성질의 친수성 고분자 및 단백질 약물을 물에 용해시켜 내부 수상을 제조하는 단계;

2) 생분해성 고분자 및 수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)를 유기용매에 가하여 유기상을 제조하는 단계;

3) 상기 단계 1)에서 얻어진 내부 수상과 단계 2)에서 얻어진 유기상을 혼합하여 1차 에멀젼을 제조하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서 얻어진 1차 에멀젼을 수성코팅물질이 포함된 외부수성 연속상에 분사하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 서방형 다공성 미세입자를 제조하는 방법.
제 2 항에 있어서,

단백질 약물이 인간 성장 호르몬, 인슐린(insulin), 소 성장 호르몬, 돼지 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 과립구-콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지-콜로니 자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(macrophage-colony stimulating factor; M-CSF), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 골격 형태발생 단백질(bone morphogenic protein), 인터페론(interferon), 아트라이오펩틴(atriopeptin), 종양 괴사 인자(TNF), 마크로파지 활성인자(macrophage activating factor), 인터루킨(interleukin), 종양 변성인자(tumor degenerating factor), 인슐린-유사성장인자(insulin-like growth factor), 표면성장 인자(epidermal growth factor), 조직 플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민 및 그 단편, 아포리포단백질-E, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 췌장 폴리펩타이드, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라지나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 오스테오제닉 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌(calcitonin), 카틸리지 유도 인자, 결합 조직 활성인자, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체형성호르몬 방출 호르몬 및 그 동족체, 신경 성장 인자, 파라타이로이드 호르몬, 씨크레틴, 조마토메딘, 아드레노코티코트로픽 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 타이로이드 자극 호르몬, 바이러스, 박테리아 또는 독소에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 바이러스 유래 백신 항원, 휴미라(humira), 레미케이드(remicade), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 이들의 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징 으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

단백질 약물이 본 발명의 미세입자 건조중량을 기준으로 1 내지 40 중량%로 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

사이클로덱스트린 유도체가 3-모노-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (3-mono-O-methyl-cyclodextrin), 2,6-디-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (2,6-di-O-methyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-메틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-methyl-cyclodextrin), 2-하이드록시에틸-사이클로덱스트린 (2-hydroxyethyl-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-사이클로덱스트린 (2-hydroxypropyl-cyclodextrin), 3-하이드록시프로필-사이클로덱스트린 (3-hydroxypropyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-글루코실-사이클로덱스트린 (6-O-Glucosyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-말토실-사이클로덱스트린 (6-O-maltosyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-디말토실-사이클로덱스트린 (6-O-dimaltosyl-cyclodextrin), 2,6-디-오르쏘-에틸-사이클로덱스트린 (2,6-di-O-ethyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-에틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-ethyl-cyclodextrin), 2,3-디-오르쏘-헥사노일-사이클로덱스트린 (2,3-di-O-hexanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-아세틸-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-acetyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘- 프로파노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-propanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-부타노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-butanoyl-cyclodextrin), 2,3,6-트라이-오르쏘-헥사노일-사이클로덱스트린 (2,3,6-tri-O-hexanoyl-cyclodextrin), 6-오르쏘-카복시메틸-사이클로덱스트린 (6-O-carboxymethyl-cyclodextrin), 황산화된 사이클로덱스트린 (sulfated cyclodextrin), 설포부틸-사이클로덱스트린 (sulfobutyl-cyclodextrin), 이들의 유도체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

사이클로덱스트린 유도체가 활성성분 1 중량부를 기준으로 2 내지 5 중량부의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

점성질의 친수성 고분자가 340 내지 300,000 범위의 중량평균 분자량을 갖는 전분(starch), 펙틴(pectin), 잔탄검(xanthan gum), 커드란(curdlan), 젤라틴(gelatin), 덱스트란(dextran), 히아루론산(hyaluronic acid), 이들의 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,

점성질의 친수성 고분자가 전분임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

점성질의 친수성 고분자가 활성성분 1 중량부를 기준으로 0.01 내지 0.5 중량부로 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

생분해성 고분자가 2,000 내지 100,000의 평균 분자량을 갖는 폴리아크릴로일 하이드록시에틸 전분(poly(acryloyl hydroxyethyl) starch), 폴리부틸렌 테레프탈레이트-폴리에틸렌글리콜의 공중합체, 키토산(chitosan) 및 그의 유도체, 폴리오르쏘에스터-폴리에틸렌글리콜의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 테레프탈레이트-폴리부틸렌 테레프탈레이트의 공중합체, 폴리세바식언하이드라이드(poly sebacic anhydride), 풀루란(pullulan) 및 그의 유도체, 전분 및 그의 유도체, 셀룰로오스 초산염(cellulose acetate) 및 그의 유도체, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리에스터(polyesters), 폴리하이드록시부티르산(polyhydroxybutyric acid), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리메타크릴산 에스터(polymethacrylic acid ester), 폴리오르쏘에스터(polyorthoester), 폴리비닐초산(polyvinyl acetate), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐부티랄(polyvinyl butyral), 폴리비닐포말(polyvinyl formal), 알부민, 카제인, 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 젤라틴, 호 모글로빈, 트랜스페린, 제인, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

생분해성 고분자가 유기용매에 5 내지 60 %(w/v)의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

수크로스 아세테이트 이소부틸레이트(SAIB)가 유기용매에 5 내지 60 %(w/v)의 농도로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

생분해성 고분자에 대한 SAIB의 혼합 중량비가 1:0.1 내지 1:1임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

유기용매가 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 디메틸설폭사이드, 디메틸폼아마이드, 클로로폼, 알코올, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

단계 2)에서 얻어진 유기상과 단계 1)에서 얻어진 내부 수상의 혼합 부피비가 1:3 내지 1:30 범위임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

수성코팅물질이 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 세틸트라이메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate)로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

외부수성 연속상 조성물이 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 수성코팅물질을 포함하는 수용액임을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,

외부수성 연속상 조성물이 0.1 내지 10%(v/v)의 염화나트륨을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.