KR20070094612A - Ｍｈｃ－ｉｉ 유전자이식된 동물들에서의 내성을 연구하는방법들 - Google Patents
Ｍｈｃ－ｉｉ 유전자이식된 동물들에서의 내성을 연구하는방법들 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20070094612A KR20070094612A KR1020077014189A KR20077014189A KR20070094612A KR 20070094612 A KR20070094612 A KR 20070094612A KR 1020077014189 A KR1020077014189 A KR 1020077014189A KR 20077014189 A KR20077014189 A KR 20077014189A KR 20070094612 A KR20070094612 A KR 20070094612A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- human
- antigen
- immunogenicity
- mutated
- transgenic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 17
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 99
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 87
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 161
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 155
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 38
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 33
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 19
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 14
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 10
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 2
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 claims 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 claims 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 abstract description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 6
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 28
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 22
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 18
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 6
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 5
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010093013 HLA-DR1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000009322 somatic translocation Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037007 arousal Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
Abstract
변이된 항원들의 면역원성을 테스트 하는 신규한 방법들이 제공되었다. 특히, 유전자이식된 동물들의 사용에 기초하는 방법들이 제공되는데, 상기 유전자이식된 동물들은 특별한 항원에 내성화되고 이후 상기 항원들의 변이체들에 노출되어 면역 반응들이 결정된다. 일 실시예에서는 상기 유전자이식된 동물은 인간 MHC 클래스 Ⅱ 분자들로 유전자 이식된 마우스이고 변이된 항체들의 라이브러리들의 면역원성이 테스트 된다.
면역원성, 항원, 항체, 유전자이식, 마우스, MHC, 내성
Description
본 발명은 단백질 변이체(protein variants)들의 면역원성(immunogenicity)을 테스트하는 생체 내(in vivo) 시스템과 관련이 있다. 특히, 본 발명은 인간 MHC 클래스 Ⅱ 분자들로 유전자이식된(transgenic) 마우스들을 사용하는 방법들과 관련이 있는데, 상기 마우스들은 특이(specific) 단백질에 내성을 가지도록 만들어지고, 이후, 면역원성의 유도를 위해서 상기 특이 단백질의 변이체들로 테스트된다. 게다가, 본 발명은 유도된 면역원성에 대한 단백질 변이체들의 라이브러리로 부터 단백질들을 선택하는 생체 내 시스템들과 관련이 있는데, 내성화된 인간 MHC 유전자이식된 마우스들은 셀 라인(cell line)들의 라이브러리(library)들 또는 다른 변이된 단백질들로 결합된 입자들을 주입받는데, 특이 셀 라인들 또는 다른 단백질들 보다 낮은 면역원성을 가지는 변이된 단백질들로 결합된 입자들은 생체 내에서 선택된다.
인간들에 잠재적인 면역원성에 대한 후보의 제약(phamaceutical) 단백질들을 테스트하는 현재의 방법들은 일차적으로 제한되는데, 이는 비-인간(non-human) 종들은 인간들과 다른 MHC(major histocompatibility antigen) 분자들을 가지고 있고, 주입된 단백질들에 대한 테스트 동물들에서의 이뮨 응답(immune response)들은 동일한 단백질들에 대한 인간들에서의 예상되는 이뮨 응답들을 반영하지 않기 때문이다. 따라서, 인간 셀들 또는 인간 MHC를 가진 셀들을 사용하여 면역원성에 대하여 단백질들을 테스트하는 것이 중요하다. 특히 가치있는 접근은 인간 혈액 샘플들을 사용하여 T 셀 증식 아쎄이(assay)들에서 단백질들을 테스트하는 것이다. 그러나, 이러한 접근은 생체 외(in vitro)에 상기 테스트 단백질에 대한 T 셀 응답들을 측정하고, 아직까지는 생체 내에서 발생하는 것처럼 항체(antibody)들의 생성을 초래하는 어떠한 생체 외 면역원성 방법들은 보여주지 않았다. 대안의 접근들은 인간 T 및 B 셀들로 재구성되거나 유전자이식된 마우스(mouse)들을 사용할 수 있는데, 잔류의 마우스 MHC 및 어떤 경우, 상기 T 셀 수용체(receptor) 분자들은 그것의 인간 대응되는 부분들에 의해서 교체된다. 그러나, 이러한 접근들은 인간들에서의 면역원성의 정확한 예측을 이끌어 내지 못할지도 모르는데, 이는 이러한 접근들은 내성, 특히 정상의 인간 단백질들에 대한 인간 면역 시스템에서의 내성을 고려하지 않기 때문이다. 예를 들어, 인간 MHC로 유전자이식된 마우스는 주입된 인간 단백질에 대하여 면역응답을 장착하는(mount) 것을 여전히 기대되는데, 이는 상기 마우스는 상기 인간 단백질에 대한 내성이 없기 때문이다. 따라서, 단백질들 및 단백질 변이체를 테스트하는 생체 내 면역원성을 용이하게 하는 향상된 방법이 필요한데, 상기 단백질들 및 단백질 변이체들은 상기 종(species)에서의 단백질들에 대한 평범한 내성을 고려한다.
따라서, 본 발명의 제 1 면은 포유동물의 항원(mammalian antigen)으로 부터 유래된, 상기 포유동물의 MHC 클래스 Ⅱ 분자들로 유전자이식된 비-인간 포유동물에서, 변이된 항원의 면역원을 테스트하는 방법을 제공하는데, 상기 비-인간 포유동물은 상기 포유동물 항원의 출처(source)가 아니고, 상기 방법은
(a) 상기 포유동물 항원에 대한 내성을 가진 상기 유전자이식된 포유동물을 상기 포유동물 항원에 접촉을 통하여 렌더(render)하는 단계;
(b) 상기 변이된 항원에 상기 유전자이식된 포유동물을 접촉하는 단계; 및
(c) 상기 유전자이식된 포유동물 안에서 상기 변이된 항원의 면역원성을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 예를 들어, 단백질들 및 단백질 변이체들의 면역원성을 테스트하는 새로운 생체 내 시스템을 제공한다. 여기서 설명하였듯이, 상기 변이된 항원은 포유동물 항원으로 부터 유래된다. 변이된 항원들은 단백질 또는 폴리펩티드 시퀀스들을 포함할 수 있는데, 상기 단백질 또는 폴리펩티드 시퀀스들은 첨가제(additions)들, 제거제(deletion)들 또는 치환제(substitution)들을 가지거나, 화학적 수단들에 의해서 유도체화(derivatised)된다. 상기 항원은 상기 방법에 사용되는 비-인간 유전자이식된 포유동물로 부터 출처되지 않는다.
특히, 상기 발명은 인간 T 셀 항원결정인자(epitope)들의 전달(presentation)을 허락하는 인간 MHC 클래스 Ⅱ 분자들로 유전자이식된 마우스들을 사용하는 방법들 및 마우스 배경(backround)에서 인간 단백질들 및 단백질 변이체들에 대한 잠재적인(potential) 면역원성을 테스트하는 방법들과 관련이 있다.
본 발명의 하나의 실시예에서는 인간 단백질에 대한 내성은 저농도(예를 들어, 인간 혈청(serom) 및/또는 다른 조직(tissue)에서 발견되는 생리적인(physiological) 양들과 동일한 농도)의 단백질을 주입함으로써 점라인(germline) 인간 MHC 클래스 Ⅱ(HLA-tg) 유전자들을 발현시키는 신생아(neonatal) 마우스에서 유도된다. 단백질들은 바람직하게는 단량체(monomer)이며, 식염수(saline) 또는 포스페이트-버퍼드(phosphate-buffered) 식염수와 같은 면역적으로 "불활성의(inert)" 완충액 안에서 정맥주사로(intravenously) 투여된다. 상기 시스템들에서 내성을 유도하는 투약(dose)의 횟수(frequency)는 내성이 유도되는 단백질에 따라서 다양할 것이다. 예를 들어, 높은 혈청 농도들에 일반적으로 나타내는 단백질들은 낮은 생리적인 농도들에서 일반적으로 발견되는 단백질들 보다 내성을 유도하기 위해서 더 자주 투여될 필요가 있다.
바람직하게, 미숙의 마우스(예를 들어, 신생아 마우스)들은 내성의 단백질들이 T셀 성장동안 전달되고, 중심 내성(central tolerance)을 유도하는 것을 보장하기 위해서 사용된다.
전형적으로 마우스들은 6주의 나이까지 반복되는 투여가 주어질 것인데, 가슴샘(thymus)으로 부터 성숙한 CD4+ 및 CD8+ T 셀들의 생성물은 (일반적으로 성장했을 때) 감소된다. 테스트 단백질 또는 불변 형태의 테스트 변이된 단백질들에 대한 내성을 수립하였을 때, 내성화된 마우스들은 이후, 상기 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들을 주입받고, 결과적으로 상기 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들에 대하여 면역원성이 테스트될 것이다. 무손상의(intact) 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자(gene)들을 가지는 마우스들에 있어서, 면역원성은 상기 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들에 대한 항체들의 생성물에 의해서 측정될 수 있다. 대안적으로, 면역원성과 관련된 다른 측정들은 내성화된 테스트 단백질-특이 T 또는 B 셀 응답들을 HLA-tg 마우스들로 부터 말초(peripheral) 혈액, 지라(spleen) 또는 Peyer's Patch를 사용하여 측정하는 아쎄이들로 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 내성은 관심 단백질에 대하여 인간 이식유전자을 발현시키는 마우스들에 인간 HLA-tg 마우스들을 역교배(backcrossing)하여 마우스들에서 유도된다. 예를 들어, 인간 IgG를 발현시키는 인간 HLA-tg 마우스들은 생산될 수 있는데, 상기 마우스들은 인간 IgG에 대해서 내성을 가진다. 인간 IgG는 가변(variable;V) 부위(region) 체세포 돌연변이(somatic mutation), 전위(translocation) 또는 재배열(rearrangement) 또는 클래스 스위칭(class switching)에 의한 불변(constant;C) 부위의 변화를 허락하는 방법에서 발현되지 않는데, 이후, 상기 마우스들은 발현되는 특이 인간 IgG 시퀀스들에 내성을 가질 것이나, 어떤 인간 가변 부위 체세포 돌연변이, 전위 또는 재배열 또는 클래스 스위칭에 의한 불변 부위의 변화에 내성을 가지지 않을 것이다. 인간 IgG가 가변 부위 체세포 돌연변이, 전위 또는 재배열들 또는 불변 부위 클래스 스위칭을 허락하는 방법으로 발현되는데, 이후, 상기 마우스들은 특이 점라인 가변 부위 및 불변 부위 시퀀스를 포함하는 특이 인간 IgG 뿐만 아니라, 친화력 성숙(affinity maturation)을 겪고 어떤 항원에 대해서 특이성을 가지는 인간 IgG에 대하여 내성을 가진다.
상기 조건들에서 내인성(endogenous) 인간 MHC 클래스 Ⅱ를 발현시키는 유전자이식된 마우스 및 인간 MHC 클래스 Ⅱ에서의 중심 내성이 달성될 수 있는 인간 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 마우스 유전체(genome)와 합쳐지는 (관심 인간 단백질을 인코딩하는)인간 이식유전자의 복사본의 수 또는 상기 이식유전자의 발현의 (전사 및 유전암호해독 및 마우스 유전체 안에 이식유전자들의 위치지정(localisation)의 효율성과 같은 다른 요인들에 의해서 결정되는) 효율은 발현되는 단백질의 양을 결정할 것이며, 이식유전자의 '생리적인 양들'을 발현하는 마우스들만이 HLA-tg 마우스들에 역교배되는 것을 위하여 선택되어지도록, 상기 인간 이식유전자(transgene)에 대한 다양한 발현 레벨에 따른 마우스들을 생산하기 위해서, 다양해 질 수 있다.
HLA-tg 마우스들에서 인간 단백질들로 내성을 유도하기 위해서, 상기 주입 또는 이식유전자 접근들 중에 어느 하나를 사용하고, 단일(single) 인간 MHC 클래스 Ⅱ 대립유전자(allele)를 발현시키는 마우스들을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 앞에서 기술한 과정들은 단일 MHC 클래스 Ⅱ 동종이형(allotype)을 각각 발현시키는 마우스들의 패널(panel)에서 내성을 유도하는데 적용된다. 다발(multiple) HLA-tg 마우스들은 인간 MHC 클래스 Ⅱ 동종이형의 필요로 하는 만큼의 비율의 집합 범위가 달성되도록 선택될 것이다. 본 발명의 범위 내에서 특이 관심(of interest) 단백질 또는 단백질 변이체에 내성을 가지는 HLA-tg 마우스들을 나타내기 위해서 다른 방법들이 적용될 수 있는데, 다른 방법들은 상기 특이 단백질에 내성을 가지는 특이 백혈구(leucocyte)들을 유도하는 방법, 상기 특이 단백질에 반응하는 특이 백혈구들을 제거하는 방법 및 내성이 유도되도록 상기 특이 단백질 또는 변이체들에 노출되는 동안 면역 시스템을 조정하는 방법을 포함한다는 것을 이해할 수 있다. 또한, 가능한한, 상기 특이 테스트 단백질 및 단백질 변이체들의 마우스 동종(homologues)들을 발현시키지 않는 마우스들은 상기 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들에 대한 상기 마우스들의 어떤 선천적인(inherent) 내성을 피하기 위해서, 본 발명에 사용되는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 앞서의 실시예들로부터의 내성화된 HLA-tg 마우스들은 특이 단백질들 또는 단백질 변이체들의 면역원성을 테스트하거나, 면역원성에 대한 단백질 변이체들의 세트(set)의 순위를 매기는 다양한 방법으로 사용될수 있다는 것을 이해할 것이다. 특이 단백질에 내성화된 마우스들에서, 면역원성은 상기 단백질의 변이체들에서 테스트될 수 있는데, 상기 변이체들은 상기 단백질 내에 아미노산 변화들을 가지는 변이체들, 디아미데이션(deamidation) 또는 글리코시레이션(glycosylation)과 같은 아미노산의 변형들에서의 차이점들, 형성(formulation)의 차이점들, 물리적인 차이점들(예를 들어, 응집(aggregation)에서의 차이점들) 또는 면역원성을 초래할 수 있는 어떤 다른 차이점들을 가지는 변이체들을 포함한다. 특히, 높은 및 오래 지속된 투여의 결과들은 내성화된 마우스들에 대하여 농도들을 증가시킬때, 관심 단백질의 투입에 의해서 결정된다. 투입의 루트(route)와 관련이 있는 면역원성은 또한 조사될 수 있는데, 단백질들은 내성화된 마우스의 다른 위치들에 투입될 수 있고, 결과로서의 면역원성은 평가될 수 있다. 내성화된 마우스들에서의 면역원성의 분석은 다양한 방법들에 의해서 수행될 수 있는 것이 이해될 수 있는데, 상기 방법들은 항체들로서 상기 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들의 주입 후에 마우스들로부터의 혈액 샘플들 또는 (Peyer's Patch, 지라와 같은) 다른 조직 샘플들을 (ELISA, RIPA, FACS 및 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해서) 테스트 하는 것, T 셀 증식(proliferation) 또는 활성(activation)에 대하여 테스트 하는 것, 단백질-반응(protein-reactive) T셀들의 생성물을 예를 들어, 특이 펩타이드-MHC 복합체(complex)들의 결합에 의해서 테스트하는 것, 시토카인(cytokine) 생성물, 증식, 셀 표면 지표 발현(cell surface marker expression), Ca2+플럭스(flux), PCR 또는 DNA 핑거프린팅(fingerprintin)을 측정함으로써, T 또는 B 셀의 테스트 하는 것, 특이 면역 반응 B 또는 T 셀들의 각성에 대해서 테스트 하는 것 또는 어떤 다른 방법에 의해서 면역원성을 테스트하는 것을 포함한다. 무손상 기능(functional) 면역글로불린 유전자들을 가진 내성화된 마우스들에 대한 면역원성의 분석은 단일 테스트 단백질의 주입 및 항체들의 생산에 의하여 면역원성의 측정에 의하여 실행될 수 있다는 것을 이해할 수 있는데, 상기 분석은 예를 들어, 주입된 테스트 단백질에 결합하는 항체들의 구성(formation)의 측정에 의하여, 또는 대안적으로 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들의 혼합물의 주입에 의하여, 예를 들어, 특이 단백질들 또는 단백질 변이체들에 결합을 위하여 상기 주입된 혼합물에 대한 응답으로 상기 혼합물 안에 형성된 항체들을 테스트하는 것에 의하여 (예를 들어, 개개의 테스트 단백질 또는 단백질 변이체들의 배열(array)들 위로 면역탁본(immunoblotting)에 의하여; 또는 주입된 마우스들로부터 항체들 또는 항체 시퀀스(sequence)들을 분리(isolate)하는 것 및 개개의 테스트 단백질들 또는 단백질 변이체들에 결합하는 것을 위하여 상기 항체들의 결합의 특이성을 결정하는 것에 의하여) 실행될 수 있다.
본 발명은 다른 인간(또는 인간화(humanised)) 단클론(monoclonal) 항체들 또는 조각(fragment)들의 면역원성 테스트에 특별히 적합할 것인데, HLA-tg 마우스들은 인간 단클론 항체 시퀀스들에 내성을 가지는데, 상기 마우스들은 이후, 가변 부위들에서 체세포 돌연변이(또는 넌-점-라인(non-germ-line) 돌연변이들, 전사 또는 재배열)를 가지는 인간 항체들과 연합된 가변 부위 돌연변이에 반응할 수 있다. 이 경우, 제거된 또는 발현시키지 않는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자들을 가진 마우스들이 더 선호될 것이다. 상기와 같이, 본 발명은 특히 면역원성이 없는 또는 낮은 레벨 면역원성을 가진 상기 항체들을 식별하기 위해서 인간 또는 인간화 단클론 항체들의 판넬들 또는 라이브러리들의 비교 면역원성을 테스트하는 것에 적합하다. 특히, 동일한 마우스 안에 주입되는 다른 인간(또는 인간화) 단클론 항체들 또는 조각들의 혼합물을 테스트하고, 예를 들어, 면역탁본법에 의하여, 상기 혼합물 안에 있는 개개의 항체들의 면역원성을 결정하는, 본 발명의 편리함은 항체들의 큰 라이브러리들의 빠른 분석에 특별히 적합하다. 박테리오파지(bacteriophage), 셀들, 또는 다른 입자들과 같은 입자들에 표시되는 항체들에 대하여, 본 발명은 바람직하게(하지만 필수적이지 않다) 상기 표시 입자에 항체 라이브러리들의 직접적인 주입을 포함하는데, 상기 마우스는 상기 주입된 입자에 내성을 가진다.
본 발명의 확장으로서, 관심 단백질 또는 단백질 변이체에 대하여 추가적으로 유전자이식된 HLA-tg 마우스들은 특이 HLA 배경, 예를 들어, 인간 HLA에 비례해서 발생되며, 내성을 가지는 단백질 변이체들의 발생에 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간 단클론 항체들은 인간 HLA의 배경에서 항원의 주입을 수행하여 성장시킬수 있는데, 이는 상기 점라인 인간 IgG가 이어지는 V 부위 체세포 돌연변이, 전사 또는 재배열들 또는 C 부위 클래스 전환을 허용하는 방법에 의해서 발현된다. 마우스들은 이후 상기 마우스들에서 발현된 상기 인간 HLA의 상황에서, 인간 IgG에 내성을 가지게 될 것인데, 상기 인간 IgG는 겪게되는 친화력 성숙를 가지고 어떤 항원에 대해서 특이성을 가지게 된다. 이것은 상기 인간 HLA-tg 마우스들로부터 발생된 인간 항체들은 인간들에 대해서 면역원성이 없게 된다는 전망을 유추할 수 있다.
관심 단백질 또는 단백질 변이체에 내성을 가지는 또는 유전자 전이된 HLA-tg 마우스들은 상기 발생과 관련이 있고, 사람을 위한 제약들을 테스트하는 다양한 면역원성 검색 애플리케이션(screening application)들이 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 단백질 변이체들에 대한 면역원성을 측정하는 것에 더하여, 상기 HLA-tg 마우스들은 관심 단백질들 또는 단백질 변이체들내에 면역원성의 부위들 또는 면역원성의 시퀀스들을 지도화(map)하는데 사용될 수 있다. 특히, 펩타이드들 스패닝 파트(peptides spanning part) 또는 관심 단백질들 또는 단백질 변이체들의 모든 시퀀스들은 HLA-tg 마우스들에 직접적인 주입 및 혈청 또는 조직 분리주(tissue isolate)들로 부터 T 셀 증식의 측정과 같은 이어지는 면역원성의 측정에 의해서 테스트된다. 이러한 방식으로, 상기 HLA-tg 마우스들은 특히 단백질들 또는 단백질 변이체들의 시퀀스들에서 T 셀 항원결정인자들을 지도화하는데 유용하다. 상기 T 셀 항원결정인자들 시퀀스들은 이후 사람을 위한 잠재적인 제약들로써 상기 단백질 또는 단백질 변이체들의 사용전에 상기 항원결정인자들을 제거하기 위해서 상기 단백질 또는 단백질 변이체들 내에서 수정될 것이다.
관심 단백질들 또는 단백질 변이체들에 내성을 가진 또는 유전자이식된 HLA-tg 마우스들에게 관심 단백질들 또는 단백질 변이체들의 면역원성을 테스트하기 위하여 다양한 방법들을 사용할 수 있는데, 상기 방법들은 생산 배치(manufacturing batch)들을 포함하는 다양한 표본 배치(preparaition batch)들로부터 및 HLA-tg 마우스들 안에 동시-주입된(co-injected) 또는 현존하는 감염병인자들(infectious disease agents), 다양한 다른 셀들, 다른 제약들, 화학적/환경적 인자들과 같은 다양한 인자(agent)들의 존재하에서 및 면역약화되거나 다양한 발작들, 손상들 또는 질병들을 겪는 HLA-tg 마우스들에, 다양한 투여량으로, 다양한 형성들로 다양한 타임포인트(timepoint)들에서 및 투여량 반복동안의 주입후에 사용된다.
본 발명의 추가적인 확장에서, 관심 단백질에 내성화된 HLA-tg 마우스들은 변이된 단백질들의 라이브러리로 부터, 상기 라이브러리의 다른 구성원들과 비교하여 낮은 면역원성을 가진 단백질을 직접적으로 선택(select)하기 위해서 사용된다. 상기 선택에서, 특이 단백질 또는 단백질 변이체에 HLA-tg 마우스들의 면역원성의 반응은 낮은 면역원성을 가진 다른 단백질들이 강화되거나 식별되도록 상기 단백질 또는 단백질 변이체에 대한 선택을 직접적으로 이끌어낸다. 예를 들어, 면역원성의 단백질 또는 단백질 변이체들에 의해서 유도된 항체들은 이러한 변이체에 대한 선택에 기본으로써 상기 면역원성의 단백질 또는 단백질 변이체에 직접적으로 결합한다. 예를 들어, 변이체 단백질들의 라이브러리로 주입된 HLA-tg 마우스들로 부터의 혈청 면역글로불린은 보다 적은 면역원성의 또는 비-면역원성의(non-immunogenic) 변이체들을 남겨놓은 상기 라이브러러리로 부터의 면역원성의 단백질 변이체들은 (예를 들어, 면역침강(immunoprecipitation) 또는 면역크로마토그라피(immunochromatography)에 의해서) 먼저흡수(preabsorb)되기 위해서 이용될 수 있는데, 상기 면역원성의 단백질 변이체들은 단백질 분자 레벨에서 (예를 들어, 질량 스펙트로메트리(mass spectrometry)에 기초한 시퀀싱 또는 핑거프린팅에 의해서) 또는 상기 변이체들, 예를 들어, 펩타이드 시퀀스 택(tag), 뉴클레익 산(neclei acid) 시퀀스 또는 상기 라이브러리에서의 특정한 단백질 변이체를 식별하는데 사용되는 어떤 다른 분자 코드와 결합된 입자들에 의해서 식별될 수 있다. 다른 생체 외 방법들은 낮은 면역원성을 가진 변이체들을 식별하기 위해서 사용될 수 있는데, 상기 방법들에서 상기 변이체들은 오직 고체 상태로 포획되고, 어떠한 마우스 항체도 상기 단백질 변이체의 특정한 포획 지점에 간섭(interfere)하는 것이 현존하는 어떠한 마우스 항체들이 없는 방법들이다. 예를 들어, 인간 IgG들의 라이브러리의 경우에 고체 상태 항원 표본은 어떠한 마우스 면역글로불린도 상기 인간 IgG 상에 항원 결합 지점(antigen-binding site)에 결합되지 않는 항체들을 포획하는데 사용될수 있다.
라이브러리로 부터의 낮은 면역원성을 가진 단백질 변이체들의 선택을 위한 생체 외 방법들의 대안으로 생체 내 선택 방법들이 사용될 수 있는데, 더 적은 면역원성의 또는 비-면역원성의 변이체들은 생체 내에서 선택된다. 생체 내 선택은 상기 내성화된 HLA-tg 마우스에서, 순환 또는 마우스내의 주입된 구역(compartment)으로 부터의 특이 변이체들에 결합하고 제거함에 의하여 또는 그러한 변이체들 또는 그러한 변이체들에 결합한 입자들, 예를 들면 표면 IgG에 의하여 살아있는 골수종(myeloma) 셀들 또는 ADCC (항체-의존하는 세포독성(antibody-dependant cytotoxicity)) 또는 CDC(보체-의존하는 세포독성(complement-dependant cytotoxicity))에 의한 살아 있는 박테리오파지, 또는 항체-의존 음세포작용에 의하여 특이 변이체들에 연결된 불활성 입자들을 발현시키는 살아 있는 셀들을 직접 죽이거나 포식하는 것에 의하여 유도된 항체들의 힘으로 이루어진다. 기본적인 방법들에서, 상기 HLA-tg 마우스는 단백질 변이체들의 라이브러리로 (예를 들어, 정맥으로) 주입되고, 선택되는 시간지점에서, 분석은 단백질 변이체들이 숙주 면역글로불린에 의해서 제거되지 않고 여전히 남았는 것에 의해서 이루어진다. 상기 분석은 예를 들어, 상기 선택된 시간지점에서 단백질 변이체들의 라이브러리의 구성원들을 정화(purify)하고, 생체 내 선택이 뒤따라 오는 라이브러리안의 강화된(enriched) 변이체들을 식별함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 단백질 변이체들이 뉴클레익 산과 (예를 들어, 골수종 또는 박테리오파지와 같은 살아있는 셀안에) 연합되는 곳에서, 상기 분석은 직접적인 증폭(amplification) 및 강화된 단백질 변이체들과 연합된 유전자의 DNA 시퀀싱 또는 상기 선택에 의해서 강화된 핑거프린트에서의 밴드(band)들을 식별하는 선택 전 및 후의 DNA 핑거프린팅에 의해서 이루어지는데, 상기 밴드들은 강화된 단백질 변이체의 연속적인 식별을 제공한다. 단백질 변이체들이 살아있는 셀들 또는 입자들에서 선택되고, 상기 셀들 또는 입자들 자신들이 면역원성을 유도한다면, HLA-tg 마우스들은 예를 들어, 상기 유전자이식 배경에 주입 또는 더 첨가, 또는 단백질 변이체들에 대한 선택 과정들에서 상기 셀들 및 입자들의 간섭을 피하기 위해서 사용되는 다른 방법들에 의해서 상기 셀들 또는 입자들에 내성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 예는 살아있는 셀들에 의해서 생산된 항체 변이체들의 생체 내 선택인데, 인간 IgG를 발현시키는 마우스 골수종(예를 들어, 하이브리도마(hybridoma)) 셀 라이브러리 또는 항체 V 부위들을 표시하는 박테리오파지 셀들과 같은 살아있는 셀들의 모집단(population)은 내성화된 HLA-tg 마우스들로 주입된다. 상기 마우스들은 주입된 골수종 셀들 또는 박테리오파지에 의해서 생산된 어떤 면역원성의 인간 IgG들에 대한 항체들을 생성할 것이고, 상기 항체들은 셀들의 성장/파지의 감염력을 억제하거나 상기 셀들 또는 파지의 (ADCC, CDC 또는 세포내이입에 의해서) 파괴를 이끌면서 표면 IgG에 결합할 것이다. 상기 방법으로, 내성화된 HLA-tg 마우스들은 면역원성의 항체들을 생사나는 골수종 셀들 또는 박테리오파지에 대하여 선택할 것이고, 낮은 또는 전혀 없는 면역원성을 가진 항체들을 생산하는 셀들/파지(phage)는 상기 주입된 모집단으로 부터 강화될 것이다. 낮은 또는 전혀 없는 면역원성을 가지는 바람직한 항체들을 생산하는 상기 셀들/파지는 이후 회복될 수 있으며, 예를 들어, 회수하고 강화된 골수종 셀들을 배양하는 것에 의해서, 항체-생산 셀들을 분류하기 위해서 항-Ig 스테이닝(staining)을 사용하여 셀을 분류하는 방법에 의해서, 또는 선택된 파지들을 세균의 주기 감염(cycled infection)에 의해서 증폭하는 것에 의해서 회복될 수 있다. 대안적으로, B 셀과 같은 비-무한증식(non-immortalised) 포유동물 셀들에 대해서, 표준적인 무한 증식(immortalisation) 및 클로닝 과정들은 EBV 형질전환 또는 셀 융합(fusion) 또는 클로닝 전에 무한증식하는 다른 수단들을 포함하여 사용될 수 있거나, PCR과 같은 뉴클레익 산 증폭 방법들이 상기 선택되는 항체들로부터 V 부위 유전자들을 분리시키기 위해서 사용될 수 있다. 게다가, 내성화된 HLA-tg 마우스들에서의 선택 전 및 후에 B셀 모집단들의 비교 분석은 강화된 B셀 계통(lineage)들 또는 특이 항체들의 강화(enrichment)를 식별하기 위해서 사용되는데, 예를 들어 상기 비교(comparative) 분석은 비교 PCR, 비교 DNA 핑거프린팅 또는 LC-MS와 같은 비교 질량 스펙트로메트리 방법들이다.
기술 분야의 숙련된 사람들에 의해서, 단백질들 및 단백질 변이체들의 면역원성을 테스트하기 위한 본 발명의 방법들의 많은 변형들이 있지만 이는 본 발명의 범위 내에서 숙고되어야한다는 것이 이해될 수 있는데, 상기 본 발명의 범위는 특이 단백질 또는 단백질 변이체에 대해서 내성화된 HLA-tg 마우스들을 배경으로서 사용되는데, 이는 단백질들의 면역원성을 측정하기 위해서, 또는 낮은 또는 전혀 없는 면역원성을 가지는 단백질들을 선택하기 위해서, 또는 면역원성에 기초하는 다른 단백질들을 비교하고 순위를 매기기위해서이다. 특이 단백질들에 내성을 가지는 HLA-tg 마우스들은 인간 HLA 이식유전자에 더하여 하나 또는 둘 이상의 인간 단백질 이식유전자들로 새로운 특히 유전자 이식된 마우스들이다. 특히, 바람직하게 가능한한 많은 인간 중 사슬 및 경 사슬 가변 부위 면역글로불린 부분으로 부호화하는, 추가적인 인간 IgG 이식유전자들을 가지는 인간 HLA-tg 마우스들은 신규하고, 치료(terapeutic) 단클론 항체들의 면역원성 테스트에 또는 변이체들의 선택으로부터의 치료 항체들의 생체 내 선택에 특히 유용하다. 또한, 본 발명은 제약으로 사용되는 단백질들 또는 인간들을 위한 생체 내 진단(diagnostic) 인자들의 발생에 특히 적용되는데, 인간 HLA-tg 마우스들은 사용되고, 거의 또는 전혀 없는 면역원성을 가지는 단백질들은 인간들 내에 존재하는 동일한 HLA 배경을 사용하여 선택되고, (만약에) 인간들에 기대되는 비슷한 레벨의 내성을 사용하여 선택될 것이다. 본 발명 내에서 마우스 이외의 생물체들이 사용될 수 있는데, 인간 HLA 분자들은 유전자이식제들에 의해서 또는 인간 항원-전달 셀들의 주입과 같은 다른 수단들에 의해서 제공될 수 있다는 것을 알것이다. 또한 인간 제약 이외의 (예를 들어, 동물 제약들) 목적을 위하여, 인간 이외의 HLA 배경들은 상기 사용되는 상기 종의 단백질들로 유도된 내성으로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 내성화된 HLA-tg 동물들은 또한 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있으며, 예방 접종(vaccination)에 사용하는 높은 면역원성을 가지는 단백질들 또는 단백질 변이체들을 선택하는 몇가지 방법들을 선택할 수 있다.
기술 분야의 숙련된 사람들에 의해서, 생체 내 또는 생체 외에서 테스트 또는 분리 방법들의 넓은 범위에 의해서 낮은 면역원성에 대한 단백질들 또는 단백질 변이체들을 선택하기 위한 본 발명의 방법들의 많은 변형들이 있다는 것이 이해될 수 있지만, 이러한 변형들은 본 발명의 범위 내에서 숙고되어야 하는데, 상기 본 발명의 범위는 상기 선택을 위해서 배경으로서 상기 특이 단백질 또는 단백질 변이체들에 내성을 가지는 HLA-tg 마우스들을 사용한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 내성화된 HLA-tg 마우스들에 의한 단백질들 또는 단백질 변이체들의 분석 또는 선택은 보통 평행한(parallel) 분석 또는 다른 동종이형의 HLA 표현형(genotype)들로 유전자이식된 마우스들의 패널에 의한 배경 HLA 동종이형들의 범위에서의 선택을 필요로 할 것이다. 인간들에서 사용을 위한 단백질들 또는 단백질들 변이체들의 선택을 위하여, 상기 인간 모집단의 적어도 50%에 나타나는 MHC 표현형들의 범위는 분석 도는 선택에 사용되는 마우스들에 존재하지 않는 다른 표현형들을 가지는 인간들에게 단백질이 주입될 때 면역원성으로 이끄는 극히 소수의 표현형들에 대한 단백질들을 선택하는 것을 피하기 위해서 바람직하다.
기술분야에서 숙련된 사람에 의하여 본 발명은 유전자 이식된 마우스들의 사용에 제한되어서는 않되고, 또한 인간 MHC 클래스 Ⅱ에 대하여 유전자이식이 표현되고, 단백질 변이체의 면역원성을 측정하기 위해서 또는 낮은 면역원성을 가지는 단백질 변이체들에 대해서 선택하기 위해서 같은 방식으로 사용되는 다른 동물들을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명은 단백질들에 제한되어서는 않되고, 비-단백질(non-protein) 변이체들의 면역원성의 측정에 적용될 수 있거나, 낮은 면역원성을 가지는 비-단백질 변이체들에 대한 선택에 적용될 수 있는데, 상기 비-단백질 변이체들은 유기 화학물질(organic chemical)들, 무기 화학물질(inorganic chemical)들, 알레르기항원(allergen)들, 미용제(cosmetics), 환경 오염물질들, 감염 인자들 및 영양소(foodstuff)들과 같다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명은 인간 용도에 대한 백신들의 성장 및 테스트에 사용될 수 있는데, 예들 들어, 인간 백신들에서 사용에 대한 유효 T 셀 항원결정인자들을 결정하는 데에, 유효 소단위(effective subunit) 또는 DNA 백신들을 검색하는데에, 인간들에 대하여 예상하는 효과를 위한 다른 백신의 형성들 및 투약의 루트들을 테스트하는 데에, 및 감염병, 암 및 염증과 같은 질병 인자들에 대항하여 면역 응답들의 예방 또는 유도에 대한 잠재적인 백신들을 테스트하는 데에 사용될 수 있는데, 상기 질병들은 잠재적인 백신들에 대하여 테스트 전에 상기 마우스들에(또는 다른 동물들에) 도입되거나 유도된다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명의 HLA-tg 유전자이식된 동물들은 인간 MHC 클래스 Ⅱ에 더하여, 상기 면역 시스템의 다른 인간 분자들의 개개의 구성물들 또는 조합물들에 유전자이식될 수 있는데, 상기 인간 분자들은 T셀 수용체, MHC 클래스 Ⅰ, CD4, CD8, 및 다른 시토카인들 또는 수용체들 이며, 인간 면역들과 관련하여 다른 분자 이벤트(event)들의 흉내내는 범위에서 인간 면역 시스템의 추가적인 구성물을 도입하는 각각의 경우에 유전자이식될 수 있다는 것이 이해될 수 있을 것이다. 같은 방법으로, 본 발명의 동물들은 테스트 단백질 또는 비-단백질에 대한 인간 면역 응답을 용이하게 하기 위해서 인간 면역 시스템의 하나 또는 둘 이상의 셀들로 이식될 수 있다.
다음의 예들은 본 발명을 보여주기 위해서 제공되며, 본 발명으로 부터의 범위를 제한하는 걸로 숙고되어서는 안된다.
예 1. 면역원성의/비-면역원성의 테스트 항체들의 생성.
상기 연구를 위해서 선택된 면역원성 테스트 항체는 마우스 cA2 항체로 부터 유래되고 가변 부위들을 가지며 Remicade®(Le et al., US6277969)로 알려진 키메라(chimeric) 항-TNFα항체이다(이하 "Remicade"). 사용되는 추가적인 테스트 항체는 Herceptin®(Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol 89(1992) p4285,US5821337)로 알려지진 인간화된 항-HER2 항체였다(이하 Herceptin). 사용되는 상기 비-면역원성 조절(control) 항체는 인간 점-라인 Vh3-53 및 VkO12 시퀀스들과 연합하는 Herceptin(이하 "GLH"=점라인 Herceptin®)의 유도체였다.
제조합체(recombinant) DNA 및 항체 기술들은 기술 분야 및 적합한 상기 방법들에 알려진 효소들 및 항체들의 사용에 대한 공급자의 설명서들에서 잘 알려진 방법들을 사용하여 행해진다. 일반적인 방법들의 출처들은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, vols 1-3, eds. Sambrook and Russel(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, John Wiley and Sons; and, Antibodies, A laboratory Manual, eds. Harlow and Lane(1988), Cold Spring Harbor를 포함하였다. Remicade®, Herceptin® 및 GLH 항체 V 부위들과 유사한 시퀀스들은 각각의 사슬들, 전체 인간 VH 및 VL 시퀀스들을 부호화하는 길이의 30-60 아마노산들의 여덟 개의 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들을 사용하여 형성되었다. 분리 VH 및 VL 올리고뉴클레오티드들은 처음에 인함유화(phosphorylate)되고, 같은 몰비율로 섞이며, 열 싸이클러(cycler)에서 94℃로 5분동안 가열되며, 65℃로 냉각 및 65℃에서 2분동안 배양이 뒤따라온다. 배양들은 이후 45℃에서 2분동안, 35℃에서 2분동안, 25℃에서 2분동안 4℃에서 30분동안 계속되었다. 올리고뉴클레오티드들은 이후 T4 DNA 리가제(ligase)(Life Techonologies, Paisley, UK)를 14℃에서 18 시간동안 사용하여 결찰(ligate)되었다.
각각의 상기 VH 및 VL 올리고뉴클레오티드 혼합물(mixture)들에서, 5'플랭킹(flanking) 시퀀스를 부호화하며, Kozak 시퀀스, 선도 신호(leader signal) 펩타이드 시퀀스 및 선도 인트론(intron), 및 3'플랭킹 시퀀스를 포함하며, 스플라이스(splice) 지점 및 인트론 시퀀스를 포함하는 추가적인 올리고뉴클레오티드들은 첨가되고, 위로 붙여졌다.(anneal) 생성된 상기 VH 및 VL 발현 카세트(cassette)들은 HindⅢ로써 상기 플라스미드 벡터(plasmid vector) pUC19안에서 BamHⅠ조각들로 복제되고 상기 전체 DNA 시퀀스들은 확정되었다. 이는 발현 벡터들 pSVgpt 및 pSVhyg(Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(1989)3833-3837)로 전송되는데, 상기 발현 벡터들 pSVgpt 및 pSVhyg는 인간 IgG1 또는 인간 κ불변 부위들 각각 및 포유동물 셀들에 있는 선택을 위한 표지(marker)들을 포함하였다.
항체 발현을 위한 상기 숙주(host) 셀 라인은 NS0, 마우스 골수종을 생성하는 비-면역글로불린인데, 상기 NS0는 European Collection of Animal Cell Culture, Porton, UK(ECACC No 85110503)으로 부터 입수되었다. 상기 중 및 경 사슬 발현 벡터(expression vector)들은 전기천공(electroporation)(에 의하여 NS0로 동시-핵산전달감염(co-transfect)되었다. 상기 gpt 유전자를 발현시키는 집락(colony)들은 10%의 소태아혈청(bovine serum), 0.8 ㎍/ml의 미코페놀릭 산(mycophenolic acid) 및 250㎍/ml의 잰틴(xanthine)으로 보충되는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 선택되었다. 핵산전달감염된 셀 클론들은 인간 IgG에 대한 ELISA의해서 인간 항체의 생성물에 대하여 검색하였다. 항체들은 Prosep®-A(Millipore, Watford, UK)을 사용하여 정화되고 농도는 인간 IgGκ에 대한 ELISA(PHarmacia Biotech,ST Albans, UK)에 의해서 결정되었다. 정화된 Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들은 두 개의 아쎄이들에 결합에 대하여 테스트되는데, 하나는 (WO 03/042247A2에서 기술된)표준 ELISA 이모빌라이즈드(immobilised) 인간 TNFα를 사용하고, 다른 하나는 4D5(Hudziak et al.,Mol. Cell. Biol.,(March 1989)p1165-1172)에 의해서 기술된 것으로서, HER2+ 인간 유방종양(tumour) 셀 라인 SK-BR-3의 증식 억제제(inhibition)를 사용하였다. 상기 Remicade 항체는 상기 ELISA 아쎄이에서 그러나 SK-BR-3 셀들의 어떠한 억제제도 가지고 있지 않은 인간 TNFα에 기대되는 결합을 보여주었다. Herceptin은 SK-BR-3 셀들의 증식 억제제를 투여하는 동안 인간 TNFα에 결합하지 않았다. 상기 GLH 항체는 인간 TNFα에의 결합도 SK-BR-3 셀들의 억제제도 보여주지 않았다.
예 2. 마우스 면역글로불린 발현이 부족한 인간 HLA 유전자이식된 마우스들.
마우스 MHC 클래스 Ⅱ가 부족한 인간 HLA-DR1 유전자이식된 마우스들은(Altmann, D.M. et al., J Exp Med 181 (1995) 867-875) Imperial College, London UK로 부터 얻었다. 상기 마우스들은 Babraham Institute, Cambridge UK (Bruggeman,EPO438474B1)으로 부터 얻은 면역글로불린 중 사슬이 부족한 마우스들과 교차되고 바람직한 인간 HLA-DR1 +/+, 마우스 MHC 클래스Ⅱ-/- 및 마우스 Ig CΔ-/-의 표현형을 가진 마우스들은 선택되었다.(여기서 "hu DR+/IgCΔ-/-") 상기 hu DR+/Ig CΔ-/- 마우스들은 이후 면역글로불린 경 사슬들이 부족한(λ/κ, Babraham Institute)마우스들에 추가적으로 교차되고, 인간 HLA-DR1 +/+, 마우스 MHC 클래스Ⅱ-/-, 마우스 Ig CΔ-/- 및 마우스 λ/κ-/-의 바람직한 표현형을 가진 마우스들이 선택되었다.(여기서 "hu DR+/IgCΔ-/-λκ-"마우스들)
예 3. 신생아 내성의 유도.
Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들은 디알리스되고(dialysed) PBS에서 500㎕로 희석되고 4℃에서 15분동안 20,000g에 원심분리되었다. 50㎕의 개개의 항체들의 내성화시키는 투여량은 태어난지 30시간 내의(=day 0) 신생아 hu DR+/IgCΔ-/-마우스들안으로 복막내로(intraperitoneally) 주입되었다. 조절 마우스들은 50㎕ PBS로 주입되었다. 총합 200 MPL+TDM 에멀전(emulsion)(RAS-Ribi 항원보강제, 생산품 코드 R-700, Corxa Corp, Hamilton, MT, USA)에 5㎍ KLH 조절을 함께 가지며, Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들 어느 하나의 5㎕의 투여량들 이후 피하로(subcutaneously) 10일, 16일, 및 24일에 주입되었다. 32일에 마우스들은 T셀 증식 아쎄이들을 위하여 희생되었다. 적혈구-제거된(red-blood cell-depleted), 피콜-정제된(Ficoll-purified) 비장의 단핵세포(splenocyte)들은 제공되고 항체 또는 KLH-펄스 감마-방사선조사된(gamma-irradiated) LPS-모세포(LPS-blast)들을 가진 T25 플라스크들에서 Loirat, D., et al., J Immunol., 165(2000) 4748-4755에 의해서 기술된 것 처럼 5×106의 셀들은 배양되었다. 배양의 7일 후에, 셀들은 웰(well)당 5×106의 셀들에서 항체 또는 KLH-펄스 방사선조사된 LPS-모세포들을 가지는 바닥이 평평한 96개의 웰 마이크로 플레이트(well micro plate)들에서 평편배양되고 완전한 RPMI+3% FCS에서 추가적으로 72 시간동안 배양되었다. 셀들은 마지막 16시간동안 웰당 1μCi의 3H-씨미딘(thymidine)으로 펄스(pulse)되고, TOMTEC 콜랙터(collector)(PE Applied Biosystems, Warrington, UK)를 가지는 필터메이트(filtermate)들 상에 수집되었다. 방사능은 마이크로-박동 계수기(micro-beat counter)(PE Applied Biosystems) 상에서 측정되고 결과들은 PBS 조절들에 대한 항체 또는 KLH 처리들을 위하여 cpm의 자극 인덱스(stmulation index;SI)로 표현되었다.
상기 결과들은 Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들로 내성화되고 이후 항원보강제에서 동일한 각각의 항체들로 접종된(challenged) 동물들에 대한 어떠한 중요한 SI>2를 보여주지 않았다. 그러나, T셀 응답들은(SI>2) 정제된 다클론(polyclonal) 인간 IgG (huIgG)에 대하여 내성을 가진 동물들에서 10 마우스들 중에서 5 마우스들에서 관찰되고 이후 Remicade 항체들로 투여되었다. 대조적으로 반응들은(SI>2) GLH로 투여후에 10 hulIgG 내성화된 마우스들 중 1 마우스가 검출되었고, 반면에 Hercaptin으로 내성화된 동물들에 대해서, GLH로 투여후에 어떠한 반응(SI>2)도 검출되지 않았다. 모든 마우스들은 항원 보강제 내에서 KLH에 강하게 반응하는데, 상기 항원보강제는 90%의 마우스들에서 강한 KLH-특이 반응들을 이끌어낸다. 상기 결과들은 신생아 hu DR+/IgCΔ-/- 마우스들에서의 각각의 Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들에 내성의 성공적인 유도를 보여주는데, 같은 항체들의 투여는 T 셀 증식 반응들을 유도하는데 실패하였다.
상기 결과들은 huIgG에 내성화된 마우스들에서 면역원성의 Remicade 항체에 대해서 중요한 T 셀 반응들의 유도를 보여주었다. Herceptin은 Remicade(50% 반응율)보다 더 낮은 면역원성(30% 반응율)이 나타나는 반면에 GLH는 huIgG 또는 Herceptin 내성화된 마우스들에서의 응답들을 유도하는데 실패하였다. 상기 예는 인간 HLA-DR에 대하여 유전자이식된 마우스들의 사용에 있어써 본 발명의 주 부분을 보여주고 인간 면역 이모글로불린들에 인간들의 내성과 유사한 특이 면역글로불린들에 대한 내성을 표시하였다. 상기 유전자이식된 마우스들은 이후 특이 면역글로불린들에 대하여 내성화된 유전자이식된 인간 HLA-DR 마우스들 인간들에서의 상기 항체들을 테스트하기 위한 대체물로서의 마우스들에서의 면역원성의 유도에 대한 다양한 단클론 항체들을 테스트하는데 사용할 수 있다. 상기 예는 인간들에 중요한 면역원성인 상기 Remicade 항체는 상기 유전자이식된 내성화된 인간 HLA-DR 마우스들에서 중요한 면역원성을 유도하였다. 게다가 뒤따라오는 실험들에서, 인간 글로불린 약제는 hu DR+/IgCΔ-/- 마우스들을 예 3 에서 처럼 내성화하는데 사용되고, 상기 마우스들은 이후 Remicade, Herceptin 및 GLH 항체들로 투여되었다. 상기 결과들은 개개의 항체들에 대하여 내성을 가질 때, Remicade 주입은 SI>2 에서 >30% 마우스들을 이끌어 내는데 반면에 Herceptin 및 GLH는 어떤 동물에서도 SI>2는 보여지지 않았다.
예 4. 인간 Ig 유전자이식된 마우스들의 생성.
인간 IgM/κ로 유전자이식된 마우스들은(네개의 특징의 마우스들, Nicolson et al., J Immunol., 163 (1999)6898-6906) hu DR+/IgCΔ-/-λκ- 마우스들(예2)에 교차되고 인간 IgM/κ, 인간 HLA-DR1 +/+, 마우스 MHC 클래스Ⅱ-/-, 마우스 IgCΔ-/- 및 마우스 λ/κ-/-의 바람직한 표현형을 가진 마우스들이 선택되었다.(여기서 "hu IgCΔ-/-/κ" 마우스들)
예 5. 인간 Ig 유전자이식된 마우스들에서 면역원성의 테스트하는 것,
hu IgM/κ 마우스들에서 면역원성 테스트를 위한 조절 항체(control antibody)는 VH에 대해서 D1.7/J4 및 Vκ에 대해서 Jκ4로 결합하여 점라인(germline) 인간 VH1-2 및 Vκ4.1 유전자들을 사용하여 형성되었다.(여기서 "VH1-2/Vκ4.1"항체) 재결합 인간 IgG1/κ 항체는 예 1에서 처럼 생성되고 상기 항체 및 예 1 로부터의 Remicade 항체 양쪽은 주입을 위한 이합체의(dimeric) Fab2 조각을 생산하기 위해서 펩신 소화(pepsin digestion)를 겪게 되었다. 소화 전에, 항체들은 0.2M 소듐 아세테이트(sodium acetate) pH 4.0 완충액에서 분리되고, 이후 2mg/ml로 조절되었다. 20㎍/ml 펩신은(Sigma, Poole, Dorset UK) 같은 부피의 0.2M 소듐 아세테이트 pH 4.0 완충액에 더해지고, 37℃에서 6시간 동안 배양되었다. 2M Trizma®기제(base)(Sigma)는 pH 7로 조절하기 위해서 더해지고 소화들은 겔 전기이동(gel electrophoresis)에 의해서 체크되었다. 항체 소화물들은 PBS에서 밤새(overnight) 분리되고 이후 Fab2 조각들을 분리하기 위해서 두개의 연결되는 Sephadex 75 컬럼(column)들을(Pharmacia) 적용하였다.
hu IgM/κ 마우스들은 CFA에서 50㎍ VH1-2/Vκ4.1 또는 Remicade Fab2 조각들 중 어느 하나로 면역화(immunise)되고 IFA에서 4, 8 및 12 주에 각각 50㎍의 Fab2 조각들로 추가되었다. 인간 IgM/κ 항체들의 생성물은 37℃에서 5㎍/ml VH1-2/Vκ4.1, Remicade Fab2 조각들 또는 전체 GLH 항체(예1) 중에 어느 하나로 PBS에서 마이크로타이어 플레이트(microtire plate)들을 PVC로 코팅하는 것에 의해서 테스트되었다. PBS에서 희석된 혈청 샘플들, 5% 닭 혈청 및 0.5% Tween-20은 이후 상온에서 1 시간동엔 웰들에서 배양되고 세척후에, 항-인간(anti-human) IgM Fc-HRP(pharmacia)은 동일한 완충액에 1 시간동안 더해지고 ABTS(Sigma)의 추가가 30분 동안 뒤따르고 OD415의 측정이 뒤따른다. 상기 실험은 Remicade Fab2로 면역화된 동물들 안의 Remicade Fab2 조각에 대해 특이성을 가지는 IgM 항체들의 강한 타이어(tire)들의 유도를 보여주었으나, 인간 면역글로불린/인간 HLA-DR 배경을 가지는 마우스들내에서의 Remicade의 면역원성을 보여주는 마우스들에서 VH1-2/Vκ4.1에 대항하는 항체들의 어떠한 유도도 보여주지 않았다. 상기 예는 인간 HLA-DR 및 인간 면역글로불린에 대하여 유전자이식된 마우스들의 사용에의 본 발명의 주요한 부분을 예시하는데, 상기 마우스들은 인간 면역글로불린 가변 부위 시퀀스들의 범위에서 내성을 가지고 상기 내성은 인간 면역글로불린 가변 부위 시퀀스들의 범위에 대하여 인간들의 내성과 유사하다. 상기 유전자이식된 마우스들은 인간들에서 상기 항체들을 테스트하는 것에 대체로서 면역원성의 유도에 대하여 다양한 단클론의 항체들을 테스트하기 위하여 사용되었다. 상기 예들은 상기 Remicade 항체는 상기 인간 HLA-DA/Ig+ 유전자이식된 마우스들에서 중요한 면역원성을 유도한다는 것을 보여주는데, 상기 면역원성은 인간들에게서 발견된 것과 유사하고, Remicade®에 대한 면역원성은 면역적격 환자들의 중요한 비율에서 유도된다는 것을 보여주었다.
예 6. 인간 Ig 유전자이식된 마우스들에서 항체들의 선택.
(예 5 로부터의)PBS에서의 VH1-2/Vκ4.1 및 Remicade Fab2 조각들의 100mg 샘플들은 hu IgM/κ 마우스들로 정맥주사로 동시-주입되거나 개별로 주입되었다. 초기 투여 후에 반복된 투약은 10일 및 20일 후에 행해진다. 최종 투여 후에 2 시간, 마우스 혈청은 VH1-2/Vκ4.1 또는 Remicade Fab2 조각들의 존재 또는 부재에 대하여 분석하였다. 수집된 혈청은 20000g에서 15분동안 4℃에서 원심분리되고 이후 PBS에서 밤새도록 분리되었다. Fab2 조각들은 이후 예 5에서 기술된것 처럼 Sephadex 75를 사용하여 정제되고 예 1에서처럼 항-인간 Fab-HRP(Pharmacia)를 사용하여 인간 TNFα에 결합에 대하여 희석 계열로 테스트되었다. 상기 결과는 VH1-2/Vκ4.1 및 Remicade Fab2 조각들로 주입된 마우스들에 대하여, 상기 회복된 Fab2는 테스트된 모든 마우스들에서 >95%로 VH1-2/Vκ4.1로 구성된다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 더 많은 면역원성의 Remicade Fab2는 더 적은 면역원성의 VH1-2/Vκ4.1에 비교하여 상기 혈액 시스템으로 부터 청소된다는(cleared) 것을 나타낸다. 상기 효과는 VH1-2/Vκ4.1 보다 더 빠른 제거(clearance)를 용이하게 하는 Remicade Fab2를 가지는 면역 복합체들의 구성에서 기인한다는 것이 가능하다. 상기 예들은 중요한 면역원성을 유도하는 다른 항체들을 가진 혼합물로부터 낮은 면역원성을 가진 항체들을 선택하는 내성화된 HLA-tg의 능력을 보여주었다.
Claims (36)
- (a) 상기 포유동물의 항원에 접촉을 통하여 상기 포유동물의 항원에 내성을 가지는 상기 유전자 이식된 포유동물을 렌더하는 단계;(b) 상기 변이된 항원에 상기 유전자이식된 포유동물을 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 유전자이식된 포유동물에서 상기 변이된 항원의 면역원성을 측정하는 단계를 포함하는 포유동물의 항원으로 부터 유래된, 상기 포유동물의 MHC 클래스 Ⅱ 분자들로 유전자이식된 비-인간 포유동물에서, 상기 비-인간 포유동물은 상기 포유동물의 항원의 출처가 아닌 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법
- 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물의 항원에 접촉은 상기 유전자이식된 포유동물 안으로 상기 포유동물의 항원을 부호화하는 하나 또는 둘 이상의 이식유전자들의 도입에 의해서 이루어지며, 상기 하나 또는 둘 이상의 이식유전자들의 발현은 상기 포유동물 항원에 추가적인 접촉에 내성을 가지는 상기 유전자이식된 포유동물을 렌더하는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 상기 항원은 용해가능한 단백질이고 상기 유전자이식된 포유동물은 내성을 유도하기 위하여 상기 단백질에 접촉되고 이후 상기 단백질의 하나 또는 둘 이상의 변이체들로 투여되는 변이된 항원의 면역원성를 테 스트하기 위한 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 항원은 단클론 항체이고 상기 유전자이식된 포유동물은 내성을 유도하기 위해서 용해가능한 단량체의 항체에 접촉되고 이후 상기 단클론 항체의 하나 또는 둘 이상의 변이체들로 투여되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 항원은 포유동물의 다클론 항체 제공이고 상기 유전자이식된 포유동물은 내성을 유도하기 위해서 상기 용해가능한 다클론 항체에 접촉하고 이후 하나 또는 둘 이상의 단클론 항체들로 투여되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 3 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항원보강제에 있거나 불용해 또는 임모빌라이즈된 형태인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 항원은 비-단백질 분자이고 상기 유전자 이식된 포유동물은 내성을 유도하기 위해서 상기 비-단백질 분자에 접촉하고 이후 상기 비-단백질 분자의 하나 또는 둘 이상의 변이체들로 투여되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 변이된 비-단백질 분자는 항원보강제에 있거나 불용해 또는 임모빌라이즈된 형태인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 포유동물은 설치류(rodent)인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스이고 상기 포유동물 MHC 클래스 Ⅱ 분자들은 인간, 예를 들어 인간 HLA-DR 유전자 이식된 마우스인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 이식된 마우스는 상기 항원에 접촉되며, 상기 항원에 대한 내성을 유도하기 위하여 태어난지 6주 까지의 그러나 바람직하게는 32 시간 이내의 신생아 마우스인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 9 항 내지 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 항원은 인간 항원인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 9 항 내지 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 항원은 비-인 간 항원인 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 이식된 마우스는 상기 항원 또는 상기 항원의 변이체들을 발현시키는 비반응의 어떤 마우스 유전자들을 삭제 또는 렌더하기 위해서 수정되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 유전자 이식된 마우스는 비반응의 마우스 면역글로불린 중 및 경 사슬 유전자를 삭제 또는 렌더하기 위해서 수정되고 이후 상기 마우스는 테스트 단클론 또는 다클론 항체들의 투여 및 면역원성의 측정 전에 인간 면역글로불린들에 내성을 가지게 렌더되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 유전자 이식된 마우스는 비반응의 마우스 단백질 유전자들을 삭제 또는 렌더하기 위해서 수정되고 이후 상기 마우스는 하나 또는 둘 이상의 변이된 비-마우스 단백질들의 투여 및 면역원성의 측정 전에 비-마우스 단백질에 내성을 가지게 렌더되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 유전자이식된 마우스는 인간 면역글로불린 중 및 경 사슬들을 부호화 하고 상기 유전자이식된 마우스는 이어서 하나 또는 둘 이상의 테스트 단클론 또는 다클론 항체와 접촉하는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 유전자이식된 마우스는 하나 또는 둘 이상의 인간 단백질들을 부호화 하고 상기 유전자이식된 마우스는 이어서 하나 또는 둘 이상의 변이된 인간 단백질들에 접촉하는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 유전자이식된 마우스는 하나 또는 둘 이상의 인간 단백질들을 부호화하고 상기 유전자이식된 마우스는 이어서 하나 또는 둘 이상의 변이된 인간 단백질들에 접촉하는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성은 테스트 단클론 또는 다크론 항체들 또는 테스트 단백질들에 대항하는 항체들의 유도를 테스트 하기 위해 상기 유전자이식된 포유동물로 부터의 혈청을 사용하여 측정되는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성은 마우스 T 셀들의 출처로써 마우스 혈액 또는 조직 샘플들을 사용하여 T 셀 증식 또는 T 셀 활동 아 세이들로 측정하는 변이된 항원의 면역원성를 테스트하기 위한 방법.
- 제 10 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역원성은 단백질-반응성의 T 셀들의 생산 예를 들어, 특이 펩타이드-MHC 복합물들의 결합에 대한 테스트, 시토킨 생산, 증식, 셀 표면 지표 발현, Ca2+ 플럭스, PCR 또는 DNA 핑커프린팅을 측정하는 것에 의해서 T 또는 B 셀들의 테스트 또는 특이 면역 반응성의 B 또는 T 셀들의 각성에 대한 테스트에 의하여 측정되는 예를 들어, 특이 펩타이드-MHC 복합물들의 결합에 의한, 방법.
- (a) 상기 인간 항원에 접촉을 통하여 상기 인간 항원에 내성을 가지는 상기 유전자이식된 마우스를 렌더하는 단계;(b) 상기 유전자 변이체에 상기 유전자이식된 마우스를 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 유전자 이식된 마우스에서 상기 변이된 항원의 면역원성을 측정하는 단계를 포함하는 인간 항원으로 부터 유래된, 인간 HLA-DR 유전자이식된 마우스에서의 변이된 항원의 면역원성을 테스트하기 위한 방법.
- (a) 상기 비-인간 항원에 접촉을 통하여 상기 비-인간 항원들에 대해서 내성을 가지는 상기 유전자이식된 마우스를 렌더하는 단계;(b) 상기 변이된 비-인간 항원에 상기 유전자이식된 마우스를 접촉시키는 단 계; 및(c) 상기 유전자이식된 마우스에서 상기 변이된 비-인간 항원의 면역원성을 측정하는 단계를 포함하는 비-인간 항원으로 부터 유래된, 인간 HLA-DR 유전자이식된 마우스에서 변이된 항원의 면역원성을 테스트하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 있어서의, 변이된 항원들의 라이브러리의 면역원성을 테스트하는 것에서의 변이된 항원의 면역원성을 테스트하기 위한 방법의 사용.
- 제 25 항에 있어서, 상기 변이된 항원들은 인간 항원들인 사용.
- 제 26항에 있어서, 상기 인간 항원들은 단백질들인 사용.
- 제 25 항에 있어서, 상기 변이된 항원은 비-인간 항원들인 사용.
- 제 28 항에 있어서, 상기 비-인간 항원들은 단백질들인 사용.
- 제 27 항에 있어서, 상기 단백질들은 항체들 또는 항체들의 조각들의 라이브러리인 사용.
- (a) 상기 인간 항원에 접촉을 통하여 상기 인간 항원에 내성을 가지는 상기 유전자이식된 마우스를 렌더하는 단계;(b) 둘 또는 둘 이상의 변이된 인간 항원들의 혼합물에 상기 유전자이식된 마우스를 접촉하는 단계; 및(c) 상기 유전자 이식된 마우스에서 다른 레벨의 면역원성에 의하여 상기 혼합물로 부터 상기 개개의 변이된 인간 항원들을 직접적으로 선택하는 단계를 포함하는 인간 항원으로 부터 유래된, 인간 HLA-DR 유전자 이식된 마우스에서 변이된 항원의 면역원성을 테스트하기 위한 방법.
- 제 31 항에 있어서, 변이된 인간 항원들은 개개의 변이된 인간 항원들에서 유도된 항체들을 테스트하기 위해서 주입된 변이된 인간 항체 혼합물에서 유도된 항체들을 테스트하는 것에 의하여 또는 상기 혼합물에서 유도된 항체들로 상기 변이된 인간 항체 혼합물을 미리-흡수하는 것에 의해서 직접적으로 선택되는 사용.
- 제 31 항에 있어서, 상기 주입된 변이된 인간 항원들은 입자들에 부착되고 상기 입자들은 개개의 변이체들을 식별하기 위해서 사용되는 사용.
- 제 31 항에 있어서, 상기 주입된 변이된 인간 항원들은 살아있는 셀들에 부착되고 상기 살아있는 셀들은 개개의 변이체들을 식별하기 위해서 사용되는 사용.
- 제 31 항 내지 34 항에 있어서, 하나 또는 둘 이상의 변이된 항원들이 비-인간 항원들로 부터 유도되는 사용.
- 제 31 내지 34 항에 있어서, 하나 또는 둘 이상의 변이된 항원들은 항체로 부터 유래되는 사용.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0425713.5A GB0425713D0 (en) | 2004-11-23 | 2004-11-23 | Immunogencity testing and antibody selection methods |
| GB0425713.5 | 2004-11-23 | ||
| PCT/GB2005/004498 WO2006056769A1 (en) | 2004-11-23 | 2005-11-23 | Methods of studying tolerance in mhc-ii transgenic animals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070094612A true KR20070094612A (ko) | 2007-09-20 |
| KR101385821B1 KR101385821B1 (ko) | 2014-04-24 |
Family
ID=33548701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020077014189A KR101385821B1 (ko) | 2004-11-23 | 2005-11-23 | Ｍｈｃ－ｉｉ 유전자이식된 동물들에서의 내성을 연구하는방법들 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9648857B2 (ko) |
| EP (1) | EP1814386B1 (ko) |
| JP (1) | JP4964781B2 (ko) |
| KR (1) | KR101385821B1 (ko) |
| CN (1) | CN101060776B (ko) |
| AT (1) | ATE499833T1 (ko) |
| AU (1) | AU2005308597B2 (ko) |
| CA (1) | CA2589163C (ko) |
| DE (1) | DE602005026688D1 (ko) |
| DK (1) | DK1814386T3 (ko) |
| ES (1) | ES2359640T3 (ko) |
| GB (1) | GB0425713D0 (ko) |
| PL (1) | PL1814386T3 (ko) |
| PT (1) | PT1814386E (ko) |
| WO (1) | WO2006056769A1 (ko) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1748294A3 (en) * | 2005-06-30 | 2008-03-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | In vivo model for immunocomparability |
| CN101918532B (zh) | 2007-08-22 | 2016-03-30 | 普罗柏欧贞股份公司 | 用于体外测试免疫原性和免疫功能的培养系统和方法 |
| AR070089A1 (es) * | 2007-12-31 | 2010-03-10 | Baxter Int | Animales no humanos transgenicos que expresan factores de la coagula-cion sanguinea humanos y usos de los mismos |
| WO2012039779A1 (en) * | 2010-09-24 | 2012-03-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Humanized transgenic mouse model |
| KR102211267B1 (ko) * | 2013-02-22 | 2021-02-04 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 사람화된 주요 조직적합성 복합체를 발현하는 마우스 |
| BR112020019026A2 (pt) * | 2018-03-24 | 2020-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animal não humano geneticamente modificado, métodos para produzir o animal não humano geneticamente modificado, para geração de uma proteína de ligação a antígeno, para obtenção de um ácido nucleico, e, para obtenção de uma célula que expressa um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana e/ou um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina humana, método in vitro de produção de um domínio variável de imunoglobulina humana, ácido nucleico, célula hospedeira, célula isolada, e, domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US6277969B1 (en) | 1991-03-18 | 2001-08-21 | New York University | Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor |
| JP4124480B2 (ja) | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
| FR2827302B1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-10-10 | Genoway | Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations |
| CN1585778A (zh) | 2001-11-12 | 2005-02-23 | 默克专利有限公司 | 修饰的抗－TNFα抗体 |
-
2004
- 2004-11-23 GB GBGB0425713.5A patent/GB0425713D0/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-11-23 EP EP05804338A patent/EP1814386B1/en not_active Not-in-force
- 2005-11-23 DE DE602005026688T patent/DE602005026688D1/de active Active
- 2005-11-23 US US11/719,876 patent/US9648857B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-23 PL PL05804338T patent/PL1814386T3/pl unknown
- 2005-11-23 AU AU2005308597A patent/AU2005308597B2/en not_active Ceased
- 2005-11-23 CA CA2589163A patent/CA2589163C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-23 JP JP2007542112A patent/JP4964781B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-23 KR KR1020077014189A patent/KR101385821B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-11-23 WO PCT/GB2005/004498 patent/WO2006056769A1/en active Application Filing
- 2005-11-23 ES ES05804338T patent/ES2359640T3/es active Active
- 2005-11-23 AT AT05804338T patent/ATE499833T1/de active
- 2005-11-23 DK DK05804338.1T patent/DK1814386T3/da active
- 2005-11-23 PT PT05804338T patent/PT1814386E/pt unknown
- 2005-11-23 CN CN200580039918.6A patent/CN101060776B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1814386A1 (en) | 2007-08-08 |
| ES2359640T3 (es) | 2011-05-25 |
| ATE499833T1 (de) | 2011-03-15 |
| US9648857B2 (en) | 2017-05-16 |
| PL1814386T3 (pl) | 2011-07-29 |
| CA2589163C (en) | 2017-01-24 |
| AU2005308597A1 (en) | 2006-06-01 |
| WO2006056769A1 (en) | 2006-06-01 |
| JP2008520229A (ja) | 2008-06-19 |
| CN101060776B (zh) | 2015-01-28 |
| PT1814386E (pt) | 2011-04-14 |
| US20090226893A1 (en) | 2009-09-10 |
| DK1814386T3 (da) | 2011-06-06 |
| KR101385821B1 (ko) | 2014-04-24 |
| DE602005026688D1 (de) | 2011-04-14 |
| CN101060776A (zh) | 2007-10-24 |
| CA2589163A1 (en) | 2006-06-01 |
| EP1814386B1 (en) | 2011-03-02 |
| JP4964781B2 (ja) | 2012-07-04 |
| GB0425713D0 (en) | 2004-12-22 |
| AU2005308597B2 (en) | 2011-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lonberg et al. | Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications | |
| JP5184374B2 (ja) | 対立遺伝子排除 | |
| Goodnow et al. | The need for central and peripheral tolerance in the B cell repertoire | |
| Payet et al. | Humoral response suppression observed with CD23 transgenics | |
| TR201906650T4 (tr) | Ortak hafif zincirli fare. | |
| US20180295818A1 (en) | TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMAL EXPRESSING HUMAN SPECIFIC MOLECULE AND HUMAN FCy RECEPTOR FAMILY | |
| JP2007054076A (ja) | 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 | |
| KR101385821B1 (ko) | Ｍｈｃ－ｉｉ 유전자이식된 동물들에서의 내성을 연구하는방법들 | |
| EA014802B1 (ru) | АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ 15 (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ИММУНОКОНЪЮГАТ НА ИХ ОСНОВЕ, ГИБРИДОМА, ТРАНСФЕКТОМА, ТРАНСГЕННОЕ ЖИВОТНОЕ, ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР (ВАРИАНТЫ) И НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ ИЛ-15, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЛ-15 ПРОДУКЦИИ TNF-α И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЛ-15 ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК | |
| Rüther et al. | C-fos expression interferes with thymus development in transgenic mice | |
| MXPA03008454A (es) | Animales transgenicos que expresan anticuerpos especificos para genes de interes y usos de los mismos. | |
| Goodnow et al. | Clonal silencing of self-reactive B lymphocytes in a transgenic mouse model | |
| CN113784756A (zh) | 生物结合分子 | |
| US20190174731A1 (en) | Gene-modified non-human animal expressing human gpc3 polypeptide | |
| CN101379087B (zh) | 用于治疗与细胞因子信号传导相关的疾病和病症、牵涉与il-22和il-22r结合的抗体的组合物和方法 | |
| CN101568262A (zh) | 在哺乳动物对象中治疗革兰氏阳性细菌感染的组合物和方法 | |
| US20220251518A1 (en) | Hybridoma, method for making the same, monoclonal antibody, and method for making the same | |
| US20220312748A1 (en) | Humanized transgenic mouse model | |
| Lawton et al. | Immunoglobulin diversity: Regulation of expression of immunoglobulin genes during primary development of B cells | |
| US20090092995A1 (en) | Method for Identifying Within a Mammal a DNA encoding a Physiologically Active Polypeptide | |
| Yoshida et al. | Creation of hybridomas from mice expressing human antibody by introduction of a human chromosome | |
| Ehst | Design and characterization of a model of murine skin graft rejection: Visualizing the immune response against a defined minor transplantation antigen | |
| JP2003199587A (ja) | 新規ｎｋｔ細胞 | |
| Fields | The impact of T cells upon anti-chromatin B cells in healthy and autoimmune mice | |
| Esser | An examination of molecular antigen recognition by the T cell receptor and T cell-mediated apoptosis of self-reactive B cells using transgenic model systems |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170404 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |