KR20070087283A - 성인성 질환 유발 병원체 핵산 검출용올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

성인성 질환 유발 병원체 핵산 검출용올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성인성 (性因性) 질환 (sexually transmitted disease) 병원체의 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 키트 및 이를 사용한 병원체 핵산 증폭 및 검출방법에 관한 것으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 성인성 질환 병원체에 대하여 우수한 혼성화 특이성을 갖는다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 멀티플렉스 PCR에서도 우수한 작동성 (workabilty)을 나타내어, 하나의 PCR 반응 세트에서 다양한 종류의 성인성 질환 병원체를 동시에 검출할 수 있다.
성인성 (性因性) 질환, 병원체, 프라이머, 프로브, 증폭

Description

성인성 질환 유발 병원체 핵산 검출용 올리고뉴클레오타이드{Oligonucleotides for Detecting Nucleic Acids of Pathogen Causing Sexually Transmitted Diseases}
도 1은 12명의 환자로부터 얻은 병원체시료에 본 발명의 프라이머 세트 I를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-12: 환자 수, N: 음성 대조군 (내부 대조군만 포함), Internal: 내부 대조군, MH: 마이코플라스마 호미니스, CT: 클라미디아 트라코마티스, HSV-2: 헤르페스 심플렉스 바이러스-2, NG: 네이지리아 고노로이아, UU: 유레아플라스마 유레아리티쿰.
도 2는 12명의 환자로부터 얻은 병원체시료에 본 발명의 프라이머 세트 II를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 1-12: 환자 수, N: 음성 대조군 (내부 대조군만 포함), Internal: 내부 대조군, TV: 트리코모나스 버지날리스, GV: 가드네렐라 버지날리스, MG: 마이코플라스마 제니탈리움, TP: 트레포네마 팔리둠, HD: 헤모필러스 듀크레이, CA: 칸디다 알비칸스.
본 발명은 성인성 (性因性) 질환 병원체 핵산과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 키트 및 이를 사용한 병원체 증폭 및 검출방법에 관한 것이다.
성인성 (性因性) 질환 (sexually transmitted disease)이란 세균, 진균, 바이러스, 원충 또는 외부기생충 등의 병원체 (pathogen)에 의한 전염성 질환으로 주로 성행위에 의하여 전파되는 질환이다.
기존에는 매독, 임질, 연성하감, 서혜부 육아종, 성병성임파육아종 등을 성병 (venereal disease)이라 칭하였으나, 성적 접촉에 의해 전파될 수 있는 질환들 즉 비임균성요도염, 음부포진, 첨규 콘딜롬, 사면발이증, 트리코모나스증, 칸디다증 등이 알려지면서 성행위와 연관된다는 의미인 성인성 질환이라는 용어를 사용하게 되었다.
성인성 질환은 가려움증, 불쾌감, 냉대하증 등 가벼운 증상에서부터 매독이나 AIDS와 같이 생명을 위협하는 질환까지 다양하다. 가벼운 증상을 나타내는 성인성 질환일지라도 반드시 치료를 해야 하며, 치료가 부적절한 경우 재발이 잘 될 뿐만 아니라, 불임이나, 선천성 기형아 출산의 문제를 일으킬 수 있다.
일반적으로 성인성 질환의 병원체는 30여 종이 넘는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 병원체는 다음과 같다: 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 유레아플라스마 유레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum ), 네이지리아 고노로이아 (Neisseria gonorrheae ), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis ), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 또는 2 (Herpes simplex virus 1 또는 2), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi ), 트리코모나스 버지날리스 (Trichomonas vaginalis), 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium ), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum ) 및 가드네렐라 버지날리스 (Gardnella vaginalis ).
질환의 치료나 진단에 있어 증상별로 접근하는 것이 편리하기는 하나, 효과적인 치료를 위해서는 병원균을 정확히 동정하는 것이 필요하다. 임상소견으로 병원균을 진단하기도 하다. 하지만, 정확한 동정을 위하여 도말, 배양 등의 전통적인 방법, 당이용법, 면역형광법, 공응집법 (co-agglutination), 단일군 항체 검사법 등이 행하여지고 있다. 최근에는 병원체의 RNA 및 DNA 등를 검출하는 방법이 개발되고 있다.
RNA 및 DNA를 검출하는 방법 중의 하나로 핵산 증폭 방법인 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하는 방법이 있으며, 정확성 및 편리성 등을 이유로 주목을 받고 있다. 하지만, PCR의 경우, 프라이머의 비특이적 혼성화에 의한 위-양성 (false-positive) 산물이 생성되는 문제점이 있다.
특히, 동시에 여러 병원체를 진단하기 위하여 멀티플레스 PCR (multiplex PCR)를 실시하는 경우에, 통상적인 프라이머는 그 서열을 디자인하는데 더 많은 제약이 따를 뿐 만 아니라, 위양성 산물 생성이 더욱 문제가 된다.
본 발명자는 간편하고 신속하면서도 매우 정확하게 성인성 질환 병원체를 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명자에 의하여 발명된 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 (dual specificity oligonucleotide) 형태를 갖는 핵산 혼성화용 서열을 사용하면, 다양한 성인성 질환 병원체를 정확하게 검출할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 성인성 질환 병원체 핵산과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 성인성 질환 병원체 핵산 증폭 또는 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 성인성 질환 병원체 핵산을 증폭하는 방법 또는 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 성인성 (性因性) 질환-유발 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화 (hybridization)되는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 다음의 일반식으로 표시되는, 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
5'-Xp-Yq-Zr-3'
상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-고 Tm 특이성 구역 (5'-high Tm specificity portion)이고, Yq는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-저 Tm 특이성 구역 (3'-low Tm specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5'-고 Tm 특이성 구역의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 구역의 Tm보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 5'-고 Tm 특이성 구역과 3'-저 Tm 특이성 구역이 타깃 서열에 혼성화되는 조건 하에서 상기 분할 구역은 비-염기쌍 버블 구조를 형성하고, 상기 버블 구조는 혼성화 특이성 측면에서 5'-고 Tm 특이성 구역이 3'-저 Tm 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-고 Tm 특이성 구역과 3'-저 Tm 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 DSO 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키며, 상기 성인성 질환 병원체는 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 유레아플라스마 유레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 네이지리아 고노로이아 (Neisseria gonorrheae), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis ), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 또는 2 (Herpes simples virus 1 또는 2), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi), 트리코모나스 버지날리스 (Trichomonas vaginalis ), 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum ) 또는 가드네렐라 버지날리스 (Gardnella vaginalis)이며, 상기 타깃 서열은 상기 성인성 질환 병원체의 핵산 서열이다.
본 발명은 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 유레아플라스마 유레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 네이지리아 고노로이아 (Neisseria gonorrheae), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 또는 2 (Herpes simples virus 1 or 2), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi ), 트리코모나스 버지날리스 (Trichomonas vaginalis ), 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium ), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum ) 또는 가드네렐라 버지날리스 (Gardnella vaginalis )의 핵산과 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “병원체 핵산”은 병원체의 지놈 자체뿐만 아니라 병원체 지놈으로부터 유래되는 모든 RNA 또는 DNA (예컨대, cDNA)를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어 “병원체 핵산”은 플라스미드도 포함한다.
본 명세서에서 용어“혼성화”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링 (pairing)에 의하여 이합체 구조 (duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 일부 미스매치 (mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면, 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면, 일부 미스매치가 존재하더라고 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면, 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 가지는 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고, 이중 특이성 (dual specificity) 구조라 명명할 수 있고, 이러한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 (dual specificity oligonucleotide)라 명명된다. DSO는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 올리고뉴클레오타이드로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-고 Tm 특이성 구역 (5'-high Tm specificity portion)과 3'-저 Tm 특이성 구역 (3'-low Tm specificity portion)에 의해 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다 (참조: PCT/KR2005/001206).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤 즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 5'-고 Tm 특이성 구역의 길이는 3'-저 Tm 특이성 구역보다 길다. 상기 5'-고 Tm 특이성 구역은 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 3'-저 Tm 특이성 구역은 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-고 Tm 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 3'-저 Tm 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 병원체-특이 올리고뉴클레오타이드는, (1) 타깃 병원체의 종 (species)에 특이적인 서열로서 (2) 동일 종의 분리종 (isolates or strain) 간에는 공통적으로 존재하는 보존서열 부위를 기본으로 하여 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 (dual specificity oligonucleotide: DSO) 형태로 디자인된다. 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드의 제조에 기본이 되는 서열은 공지된 병원체의 핵산 서열을 검색하여 타깃 병원체의 종 (species)에 특이적인 서열이면서 동일 종 병원체의 분리종들 (isolates or strain)간에는 보존서열인 부위를 발굴하고, 발굴된 서열 중 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있으며, DSO 형태로 제조하기에 유용한 서열에서 선택된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 혼성화되는 타깃서열은 타깃 병원체의 지놈 상의 특정 유전자를 코딩하는 서열, 타깃 병원체의 rRNA를 코딩하는 서열, 상기 서열 사이의 지놈 서열 또는 플라스미드 상의 서열이다.
본 발명의 바림직한 구현예에 따르면, 타깃 서열은 공지된 서열에 기초하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 마이코플라스마 호미니스의 경우, GenBank 접근번호: AJ243692, AY879770, AF443617, Z98055, Z27121, AJ132792, AJ005058, AY738737; 유레아플라스마 유레아리티쿰의 경우, GenBank 접근번호: AF085729, U50459, L20329, AY641822, X51315, Z34275, AF272621; 네이지리아 고노로이아의 경우, GenBank 접근번호: AJ223447, AE004969, M10316, U20374; 클라미디아 트라코마티스의 경우, GenBank 접근번호: M19487, AE001273, CP000051; 헤르페스 심플렉스 바이러스 2의 경우 GenBank 접근번호: Z86099; 헤르페스 심플렉스 바이러스 1의 경우 GenBank 접근번호: AJ421498, X14112; 칸디다 알비칸스의 경우 GenBank 접근번호: M90812, AP006852; 헤모필러스 듀크레이의 경우, GenBank 접근번호: AF087639, AY434675, AE017143; 트리코모나스 버지날리스의 경우, GenBank 접근번호: L05468; 마이코플라스마 제니탈리움의 경우, GenBank 접근번호: L43967, AY386817, AY816341; 트레포네마 팔리둠의 경우, GenBank 접근번호: M88769, AE000520, X61228, X54111; 가드네렐라 버지날리스의 경우, GenBank 접근번호: L08167, M58744, M85116에 기재된 서열을 이용하여 서열을 선택할 수 있다.
본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 각 병원체에 대하여 바람직한타깃 서열은 표 1a-1b의 이용서열에 기재된 서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 부위는 상기 타깃 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있도록 그 서열이 디자인된다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상기 타깃 병원체 핵산에 특이적으로 혼성화되는 것으로 서열목록 제 1 내지 43 서열에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드이다.
서열목록 제 1 서열 내지 43 서열과 그 타깃 병원체는 표 1a-1b과 같다.
SEQ ID NO 병원체 명칭 프라이머 서열 (5’→ 3’) 이용서열
1 마이코플라스마 호미니스 MH-gap-F1 TGC TCC AGC TAA AAG CGA AGG IIIII AAA CAG TTG TT gap gene
2 MH-gap-F2 ACT GTT TAG CTC CTA TTG CCA ACG IIIII GAA AAA AAC TT
3 MH-gap-R2 GCC TGC TTT TGC ACC AAT AAT A IIIII TGA TAC AAT TG
4 유레아플라스마 유레아리티쿰 UU-F1 AAA TTC CTC GTA AAG GCG GAC IIIII ATG ATT AAA TCA ureG 및 ureD
5 UU-F2 GAA GCA CAC AAC AAA ATG GCG IIIII TGT GTA TTT CAC
6 UU-R1 CAT AAC CCC CGC CCA TAC TAA IIIII TGA AAA CAG GG
7 UU-R2 GCT TTG GCT GAT GAT TGC GTA G IIIII ATG CAA CGT GC
8 네이지리아 고노로이아 NG-porA-F1 TAC GCC TGC TAC TTT CAC GCT IIIII GTA ATC AGA TG porA pseudogene
9 NG-porA-R1 CAA TGG ATC GGT ATC ACT CGC IIIII CGA GCA AGA AC
10 클라미디아 트라코마티스 Ctra-F279 GACTCGGCTTGGGAAGAGCT IIIII GGCGTCGTAT pCTT1
11 Ctra-R626 AGCCAGCACTCCAATTTCTGAC IIIII GAATATATCA
12 CT-F1 CCT TGG AGC ATT GTC TGG GC IIIII ACC AAT CCC G
13 CT-R1 TGG ACC GCA TCA CTC AAC AA IIIII CTT GTA GAT C
14 CT-F2 TGC AAC GGG TTA TTC ACT CCC IIIII CAT TGA AAC TT
15 CT-R2 ACC CAT ACC ACA CCG CTT TCT IIIII GCC TAC ACG T
16 CT-ompA-F1 GCTTCTGGGAATACGACCTCTACT IIIII AAAATTGGTAG ompA
17 CT-ompA-R1 CCAACACTCCAAGCAAAAGTA IIIII TGTATACAGT
18 CT-ompA-R2 CCACATTCCCACAAAGCTGC IIIII CTCCAACACT
19 헤르페스 심플렉스 바이러스-2 HSV2-glyC-F1 CAG CGG CTC ATC ATC GAA GA IIIII CCC TGG AGA C glycoprotein C
20 HSV2-glyC-R1 TCT CCT GCG TCT GCG TGT GT IIIII GGC CGG ATC G
21 HSV2-glyC-R2 GCA TGG TCG CCC GTA AAC TC IIIII TGA TGG TTG G
22 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 HSV1-gC-F1 CAGCGGCTGATTATCGGCGA IIIII CGCCCGCGAC gC-1
23 HSV1-gC-R1 GCTCGTGCGTCTGCGTGTCG IIIII GCCCGGGTTA
24 HSV1-gC-R2 ACATGCCGGACCCCAAATTC IIIII TGATGGTTGG
25 칸디다 알비칸스 CA-phr1-F1 TGCCGATGGTAGCAAAGGTG IIIII GGTGTTGCTT pH responsive protein
26 CA-phr1-F2 TCCTCTGGTGGAAGCTCCAA IIIII GATCTTCCTC
27 CA-phr1-R1 CGTCCTATACAACAGAACCCTTCA IIIII GTTAGTCTTC
28 헤모필러스 듀크레이 HD-p27-F1 TGCTTGCAACACCAAATGATG IIIII CAAAAAGTAGT p27
29 HD-p27-R1 TCTACAGGGTTGTTTGCAGGC IIIII ACAAGCAGTT
30 HD-p27-R2 GGTTTTGTTGCCATTCTTGGAA IIIII TGTAGTCTTC
31 트리코모나스 버지날리스 TV-btub1-F1 GCTGAATCCTGCGACTGCCT IIIII GCTTCCAGCT beta-tubulin 1
32 TV-btub1-F2 CTCAACTCCGACCTTCGTAAGC IIIII GTCAACCTTG
33 TV-btub1-R1 GGAAGTGAGCGGATGTAAGGTAAG IIIII CGGCGTGGAT
34 마이코플라스마 제니탈리움 MG-gyrA-F1 ATAATCTTCAACATCGTGGTGGAG IIIII GTTAAAGGGC gyrA
35 MG-gyrA-R1 AATCTCATCATTTCCGTGGGTT IIIII TACTGAATACA
36 MG-gyrA-F2 AAAACCCACGGAAATGATGAGA IIIII ATTGGTTCTAC
37 MG-gyrA-R2 CTCCCTTAGCATTACGTTTTGTGA IIIII TATTTATCTATG
38 트레포네마 팔리둠 TP-47-F1 GCGTCATTTCAGGATTTGGG IIIII ACGGGGAGAT 47-kd 항원
39 TP-47-F2 TCACGGTATGAAGTTTGTCCCA IIIII GGTTCCTCAT
40 TP-47-R1 GCGTCATCACCGTAGTAGTCGTAG IIIII CGTGTTGAAG
41 가드네렐라 버지날리스 GV-F1 CGCTCGGTTGAGTGTGGTTAC IIIII TGGAAAACAA 16S & 23S rRNA (internal transcribed spacer)
42 GV-F2 TTGGCTTGTGTTCTTGGTGTTTG IIIII TTGAGAACTG
43 GV-R1 AATCCCACGACCCCGAATAC IIIII ACCTGACGGT
* I: 디옥시이노신
이와 같이, 발굴된 보존 서열을 DSO 행태로 디자인한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 위양성 산물 (false positive product) 및 배경 산물 (backgrounds)의 문제를 상당히 개선할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열 내지 43 서열뿐만 아니라 상기 서열과 상보적인 서열 및 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “실질적으로 동일한 서열”은 올리고뉴클레오타이드가 상기한 DSO의 구조를 가지면서 타깃 서열에 특이적으로 혼성화되는 능력을 보유하는 범위 내에서, 서열목록 제 1 서열 내지 43 서열에 기재된 서열의 일부 염기가 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 의미한다. 이러한 실질적으로 동일한 서열이 본 발명의 청구범위에 속한다는 것은 균등론의 원칙 하에 명확하게 인식된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프로브 (probe)로서 타깃 병원체 핵산과의 혼성화를 통하여 타깃 병원체 핵산을 검출하는데 사용된다. 본 명세서에서 용어 “프로브”는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소, 매스 표지, 전자밀집입자, 효소, 조인자, 효소에 대한 기질, 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5‘-말단, 3’-말단 또는 내부에 표지된다. 표지는 직접 표지 즉, 염료 또는 간접 표지 즉, 바이오틴, 디고신 (digoxin), 알칼리 포스파타아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 등일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 (primer)로서 타깃 병원체 핵산과의 혼성화를 통하여 타깃 병원체 핵산을 증폭하는데 사용된다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 타깃 병원체 핵산의 증폭은 타깃 병원체의 검출을 위한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 성인성 질환 병원체 핵산과 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 쌍 (pair)을 제공한다.
본 발명에서 각 병원체에 대하여 바람직한 올리고뉴클레오타이드 쌍은 다음과 같다.
마이코플라스마 호미니스: 서열목록 제 1 및 3 서열, 또는 서열목록 제 2 및 3서열;
유레아플라스마 유레아리티쿰: 서열목록 제 4 및 6 서열, 서열목록 제 4 및 7 서열, 서열목록 제 5 및 6 서열, 또는 서열목록 제 5 및 7 서열; 네이지리아 고노로이아: 서열목록 제 8 및 9 서열; 클라미디아 트라코마티스: 서열목록 제 10 및 11 서열, 서열목록 제 12 및 13 서열, 서열목록 제 14 및 15 서열, 서열목록 제 16 및 17 서열, 또는 서열목록 제 16 및 18 서열; 헤르페스 심플레 2 바이러스: 서열목록 제 19 및 20 서열, 또는 서열목록 제 19 및 21 서열; 헤르페스 심플레 1 바이러스: 서열목록 제 22 및 23 서열, 또는 서열목록 제 22 및 24 서열; 칸디다 알비칸스: 서열목록 제 25 및 27 서열, 또는 서열목록 제 26 및 27 서열; 헤모필러스 듀크레이: 서열목록 제 28 및 29 서열, 또는 서열목록 제 28 및 30 서열; 트리코모나스 버지날리스: 서열목록 제 31 및 33 서열, 또는 서열목록 제 32 및 33 서열; 마이코플라스마 제니탈리움: 서열목록 제 34 및 35 서열, 또는 서열목록 제 36 및 37 서열; 트레포네마 팔리둠: 서열목록 제 38 및 40 서열, 또는 서열목록 제 39 및 40 서열; 가드네렐라 버지날리스: 서열목록 제 41 및 43 서열, 또는 서열목록 제 42 및 43 서열
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 쌍은 상술한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열로 구성되므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
바람직하게는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 쌍은 성인성 질환 병원체 검출을 위한 프라이머 쌍 (전방형 및 역방향 프라이머)으로 사용된다.
본 발명의 또 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 쌍 (pair)에서 선택되는 두 쌍 이상의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함하는 성인성 질환 병원체 핵산과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 세트 (set)를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 세트는 상술한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로 구성되므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 세트는 성인성 질환 병원체 검출을 위한 프로브 세트 또는 증폭을 위한 프라이머 세트로 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 목적에 따라 동시에 여러 종류가 사용될 수 있으며, 동시에 사용되어도 각각 및 전체 결과에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 세트는 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)의 프라이머 세트로 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제 2 및 3 서열, 서열목록 제 5 및 6 서열, 서열목록 제 8 및 9 서열, 서열목록 제 10 및 11 서열 및 서열목록 제 19 및 20 서열 (또는 서열목록 제 22 및 23 서열)을 한 세트로 하여 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제 26 및 27 서열, 서열목록 제 28 및 29 서열, 서열목록 제 31 및 33 서열, 서열목록 제 34 및 35 서열, 서열목록 제 39 및 40 서열 및 서열목록 제 42 및 43 서열을 한 세트로 하여 사용한다.
상기 구현예는 일 구현예일 뿐이며, PCR 크기를 고려하여 목적에 따라 다양한 조합을 구성할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 쌍, 또는 올리고뉴클레오타이드 세트를 포함하는 성인성 질환 병원체 검출용 키트 또는 성인성 질환 병원체 증폭용 키트를 제공한다.
본 발명은 상술한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트가 PCR에 사용되는 경우, 선택적으로 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 저해제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 포지티브 및 네가티브 대조군 반응을 수행하는 데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 구획에 상술한 성분들을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 쌍, 올리고뉴클레오타이드를 세트를 사용하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 성인성 질환 병원체 핵산에 혼성화시키는 단계를 포함하는 성인성 질환 병원체 검출방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 쌍, 올리고뉴클레오타이드를 세트를 사용하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 성인성 질환 병원체 핵산에 혼성화시키는 단계를 포함하는 성인성 질환 병원체 증폭방법을 제공한다.
본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이다.
성인성 질환 병원체의 핵산 서열을 증폭하는 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관련 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다.
핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 성인성 질환 병원체의 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용된다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMPs 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 (즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
본 발명의 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리(또는 정제)는 증폭과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 발현 벡터를 가지는 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 증폭 산물을 발현하기 위하여, 프로모터의 조절하 또는 프로모터에 작동적으로 연결된 증폭 산물을 운반하는 발현 벡터를 제조한다. 다양한 숙주-발현 시스템에서 단백질 또는 펩타이드 발현을 하기 위하여, 증폭산물 및 전사/번역/조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하는 많은 표준 기술들이 알려져 있다. 원핵세포 숙주용 프로모터는 pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 및 T7 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 진핵세포 숙주용 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 그리고 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 또는 시토메갈로 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵세포 숙주의 예는 E. coli, 바실러스 서브틸리스, 그리고, 살로넬라 티피무리움, 세라티아 마르세센스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내세균을 포함한다. 미생물뿐만 아니라, 다세포 유기체로부터 유래된 세포 배양물도 숙주로서 이용할 수 있다. 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 세포배양물이 이용될 수 있다. 포유동물 세포뿐만 아니라, 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 하나 또는 그 이상의 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물도 이용될 수 있다. 증폭산물로부터 발현된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다.
한편, 본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, 본 발명은 멀티플렉스 PCR 과정에 따라 실시된다. 멀티플렉스 PCR은 PCR의 다른 변형 형태로서, 동일한 반응물에서 둘 이상의 프라이머쌍을 이용하여 하나 이상의 타깃 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 그러나, 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나오며, 이러한 오류의 결과는 반응 실패에 의한 위음성 (false-negative) 결과 그리고 가짜 생성물의 증폭과 같은 위양성 (false-positive) 결과를 포함한다. 따라서 이러한 오류를 줄이기 위하여 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 최적화하는 데 인력과 시간을 많이 소비하지만, 만족할만한 결과를 얻기는 극히 힘들다. 본 발명의 방법은 이러한 종래의 멀티플렉스 PCR의 문제점을 극복하여, 하나의 PCR 반응 세트에서 다양한 종류의 성인성 질환 병원체를 동시에 오류 없이 증폭할 수 있다.
본 발명의 이점 (advantages)을 정리하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 올리고뉴클레오트이드의 탁월한 특이성으로 인하여 위음성 오류 또는 위양성-오류를 극복할 수 있다;
(b) 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 멀티플렉스 PCR에서 우수한 작동성 (workability)을 나타내어, 하나의 PCR 반응 세트에서 다양한 종류의 성인성 질환 병원체를 동시에 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I: 프라이머 디자인 및 제조
공지된 병원체의 핵산 서열을 참조하여, 타깃 병원체의 종 (species)에 특이적인 서열로서 분리종 (isolates or strain) 간에는 공통적으로 존재하는 보존서열 부위를 발굴하였다.
실시예 I-1: 마이코플라스마 호미니스 핵산 증폭용 프라이머
마이코플라스마 호미니스의 gap 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
MH-gap-F1 TGC TCC AGC TAA AAG CGA AGG IIIII AAA CAG TTG TT (SEQ ID NO: 1)
MH-gap-F2 ACT GTT TAG CTC CTA TTG CCA ACG IIIII GAA AAA AAC TT(SEQ ID NO: 2)
MH-gap-R2 GCC TGC TTT TGC ACC AAT AAT A IIIII TGA TAC AAT TG (SEQ ID NO: 3)
실시예 I-2: 유레아플라스마 유레아리티쿰 핵산 증폭용 프라이머
유레아플라스마 유레아리티쿰의 ureG 및 ure D 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
UU-F1 AAA TTC CTC GTA AAG GCG GAC IIIII ATG ATT AAA TCA (SEQ ID NO: 4)
UU-F2 GAA GCA CAC AAC AAA ATG GCG IIIII TGT GTA TTT CAC (SEQ ID NO: 5)
UU-R1 CAT AAC CCC CGC CCA TAC TAA IIIII TGA AAA CAG GG (SEQ ID NO: 6)
UU-R2 GCT TTG GCT GAT GAT TGC GTA G IIIII ATG CAA CGT GC (SEQ ID NO: 7)
실시예 I-3: 네이지리아 고노로이아 핵산 증폭용 프라이머
네이지리아 고노로이아의 porA pseudogene에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
NG-porA-F1 TAC GCC TGC TAC TTT CAC GCT IIIII GTA ATC AGA TG (SEQ ID NO: 8)
NG-porA-R1 CAA TGG ATC GGT ATC ACT CGC IIIII CGA GCA AGA AC (SEQ ID NO: 9)
실시예 I-4: 클라미디아 트라코마티스 핵산 증폭용 프라이머
클라미디아 트라코마티스의 pCTT1 또는 ompA에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
Ctra-F279 GACTCGGCTTGGGAAGAGCT IIIII GGCGTCGTAT (SEQ ID NO: 10)
Ctra-R626 AGCCAGCACTCCAATTTCTGAC IIIII GAATATATCA (SEQ ID NO: 11)
CT-F1 CCT TGG AGC ATT GTC TGG GC IIIII ACC AAT CCC G (SEQ ID NO: 12)
CT-R1 TGG ACC GCA TCA CTC AAC AA IIIII CTT GTA GAT C (SEQ ID NO: 13)
CT-F2 TGC AAC GGG TTA TTC ACT CCC IIIII CAT TGA AAC TT (SEQ ID NO: 14)
CT-R2 ACC CAT ACC ACA CCG CTT TCT IIIII GCC TAC ACG T (SEQ ID NO: 15)
CT-ompA-F1 GCTTCTGGGAATACGACCTCTACT IIIII AAAATTGGTAG (SEQ ID NO: 16)
CT-ompA-R1 CCAACACTCCAAGCAAAAGTA IIIII TGTATACAGT (SEQ ID NO: 17)
CT-ompA-R2 CCACATTCCCACAAAGCTGC IIIII CTCCAACACT (SEQ ID NO: 18)
실시예 I-5: 헤르페스 심플렉스 바이러스 2 핵산 증폭용 프라이머
헤르페스 심플렉스 바이러스 2의 글리코프로테인 C 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
HSV2-glyC-F1 CAG CGG CTC ATC ATC GAA GA IIIII CCC TGG AGA C (SEQ ID NO:19)
HSV2-glyC-R1 TCT CCT GCG TCT GCG TGT GT IIIII GGC CGG ATC G (SEQ ID NO:20)
HSV2-glyC-R2 GCA TGG TCG CCC GTA AAC TC IIIII TGA TGG TTG G (SEQ ID NO:21)
실시예 I-6: 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 핵산 증폭용 프라이머
헤르페스 심플렉스 바이러스 1의 gC-1 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
HSV1-gC-F1 CAGCGGCTGATTATCGGCGA IIIII CGCCCGCGAC (SEQ ID NO:22)
HSV1-gC-R1 GCTCGTGCGTCTGCGTGTCG IIIII GCCCGGGTTA (SEQ ID NO:23)
HSV1-gC-R2 ACATGCCGGACCCCAAATTC IIIII TGATGGTTGG (SEQ ID NO:24)
실시예 I-7: 칸디다 알비칸스 핵산 증폭용 프라이머
칸디다 알비칸스의 pH 반응 단백질의 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
CA-phr1-F1 TGCCGATGGTAGCAAAGGTG IIIII GGTGTTGCTT (SEQ ID NO:25)
CA-phr1-F2 TCCTCTGGTGGAAGCTCCAA IIIII GATCTTCCTC (SEQ ID NO:26)
CA-phr1-R1 CGTCCTATACAACAGAACCCTTCA IIIII GTTAGTCTTC (SEQ ID NO:27)
실시예 I-8: 헤모필러스 듀크레이 핵산 증폭용 프라이머
헤모필러스 듀크레이의 p27 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
HD-p27-F1 TGCTTGCAACACCAAATGATG IIIII CAAAAAGTAGT (SEQ ID NO:28)
HD-p27-R1 TCTACAGGGTTGTTTGCAGGC IIIII ACAAGCAGTT (SEQ ID NO:29)
HD-p27-R2 GGTTTTGTTGCCATTCTTGGAA IIIII TGTAGTCTTC (SEQ ID NO:30)
실시예 I-9: 트리코모나스 버지날리스 핵산 증폭용 프라이머
트리코모나스 버지날리스의 베타-튜블린 1 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
TV-btub1-F1 GCTGAATCCTGCGACTGCCT IIIII GCTTCCAGCT (SEQ ID NO:31)
TV-btub1-F2 CTCAACTCCGACCTTCGTAAGC IIIII GTCAACCTTG (SEQ ID NO:32)
TV-btub1-R1 GGAAGTGAGCGGATGTAAGGTAAG IIIII CGGCGTGGAT (SEQ ID NO:33)
실시예 I-10: 마이코플라스마 제니탈리움 핵산 증폭용 프라이머
마이코플라스마 제니탈리움의 gyrA 유전자에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
MG-gyrA-F1 ATAATCTTCAACATCGTGGTGGAG IIIII GTTAAAGGGC (SEQ ID NO:34)
MG-gyrA-R1 AATCTCATCATTTCCGTGGGTT IIIII TACTGAATACA (SEQ ID NO:35)
MG-gyrA-F2 AAAACCCACGGAAATGATGAGA IIIII ATTGGTTCTAC (SEQ ID NO:36)
MG-gyrA-R2 CTCCCTTAGCATTACGTTTTGTGA IIIII TATTTATCTATG (SEQ ID NO:37)
실시예 I-11: 트레포네마 팔리둠 핵산 증폭용 프라이머
트레포네마 팔리둠의 47-kd 항원을 인코딩하는 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
TP-47-F1 GCGTCATTTCAGGATTTGGG IIIII ACGGGGAGAT (SEQ ID NO: 38)
TP-47-F2 TCACGGTATGAAGTTTGTCCCA IIIII GGTTCCTCAT (SEQ ID NO: 39)
TP-47-R1 GCGTCATCACCGTAGTAGTCGTAG IIIII CGTGTTGAAG (SEQ ID NO: 40)
실시예 I-12: 가드네렐라 버지날리스 핵산 증폭용 프라이머
가드네렐라 버지날리스의 16S & 23S rRNA 사이의 내부 지놈 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DSO (dual specificity oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다.
GV-F1 CGCTCGGTTGAGTGTGGTTAC IIIII TGGAAAACAA (SEQ ID NO:41)
GV-F2 TTGGCTTGTGTTCTTGGTGTTTG IIIII TTGAGAACTG (SEQ ID NO:42)
GV-R1 AATCCCACGACCCCGAATAC IIIII ACCTGACGGT (SEQ ID NO:43)
실시예 I-13: 종래 형태의 프라이머의 제조
상기 본 발명의 프라이머를 종래 형태의 프라이머 즉, DSO 구조를 가지지 않는 프라이머 형태로 제조하고 대조용 프라이머 세트로 사용하였다. 종래 형태의 프라이머 서열 및 대응하는 본 발명의 프라이머의 명칭은 다음과 같다.
종래 형태의 프라이머 서열 ( 5’→ 3’) 대응하는 본 발명의 프라이머 명칭
TGC TCC AGC TAA AAG CGA AGG TGTTA AAA CAG TTG TT MH-gap-F1
ACT GTT TAG CTC CTA TTG CCA ACG TATTG GAA AAA AAC TT MH-gap-F2
GCC TGC TTT TGC ACC AAT AAT A TCACT TGA TAC AAT TG MH-gap-R2
AAA TTC CTC GTA AAG GCG GAC AAGGA ATG ATT AAA TCA UU-F1
GAA GCA CAC AAC AAA ATG GCG CATAC TGT GTA TTT CAC UU-F2
CAT AAC CCC CGC CCA TAC TAA TAGTT TGA AAA CAG GG UU-R1
GCT TTG GCT GAT GAT TGC GTA G TAATA ATG CAA CGT GC UU-R2
TAC GCC TGC TAC TTT CAC GCT GGAAA GTA ATC AGA TG NG-porA-F1
CAA TGG ATC GGT ATC ACT CGC TCTGC CGA GCA AGA AC NG-porA-R1
GACTCGGCTTGGGAAGAGCT TTTGC GGCGTCGTAT Ctra-F279
AGCCAGCACTCCAATTTCTGAC TGTGA GAATATATCA Ctra-R626
CCT TGG AGC ATT GTC TGG GC GATCA ACC AAT CCC G CT-F1
TGG ACC GCA TCA CTC AAC AA ACATA CTT GTA GAT C CT-R1
TGC AAC GGG TTA TTC ACT CCC AGTAA CAT TGA AAC TT CT-F2
ACC CAT ACC ACA CCG CTT TCT AAACC GCC TAC ACG T CT-R2
GCTTCTGGGAATACGACCTCTACT CTTTC AAAATTGGTAG CT-ompA-F1
CCAACACTCCAAGCAAAAGTA GTATC TGTATACAGT CT-ompA-R1
CCACATTCCCACAAAGCTGC ACGAG CTCCAACACT CT-ompA-R2
CAG CGG CTC ATC ATC GAA GA GCTGA CCC TGG AGA C HSV2-glyC-F1
TCT CCT GCG TCT GCG TGT GT ATCTG GGC CGG ATC G HSV2-glyC-R1
GCA TGG TCG CCC GTA AAC TC CATGG TGA TGG TTG G HSV2-glyC-R2
CAGCGGCTGATTATCGGCGA GGTGA CGCCCGCGAC HSV1-gC-F1
GCTCGTGCGTCTGCGTGTCG ATCTG GCCCGGGTTA HSV1-gC-R1
ACATGCCGGACCCCAAATTC CATGG TGATGGTTGG HSV1-gC-R2
TGCCGATGGTAGCAAAGGTG AATAT GGTGTTGCTT CA-phr1-F1
TCCTCTGGTGGAAGCTCCAA ATCTG GATCTTCCTC CA-phr1-F2
CGTCCTATACAACAGAACCCTTCA TATCG GTTAGTCTTC CA-phr1-R1
TGCTTGCAACACCAAATGATG AAGCA CAAAAAGTAGT HD-p27-F1
TCTACAGGGTTGTTTGCAGGC TTATC ACAAGCAGTT HD-p27-R1
GGTTTTGTTGCCATTCTTGGAA TTTTT TGTAGTCTTC HD-p27-R2
GCTGAATCCTGCGACTGCCT TCAGG GCTTCCAGCT TV-btub1-F1
CTCAACTCCGACCTTCGTAAGC TCGCT GTCAACCTTG TV-btub1-F2
GGAAGTGAGCGGATGTAAGGTAAG ACACA CGGCGTGGAT TV-btub1-R1
ATAATCTTCAACATCGTGGTGGAG TTGGG GTTAAAGGGC MG-gyrA-F1
AATCTCATCATTTCCGTGGGTT TTAAT TACTGAATACA MG-gyrA-R1
AAAACCCACGGAAATGATGAGA TTTTT ATTGGTTCTAC MG-gyrA-F2
CTCCCTTAGCATTACGTTTTGTGA GTCTA TATTTATCTATG MG-gyrA-R2
GCGTCATTTCAGGATTTGGG AGAGG ACGGGGAGAT TP-47-F1
TCACGGTATGAAGTTTGTCCCA GTTGC GGTTCCTCAT TP-47-F2
GCGTCATCACCGTAGTAGTCGTAG CGGAC CGTGTTGAAG TP-47-R1
CGCTCGGTTGAGTGTGGTTAC TGGTG TGGAAAACAA GV-F1
TTGGCTTGTGTTCTTGGTGTTTG GTGGT TTGAGAACTG GV-F2
AATCCCACGACCCCGAATAC GCAAC ACCTGACGGT GV-R1
실시예 II: 병원체 시료의 준비
환부 스왑 (swap) 또는 소변 등으로부터 병원체를 채취하여 이로부터 DNA를 분리하였다. 효율적인 DNA 분리를 위하여 QIA quick PCR purification kit (Qiagen, 미합중국)을 사용하였다.
실시예 III: 내부 대조군 (internal control)
벼 (Oryza sativa) 의 광합성 관련 유전자인 rbcL을 pUC 18 벡터에 삽입하여 내부 대조군으로 사용하였다.
rbcL 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머 서열은 다음과 같으며, 증폭 산물의 크기는 719 bp이다.
명칭 sequence (5'- 3')
rbcL-F164 CTGCAGTAGCTGCCGAATCTTCIIIIIGTACATGGAC
rbcL-R882 GTGAATGTGAAGAAGTAGGCCGTTIIIIIGGCAATAATG
실시예 IV: 멀티플렉스 PCR
실시예 I에서 제조된 프라이머 중에서 다음과 같이 프라이머 세트 I 및 II를 준비하였다. 상기 프라이머 세트 I 및 II, 그리고 실시예 II에서 얻은 환자의 병원체 DNA 시료를 사용하여 멀티플렉스 PCR를 수행하였다(각 프라이머 세트는 실시예 III의 내부 대조군 증폭용 프라이머를 포함한다). 음성 대조군은 내부 대조군만을 포함하는 시료를 사용하였다.
프라이머 세트 I
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
Mycoplasma hominis MH-gap-F2 / MH-gap-R2 398
Ureaplasma urealyticum UU-F2 / UU-R1 130
Neisseria gonorrhoeae NG-porA-F1 / NG-porA-R1 214
Chlamydia trachomatis CTR-F279 / CTR-R626 348
HSV-2 HSV2-glyC-F1 / HSV2-glyC-R1 283
프라이머 세트 II
병원체 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
Candida albicans CA-phr1-F2 / CA-phr1-R1 234
Haemophilus ducreyi HD-p27-F1 / HD-p27-R1 268
Trichomonas vaginalis TV-btub1-F1 / TV-btub1-R1 580
Mycoplasma genitalium MG-gyrA-F1 / MG-gyrA-R1 410
Treponema pallidum TP-47-F2 / TP-47-R1 345
Gardnerella vaginalis GV-F2 / GV-R1 509
DNA 시료, 15 mM MgCl2 (Roche)을 함유하는 2 ㎕의 10x PCR 반응 완충액, 2 ㎕의 dNTP (각각 2 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 4 ㎕의 프라이머 세트 I 또는 II 및 0.5 ㎕의 Taq 중합효소 (5 units/㎕)를 포함하는 최종 20 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열 (94℃) 된 온도 사이클러 (thermal cycler)에 넣고, 94℃ 15분에서 변성반응시킨 후, 94℃ 30초, 60-65℃ 1.5분 및 72℃ 1.5분의 30-45 사이클 처리하고; 이어 72℃에서 10분 반응시켰다.
PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로스 겔에 전기영동하고, 나타난 밴드를 용출하고 서열을 확인하였다.
한편, 실시예 I-13에서 제조한 종래 형태의 프라이머 쌍들(대조용 프라이머 세트)을 상기 프라이머 세트 대신 사용하여 동일한 실험을 실시하였다.
도 1 및 2는 환자로부터 얻은 병원체 시료에 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 도 1 (프라이머 세트 I) 및 2 (프라이머 세트 II)에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머는 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위-양성 오류 없이 성인성 질환 병원체 감염환자가 어떤 병원체에 감염되어 있는 지를 정확히 검출해 내었다.
성인성 질환 병원체의 검출에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 PCR 기반 기술의 프라이머로서 뿐만 아니라, 마이크로어레이 기반 기술에서 성인성 질환 병원체를 검출하는 프로브로도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 성인성 질환 병원체에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 키트 및 이를 사용한 성인성 질환 병원체 검출 또는 증폭 방법을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 (dual specificity oligonucleotide; DSO) 형태로 디자인된다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 성인성 질환 병원체에 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)에 매우 유용하다.
<110> Seegene, Inc. <120> Oligonucleotides for Detecting Nucleic Acids of Pathogen Causing Sexually Transmitted Diseases <160> 43 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-gap-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosne <400> 1 tgctccagct aaaagcgaag gnnnnnaaac agttgtt 37 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-gap-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 actgtttagc tcctattgcc aacgnnnnng aaaaaaactt 40 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-gap-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 gcctgctttt gcaccaataa tannnnntga tacaattg 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 aaattcctcg taaaggcgga cnnnnnatga ttaaatca 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 gaagcacaca acaaaatggc gnnnnntgtg tatttcac 38 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 cataaccccc gcccatacta annnnntgaa aacaggg 37 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 gctttggctg atgattgcgt agnnnnnatg caacgtgc 38 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-porA-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-porA-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 9 caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37 <210> 10 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gaaactt 37 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 15 acccatacca caccgctttc tnnnnngcct acacgt 36 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-ompA-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 16 gcttctggga atacgacctc tactnnnnna aaattggtag 40 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-ompA-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 17 ccaacactcc aagcaaaagt annnnntgta tacagt 36 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-ompA-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 18 ccacattccc acaaagctgc nnnnnctcca acact 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2-glyC-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 19 cagcggctca tcatcgaaga nnnnnccctg gagac 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2-glyC-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 20 tctcctgcgt ctgcgtgtgt nnnnnggccg gatcg 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2-glyC-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 21 gcatggtcgc ccgtaaactc nnnnntgatg gttgg 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1-gC-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 22 cagcggctga ttatcggcga nnnnncgccc gcgac 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1-gC-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 23 gctcgtgcgt ctgcgtgtcg nnnnngcccg ggtta 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV1-gC-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 24 acatgccgga ccccaaattc nnnnntgatg gttgg 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-phr1-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 25 tgccgatggt agcaaaggtg nnnnnggtgt tgctt 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-phr1-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 26 tcctctggtg gaagctccaa nnnnngatct tcctc 35 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-phr1-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 27 cgtcctatac aacagaaccc ttcannnnng ttagtcttc 39 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HD-p27-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 28 tgcttgcaac accaaatgat gnnnnncaaa aagtagt 37 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HD-p27-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 29 tctacagggt tgtttgcagg cnnnnnacaa gcagtt 36 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HD-p27-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 30 ggttttgttg ccattcttgg aannnnntgt agtcttc 37 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV-btub1-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 31 gctgaatcct gcgactgcct nnnnngcttc cagct 35 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV-btub1-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 32 ctcaactccg accttcgtaa gcnnnnngtc aaccttg 37 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV-btub1-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 33 ggaagtgagc ggatgtaagg taagnnnnnc ggcgtggat 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-gyrA-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 34 ataatcttca acatcgtggt ggagnnnnng ttaaagggc 39 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-gyrA-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 35 aatctcatca tttccgtggg ttnnnnntac tgaataca 38 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-gyrA-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 36 aaaacccacg gaaatgatga gannnnnatt ggttctac 38 <210> 37 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG-gyrA-R2 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 37 ctcccttagc attacgtttt gtgannnnnt atttatctat g 41 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP-47-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 38 gcgtcatttc aggatttggg nnnnnacggg gagat 35 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP-47-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 39 tcacggtatg aagtttgtcc cannnnnggt tcctcat 37 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP-47-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 40 gcgtcatcac cgtagtagtc gtagnnnnnc gtgttgaag 39 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV-F1 primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 41 cgctcggttg agtgtggtta cnnnnntgga aaacaa 36 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV-F2 primer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 42 ttggcttgtg ttcttggtgt ttgnnnnntt gagaactg 38 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GV-R1 primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 43 aatcccacga ccccgaatac nnnnnacctg acggt 35

Claims (16)

  1. 다음의 일반식으로 표시되는, 성인성(性因性) 질환-유발 병원체의 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드:
    5'-Xp-Yq-Zr-3'
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-고 Tm 특이성 구역 (5'-high Tm specificity portion)이고, Yq는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-저 Tm 특이성 구역 (3'-low Tm specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5'-고 Tm 특이성 구역의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 구역의 Tm보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 5'-고 Tm 특이성 구역과 3'-저 Tm 특이성 구역이 타깃 서열에 혼성화되는 조건 하에서 상기 분할 구역은 비-염기쌍 버블 구조를 형성하고, 상기 버블 구조는 혼성화 특이성 측면에서 5'-고 Tm 특이성 구역이 3'-저 Tm 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DSO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-고 Tm 특이성 구역과 3'-저 Tm 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 DSO 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키며, 상기 성인성 질환 병원체는 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis ), 유레아플라스마 유레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum ), 네이지리아 고노로이아 (Neisseria gonorrheae ), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis ), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 또는 2 (Herpes simples virus-1 or 2), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans ), 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi ), 트리코모나스 버지날리스 (Trichomonas vaginalis ), 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum ) 또는 가드네렐라 버지날리스 (Gardnella vaginalis )이며, 상기 타깃 서열은 상기 성인성 질환 병원체의 핵산 서열이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포 스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 분할 구역은 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 구역의 길이는 3'-저 Tm 특이성 구역보다 긴 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 구역은 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 3'-저 Tm 특이성 구역은 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 3'-저 Tm 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열 내지 제43서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 성인성 질환 병원체 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드.
  14. 서열목록 제 1 및 3 서열, 서열목록 제 2 및 3서열, 서열목록 제 4 및 6 서열, 서열목록 제 4 및 7 서열, 서열목록 제 5 및 6 서열, 서열목록 제 5 및 7 서열, 서열목록 제 8 및 9 서열, 서열목록 제 10 및 11 서열, 서열목록 제 12 및 13 서열, 서열목록 제 14 및 15 서열, 서열목록 제 16 및 17 서열, 서열목록 제 16 및 18 서열, 서열목록 제 19 및 20 서열, 서열목록 제 19 및 21 서열, 서열목록 제 22 및 23 서열, 서열목록 제 22 및 24 서열, 서열목록 제 25 및 27 서열, 서열목록 제 26 및 27 서열, 서열목록 제 28 및 29 서열, 서열목록 제 28 및 30 서열, 서열목록 제 31 및 33 서열, 서열목록 제 32 및 33 서열, 서열목록 제 34 및 35 서열, 서열목록 제 36 및 37 서열, 서열목록 제 38 및 40 서열, 서열목록 제 39 및 40 서열, 서열목록 제 41 및 43 서열, 그리고 서열목록 제 42 및 43 서열로 구성된 군으로부터 선택되며, 성인성 질환 병원체 핵산과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 쌍 (pair).
  15. 상기 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드, 또는 상기 제 14 항의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함하는 성인성 질환 병원체 검출용 키트.
  16. 상기 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드, 또는 상기 제 14 항의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함하는 성인성 질환 병원체 핵산 증폭용 키트.
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