KR20070082271A - 액티오사이드를 함유하는 지황 추출물 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액티오사이드를 함유하는 지황 추출물, 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지황(Rehmannia glutinosa)의 잎, 줄기, 또는 뿌리로부터 강력한 항산화활성을 가지는 액티오사이드(acteoside)를 주요 성분으로 포함하는 지황 추출물 및 상기 액티오사이드의 반응성 산소종에 대한 소거활성, 면역세포 증식 및 활성, 미백, 자외선 흡수, 콜라겐 분해 효소활성억제 및 멜라닌 생합성 억제의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따라 분리-정제된 지황 추출물은 활성산소종을 소거시킴으로써 항산화 효과를 나타내고, 정상 면역세포 특이적 증식 및 사이토카인 생성을 촉진하여 면역활성 효과를 나타낼 뿐만 아니라 자외선을 흡수하고, 콜라겐분해효소의 활성을 억제하며, 멜라닌 생성 또한 현저하게 억제함으로써 화장품 조성료로서의 미백효과, 주름개선효과, 피부보호효과를 나타낸다.

지황, Acteoside, 유해활성산소, 항산화제, 면역활성, 화장품조성료

Description

액티오사이드를 함유하는 지황 추출물 및 그 용도 {Rehmannia glutinosa active extract comprising acteoside and Application thereof}

도 1a는 지황으로부터 추출된 활성분획물의 주요 유효성분인 액티오사이드(acteoside)의 화학적 구조를 나타낸다.

도 1b는 액티오사이드의 NMR 자료를 나타내는 그림이다.

도 1c는 지황 추출물 내에 함유된 유효성분 액티오사이드를 고압액체크로마토그라피(HPLC)로 확인한 크로마토그램이다.

도 2는 지황 시료의 디피피에이취 라디칼(DPPH radical) 소거 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 지황 시료의 하이드록실 라디칼(^·OH) 유도성 지방산 산화 억제효과를 암모늄 시오시아네이트 방법을 통해 확인한 결과이다.

도 4는 데옥시리보오스 실험 시스템(deoxyribose assay system)을 이용하여 지황 시료의 산화-활성 전환 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 지황 시료의 전자공여 효과를 상용적인 화합물인 비타민 C(ascorbic acid)와 비교분석한 그래프이다.

도 6은 데옥시리보오스 실험 시스템(deoxyribose assay system)을 이용하여 지황 시료의 전자공여 효과와 금속이온 및 슈퍼옥사이드 라디칼(O₂ ^·-)의 소거활성에 대한 기전을 나타낸 그래프이다.

도 7은 지황 시료의 슈퍼옥사이드 라디칼(O₂ ^·-) 소거활성이 비타민 C와 비교하여 매우 강력하다는 것을 확인한 그래프이다.

도 8은 지황 시료의 활성 산소 유도성 면역세포 사멸에 대한 유의적 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 지황 시료의 활성 산소 유도성 미토콘드리아 막 활성 손상의 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 지황 시료의 활성 산소 소거 효과를 면역세포를 이용하여 확인한 그림이다.

도 11은 지황 시료의 면역세포(비장세포) 증식 및 활성효과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 지황 시료의 면역세포 특이적 증식 효과를 다른 세포를 이용하여 확인한 그래프이다.

도 13은 지황 시료의 사이토카인으로서 TNF-alpha의 생성 촉진효과를 확인한 그래프이다.

도 14는 지황 시료의 콜라겐 및 젤라틴 분해효소 활성의 유의적 억제효과를 나타낸 그림 및 그래프이다. (A: Gel을 이용한 액티오사이드의 MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과, B: 액티오사이드의 Pro-MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과에 대한 통계, C: 액티오사이드의 active-MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과에 대한 통계)

도 15는 지황 시료의 농도 의존적 자외선(0-400nm) 흡수효과를 나타낸 그림이다. (A: Acteoside 0.25mM, B: Acteoside 2.5mM, C: Acteoside 25mM)

도 16은 지황 시료의 멜라닌 생합성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 액티오사이드를 함유하는 지황 추출물 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 강력한 항산화활성을 가지는 액티오사이드(acteoside)를 주요 성분으로 포함하는 지황 추출물 및 액티오사이드의 반응성 산소종에 대한 소거활성, 면역세포 증식 및 활성, 미백, 자외선 흡수, 콜라겐 분해 효소활성억제 및 멜라닌 생합성 억제의 용도에 관한 것이다.

지황(Rehmannia glutinosa Liboschitz)은 가공방법에 따라 세 가지로 나뉘는데, 한방에서는 뿌리의 생것을 생지황, 건조한 것을 건지황, 쪄서 말린 것을 숙지황이라고 한다. 건지황(乾地黃)은 그 맛이 달고 쓰며 성질은 냉하다. 심경(心經), 간경(肝經), 신경(腎經)에서 작용한다. 대표적인 약효는 음(陰)을 자양하고 혈액을 멎게 하며 열병 후에 생기는 갈증과 음(陰)이 허하며 내열이 나는 증상에 효과가 있다. 소갈병과 토혈, 뇨혈, 월경불순, 음허(陰虛)로 인한 변비, 풍습으로 인해 저린 통증 등에 응용된다. 숙지황(熟地黃)은 그 맛이 달고 성질은 약간 덥다. 주로 간경(肝經)과 신경(腎經)에서 작용을 한다. 간장과 신장의 음이 허하고 현기증에 귀가 울리는 증상을 치료한다. 소갈병에 효과가 있고 식은땀이 많이 나고 허리와 무릎이 시큰거리는 증상에도 효과가 있으며, 혈허로 혈색이 없고 가슴이 두근거리며 불면증이 있고 월경불순과 기능성 자궁출혈 등의 질환에도 널리 응용된다. 또한, 한약재 중에서 감초 다음으로 가장 널리 쓰이는 자양 보약재이기도 하다.

현대 약리학 연구에 의하면 지황에는 인체에 유익한 여러 종류의 아미노산과 여러 종류의 당류(糖類)가 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다. 지황은 포도당 9%, 스타키오즈 32%, 만니톨 1%, 환원당 13%를 함유하고 있으며 다양한 올리고 당을 함유하고 있어 가공 적성 및 혈압 조절, 혈전 용해, 간기능 활성, 항돌연변이원성 등의 다양한 활성이 있음에도 불구하고 경제성이 떨어진다는 이유로 지황 대신 숙지황으로만 사용되고 있는 실정이다. 이같이 한방에서 중요한 약재로써 사용되는 지황의 주요 성분으로는 iridoid 배당체로 catalpol, leonuride, aucubin, mielittoside, rehmannioside A, B, C, D가 있고 당류로써 스타키오즈(stachyose), 라피노스(raffinose), 수크로오스(sucrose) 등이 있으며 기타 만니톨과 10여 종류의 아미노산 등이 있다고 보고되었다.

반응성 산소종(Reactive oxygen species; ROS)이란 쌍을 이루지 못한 전자를 가진 불안정한 산소로서 세포 지질막, 세포내 단백질 및 DNA 등을 손상시켜 세포사멸을 초래하며, 나아가 노화 및 각종 질병을 일으키는 물질이다. 반응성 산소종에 는 수퍼옥사이드 라디칼 (superoxide anion, O₂ ^·-), 하이드로겐 퍼옥사이드(hydrogen peroxide, H₂O₂), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical,^·OH), 일중항산소, 유기 자유기(organic free radical, R) 및 페록실 자유기(peroxyl free radical; ROOH) 등이 있으며, 이들은 생체내 대사과정에서 자연적으로 생성되는 부산물이다(J.M. Mates, F.M. Sanchez-Jimenez, IJBCB 32 (2000) 157-170). 반면 생체 내 여러 항산화 효소들은 과다한 활성산소 생성을 예방하고, 생성된 유리기를 포착, 제거하며, 철 및 구리와 같은 금속이온을 포착하여 세포 내 지질 과산화의 발생을 억제하는 작용을 한다.

그러나 세포 내 항산화 방어기작과 반응성 산소종 생성간에 불균형이 일어나 과도한 활성산소가 발생될 경우 세포는 산화적 스트레스를 받게 되며, 그 현상이 지속될 경우 세포 내 중요한 기관에 손상을 주어 신호 전달계, 유전자 발현계 등의 생물학적 기작을 변형시킴으로써 돌연변이 또는 세포고사를 야기하게 된다. 결과적으로 과도한 산화적 스트레스는 여러 형태의 세포손상 및 사멸을 초래하며, 나아가 신경퇴행성 질병, 면역 기능장애 및 종양 발병의 직-간접적 원인이 된다(A.F.G. Slater, S. Orrenius, in: R.G. Cutler, L. Packer, J. Bertram, A. Mori, (Eds.) Birkhauser Verlag Basel, Switzerland, 1995, pp. 21-26; H. Wiseman, B. Halliwell, Biochem. J. 313 (1996) 17-29).

세포내 산화-항산화 불균형을 초래하는 세포내외적 원인은 다양한 것으로 보 고되었으나 그 중에서도 자외선 조사, 에탄올, 그리고 만성적 질병 상태로부터 세포 내 산소자유기 발생이 촉진되는 것으로 알려져 있으며, 항산화 물질은 그러한 활성산소기를 불활성화시키고 나아가 세포고사를 억제한다(R. von Harsdorf, P.F. Li, R. Dietz, Circulation 99 (1999) 2934-2941; B.A. Wagner, G.R. Buettner, C.P. Burns, Cancer Res. 53 (1993) 711-713).

한편, 피부의 최외각층인 각질층은 외부의 침투에 대한 장벽으로서의 기능을 갖는데 피부가 노화됨에 따라 피부 고유의 기능이 저하되면서 주름이 형성되고 멜라닌 색소가 생성된다. 이러한 노화의 주요인으로서 태양광에 대한 노출에 의해 자외선이 피부의 결합조직인 콜라겐과 엘라스틴의 산화적 절단을 촉진시키며 결과적으로 결합조직의 비정상적인 교차결합에 의해 주름형성을 유발한다. 또한, 피부의 함수기능이 저하되어 피부가 거칠게 되고 각종 피부 질환의 원인이 된다. 따라서 이러한 피부에 스트레스를 제공하는 요인들을 막기 위한 항산화제 및 이를 포함하는 화장품의 기능은 필수적이라 할 수 있다.

따라서 산화적 스트레스로 야기되는 피부손상 및 각종 질환에 대한 예방 및 치료방법으로서 천연 항산화제의 이용가능성이 크게 평가되고 있으며, 오늘날에는 항산화제 치료(antioxidant therapy)라는 새로운 생화학적 및 의학적 접근이 다양하게 이루어지고 있다. 특히, 예전의 항산화제는 주로 식품의 저장 또는 보존 목적으로 합성항산화제가 많이 이용되었으나, 최근에 합성항산화제의 과다한 섭취는 생체 내 돌연변이 유발, 독성작용 및 발암 등의 문제를 가져올 수 있다는 가능성이 제기되어 오늘날에는 보다 안전하면서도 강한 항산화제를 천연물 또는 미생물 대사 산물로부터 탐색하는 연구가 활발히 수행되고 있다.

최근 우리나라에서도 천연물로부터 강력한 항산화제를 얻으려는 연구가 다양하게 진행되고 있으며, 항산화치료뿐만 아니라 기능성 식품으로도 그 이용성을 연구하는 추세이다. 그러므로 인체에 직접 이용함에 독성이나 부작용이 없고 강력한 항산화효과를 갖는 천연 항산화제의 탐색 및 개발은 매우 중요하다. 특히 비타민 C는 하이드록실 라디칼에 대한 항산화 활성이 강력하나 생체 내에서보다 중요한 역할을 갖는 슈퍼옥사이드 라디칼에 대한 소거 활성은 매우 낮으며, 반면 쿼시틴(quercetin)과 같은 플라보노이드 화합물은 슈퍼옥사이드 라디칼에 대한 소거활성은 강하나 지용성이며, 때로는 피부손상이나 발암을 유발시킬 수 있으며, 체내에서는 중간생성물로서 항산화제가 아닌 산화제로서의 특성을 갖는다고 알려져 그러한 단점을 보완하면서도 이용성이 높은 천연 항산화제의 개발이 매우 중요한 과제로 대두되었다.

한편, Bipyridilium quternary(BQ) 계열 및 diphenyl ether(DE) 계열의 제초제는 대상 식물체 내에서 활성산소를 발생하여 세포막의 지질과산화를 일으켜 파괴함으로써 살초활성을 나타낸다. 그러나 이들 제초제에 대하여 내성 또는 저항성을 나타내는 식물체에서는 이들 제초제에 의해서 발생된 활성산소를 소거시킬 수 있기 때문에 안전하다. 실 예로 지황은 BQ 계열의 제초제 paraquat가 비선택성 제초제임에도 불구하고 이 제초제에 의해서 전혀 피해를 받지 않고 내성을 나타내는데, 이러한 내성 기작은 paraquat의 장기간에 걸친 반복 처리로 저항성이 발현된 식물체들에 대한 저항성 발현 기구 즉 방어 효소 활성 등과 같은 기작만으로는 해명이 되 지 않고 오히려 액티오사이드와 같은 항산화물질에 의한 활성산소의 소거 작용이 주요 내성 발현 기구로 인정되고 있다. 이는 액티오사이드를 주요 유효성분으로 하는 추출물의 항산화 용도로서의 이용 가능성을 제시한다 하겠다.

특히 지황은 생지황, 숙지황 등 여러 형태로 한방에서의 의학적 용도로 이용되어 왔으나 지금까지는 지황의 뿌리 부분만을 이용하였을 뿐 잎 부분은 전혀 이용되어 오지 않았다. 따라서 활성산소 유도성 살초에 대한 내성을 갖는 지황의 잎으로부터 활성성분을 얻어내고 그 성분의 물리생화학적 특성규명은 물론 약리적, 의학적 효과를 효율적으로 분석하는 것은 매우 중요하였다. 그러나 종래기술에서는 지황의 잎으로부터 액티오사이드를 주 유효성분으로 하는 활성성분을 정제하는 방법이 개발되지 못하였고, 기존에 개발된 유사한 종래기술이라 할지라도 그 적용에 있어 많은 문제점이 있어 이에 대한 개선은 물론 액티오사이드의 효율적 정제 방법의 개발에 대한 필요성이 지대한 실정이다.

한편, 본 발명의 종래 기술로서, 한국특허공개 10-2005-0008590(지황의 생약성분을 함유한 쌀의 제조방법)은 지황의 생약 성분을 열수 추출하여 쌀을 제조한 것이고, 한국특허등록 10-0500029-0000(숙지황 추출물을 포함하는 기억력 향상 생약조성물)은 숙지황을 에틸알코올, 석유에테르(petroleum ether), 클로로포름, 메틸알코올, 물(H₂O)로 구성된 유기용매로 추출하여 사용한 것이고, 한국특허등록 10-0519005-0000(지황을 이용한 면역기능증진활성을 가진 유산균 발효제품 및 이의 제조공정)은 지황가루 또는 에틸알코올에 의한 지황 추출물을 사용한 것으로 본 발명 의 구성과 상이하다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 지황의 잎, 줄기, 또는 뿌리로부터 강력한 항산화활성을 가지는 액티오사이드를 포함하는 지황 추출물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기의 액티오사이드를 함유하는 항산화제, 면역활성제, 멜라닌 생성 억제제, 콜라겐분해효소활성 억제제, 자외선 차단제, 화장품 조성료를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 지황 추출물을 포함한다.

또한, 본 발명은 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 항산화제, 면역활성제, 멜라닌 생성 억제제, 콜라겐분해효소활성 억제제, 자외선 차단제 및 화장품 조성료를 포함한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 오랫동안 지황의 잎으로부터 활성산소를 소거하는 항산화 물질을 탐색하기 위한 다양한 실험을 수행하여 여러 추출물을 얻었고, 이를 이용한 여러 실험을 통해 특정 조건하에서 추출된 액티오사이드를 주요 유효성분으로 하는 추출정제물이 우수한 항산화 효과뿐만 아니라 화장품 조성료로서의 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 지황은 잎, 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있으며, 분쇄기에서 마쇄하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 지황 분쇄물을 메탄올 추출하여 여지를 통해 거르고, 여과물을 다시 메탄올 추출하는 것이 바람직하다. 여과된 추출액을 합한 다음 35±2℃의 수욕 상에서 감압 농축 건고 하고, 이 건고물을 증류수에 녹인 후 같은 양의 노르말핵산으로 세척하여, 부탄올로 2~4회 추출한 후 합쳐진 부탄올 분획을 감압 농축하여 건고할 수 있다. 상기 부탄올 농축물을 실리카겔(70-230 mesh)이 담긴 유리컬럼에 옮기고 클로로포름, 95:5, 90:10, 80:20의 클로로포름:메탄올 용액으로 차례로 용출시키고, 마지막 용출액을 35±2℃의 수욕 상에서 감압 농축 건고하여 액티오사이드를 주성분으로 하는 지황 추출물을 얻을 수 있다. 이 추출물을 본 발명의 실시예에서 제시한 여러 가지 생리활성실험에 사용할 수 있다. 또한, 이 건고물을 수지(Sigma Sephadex LH-20)가 담긴 유리컬럼으로 옮기고 클로로포름:메탄올:물(6:3:1) 혼합용액으로 용출시켜 용출액을 받은 다음 이들을 35±2℃의 수욕상에서 감압 농축 건고하면 순수한 액티오사이드를 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 지황 추출물은 항산화 및 면역 활성제뿐만 아니라 미백, 자외선흡수, 콜라겐분해효소억제 효과를 갖는 향장산업 원료 물질로서 이용될 수 있다.

즉, 상기와 같이 지황으로부터 분리 정제된 추출물을 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 항산화, 면역활성, 자외선 차단, 피부 노화방지, 미백효과 등을 위한 치료 및 예방에 사용할 수 있다.

본 발명에서 정제 분리한 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 항산화제제로서의 이용은 물론 향장 원료물질로서 적절한 제제 방법을 통한 화장품 개발을 통해 주름억제, 피부노화방지, 미백 등에 특이적으로 이용할 수 있다. 상기 조성물은 지황 추출물로부터 분리, 정제한 액티오사이드를 각각 1 내지 10 μM로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 지황 추출물이 화장료 조성물로 제조되는 경우에는, 유효 성분으로서의 상기 지황 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 경구용 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상술한 지황 추출물 이외에 식품학적 또는 약학적으로 허용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 경구용 화장료 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 경구용 화장료 조성물에 포함되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 경구용 식품 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다. 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 및 시험예에로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 지황 추출물 및 지황 추출물 내 유효성분 액티오사이드의 확인

지황 잎(또는 줄기 및 뿌리) 500g을 분쇄기에 넣고 마쇄한 후 메탄올 5L를 부어 3시간 동안 정치시킨 다음 여지(Whatman No. 1)를 통해 거르고, 다시 5L의 메탄올을 부어 동일한 방법으로 추출액을 얻었다. 여과된 추출액을 합한 다음 35℃의 수욕 상에서 감압 농축 건고하였다. 이 건고물을 1L의 증류수에 다시 녹인 후 같은 양의 노르말핵산으로 2회 세척하였다. 이어서 1.5L의 부탄올로 3회 추출한 후 합쳐진 부탄올 분획을 35℃의 수욕 상에서 감압 농축 건고하였다.

상기 부탄올 농축물을 실리카겔(70-230 mesh, 260g)이 담긴 직경 3.6cm, 길이 60cm의 유리컬럼에 옮기고 크로로포름 1L로 용출시킨 다음 계속해서 95:5 비율의 크로로포름:메탄올 용액 1L, 90:10 비율의 크로로포름:메탄올 용액 1L을 용출시킨 후 마지막으로 80:20 비율의 크로로포름:메탄올 용액 1L의 용출액을 받았다. 이후 마지막으로 용출시켜 받은 용출액을 35℃의 수욕 상에서 감압 농축 건고하여 액티오사이드를 주성분으로 하는 지황 추출물을 얻었다. 이 추출물은 실시예에서 제시한 여러 가지 생리활성실험에 사용하였다. 한편, 이 건고물을 수지(Sigma Sephadex LH-20, 25-100mm) 50g이 담긴 직경 2.8cm, 길이 45cm의 유리컬럼으로 옮 기고 6:3:1의 클로로포름:메탄올:물 300mL로 용출시켜 용출액을 받은 다음 이들을 35℃의 수욕상에서 감압 농축 건고하여 순수한 액티오사이드 0.354g을 얻었다.

도 1a는 지황 추출물 내의 유효성분 액티오사이드의 분자구조이다(Chun JC, Kim JC, Hwang IT, Kim SE Pestic. Biochem. Physiol. 2002. 72:153-159).

도 1b는 액티오사이드에 대한 NMR 자료이다.

도 1c는 지황 추출물 내에 함유된 유효성분 액티오사이드를 고압액체크로마토그라피(HPLC)로 확인한 크로마토그램이다. HPLC 분석 조건으로 컬럼은 mBondapak C₁₈(3.9mm × 30cm), 이동상은 20:80 비율의 아세톤니트릴(acetonitrile):0.1% 트리플로로아세틱 에시드(trifluoroacetic acid)를 함유한 물로, 이동상의 유속을 1분당 1㎖로 검출파장 332.6 nm에서 분석하였을 때 머무름 시간 3.15분에서 액티오사이드의 단일 피크가 나타났다.

[시험예 1] 지황 추출물의 디피피에이취(DPPH: diphenylpicrylhydrazil) 라디칼 소거활성 측정

지황 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 측정은 상용적인 방법에 의거하여 실시하였다(Gyamfi MA, Yonamine M, Aniya Y. Gen Pharmacol 1999 32: 661-667).

도 2에서 DPPH 라디칼 소거활성 측정 시스템에 지황 활성분획의 주요 성분인 액티오사이드와 상용적인 항산화제로서 비타민 C를 각각 첨가한 후 흡광도를 측정한 결과 두 처리구에서 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 특 히 IC₅₀을 비교한 결과 액티오사이드의 라디칼 소거활성이 비타민 C보다 더 높게 나타났다.

[시험예 2] 지황 추출물의 지방산화 억제 효과 검색

Fe^{3 +}에 의하여 생성되는 ^·OH에 대한 소거활성을 암모니움 티오시아네이트 분석법으로 실험하여 리놀레익산(linoleic acid) 산화를 측정하여 간접적으로 규명하였다(Takao T 등, Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 1780-1783).

도 3은 암모니움 티오시아네이트 분석법으로 측정한 것으로 지황 추출물의 ^·OH 유도성 지방산산화물의 생성 억제율을 나타낸 것으로, 액티오사이드는 농도에 비례하여 Fe³⁺-의존적 리놀레익산 산화를 저해하였다.

[시험예 3] 지황 시료의 전자공여체로서의 산화-환원 활성 전환 효과 검색

대부분의 항산화제들, 특히 비타민 C의 경우 항산화제이면서도 전자공여체로서 역할을 수행하며 이러한 특성은 항산화활성이 강력한 물질일수록 높게 나타나는 것으로 알려져 있어 데옥시리보오스 실험 시스템을 이용하여 지황 추출물의 활성을 측정하였다.

도 4는 지황의 산화-환원 활성을 Fe³⁺에 의하여 생성되는 하이드록실 라디칼(^ㆍOH) 유도성 디옥시리보스 변성 정도를 측정하여 검색하였으며, 디옥시리보스의 변성정도는 티오바르티추릭산-말론알데하이드 부가물(이하 "TBA-MDA"라 함)의 생성율로 흡광도 측정기를 이용하여 측정하였다. 그 결과 액티오사이드는 10 μM이하 저 농도에서는 Fe^{3 +}-의존적으로 발생되는 ^·OH의 소거활성을 나타낸 반면, 50 μM 이상에서는 ^·OH의 생성을 촉진, 즉 산화-환원 활성이 강력하다는 것을 보여주었다.

지황 추출물의 산화-환원 활성에 대한 정확한 기전을 규명하기 위해 데옥시리보오스 측정 시스템에서 전자공여체로서 사용되는 비타민 C 및 상용적인 항산화제로서 금속이온 소거제인 디에프엑스(DFX) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase; SOD)를 이용하여 전자공여체로서의 활성을 측정하였다.

도 5는 지황 추출물도 비타민 C와 같이 농도 의존적으로 ^·OH를 생성시킴을 보여주며, 이는 지황 추출물도 강력한 전자공여체로서 기능과 함께 우수한 항산화 활성을 포함한다는 것을 의미한다.

도 6은 상기 측정 시스템에서 지황 추출물 10 μM이하에서는 오히려 반대효과 즉, 전자공여체가 아닌 라디칼 소거제로서 기능을 보여준 바 이에 대한 보다 심도 있는 원인분석을 실시한 그래프이다. 도 6에서 보는 봐와 같이 액티오사이드만을 처리한 실험에서는 전자공여 효과가 농도 의존적으로 현저하였으나 액티오사이드와 DFX 또는 SOD를 같이 첨가하였을 경우 전자 공여 효과가 크게 억제되었으며, 특히 DFX를 첨가했을 경우 그러한 억제효과가 크게 나타났다. 이러한 결과는 데옥시리보오스 시스템에서의 ^·OH 생성은 주요하게는 Fe^{3 +}-의존적이지만 일부는 슈퍼옥 사이드 라디칼(O₂ ^·-)에 의해서도 발생된다는 것을 의미하며, 도 5의 결과와 비교할 때 비타민 C에 비해 지황 추출물은 ^·OH 뿐만 아니라 O₂ ^·-의 소거활성도 매우 우수하다는 것을 보여주고 있다.

[시험예 4] 지황 추출물의 O₂ ^·-에 대한 소거활성 측정

O₂ ^·-는 체내에서 강력한 산소종인 ^·OH의 생성을 유발시키며, 항산화제의 항산화효과가 ^·OH보다는 O₂ ^·- 특이적일 때 더 좋은 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 지황 추출물의 O₂ ^·- 소거활성을 상용적인 항산화제인 비타민 C와 비교분석 하였다. 이에 대한 분석 방법은 하이포잔틴/잔틴 옥시데이즈(hypoxanthine/xanthine oxidase; X/XO)를 이용하여 Gotoh & Niki의 방법에 따라 분석하였다(N. Gotoh, E. Niki, Biochim. Biophys. Acta 1115 (1992) 201-207).

상세한 방법을 설명하면, 지황 추출물을 농도별로 반응액(100㎕ 30mM EDTA (pH 7.4), 10㎕ 30 mM hypoxanthine in 50 mM NaOH, and 200㎕ 1.42 mM nitroblue tetrazolium)에 첨가하고, 5분 후 100㎕(0.5 U/ml) 잔틴 옥시데이즈를 첨가한 다음 50 mM 인산완충액(pH 7.4)을 총 반응량이 3㎖가 되도록 넣어주었다. 상온에서 20분간 반응시킨 다음 560㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 7은 액티오사이드의 O₂ ^·- 소거활성을 비타민 C와 비교분석한 결과로서 슈퍼옥사이드 음이온의 생성 억제율을 나타낸 것이다. 그래프에서 보는 바와 같이 액티오사이드는 농도 의존적으로 비타민 C에 비해 매우 강력한 소거활성을 나타냈으며, 100μM 첨가시 60% 이상의 소거활성을 나타냈다. 이는 도 5 및 6의 결과와 비교분석 시 지황 추출물은 비타민 C보다 강력한 항산화 활성을 갖는다는 것을 보여주는 결과이다.

[시험예 5] 지황 추출물의 활성산소 유도성 세포사멸의 억제 효과 검색

상기 시험예 1부터 4에서 얻어진 결과들에 대한 효과를 보다 심도 있게 검증하기 위하여 면역세포와 글루코스 옥시데이즈를 이용하여 지황 추출물의 항산화 효과를 검색하였다.

본 시험예에서 이용한 방법은 엠티티(MTT) 평가방법(도 8), 플로로 사이토미터(flow cytometer)를 이용한 미토콘드리아 막 활성 측정(도 9), 및 DCFH-DA를 이용한 세포 내 활성산소 측정 방법(도 10) 등을 이용하였다.

먼저 위 검증을 수행함에 있어 면역세포로서 Jurkat 세포를 10% 혈청(FBS) 및 항생제가 함유된 RPMI 1640 배지에서 부유시켜 ㎖당 10⁶개의 세포가 포함되도록 조정한 후 6웰 또는 96웰 배양용기에 2㎖ 또는 100㎕씩 분주하였다. 지황 추출물을 처리하기 직전 배지를 0.5% FBS가 함유된 RPMI1640으로 교체하고, 10 mM 글루코스 /2 또는 5 mU/㎖ 글루코스 옥시데이즈(G/GO)를 처리하여 배지 내에 ^·OH가 생성되도록 유도하였다(M. Michikawa, K.T. Lim, J.G. McLarnon, S.U. Kim, J. Neurosci. Res. 37 (1994) 62-70). 최종적으로는 ^·OH에 의한 세포손상과 그에 대한 추출물의 억제효과를 MTT 방법, 즉 Mosmann 방법에 따라 검증하였으며(T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63), ^·OH에 의한 미토콘드리아 막 활성 억제와 세포 내 활성산소량을 flow cytometric 분석 방법에 의거 검증하였다.

도 8은 96웰 배양용기에 분주된 Jurkat 세포를 G/GO 시스템에 노출시킨 다음 PBS에 ㎖당 5 ㎎으로 용해된 MTT 10㎕를 각 웰에 첨가하고, 37도에서 4시간 동안 반응시킨 후 최종 단계로 70㎕의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한 후 560 nm에서 흡광도를 측정한 결과이다. 그 결과 Jurkat 세포를 G/GO 시스템에 24시간 노출하였을 경우 생존율이 약 20%로 감소되었으나 지황 추출물 처리구에서는 생존율이 크게 증가됨을 알 수 있었다. 특히 100μM 지황 추출물을 처리한 결과 세포의 생존율이 20%에서 80% 이상으로 증가하였다. 이러한 결과는 지황 추출물의 강력한 항산화 활성이 세포에서도 동일하게 나타난다는 것을 의미한다.

도 9는 6웰 배양용기에 분주된 Jurkat 세포를 G/GO 시스템에 노출시킨 다음 50nM DiOC를 각 웰에 첨가하여 37도에서 20분간 반응시킨 후 최종 단계로 flow cytometry를 이용하여 미토콘드리아 막 활성도(MTP)를 측정하였다. 그 결과 Jurkat 세포를 G/GO 시스템에 24시간 노출하였을 경우 MTP가 대조구에 비해 약 35% 이상 감소되었으나 지황 추출물 처리구에서는 MTP 저하가 농도 의존적으로 현저하 게 억제됨을 확인하였다. 특히 100μM 지황 추출물을 처리한 결과 MTP가 대조구와 유사하게 나타났으며, 이는 지황 추출물의 강력한 항산화 활성과 더불어 세포 활성 촉진의 효과도 있다는 것을 의미한다.

도 10은 도 9와 같은 방법으로 처리된 Jurkat세포를 회수하여 Bass 등의 방법(Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. J Immunol 1983 130: 1910-1917)에 의거하여 DCFH-DA를 첨가한 후 flow cytometry를 이용하여 세포 내 활성산소 존재량을 분석한 결과이다. 그 결과 G/GO 처리구에서는 세포 내 활성산소량이 증가되었으나 이에 50μM의 액티오사이드를 첨가한 경우 세포 내 활성산소량이 현저하게 감소된다는 것을 보여주었다.

[시험예 6] 지황 추출물의 면역활성 증진 효과 검증

본 시험예에서는 세포증식(tritium uptake) 평가방법(도 11), MTT평가방법을 이용한 세포생존율 측정(도 12), 및 ELISA 방법을 이용한 사이토카인(cytokine) 측정 방법(도 13) 등을 이용하였다.

먼저 위 검증을 수행함에 있어 생쥐로부터 비장세포, 면역세포로서 Jurkat 세포, 및 암세포로서 MCF-7 세포를 10% 혈청(FBS) 및 항생제가 함유된 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에서 부유시켜 ㎖당 10⁶개의 세포가 포함되도록 조정한 후 6웰 또는 96웰 배양용기에 2㎖ 또는 100 ㎕씩 분주하였다. 분주 후 지황 추출물을 100 μM까지 다양한 농도로 세포에 처리한 후 각각의 방법을 통해 면역활성 효과를 검증하였 다.

도 11은 96웰 배양용기에 단일세포로 분주된 비장세포에 액티오사이드를 5에서 100 μM까지 첨가한 후 36시간 동안 37℃에서 배양하고, 1mCi의 [methyl-³H]티미딘(Amersham Pharmacia Biotech)을 세포배양액에 첨가한 후 다시 12시간 동안 배양시킨 후 세포수확기를 통해 회수하였고, Liquid scintillation counter를 이용하여 각 처리 샘플에 대한 동위원소량을 측정하여 지황 추출물의 면역세포 증식효과를 검증하였다. 그 결과 지황 추출물을 첨가하지 않은 비장세포는 동위원소량이 약 3,000 cpm 정도로 측정되었으나 지황추출물을 첨가한 비장세포에서의 동위원소량은 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 액티오사이드 100 mM을 처리한 경우에는 약 14,000 cpm이 측정되었으며, 이는 지황 추출물 처리 후 5.6배의 비장세포 증식 효과가 나타났다는 것을 보여주고 있다.

도 12에서는 도 11에서 보여주었던 지황 추출물의 비장세포 증식효과가 면역세포 특이적인지 또는 정상세포 특이적인지 확인하기 위해 수행하였으며, 분석방법은 MTT 평가 방법을 이용하였다. 그 결과 정상 면역세포인 비장세포는 지황 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 세포 활성이 증가된 반면 Jurkat 및 MCF-7 세포에 있어서는 어떠한 생존율 증가도 측정되지 않았다. 이는 지황 추출물은 정상 면역세포에 대해서만 특이적인 활성을 갖는다는 것을 의미한다.

도 13은 지황 추출물의 면역세포 증식 효과에 있어 면역활성으로서 cytokine의 생성에 미치는 영향을 검증한 그래프이며, 실험은 6웰 배양용기에 단일세포로 분주된 비장세포에 액티오사이드를 5에서 100 mM까지 첨가한 후 48시간 동안 37도에서 배양시킨 후 배지만을 수확하여 항체를 이용한 ELISA를 수행하였다. 그 결과 지황 추출물 50 mM 이상 첨가시 TNF-alpha의 생성량이 유의적으로 증가된다는 것을 보여주었으며, 이러한 결과는 지황 추출물의 면역활성 효과를 과학적으로 검증해주고 있다는 것을 의미한다.

[시험예 7] 지황 추출물의 콜라겐 분해효소활성 억제 효과 검증

콜라겐분해효소(MMP; matrix metalloproteinase)의 과다한 활성은 피부의 주름, 노화촉진 및 암의 발생 및 전이에 있어 주요한 원인의 하나로 알려져 있다. 본 시험예에서는 NIH3T3세포를 이용하여 지황 추출물의 효과를 검증하였다.

방법은 먼저 NIH3T3 세포를 6웰에 분주한 후 100 ng/㎖의 TPA(phorbol ester)를 처리한 다음 다양한 농도의 지황 추출물을 처리한 후 TPA 유도성 MMP의 활성에 대한 지황 추출물의 억제효과를 측정하였으며, 측정방법은 gelatin zymography로서 Choi 등(Choi NS, Yoon KS, Lee JY, Han KY, Kim SH. J Biochem Mol Biol 2001; 34: 531-536)의 방법에 의거하여 분석하였다.

그 결과, 도 14에서 A는 Gel을 이용한 액티오사이드의 MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과 분석한 것으로, TPA 처리에 의해 NIH3T3 세포 내 MTP 활성이 증가한다는 것을 알 수 있으며, 이는 액티오사이드의 처리에 의해 현저하게 억제된다는 것을 보여주었다. 특히 100 μM의 액티오사이드 처리시에는 MTP가 대조구 보다 감소되는 것을 보여주었다. 또한, 도 14에서 B 및 C는 A의 결과를 통계적으로 분석하여 그래 프로 나타내었는데, B는 액티오사이드의 Pro-MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과에 대한 통계적 분석이고, C는 액티오사이드의 Active-MMP-2 및 -9의 활성 억제 효과에 대한 통계적 분석이다. 각각의 그래프는 A에서 나타난 바와 같이 지황 추출물의 콜라겐 분해효소활성 억제 효과를 더욱 강력하게 보여준다 하겠다.

[시험예 8] 지황 추출물의 자외선 흡수 효과 검증

자외선은 피부의 노화뿐만 아니라 피부암의 발생에 있어서도 중요한 원인이 된다고 알려져 있으며, 현재는 자외선 보호만을 목적으로 하는 화장품이 널리 이용되고 있는 실정이다. 본 시험예에서는 지황 추출물의 자외선 흡수정도를 분석하기 위해 UV spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.

도 15에서는 지황 추출물의 농도 의존적인 자외선(0-400 nm) 흡수 효과를 보여주고 있으며(A: 액티오사이드 0.25mM, B: 액티오사이드 2.5mM, C: 액티오사이드 25mM), 특히 2.5mM에 있어서도 대부분의 자외선이 흡수된다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 지황 추출물은 자외선 흡수 효과가 매우 우수하며 자외선으로부터 피부를 보호하거나 손상된 피부의 치료에도 효율적으로 이용될 수 있다는 가능성을 확인시켜주는 것이라 하겠다.

[시험예 9] 지황 추출물의 멜라닌 생합성 억제 효과 검증

본 시험예는 먼저 0.1M phosphate buffer(pH 6.5) 220㎕에 1.5 mM 타이로신(tyrosine) 40㎕를 첨가한 다음 농도별로 20㎕의 지황 추출물을 첨가하였다. 그 후 2,000U/㎖ 머쉬룸 타이로시나아제(mushroom tyrosinase) 20㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 37도에서 10분간 반응시키고, 0.03% L-DOPA 20㎕를 첨가하고 37도에서 1시간 동안 반응시켰다. 4,000rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 1N NaOH 100㎕를 넣어 잘 흔들어 혼합시켰다. 끝으로 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였고 멜라닌 생성 저해효과(%)는 "100-(각 추출물의 반응 흡광도/공시험액의 반응흡광도)×100"의 공식에 의해 계산하였다.

도 16은 멜라닌 생합성에 대한 지황 추출물의 억제 효과를 나타낸 것으로 지황 추출물 농도 의존적으로 생합성 억제가 나타났다. 특히 지황 추출물 10 μM 이하에서는 억제효과가 현저하지 않았으나 50μM 이상에서는 매우 높게 나타났다. 이러한 결과는 지황 추출물의 미백효과를 의미하며, 향후 향장산업에서 매우 중요한 원료물질로서 이용될 수 있다는 것을 의미한다 하겠다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 액티오사이드를 함유하는 지황 추출물은 무독한 천연추출물로 반응성 산소종을 강력하게 소거시킬 수 있다. 특히, 지황 추출물은 강한 항산화력 뿐만 아니라 면역활성, 자외선 흡수, 콜라겐분해효소활성 억제 효과 및 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내어 반응성 산소종에 의해 매개되는 각종 질환의 예방 및 치료 용도로 사용할 수 있으며, 아울러 피부노화방지, 피부주름방지, 자외선에 의한 피부손상 방지 등을 위한 화장품 원료물질로서도 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (7)

1. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 지황 추출물.
2. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 항산화제.
3. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 면역활성제.
4. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제제.
5. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 콜라겐분해효소활성 억제제.
6. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 자외선 차단제.
7. 액티오사이드를 유효성분으로 함유하는 화장품 조성료.

Images