KR20070077902A

KR20070077902A - 신규한 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴하이드록실라제 유전자

Info

Publication number: KR20070077902A
Application number: KR1020060007749A
Authority: KR
Inventors: 최의성; 손정훈; 최은화; 손여진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2007-07-30
Also published as: KR100745216B1

Abstract

본 발명은 신규한 베타-카로틴 케톨라제(β-carotene ketolase)와 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase)에 관한 것으로, 상기 단백질은 칸타잔틴(canthaxanthin), 제아잔틴(zeaxanthin) 및 아스타잔틴(astaxanthin)등의 잔토필 등의 생산에 이용될 수 있다.

베타-카로틴 케톨라제, 베타-카로틴 하이드록실라제, 칸타잔틴, 제아잔틴, 아스타잔틴, 항산화제, 착색제

Description

신규한 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴 하이드록실라제 유전자{Novel genes coding for β-carotene ketolase and β-carotene hydroxylase}

도 1은 본 발명에 따른 신규한 유전자 개개의 발현 혹은 조합 발현하는 대장균 균주에서 추출한 색소화합물에 대한 TLC 분석 결과이다. 이때, 레인 6은 아스타잔틴 표품, 레인 7은 칸타잔틴 표품, 레인 8은 제아잔틴 표품의 TLC 결과이고 레인 1은 베타-카로틴을 생성하도록 조작된 노랑색 대장균의 추출물이며 레인 2는 A318 crtW 유전자를 추가적으로 발현하는 노랑색 대장균의 추출물, 레인 3은 A318 crtZ 유전자를 추가적으로 발현하는 노랑색 대장균의 추출물, 레인 4는 A318 crtWZ 유전자를 추가적으로 발현하는 노랑색 대장균 추출물, 레인 5는 K143 crtW 유전자를 추가적으로 발현하는 노랑색 대장균 추출물 시료의 TLC 결과를 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 신규한 유전자 개개의 발현 혹은 조합 발현하는 대장균 균주에서 추출한 색소화합물과 표준시료에 대한 HPLC 결과이다.

본 발명은 신규한 베타-카로틴 케톨라제(β-carotene ketolase)와 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase)에 관한 것이다.

잔토필은 카로티노이드에 산소를 포함하는 기능기(functional group)가 부가된 형태의 화합물 군으로서 식품착색을 위한 첨가물, 화장품, 그리고 양식어류나 가금류의 사료첨가 착색제로 많이 이용되어 왔다. 또한 최근에는 강력한 항산화 활성을 가지는 것에 기인하여 동맥경화, 백내장(cataract), 노인성 황반변성, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 등의 예방과 항암, 항노화, 그리고 면역증강 등의 새로운 용도가 밝혀짐에 따라 의약용이나 건강기능식품으로도 개발되고 있다. 잔토필은 싱글렛 산소(singlet oxygen), 활성산소종(reactive oxygen species), 자유라디칼(free radical)을 소거하는 항산화활성을 가지며 이는 잔토필의 베타-이오논 링 구조에 부가되어 있는 케톤과 하이드록실 기의 존재에도 의존한다. 또한 케톤기가 부가되어 있는 칸타잔틴 (4,4’-diketo-β-carotene)과 같은 잔토필은 베타-카로틴보다 radical-initiated lipid peroxidation과 hydroperoxide 형성을 더 효율적으로 지연하는 것으로 알려지고 있으며 하이드록시기가 부가되어 있는 제아잔틴 ((3R,3'R)-β,β-carotene-3,3‘-diol)과 같은 잔토필도 수용액상이나 유지상에서의 산화방지에 더 효율적인 것으로 알려지고 있다. 케톤기와 하이드록시기가 모두 부가되어 있는 아스타잔틴 (3R,3‘R-dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione)은 베타-카로틴에 비하여 100-500배의 항산화 활성을 가지는 것으로 알려지고 있다.

이러한 잔토필의 강력한 항산화 활성과 건강기능으로 인하여 칸타잔틴, 제아 잔틴, 그리고 아스타잔틴이 커다란 시장을 형성하고 있다. 현재 상업적으로 잔토필은 주로 천연물로부터의 용매 추출이나 다단계의 화학합성에 의해 생산되고 있고 칸타잔틴, 제아잔틴, 그리고 아스타잔틴이 화학적 합성법을 사용하여 공업적 스케일로 생산되고 있다. 그러나 화학합성이나 용매추출보다 천연물과 생물학적 생산법을 선호하는 소비자 욕구로 인하여 미생물을 사용하는 생물학적 친환경적인 공정이 개발되고 있으며 현재 아스타잔틴의 경우 효모 파피아로드지마(Phaffia rhodozyma) 발효생산법과 미세조류 헤마토코커스 플루비아리스(Haematococcus pluvialis) 배양법이 상업화 되고 있다. 그리고 최근에는 보다 효율적인 잔토필 생산을 위하여 대사공학 기법을 이용한 생물공학적 생산이 시도되고 있으며 화학합성과 경쟁력을 가지는 상태에 이르게 되었다.

칸타잔틴, 제아잔틴, 그리고 아스타잔틴의 생합성 경로를 살펴 보면, 베타-카로틴의 베타-이오논 링 구조의 4,4’ 위치에 케톤기를 부가하는 베타-카로틴 케톨라제에 의하여 칸타잔틴이 생성되며 베타-카로틴의 베타-이오논 링 구조의 3,3’ 위치에 하이드록실기를 부가하는 베타-카로틴 하이드록실라제에 의하여 제아잔틴이 생성된다. 베타-카로틴 케톨라제와 베타-카로틴 하이드록실라제가 동시에 작용하면 베타-카로틴으로부터 아스타잔틴이 생성된다.

베타-카로틴 케톨라제 단백질은 crtW 유전자에 의하여 코딩되며 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질은 crtZ 유전자에 의하여 코딩된다. 칸타잔틴, 제아잔틴, 그리고 아스타잔틴의 효율적인 생산을 위해서는 이 두 효소 단백질의 활성이 높아야 할뿐만 아니라 서로 효율적인 상호 작용이 바람직하다.

이에 본 발명자는, 사료첨가제, 화장품 및 식품 착색제, 항산화제, 항암제 등의 유용한 용도를 갖는 천연 잔토필 색소를 안정적으로 대량 공급하기 위하여 잔토필 생합성에 중요한 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴 하이드록실라제 유전자를 확보하고자 노력한 결과, 해양 세균으로부터 신규한 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴 하이드록실라제 유전자를 발견하고 재조합 발현 후 활성을 확인하고 원활한 상호작용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 베타-카로틴 케톨라제(β-carotene ketolase) 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase) 단백질을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질, 상기 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질, 또는 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질과 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 모두 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및/또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 칸타잔틴, 제아잔틴, 아스타잔틴 등의 잔토필을 생산하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명자는 제주도 연안 해수에서 채취한 세균 A318로부터 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴 하이드록실라제 유전자를 분리하였으며 세균 K143으로부터 베타-카로틴 케톨라제 유전자를 분리하였다.

A318 균주 유래의 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 케톨라제의 아미노산 서열 유사성 분석 결과, Erythrobacter sp.의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 67%, Paracoccus sp .의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 51%의 유사도를 보이는 신규한 crtW 단백질임을 확인할 수 있었다. 또한 A318 균주의 crtW 유전자의 하류 부위에서 베타-카로틴 하이드록실라제 (crtZ)와 유사성을 보이는 유전자를 발견하고 이 유전자가 베타-카로틴 하이드록실라제 활성을 가진다는 것을 규명하고, A318 균주 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 제공한다. 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 A318 균주 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제의 아미노산 서열 유사성 분석 결과, Erythrobacter sp.의 베타-카로틴 하이드록실라제 (crtZ)와 77%, Sphingopyxis sp .의 베타-카로틴 하이드록실라제(crtZ)와 65%의 유사도를 보이는 신규한 crtZ 단백질임을 확인할 수 있었다.

본 발명자는 또 다른 해양 세균 K143 균주로부터 베타-카로틴 케톨라제 유전자를 클로닝하여, 상기 유전자가 베타-카로틴 케톨라제 활성을 지닌다는 것을 규명하고, K143 균주 유래의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 제공한다. 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 베타-카로틴 케톨라제를 아미노산 서열 유사성 분석 결과, Nodularia sp.의 베타-카로틴 케톨라제(crtW)와 45%, Nostoc sp .의 ㅂ베타-카로틴 케톨라제(crtW)와 42%의 유사도를 보이는 신규한 crtW 단백질임을 확인할 수 있었다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 (i)서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 케톨라제(β-carotene ketolase) 효소 활성을 가지는 단백질, 또는 (ii)서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 케톨라제 효소 활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 “베타-카로틴 케톨라제”는 베타-이오논(β-ionone) 링에 4-메틸렌(4-methylene) 그룹을 케토 그룹(keto group)으로 전환하는 활성을 가지는 케토-그룹 도입 효소(keto group-introducing enzyme)를 의미한다. 이런 효소 활성의 대표적인 예 중 하나가 기질 베타-카로틴으로부터 에치네논(echinenone)을 거쳐 칸타잔틴을 합성하는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase) 효소 활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 “베타-카로틴 하이드록실라제”는 베타-이오논(β-ionone) 링의 3번 위치에 하이드록실 그룹(hydroxyl group)을 부가하는 활성을 가지는 하이드록실-그룹 도입 효소(hydroxyl group-introducing enzyme)를 의미한다. 이런 효소 활성의 대표적인 예 중 하나가 기질 베타-카로틴으로부터 제아잔틴을 합성하는 것이다.

본 발명의 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질은 야생형 뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 효소 활성을 가지는 기능적 상동체 또한 포함한다.

본 발명에서 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 베타-카로틴 케톨라제 및 베타-카로틴 하이드록실라제를 코딩하는 아미노산 서열과 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 90% 이상의 상동성 이 유지되고 본 발명에서 효소 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 제공하는 베타-카로틴 케톨라제 및 베타 카로틴 하이드록실라제는 야생형의 아미노산 서열 변이체를 포함된다. 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.

이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이로 효소 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

상술한 바와 같은 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다.

바람직하게는, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 케톨라제는 서열번호 3의 핵산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 케톨라제는 서열번호 7의 핵산 서열을 가진다. 또한, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 하이드록실라제는 서열번호 5의 핵산 서열을 가진다.

본 발명의 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및/또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한, 상기 베타-카로틴 케톨라제와 베타-카로틴 하이드록실라제는 하나의 벡터에서 발현될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 베타-카로틴 케톨라제와 베타-카로틴 하이드록실라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, “벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 베타-카로틴 케톨라제 및/또는 베타-카로틴 하이드록실라제를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서, “작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적 으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.

본 발명의 구체적인 양태에서는 A318 균주로부터 유래한 crtW 및 crtZ 유전자가 포함된 플라스미드인 pA318crtWZ를 제작하였으며, 이로 형질전환된 대장균 DH5α를 2006년 1월 6일자로 한국미생물보존협회 (한국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221, 유림빌딩 2층)에 수탁 번호 KFCC11365P로 기탁하였다.

본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서는 K143 균주로부터 유래한 crtW 유전자가 포함된 플라스미드인 pK143crtW를 제작하였으며, 이로 형질전환된 대장균 DH5α를 2006년 1월 6일자로 한국미생물보존협회 (한국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221, 유림빌딩 2층)에 수탁 번호 KFCC11366P로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

재조합 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환하기 위하여 본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

적절한 숙주세포로는 효모, 진균, 세균 또는 조류, 예를 들어, 파라코커스 (Paracoccus), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 알칼리제네스 (Alcaligenes), 에르위니아 (Erwinia), 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

형질전환체에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크 로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다.

상기의 방법으로 분리된 베타-카로틴 케톨라제 및/또는 베타-카로틴 하이드록실라제를 이용하여 베타-카로틴이 존재하는 인 비트로(in vitro) 시스템에서 칸타잔틴, 제아잔틴 및 아스타잔틴 등의 잔토필을 생산할 수 있다.

또한, 베타-카로틴 케톨라제 및/또는 베타-카로틴 하이드록실라제의 효소가 과발현되는 인 비보(in vivo) 시스템에서 칸타잔틴, 제아잔틴 및 아스타잔틴 등의 잔토필을 생산할 수 있다.

또 다른 양태로서 (i) 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 칸타잔틴을 생산하는 방법 (ii) 상기 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 제아잔틴을 생산하는 방법 또는 (iii) 상기 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 아스타잔틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이 때, 베타 카로틴을 생산하는 미생물에서 상기 유전자의 과발현을 유도하여 미생물로부터 잔토필을 수거하는 방법으로 잔토필을 생산하는 것이 보다 바람직하다.

베타-카로틴을 생산하는 미생물은 베타-카로틴을 합성 기작에 작용하는 유전자를 발현시켜서 베타-카로틴을 생산하도록 조작된 미생물일 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서는, crtE(GGPP(geranylgeranyl diphosphate) synthase), crtB(phytoene synthase), crtY(lycopene beta-cyclase) 및 crtI(phytone dehydrogenase) 유전자가 과발현되어 베타-카로틴을 생산하도록 조작된 대장균을 칸타잔틴, 제아잔틴 및 아스타잔틴 등의 잔토필을 생산에 이용하였다.

베타-카로틴을 생산하는 미생물로 베타-카로틴 케톨라제를 코딩하는 벡터를 형질전환시키고 상기 형질전환체를 적절한 조건에서 배양할 경우, 미생물로부터 칸타잔틴을 얻을 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서, K318 유래의 베타-카로틴 케톨라제 또는 K143 유래의 베타-카로틴 케톨라제를 crtE, crtB, crtY 및 crtI가 발현되도록 조작된 대장균에서 과발현시킬 경우, 칸타잔틴이 생산되는 것을 색소화합물의 HPLC 분석 결과 확인할 수 있었다.

베타-카로틴을 생산하는 미생물로 베타-카로틴 하이드록실라제를 코딩하는 벡터를 형질전환시키고 상기 형질전환체를 적절한 조건에서 배양할 경우, 미생물로부터 제아잔틴을 생산할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서, K318 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제를 상기 crtE, crtB, crtY 및 crtI가 발현되도록 조작된 대장균에서 과발현시킬 경우, 제아잔틴이 생산되는 것을 색소화합물의 HPLC 분석 결과 확인할 수 있었다.

베타-카로틴을 생산하는 미생물로 베타-카로틴 케톨라제와 베타-카로틴 하이드록실라제를 코딩하는 벡터를 형질전환시키고 상기 형질전환체를 배양함으로써, 미생물로부터 아스타잔틴을 얻을 수 있다. 이 때, 베타-카로틴 케톨라제와 베타-카로틴 하이드록시라라제는 하나의 벡터에서 발현되거나 개별적인 벡터로부터 각각 발현될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서, A318 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제를 A318 유래의 베타-카로틴 케톨라제 또는 K143 유래의 베타-카로틴 케톨라제와 함께 과발현시킬 경우, 아스타잔틴이 생산되는 것을 색소화합물의 HPLC 분석 결과 확인할 수 있었다. 특히, A318 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제를 K143 유래의 베타-카로틴 케톨라제와 함께 과발현시킬 경우 아스타잔틴의 생산 효율이 높았다.

본 발명의 칸타잔틴, 제아잔틴 및 아스타잔틴의 생산능을 갖는 재조합 균주는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있으며, 이러한 발효 방법으로는 배치, 페드-배치(fed-batch) 및 연속 배양 등을 예시할 수 있다. 배지중에 포함될 수 있는 동화성 탄소원으로는 슈가 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용될 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기 질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등이 사용될 수 있고, 기타 비타민, 성장 촉진제, 색소 형성 촉진제 등이 배지 중에 포함될 수 있다. 배양에 따른 잔토필의 생산능을 증대시키기 위해 다양하게 조절할 수 있다.

배양된 균주로부터 잔토필, 잔토필-함유 균주는 원심분리, 여과 등 당 분야의 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 잔토필-함유 균주는 이를 배양물로부터 회수하여 동물 사료 첨가제로 사용할 수 있다.

배양된 균주내에 존재하는 잔토필은 당 분야의 통상의 방법으로 분리 정제할 수 있다. 균체내에 존재하는 잔토필은 유기 용매, 예를 들어, 아세톤(acetone), 클로로포름(chloroform), 메틸 알콜(methyl alchol), 헥산(hexane), 디클로로메탄 (dichloromethane), 사이크로헥산(cyclohexane), 에탄올(ethanol), 벤젠(benzene), 카본 디설피드(carbon disulfide), 디에틸 에테르(diethyl ether) 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 상기 방법으로 생산된 잔토필은, 화장품 및 식품 착색제, 항산화제, 항암제 등에 다양하게 사용될 수 있고, 합성법으로 만들어진 잔토필에 비하여 안전하다는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 균주의 분리 및 배양

1) 균주의 분리

제주도 연안 해수를 채취하여 마린 아가 플레이트 2216(제조원 : Difco Laboratories, MD USA)에 100μL씩 도말한 후 25℃에서 3일~5일 동안 배양하였다. 3일~ 5일 후 오렌지색을 띄는 콜로니를 동일한 배지에서 계대배양을 3차례를 실시하여 2 종류의 세균 균주를 얻었으며, 이를 잠정적으로 A318 및 K143으로 명명하였다.

2) 균주의 배양

분리된 균주 A318 및 K143의 배양에는 마린 브로스 배지 2216 (제조원 : Difco Laboratories, MD USA)을 사용하였다. 액체배지의 경우 37.4g의 가루 배지를 증류수 1L에 넣은 후 2분 동안 끓여 모든 화합물을 안전히 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하며, 고체배지의 경우 55.1g의 가루 배지를 증류수 1L에 넣은 후 2분동안 끓여 모든 화합물을 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하여 사용하였다. 배양체의 준비는 300mL 배플드 플라스크(baffled flask)에 100mL씩 분주한 액체 배지에 분리된 균주의 단일집락을 접종하고 30℃, 150rpm에서 진탕배양하였다.

실시예 2 - 베타-카로틴 케토라제 ( crtW ) 및 베타-카로틴 하이드록실라제 ( crtZ ) 유전자의 클로닝

crtW 유전자는 베타 카로틴(beta-carotene)을 기질로하여 칸타잔틴을 생성하는 베타 카로틴 케톨라제(beta-carotene ketolase)를 코딩하는 유전자로, 분리 균주 A318 및 K143으로부터 칸타잔틴 생합성 유전자인 crtW를 확보하기 위하여 기존에 알려진 유전자들 간의 유사성을 기초로 프라이머를 제작하였고 PCR 방법을 통해 유전자를 확보하였다. 두 균주를 마린 브로스 2216(제조원: Difco Laboratories, MD USA)에서 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 이로부터 추출된 염색체를 PCR 반응의 주형으로 사용하였고, 아래의 프라이머를 사용하였다.

프라이머 2: 5'-CAY GAY GCN ATG CAY GG-3' (서열번호 1)

프라이머 7: 5'-TAN CCR AAR TGR TAR CA-3' (서열번호 2)

상기 중합효소 연쇄반응은 써멀 사이클러(Thermal Cycler; 제조원: Takara, Japan)를 사용하여 수행하였고, 94℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 35회 수행한 후, 72℃에서 15분간 반응시키는 조건으로 수행하여 약 0.5kb의 단편을 획득하였다. 얻어진 단편은 0.9% 아가로스 겔에서 분획한 다음 이를 pKST에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 브라디리조비움 종(Bradyrhizobium sp.)의 crtW 유전자와 41%의 유사도(Similarity)를 보인 0.5kb의 유전자 단편을 프로브로 만들기 위하여 DIG-dUTP가 첨가된 DIG 라벨링과 함께 서열번호 1및 2의 프라이머를 사용하여 다시 PCR을 수행하였다. 전체 crtW 유전자를 분리하기 위하여 A318 및 K143 균주의 게놈성 DNA에 대하여 서던블럿을 수행하였다. 먼저 여러 가지 제한효소로 각각 처리한 게놈성 DNA를 0.9% 아가로스겔에서 전기영동하여 크기별로 분획한 후 나일론 멤브레인(Schleicher & Schuell, 독일)으로 모세관 이동(capillary transfer) 방법으로 옮겼다. 하이브리드화는 42℃에서 50% 포름아미드를 포함하는 표준용액(5 X SSC, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 5% blocking regent, 50% formamide)을 사용하여 프로브를 첨가한 후 6시간 이상 지속하였다. 제조사(Boehringer-Mannheim, 독일)의 매뉴얼에 따라서 멤브레인을 알칼라인 포스파타제와 연결된 DIG에 대한 항체와 반응시킨 후 기질인 NBT와 X-포스페이트를 첨가하여 발색반응을 수행하였다. 그 결과 A318 균주는 제한효소 PstⅠ으로 처리한 게놈성 DNA의 7kb 위치에서, 그리고 K143 균주는 제한효소 EcoRI으로 처리한 게놈성 DNA의 4kb 위치에서 선명한 갈색 시그널이 확인되었다. 따라서 crtW 유전자가 포함된 미니-라이브러리를 제작하기 위하여 A318 균주의 게놈성 DNA는 PstⅠ으로 처리하고 K143 균주의 게놈성 DNA는 EcoRI으로 처리하여 각각 0.9% 아가로스 겔에서 분획하였다. 각각 7 kb 및 4kb 주위의 DNA 단편을 겔 추출 키트를 사용하여 회수하였으며 PstI과 EcoRI으로 처리한 pBluescriptⅡ 벡터와 각각 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하여 미니-라이브러리를 제작하였다. 미니-라이브러리로부터 약 500여개의 플라스미드를 정제한 후 동일한 프로브를 사용하여 서던블럿을 반복 수행하여 crtW 전체 유전자를 포함하는 플라스미드를 선별하였다. crtW 유전자가 포함된 부위의 염기서열을 분석한 결과 서열번호 3과 같았고 이로부터 추정된 단백질 서열은 서열번호 4와 같다. 서열번호 4를 기초로 유사성 분석결과 Erythrobacter sp.의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 67%, Paracoccus sp .의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 51%의 유사도를 보여, 본 발명에서 얻은 유전자가 crtW 유전자임이 확인되었으며 기존 유전자와 낮은 유사도로 판단하여 신규한 crtW 유전자임을 확인할 수 있었다. 또한 A318 균주의 경우 crtW 유전자의 하류 부위의 염기서열을 분석한 결과 베타-카로틴 하이드록실라제 (crtZ)와 유사성을 보이는 서열번호 5와 같은 ORF를 발견하였고 이 유전자는 crtW 유전자와 오페론 구조를 형성하고 있음을 발견하였다. 이로부터 추정된 단백질 서열은 서열번호 6과 같다. 서열번호 6을 기초로 유사성 분석결과 Erythrobacter sp.의 베타-카로틴 하이드록실라제 (crtZ)와 77%, Sphingopyxis sp .의 베타-카로틴 하이드록실라제 (crtZ)와 65%의 유사도를 보여, 본 발명에서 얻은 유전자가 crtZ 유전자임이 확인되었으며 기존 유전자와 낮은 유사도로 판단하여 신규한 crtZ 유전자임을 확인할 수 있었다. 위와 같이 얻은 신규 crtW 유전자 및 crtZ 유전자가 포함된 플라스미드인 pA318crtWZ가 형질전환된 대장균 DH5α를 2006년 1월 6일자로 한국미생물보존협회 (한국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221, 유림빌딩 2층)에 수탁 번호 KFCC11365P로 기탁하였다.

K143 균주의 경우 crtW 유전자가 포함된 부위의 염기서열을 분석한 결과 서열번호 7과 같았고 이로부터 추정된 단백질 서열은 서열번호 8과 같다. 서열번호 8을 기초로 유사성 분석결과 Nodularia sp.의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 45%, Nostoc sp .의 베타-카로틴 케톨라제 (crtW)와 42%의 유사도를 보여 본 발명에서 얻은 유전자가 crtW 유전자임이 확인되었으며 기존 유전자와 낮은 유사도로 판단하여 신규한 crtW 유전자임을 확인할 수 있었다. 위와 같이 얻은 신규 crtW 유전자가 포함된 플라스미드인 pK143crtW가 형질전환된 대장균 DH5α를 2006년 1월 6일자로 한국미생물보존협회 (한국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221, 유림빌딩 2층)에 수탁 번호 KFCC11366P로 기탁하였다.

실시예 3 - 베타-카로틴 케토라제 ( crtW ) 및 베타-카로틴 하이드록실라제 ( crtZ ) 단백질의 활성 확인

A318 균주의 crtW, crtZ 및 crtWZ와 K143의 crtW , 각각의 유전자의 발현후 효소 활성을 확인하기 위하여 베타-카로틴을 생합성 할 수 있는 노랑색 대장균 (J. Bacteriol. 177, 6575-6584, 1995)에 각 유전자를 형질전환하고 발현시키면 도입된 유전자의 활성에 의하여 베타-카로틴이 칸타잔틴, 제아잔틴, 혹은 아스타잔틴과 같은 잔토필 (xanthophyll)로 전환될 경우 노랑색 대장균이 붉은색으로 변하게 되므로 도입된 유전자의 활성을 확인할 수 있게 된다. crtW, crtZ 및 crtWZ 유전자가 대장균에서 발현될 수 있도록 대장균에서 구성적 발현을 유도하는 GAL10 프로모터 (사카로미세스 세레비지에 유래의 500bp 길이)에 각 ORF를 다음과 같이 연결하였다.

발현 벡터로는 GAL10 프로모터를 pBluescriptⅡKS(+) 벡터의 SacⅠ과 HindⅢ, SacⅠ과 EcoRⅠ제한효소 위치에 각각 클로닝한 벡터, pGAL(HindⅢ)와 pGAL(EcoRⅠ)를 사용하였다. A318의 crtW는 A318 W-F와 A318 W-R 프라이머, crtZ는 A318 Z-F, A318 Z-R 프라이머, crtWZ는 A318 W-F와 A318 Z-R 프라이머를 각각 사용하여 PCR로 증폭하였고, 그 산물을 HindⅢ와 SalⅠ으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단한 pGAL(HindⅢ) vector에 각각 클로닝하여 이를 pGAL-A318crtW, pGAL-A318crtZ, pGAL-A318crtWZ로 각각 명명하였다. K143의 crtW는 K143 W-F와 K143 W-R 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였고, 그 산물을 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 절단한 후, 동일한 제한효소으로 절단한 pGAL(EcoRⅠ) 벡터에 각각 클로닝 하였고, 이를 pGAL-K143crtW로 명명하였다.

A318 W-F 프라이머: AAGCTT AAAAATGCTCGACGACGCAATC (서열번호 9)

HindⅢ

A318 W-R 프라이머: GTCGAC TCATGATGTGGTCGTGCT (서열번호 10)

SalⅠ

A318 Z-F 프라이머: AAGCTT AAAAATGAGCATTCCGGCCATT (서열번호 11)

HindⅢ

A318 Z-R 프라이머: GTCGAC TCAGGCGCCTGCGCTGTC (서열번호 12)

SalⅠ

K143 W-F 프라이머: GAATTC AAAAATGATTGCAGGAAATCAA (서열번호 13)

EcoRⅠ

K143 W-R 프라이머: GTCGAC TTATTTTACCATTTCCTC (서열번호 14)

SalⅠ

이들 플라스미드를 노랑색 대장균에 형질전환하였다. 이때 노랑색 대장균은 클로로암페니콜(chloramphenicol)을 선택마커로 하는 pACYC184 vector에 crtE, crtB, crtY, crtI 유전자가 cloning (pACCAR16 △ crtX) 되어 베타-카로틴을 생성함으로써 노란색을 띄는 균주이므로 암피실린(ampicillin)과 클롤로암페니콜(chloramphenicol)을 통해 선택하였다. 그 결과 A318 crtW 유전자를 추가적으로 발현하는 플라스미드 pGAL-A318crtW로 형질전환된 노랑색 대장균은 옅은 붉은색, A318 crtZ 유전자를 추가적으로 발현하는 플라스미드 pGAL-A318crtZ로 형질전환된 노랑색 대장균은 진한 노랑색을 띄었으며, A318 crtWZ 유전자를 추가적으로 발현하는 pGAL-A318crtWZ로 형질전환된 노랑색 대장균은 등황색을 띄었다. 또한 K143 crtW 유전자를 추가적으로 발현하는 플라스미드 pGAL-K143crtW로 형질전환된 노랑색 대장균은 옅은 붉은색을 띄었다. 이들 균주의 잔토필 생성능 검정을 위하여 TLC(thin layer chromatography)를 수행하였다. 각각의 균주 내에 포함된 색소화합물은 아세톤(acetone)을 통해 추출하였다. 색소 추출물을 건조시킨 후 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:1 혼합용매에 용해시켰다. TLC의 매질은 실리카겔(Silica gel 60F254, 제조원: Merck, Germany)을 사용하였고, 추출된 색소 추출물을 헥산:아세톤(cloroform:acetone) 70:30 용매에서 전개시켰다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. A318 crtW 유전자를 발현하는 노랑색 대장균은 표준 칸타잔틴과, A318 crtZ 유전자를 발현하는 노랑색 대장균은 표준 제아잔틴과, 그리고 A318 crtWZ 유전자를 발현하는 노랑색 대장균은 표준 아스타잔틴의 Rf 값과 동일한 값을 가지는 색소 밴드를 나타내었다 (도 1). 또한 K143 crtW 유전자를 발현하는 노랑색 대장균은 표준 칸타잔틴과 동일한 Rf 값을 보이는 색소 밴드를 형성하였다 (도 1). 따라서 도입된 유전자 crtW , crtZ , crtWZ의 발현을 통해 베타-카로틴이 변환되어 각각 칸타잔틴, 제아잔틴, 아스타잔틴이 생성됨을 확인할 수 있었다.

형질전환된 노랑색 대장균의 색소화합물을 좀 더 정확히 분석하기 위하여HPLC 분석을 수행하였다. 각각의 형질전환된 노랑색 대장균으로부터 색소화합물을 추출하여 HPLC 분석을 하였다. 색소 화합물은 아세톤을 통해 추출한 후 Hexane : 20% KCl(1:1)를 동량을 첨가하여 분리 조작하였다. Hexane 층에 동량의 물을 넣어 분리 조작하여 색소가 함유한 hexane층을 감압 농축하였다. 감압 농축된 색소 추출 물을 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:9 혼합용매에 용해시켰다. HPLC에 사용된 컬럼은 C18 역상 컬럼(Ultrasphere ODS 4.6㎜ x 25㎝, 제조원: Beckman Coulter, CA, USA)을 사용하였고, 용매는 아세토나이트릴:메탄올:이소프로파놀(acetonitrile:methanol:isoprophanol) 90:6:4로 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 하였고, 흡광도는 UV 475nm에서 감지하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 사용한 표품으로는 아스타잔틴의 경우 6.5분대, 제아잔틴의 경우 8.5분대, 칸타잔틴의 경우 10.9분대의 피크로 나타났다. A318의 crtW 유전자가 형질전환된 노랑색 대장균에서 추출한 화합물에서 표품 칸타잔틴과 일치하는 10.7분대, crtZ 유전자가 형질전환된 노랑색 대장균에서는 표품 제아잔틴과 일치하는 8.3분대, crtWZ 유전자가 형질전환된 노랑색 대장균에서는 표품 아스타잔틴과 일치하는 6.4분대의 피크가 나타났다 (도 2). 그러므로 A318의 crtW , crtZ , crtWZ 유전자가 형질전환 됨으로써 칸타잔틴, 제아잔틴, 그리고 아스타잔틴이 각각 생성된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 K143 crtW 유전자가 형질전환된 노랑색 대장균에서 추출한 화합물에서 표품 칸타잔틴과 일치하는 10.5분대의 피크가 나타났다 (도 2). 그러므로 K143의 crtW 유전자가 발현됨으로써 칸타잔틴이 생성된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4 - 베타-카로틴 케토라제 ( crtW ) 및 베타-카로틴 하이드록실라제 ( crtZ ) 유전자의 동시발현

K143 유래의 crtW 유전자와 A318 유래의 crtZ 유전자를 동시 발현시키기 위 하여, 먼저 아래 표시한 BADpro-F(1)와 BADpro-HR2 프라이머, BADpro-F(1)와 BADpro-ER1 프라이머를 각각 사용하여 BAD 프로모터를 pBAD/myc-His A, B, C (Invitrogen 사, 미국 Carlsbad 시)를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였고, 실시예 3에서 구축한 pGAL-K143crtW와 pGAL-A318crtW 플라스미드의 SacⅠ과 EcoRⅠ제한효소 위치, 그리고, SacⅠ과 HindⅢ 제한효소 위치에 각각 클로닝하여 GAL10 프로모터를 BAD 프로모터로 대체하였고 이를 각각 pBAD-K143crtW와 pBAD-A318crtW로 명명하였다. 실시예 3에서 구축한 pGAL-A318crtZ 플라스미드를 주형으로 하여 아래에 표시한 pGal(Xho)-F와 A318Z(Kpn)-R 프라이머를 이용하여 GAL10 프로모터와 A318crtZ을 포함하는 부분을 PCR로 증폭하였고, 위에서 제조한 pBAD-K143crtW와 pBAD-A318crtW 플라스미드의 XhoⅠ과 KpnⅠ 위치에 클로닝함으로써 A318 crtZ 유전자가 K143 crtW 와 A318 crtW 유전자의 뒷부분에 각각 위치하도록 하였고 이를 pBKW-GAZ와 pBAW-GAZ로 각각 명명하였다.

BADpro-F(1) 프라이머: GAGCTC AAACCAATTGTCCATATTGCA (서열번호 15)

SacⅠ

BADpro-ER1 프라이머: GAATTC GGTTAATTCCTCCTGTTAGCC (서열번호 16)

EcoRⅠ

BADpro-HR2 프라이머: AAGCTT GGTTAATTCCTCCTGTTAGCC (서열번호 17)

HindⅢ

pGal(Xho)-F 프라이머: CTCGAG CGGTAATCGCTTCGCTGATTA (서열번호 18)

XhoⅠ

A318Z(Kpn)-R 프라이머: GGTACC TCAGGCGCCTGCGCTGTCCCG (서열번호 19)

KpnⅠ

K143 유래의 crtW 유전자와 A318 유래의 crtZ 유전자를 동시 발현시키는 플라스미드 pBKW-GAZ와 A318 유래의 crtW 유전자와 A318 유래의 crtZ 유전자를 동시 발현시키는 플라스미드 pBAW-GAZ를 베타-카로틴을 생성 하도록 조작된 노랑색 대장균에 형질전환한 후 BAD 프로모터를 발현시키기 위하여 대장균의 배지에 0.2% 아라비노스를 첨가하여 발현을 유도하였고 균체를 수득한 후 실시예 3의 방법으로 색소 추출물을 HPLC로 분석하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 pBAW-GAZ 플라스미드로 형질전환된 노랑색 대장균은 표품 아스타잔틴과 일치하는 6.3분대의 피크를 보였고 pBKW-GAZ 플라스미드로 형질전환된 노랑색 대장균도 6.3분대의 피크를 보였다. 또한 아스타잔틴의 상대적인 분포를 볼 때 pBKW-GAZ 플라스미드로 형질전환된 노랑색 대장균은 pBAW-GAZ 플라스미드로 형질전환된 노랑색 대장균보다 아스타잔틴 생성능이 보다 우수함을 알 수 있었다.

본 발명에 의해 제공되는 베타-카로틴 케톨라제(crtW) 및 베타-카로틴 하이드록실라제(crtZ) 유전자는 항산화제, 항암제, 착색제, 동물사료 보조제 등으로 사 용될 수 있는 유용한 천연색소 칸타잔틴, 제아잔틴 및 아스타잔틴을 생물학적 방법으로 생산하여 공급하는데 사용할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel genes coding for beta-carotene ketolase and beta-carotene hydroxylase <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-carotene ketolase-specific primer <400> 1 caygaygcna tgcaygg 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-carotene ketolase-specific primer <400> 2 tanccraart grtarca 17 <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> A318 <220> <221> CDS <222> (1)..(774) <223> beta-carotene ketolase <400> 3 atg ctc gac gac gca atc acc agc ccc gcc gcc gcc agc ggc gcg cga 48 Met Leu Asp Asp Ala Ile Thr Ser Pro Ala Ala Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 gcg cag cag gcc gcc att ggc ctg gcg ctg gct gcg gcc att ttc ggc 96 Ala Gln Gln Ala Ala Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Phe Gly 20 25 30 agc tgg gtc gcc atc cat gtc tat gcg att ttc atc ttc gaa ctg agc 144 Ser Trp Val Ala Ile His Val Tyr Ala Ile Phe Ile Phe Glu Leu Ser 35 40 45 tgg gcg acc ttg ccg atc gcg ctc ggc atc gcg ttg gtg caa tgc tgg 192 Trp Ala Thr Leu Pro Ile Ala Leu Gly Ile Ala Leu Val Gln Cys Trp 50 55 60 ctg tcg gtc ggc ttg ttc atc gtc agc cat gac gcc atg cac ggc tct 240 Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Val Ser His Asp Ala Met His Gly Ser 65 70 75 80 ctc gcg ccc ggc gcg ccg cgg gtg aac gcg gtg atc ggg gct gcg ctc 288 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Val Asn Ala Val Ile Gly Ala Ala Leu 85 90 95 ctg ttt ctc tat gcc ggt ttc ggc tgg cgc aag atg cgc gat gcg cat 336 Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Gly Trp Arg Lys Met Arg Asp Ala His 100 105 110 ttc gat cat cac aag cat acg ggc gcg gac ggg gat ccc gat ttc gac 384 Phe Asp His His Lys His Thr Gly Ala Asp Gly Asp Pro Asp Phe Asp 115 120 125 acc gcc aac ccg acc gat ggc ctg cgc tgg tat cgc act ttc ctg acc 432 Thr Ala Asn Pro Thr Asp Gly Leu Arg Trp Tyr Arg Thr Phe Leu Thr 130 135 140 cgt tat ttc ggc tgg cgc agc gcg ctc tac gtt tcg ctg gtg gtg acg 480 Arg Tyr Phe Gly Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Ser Leu Val Val Thr 145 150 155 160 gtc tac tgg ctg gtg gtc ggc gtg ccg atg gcg cag atc gtg ctg gtc 528 Val Tyr Trp Leu Val Val Gly Val Pro Met Ala Gln Ile Val Leu Val 165 170 175 tat ggc ctg ccc gcc atc gca tcg tcg gtg cag ctc ttc tat ttc ggc 576 Tyr Gly Leu Pro Ala Ile Ala Ser Ser Val Gln Leu Phe Tyr Phe Gly 180 185 190 act tac cgc cca cac cac cat gac gag cac gca ttc gag gat cgg cac 624 Thr Tyr Arg Pro His His His Asp Glu His Ala Phe Glu Asp Arg His 195 200 205 aat gcc cgt tcc aac gat tat cca gcg tgg ttg agc ctc gcc act tgc 672 Asn Ala Arg Ser Asn Asp Tyr Pro Ala Trp Leu Ser Leu Ala Thr Cys 210 215 220 ttc cat ttc ggc tat cat ctc gaa cat cac cgc cat ccc ggc gtg ccc 720 Phe His Phe Gly Tyr His Leu Glu His His Arg His Pro Gly Val Pro 225 230 235 240 tgg tgg gcg ctg ccg gca cgg cgc agg caa gac atg caa agc acg acc 768 Trp Trp Ala Leu Pro Ala Arg Arg Arg Gln Asp Met Gln Ser Thr Thr 245 250 255 aca tca tga 777 Thr Ser <210> 4 <211> 258 <212> PRT <213> Unknown <400> 4 Met Leu Asp Asp Ala Ile Thr Ser Pro Ala Ala Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ala Ala Ile Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ile Phe Gly 20 25 30 Ser Trp Val Ala Ile His Val Tyr Ala Ile Phe Ile Phe Glu Leu Ser 35 40 45 Trp Ala Thr Leu Pro Ile Ala Leu Gly Ile Ala Leu Val Gln Cys Trp 50 55 60 Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Val Ser His Asp Ala Met His Gly Ser 65 70 75 80 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Val Asn Ala Val Ile Gly Ala Ala Leu 85 90 95 Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Gly Trp Arg Lys Met Arg Asp Ala His 100 105 110 Phe Asp His His Lys His Thr Gly Ala Asp Gly Asp Pro Asp Phe Asp 115 120 125 Thr Ala Asn Pro Thr Asp Gly Leu Arg Trp Tyr Arg Thr Phe Leu Thr 130 135 140 Arg Tyr Phe Gly Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Ser Leu Val Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Trp Leu Val Val Gly Val Pro Met Ala Gln Ile Val Leu Val 165 170 175 Tyr Gly Leu Pro Ala Ile Ala Ser Ser Val Gln Leu Phe Tyr Phe Gly 180 185 190 Thr Tyr Arg Pro His His His Asp Glu His Ala Phe Glu Asp Arg His 195 200 205 Asn Ala Arg Ser Asn Asp Tyr Pro Ala Trp Leu Ser Leu Ala Thr Cys 210 215 220 Phe His Phe Gly Tyr His Leu Glu His His Arg His Pro Gly Val Pro 225 230 235 240 Trp Trp Ala Leu Pro Ala Arg Arg Arg Gln Asp Met Gln Ser Thr Thr 245 250 255 Thr Ser <210> 5 <211> 501 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> A318 <220> <221> CDS <222> (1)..(498) <223> beta-carotene hydroxylase <400> 5 atg agc att ccg gcc att ctc ctg acc ctc gcg ggc gca gtc gtc ttc 48 Met Ser Ile Pro Ala Ile Leu Leu Thr Leu Ala Gly Ala Val Val Phe 1 5 10 15 atg gaa ttc ttc gcc tgg tgg gcg cac aaa tac gtc atg cat ggc tgg 96 Met Glu Phe Phe Ala Trp Trp Ala His Lys Tyr Val Met His Gly Trp 20 25 30 ggc tgg aac tgg cac cgc gac cat cac gaa ccg cat gac aat gtg ctg 144 Gly Trp Asn Trp His Arg Asp His His Glu Pro His Asp Asn Val Leu 35 40 45 gaa aag aac gac ctg ttc gcc gtc gtt ttc ggc tcc atc gtc atc gcc 192 Glu Lys Asn Asp Leu Phe Ala Val Val Phe Gly Ser Ile Val Ile Ala 50 55 60 atg ttc acg atc ggc tat ttc gta tcg gac ttc ctg tgg tgg ctg gca 240 Met Phe Thr Ile Gly Tyr Phe Val Ser Asp Phe Leu Trp Trp Leu Ala 65 70 75 80 gcg ggc atc acg ctg tac ggc ctg atc tat acc ttc atc cat gac ggg 288 Ala Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Leu Ile Tyr Thr Phe Ile His Asp Gly 85 90 95 ctg gtg cat cag cgc tat ttc cgc tgg gtg ccg aag cgc ggc tat gcg 336 Leu Val His Gln Arg Tyr Phe Arg Trp Val Pro Lys Arg Gly Tyr Ala 100 105 110 aag cgg ctg gtg cag gcg cat aag ctg cat cat gca acg gtg ggc aag 384 Lys Arg Leu Val Gln Ala His Lys Leu His His Ala Thr Val Gly Lys 115 120 125 gaa ggc ggg gtg agt ttc ggc ttc ctc ttt gcc cgc gag ccg agt gcg 432 Glu Gly Gly Val Ser Phe Gly Phe Leu Phe Ala Arg Glu Pro Ser Ala 130 135 140 ctt aag gcc gaa ttg cgc cgc cag cgg gaa agc gga gaa gcg gtg gtg 480 Leu Lys Ala Glu Leu Arg Arg Gln Arg Glu Ser Gly Glu Ala Val Val 145 150 155 160 cgg gac agc gca ggc gcc tg a 501 Arg Asp Ser Ala Gly Ala 165 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> Unknown <400> 6 Met Ser Ile Pro Ala Ile Leu Leu Thr Leu Ala Gly Ala Val Val Phe 1 5 10 15 Met Glu Phe Phe Ala Trp Trp Ala His Lys Tyr Val Met His Gly Trp 20 25 30 Gly Trp Asn Trp His Arg Asp His His Glu Pro His Asp Asn Val Leu 35 40 45 Glu Lys Asn Asp Leu Phe Ala Val Val Phe Gly Ser Ile Val Ile Ala 50 55 60 Met Phe Thr Ile Gly Tyr Phe Val Ser Asp Phe Leu Trp Trp Leu Ala 65 70 75 80 Ala Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Leu Ile Tyr Thr Phe Ile His Asp Gly 85 90 95 Leu Val His Gln Arg Tyr Phe Arg Trp Val Pro Lys Arg Gly Tyr Ala 100 105 110 Lys Arg Leu Val Gln Ala His Lys Leu His His Ala Thr Val Gly Lys 115 120 125 Glu Gly Gly Val Ser Phe Gly Phe Leu Phe Ala Arg Glu Pro Ser Ala 130 135 140 Leu Lys Ala Glu Leu Arg Arg Gln Arg Glu Ser Gly Glu Ala Val Val 145 150 155 160 Arg Asp Ser Ala Gly Ala 165 <210> 7 <211> 714 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> K143 <220> <221> CDS <222> (1)..(711) <223> beta-carotene ketolase <400> 7 atg att gca gga aat caa att tta gga aac aag cat ata gac cct act 48 Met Ile Ala Gly Asn Gln Ile Leu Gly Asn Lys His Ile Asp Pro Thr 1 5 10 15 ggg gtg gtg gtg gct atc tta atc atc gct tgc tgg agt acc tca atg 96 Gly Val Val Val Ala Ile Leu Ile Ile Ala Cys Trp Ser Thr Ser Met 20 25 30 gtt ttt tta ctt aag tgg aac att aat tgg tcc aat ccc ctc acc tat 144 Val Phe Leu Leu Lys Trp Asn Ile Asn Trp Ser Asn Pro Leu Thr Tyr 35 40 45 ctt ttt gta ttg atc caa atg cac ctg tat aca gga ttg ttt att aca 192 Leu Phe Val Leu Ile Gln Met His Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr 50 55 60 gca cat gat gcc atg cat ggg ttg gtt tca tcc aat aaa att gta aac 240 Ala His Asp Ala Met His Gly Leu Val Ser Ser Asn Lys Ile Val Asn 65 70 75 80 aat gta ata ggc gta ttt gca gcc ctt ctt ttt tcg tac aat ttc tat 288 Asn Val Ile Gly Val Phe Ala Ala Leu Leu Phe Ser Tyr Asn Phe Tyr 85 90 95 tgg aaa ttg ttt ccc aaa cat cat gaa cat cat cgg ttt gtg gcc acg 336 Trp Lys Leu Phe Pro Lys His His Glu His His Arg Phe Val Ala Thr 100 105 110 gat caa gat ccg gat tac cat cat tct gat aac ttc ttt gtt tgg tat 384 Asp Gln Asp Pro Asp Tyr His His Ser Asp Asn Phe Phe Val Trp Tyr 115 120 125 ttt agt ttc atc aaa cag tat ctc agc gta tgg caa att ctc cta atg 432 Phe Ser Phe Ile Lys Gln Tyr Leu Ser Val Trp Gln Ile Leu Leu Met 130 135 140 gct atc acc ttc aat att tta aag cta ttt ctg cct gtg gat aac ttg 480 Ala Ile Thr Phe Asn Ile Leu Lys Leu Phe Leu Pro Val Asp Asn Leu 145 150 155 160 ata att ttc tgg atg ctt cca gct gtg tta tcc aca ttt caa cta ttt 528 Ile Ile Phe Trp Met Leu Pro Ala Val Leu Ser Thr Phe Gln Leu Phe 165 170 175 tac ttt gga act tac ctt cct cat cga ggg gaa agt gat aac aaa cac 576 Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Arg Gly Glu Ser Asp Asn Lys His 180 185 190 cat tca aat aca cag tcc aaa aat cac ctt tgg gca ttt att tca tgc 624 His Ser Asn Thr Gln Ser Lys Asn His Leu Trp Ala Phe Ile Ser Cys 195 200 205 tat ttc ttt ggc tat cac tat gag cat cat gat tct ccg ggc aca cct 672 Tyr Phe Phe Gly Tyr His Tyr Glu His His Asp Ser Pro Gly Thr Pro 210 215 220 tgg tgg agg ctg tgg aga aaa aaa gag gaa atg gta aaa taa 714 Trp Trp Arg Leu Trp Arg Lys Lys Glu Glu Met Val Lys 225 230 235 <210> 8 <211> 237 <212> PRT <213> Unknown <400> 8 Met Ile Ala Gly Asn Gln Ile Leu Gly Asn Lys His Ile Asp Pro Thr 1 5 10 15 Gly Val Val Val Ala Ile Leu Ile Ile Ala Cys Trp Ser Thr Ser Met 20 25 30 Val Phe Leu Leu Lys Trp Asn Ile Asn Trp Ser Asn Pro Leu Thr Tyr 35 40 45 Leu Phe Val Leu Ile Gln Met His Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr 50 55 60 Ala His Asp Ala Met His Gly Leu Val Ser Ser Asn Lys Ile Val Asn 65 70 75 80 Asn Val Ile Gly Val Phe Ala Ala Leu Leu Phe Ser Tyr Asn Phe Tyr 85 90 95 Trp Lys Leu Phe Pro Lys His His Glu His His Arg Phe Val Ala Thr 100 105 110 Asp Gln Asp Pro Asp Tyr His His Ser Asp Asn Phe Phe Val Trp Tyr 115 120 125 Phe Ser Phe Ile Lys Gln Tyr Leu Ser Val Trp Gln Ile Leu Leu Met 130 135 140 Ala Ile Thr Phe Asn Ile Leu Lys Leu Phe Leu Pro Val Asp Asn Leu 145 150 155 160 Ile Ile Phe Trp Met Leu Pro Ala Val Leu Ser Thr Phe Gln Leu Phe 165 170 175 Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Arg Gly Glu Ser Asp Asn Lys His 180 185 190 His Ser Asn Thr Gln Ser Lys Asn His Leu Trp Ala Phe Ile Ser Cys 195 200 205 Tyr Phe Phe Gly Tyr His Tyr Glu His His Asp Ser Pro Gly Thr Pro 210 215 220 Trp Trp Arg Leu Trp Arg Lys Lys Glu Glu Met Val Lys 225 230 235 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A318 W-F primer <400> 9 aagcttaaaa atgctcgacg acgcaatc 28 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A318 W-R primer <400> 10 gtcgactcat gatgtggtcg tgct 24 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A318 Z-F primer <400> 11 aagcttaaaa atgagcattc cggccatt 28 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A318 Z-R primer <400> 12 gtcgactcag gcgcctgcgc tgtc 24 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K143 W-F primer <400> 13 gaattcaaaa atgattgcag gaaatcaa 28 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K143 W-R primer <400> 14 gtcgacttat tttaccattt cctc 24 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BADpro-F(1) primer <400> 15 gagctcaaac caattgtcca tattgca 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BADpro-ER1 primer <400> 16 gaattcggtt aattcctcct gttagcc 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BADpro-HR2 primer <400> 17 aagcttggtt aattcctcct gttagcc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGal(Xho)-F primer <400> 18 ctcgagcggt aatcgcttcg ctgatta 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A318Z(Kpn)-R primer <400> 19 ggtacctcag gcgcctgcgc tgtcccg 27

Claims

(i)서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 케톨라제(β-carotene ketolase) 효소 활성을 가지는 단백질, 또는 (ii)서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 케톨라제 효소 활성을 가지는 단백질.
제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제2항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 케톨라제 단백질이 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 코딩되고 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 베타-카로틴 케톨라제 단백질이 서열번호 7의 핵산 서열에 의하여 코딩되는 핵산 분자.
서열번호 6의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지고 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase) 효소 활성을 가지는 단백질.
제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제5항에 있어서, 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질이 서열번호 5의 핵산 서열에 의하여 코딩되는 핵산 분자.
제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및 제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제8항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제9항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제10항 내지 제12항의 어느 하나의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 베타-카로틴 케톨라제 단백질 또는 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 생산하는 방법.
제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 칸타잔틴을 생산하는 방법.
제14항에 있어서, 제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 코딩하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 칸타잔틴을 생산하는 방법.
제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 제아잔틴(zeaxanthin)을 생산하는 방법.
제16항에 있어서, 제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 제아잔틴을 생산하는 방법.
제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및 제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 베타-카로틴이 존재하는 조건하에 제공하여 아스타잔틴(astraxathin)을 생산하는 방법.
제18항에 있어서, (i)제1항의 베타-카로틴 케톨라제 단백질을 코딩하는 벡터와 제4항의 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 벡터, 또는 (ii) 베타-카로틴 케톨라제 단백질 및 베타-카로틴 하이드록실라제 단백질을 코딩하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴을 생산하는 방법.