KR20070073796A - 선택된 분자를 세포에 수송하기 위한 비히클 - Google Patents

Abstract

본원은, 정전기적 상호작용에 의해 선택된 분자에 결합된 세인트-분자 (Saint-molecule)로 이루어지고, 상기 세인트 분자가 세포 특이적 리간드에 커플링되는 링커 분자에 공유결합으로 커플링되는, 선택된 분자를 세포에 수송하기 위한 비히클에 관한 것이다.

세인트-분자, 링커 분자, 비히클

Description

선택된 분자를 세포에 수송하기 위한 비히클{Vehicle for the transport of a chosen molecule to a cell}

본 발명은 정전기적 상호작용, 보다 특히 비-공유적 결합, 예를 들어 수소 결합에 의해 선택된 분자에 결합된 세인트-분자 (Saint-molecule)를 포함하는, 선택된 분자를 세포에 수송하기 위한 비히클에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 선택된 분자를 세포에 표적 수송하기 위한 세인트-분자의 용도에 관한 것이다.

선택된 분자가 신체의 바람직한 세포에서 또는 근처에서 이의 작용을 수행하도록 선택된 분자를 신체에 투여하는 것은 현 기술 수준에서 공지되어 있다. 이러한 분자를 세포에 전달하기 위한 하나의 가능성은, 상당량의 선택된 분자를 신체에 투여하는 것이며, 이로써, 확산에 의해, 필요한 농도의 선택된 분자가 표적된 세포에서 얻어질 것이다. 이러한 과정의 문제점은, 선택된 분자가 신체의 다른 부분에서 바람직하지 않은 부작용을 발생시킬 수 있다는 것이다.따라서, 선택된 분자, 예를 들어 약물을 신체의 특정 위치에 있는 특정 세포로 전달하는 방법이 개발되었다. 첫번째 방법은 선택된 화합물을 항체에 커플링시키는 것을 포함한다. 이러한 커플링은 공유결합이다. 그러한 결과로서, 선택된 화합물의 활성이 유리 분자의 활성과 비교하여 실질적으로 감소된다. 현재 통용되고 있는 또 다른 방법은 리포 좀에 선택된 분자를 패키징하는 것이다. 분자가 패키징되는 리포좀의 외부에 항체가 커플링될 수 있다. 리포좀에 대한 항체의 이러한 커플링은 대부분 리포좀에 선택된 분자를 포함시킨 후 일어난다. 선택된 분자가 포함되기 전에 항체의 커플링이 일어나는 경우, 항체가 리포좀의 내막에 위치될 수 있어 리포좀의 효율을 감소시킬 수 있다. 선택된 분자, 예를 들어 제약학적 화합물의 포함에 대한 일반적으로 공지된 단점은, 약제가 리포좀으로부터 서서히 누출될 것이라는 것이다. 두번째 단점은, 패키징 (선택된 화합물을 내부에 포함하는 리포좀)의 형성을 선택된 화합물을 포함하는 용액에서 수행해야 한다는 것이다. 패키징 동안, 5 % 이하의 선택된 화합물이 리포좀에 포함될 것이다. 이는, 95 %의 선택된 화합물이 리포좀에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 결과적으로, 이러한 방법의 효율은 매우 낮다.

본 발명의 목적은 선택된 화합물의 세포에의 전달을 강력히 개선하는 비히클을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 선택된 분자에 대해 장기간 동안 안정하게 결합할 수 있는 비히클을 제공하는 것이다.

하나 이상의 상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 청구항 제1항에 따른 양태를 특징으로 하는 전술된 바와 같은 비히클을 제공한다. 이러한 방식으로, 선택된 분자를 세포에 전달하는 매우 안정한 공정이 제공된다.

비록 하기에서는 수소 상호작용 및 수소 결합이 일반적으로 언급되지만, 상호작용은 이러한 단순 형태로 제한되지 않는다. 모든 경우에서, 어떠한 종류의 정전기적 상호작용도 언급될 수 있다.

본원에서, 용어 "세포는"가 일반적으로 사용된다. 그러나, 당업자에 의해 분명히 이해되는 바와 같이, "특이 세포"는 선택된 화합물이 수송되어야 하는 세포를 말한다.

바람직한 양태는 청구항 제2항, 제3항 및 제4항에 기술된다.

또 다른 양상에 따라, 본 발명은 선택된 분자를 표적화 방식으로 세포로 수송하는 세인트-분자의 용도에 관한 것이다. 세인트-분자는 일반적으로 공지되어 있으며, 또한 수송 비히클로도 기술되며, 유럽 특허 번호 제EP-0755924 B1호 및 미국 특허 번호 제US 5,853,694호 및 제US 6,726,894호 (본 출원인에 의해 등록됨)에 광범위하게 기술되어 있다. 이러한 특허의 기술이 본원에 참조로 포함된다. 세인트-분자는 광범위한 기술에 따라 합성적 양친매성 물질로 간주된다.

선택된 분자, 예를 들어 마크로분자 또는 약제는 일반적으로 세인트-분자에 감싸이며 (enwrapped), 상술된 유럽 특허 번호 제EP-0755924 B1호 및 미국 특허 번호 제US 5,853,694호 및 제US 6,726,894호에 광범위하게 기술되어 있다.

바람직한 양태에 따라, 세인트-분자는 링커 분자에 공유적으로 결합된다. 이러한 공유적 커플링에 의해 안정한 비히클의 통합된 단단한 부분이 확실하게 된다. 링커 분자는 위치 R1, R2, R3, R4, R5 및 R5'에서 세인트-분자에 결합될 수 있으며, 이때 R5 및 R5'는 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 유형의 세인트-분자에 대해 보다 광범위한 기술로 미국 특허 제US 6,726,894호를 참조한다. 링커 분자의 예는 1-N'-메틸-4-(아미노부틸, 시스-9-올레일)-메틸피리미디늄클로라이드 (세인트-아미노-링커), 및 1-N'-메틸-4-(N-숙신이미딜-S-아세틸티오-아세테이트, 시스-9-올레일)-메틸피리디늄클로라이드 (세인트-SATA-링커)를 들 수 있다. 이러한 모든 경우에서, 아세틸티오아세티이트 및 SATA 그룹은 링커(잔기)로 작용한다. 그러나, 세인트-분자에 공유적으로 결합될 수 있는 모든 화학적 화합물을 포함하여, 동등한 화합물이 링커-잔기로서 적용될 수 있다. 비록 일반적으로는 단지 하나의 링커 분자가 세인트-분자에 결합될 것이지만, 위치의 조합, 예를 들어 R1, R2, R3, R4, R5 또는 R5' 단독 또는 이들의 조합 (최대 모든 5개의 링커 위치 이하)이 링커 분자에 의해 차지될 수 있을 것이다.

추가의 바람직한 양태에 따라, 세포 특이적 리간드는 항체 또는 이의 유도체, 단백질, 펩타이드, 세포-표면을 표적하는 특정 적용을 갖는 화합물, 및 목적하는 세포 특이성을 갖는 다른 화합물 중에서 선택된다.

항체 또는 이의 유도체는 합성적이거나 천연 발생적 변이체일 수 있다.

본 발명의 범위 내에서, 리간드는 세포의 수용체 또는 단백질에 결합할 수 있는 모든 화합물이 고려된다. 리간드에 대한 예비조건은, 수용체 및/또는 세포 유형에 대해 특이성을 갖는 것이다. 이러한 유형의 리간드의 예는 L-도파 또는 아드레날린 유도체이다. 이러한 제1 유형의 리간드는 특이적으로 흑질의 도파민 수용체를 특이적으로 결합하고, 제2 유형의 리간드는 신체의 아드레날린작동 수용체에 특이적으로 결합한다. 물론, 본 발명은 이러한 예로 제한되지 않는다.

보다 특이적으로, 감싸이는 분자는 세인트-분자의 활성 표면에서 결합하는 것이 바람직하다. 이러한 양태로 제한됨이 없이, 양성적으로 하전되는 피리디늄 그룹이 사용된다. 이러한 그룹은 감싸이는 마크로분자의 음성적 하전물에 결합한다. 또한, 세인트-분자는 간접적 방식으로 마크로분자가 양성적 하전을 갖는 경우 마크로분자를 둘러싸는 물-층과 상호작용함으로써 마크로분자를 결합할 수 있다. 그 결과, 세인트-분자는 정전기적 상호작용에 의해, 예를 들어 수소-결합을 형성함으로써 마크로분자를 결합하고, 이로써 세인트-분자로부터 선택된 분자의 누출을 방지할 것이다.

또한, 예를 들어 피리디늄-환의 오르토-전자 또는 탄소-원자로부터의 정전기적 상호작용이 결합에 이용되는 가능성이 존재할 수 있다.

본 발명은 선택된 분자, 예를 들어 약물을 신체의 특정 위치에 있는 특정 세포로 전달할 수 있게 한다. 이로써, 신체에 투여되어야 하는 약물의 양이 치료에 필요한 세포의 양에 대해 정확히 일치될 수 있는 이점이 발생한다. 세인트 분자와 감싸이는 화합물 사이의 적합한 체계를 선택함으로써, 화합물의 누출이 방지되며, 링커 커플링된 리간드에 상보적인 수용체 리간드를 포함하는 세포막으로 전달 후 방출되거나, 융합되거나, 흡수된다. 이러한 방식으로, 선택된 분자는 신체의 다른 부에 방출되는 것이 방지된다. 이때 이들은 세인트-분자 비히클에 포함되게 남는다.

본 발명의 본질이 상술되었다. 상기한 기술 및 첨부된 결론에 기초하여, 당업자라면 추가의 양태를 간단히 개발할 수 있을 것이며, 이들 모두가 본 발명의 범위에 속한다.

도 1은 GFP 양성 세포의 백분율 (%)을 도시한 것이다.

사람 태아 신장 세포는 트랜스펙션 (transfection)이 어렵다. 이들 세포를 사용하는 경우, 주요한 경쟁적 트랜스펙션 방법은 성공적-트랜스펙션을 위해 수 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 필요로 한다. 세인트-18과 배합하는 경우, 통상적으로 1 □g (12-웰 당)으로 90 % 이상의 트랜스펙션 비율을 갖는다. 표적 잔기 세인트-18-RGD의 증진 효과를 구체화하기 위해서, 본 프로토콜에서 본 발명자는 소량의 플라스미드 DNA (500 ng/12-웰)을 사용하였다. 세인트-링커-RGD의 구조식이 하기 화학식 1에 나타나 있다. 또한, RGD-펩타이드는, 본원에 기술되는 바와 같이, 세인트-링커의 SATA-그룹에 커플링된다. RGD 그룹은 인테그린 수용체 부류의 표적화 잔기이며, 트랜스펙션 효율을 증진시키는 것으로 생각된다. 사람 태아 신장 세포주 293A를 12-웰 플레이트에서 배양하고, 4가지 조합의 세인트-분자 (즉, 세인트-18, RGD에 커플링된 세인트-18, 세인트-18과 RGD에 커플링된 세인트-18의 혼합물, 및 링커 분자 (참조용))로 트랜스펙션한다. CMV-GFP 플라스미드 500 ng을 3.75 nm 세인트 분자 또는 링커 (웰 당)와 컴플렉스를 형성한다. 트랜스펙션한지 48시간 후, GFP 발현을 FACS 분석으로 측정한다. GFP 양성 세포의 백분율 (%)이 도 1에 도시된다.

세인트-링커-RGD의 구조식

도 1에 도시된 결과는 하기를 분명히 나타낸다:

1. S18-링커 (참조)는 트랜스펙션 제제 (컬럼 4)로서 불충분하게 작용한다.

2. S18/RGD는 세포를 트랜스펙션할 수 있다.

3. S18:S18RGD 비율 500:1은 트랜스펙션율을 약 33 % 증가시킨다.

S18-링커 단독은 주요한 트랜스펙션능을 갖지 않는다. 본 발명자는 100% S18-RGD이 RGD 그룹에 의해 발생하는 입체 장애로부터 감소된 트랜스펙션 효율을 갖는다고 생각한다. 그러나, S18-RGD가 S18과 500:1의 비율로 혼합되는 경우, 트랜스펙션 효율은 상당히 증가한다. 보다 최적화된 비율이 결정될 수 있을 것이다. RGD외의 다른 표적 분자 (예: 세포-특이적 리간드)를 사용하는 경우 유사한 결과가 얻어진다. 그러나, 모든 경우에서, 최적 효과를 얻는데는 최적화가 필요할 것이다. 이러한 실험은 세인트 분자의 트랜스펙션 증진 특성을 잘 나타낸다.

Claims (6)

1. 정전기적 상호작용에 의해 선택된 분자에 결합되는 세인트-분자 (Saint-molecule)를 포함하고, 상기 세인트 분자가 세포 특이적 리간드에 커플링되는 링커-분자 (linker-molecule)에 결합됨을 특징으로 하는, 선택된 분자를 세포에 수송하기 위한 비히클.
2. 제1항에 있어서, 상기 세인트-분자가 상기 링커 분자에 공유적으로 결합됨을 특징으로 하는 비히클.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포-특이적 리간드가 항체 또는 이의 유도체, 단백질, 펩타이드, 세포-표면을 표적하는 특정 적용을 갖는 화합물, 및 목적하는 세포 특이성을 갖는 다른 화합물 중에서 선택됨을 특징으로 하는 비히클.
4. 제1항, 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공유적으로 결합된 분자가 세포와의 융합을 개시함을 특징으로 하는 비히클.
5. 세포 특이적 리간드에 커플링되는 링커 분자에 커플링된 세인트-분자가 정전기적 상호작용에 의해 선택된 분자에 결합되는, 선택된 분자를 세포에 표적 수송하기 위한 세인트-분자의 용도.
6. 제5항에 있어서, 제2항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 따른 비히클을 사용하는 용도.

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