ES2318549T3 - Vehiculo para el transporte de una enzima modificada de adn a un genoma. - Google Patents
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Abstract
Vehículo para el transporte de una enzima/molécula modificadora de ADN al núcleo, que se caracteriza porque la enzima modificadora de ADN está combinada con una molécula SAINT o una combinación de diversas entidades de la misma.
Description
Vehículo para el transporte de una enzima
modificada de ADN a un genoma.
La presente invención se refiere a un vehículo
para el transporte de una enzima modificadora de ADN a un sitio
deseado en un genoma. Además, la presente invención se refiere a la
aplicación del vehículo de la presente invención que comprende una
molécula SAINT.
A partir del estado de la técnica se conoce que
el cáncer y las enfermedades metabólicas están en muchos casos
causadas por la regulación indeseada de genes específicos. La
investigación en biología molecular de este tipo de enfermedades se
utilizan frecuentemente enzimas modificadoras de ADN (tales como
enzimas de restricción, metilasas y desmetilasas, etc.). Estas
enzimas son específicas, de manera que en el genoma de humanos,
animales, plantas, bacterias y virus tienen cierta especificidad
para reconocer una secuencia de nucleótidos concreta. Las
secuencias de nucleótidos específicas de este tipo se encuentran
habitualmente varias veces, incluso a veces miles de veces por
genoma.
La tecnología descrita anteriormente es conocida
a partir del artículo de Paul S. Lovett y Michael G Bramucci
"Evidence of a non-random base sequence in a
Bacillus pumilus plasmid: EcoR1 endonuclease digestion of
pPL576" (Evidencia de una secuencia de bases no aleatorias en un
plásmido de Bacillus pumilus: digestión con endonucleasa
EcoR1 de pPL576) Journal of Bacteriology, julio 1975, pág. 377/379
Vol. 123(1). Además, esta tecnología es conocida a partir
del Manual "Molecular cloning: a laboratory manual" (Clonación
molecular: un manual de laboratorio), ed. T. Maniatis, publicado
por Cold Spring Harbor.
El documento WO 2004/050885A da a conocer un
método para suprimir la expresión de un gen seleccionado relacionado
con la apoptosis en una célula.
El documento WO 03/01030A se refiere a un método
de supresión de la expresión de un gen endógeno seleccionado en una
célula eucariota.
STEENSEL VAN B y otros: "Identification of
in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered Dam
methyltransferase" (Identificación de dianas de ADN in
vivo de proteínas de cromatina utilizando Dam metiltransferasa
de unión) NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, Vol. 18, no.
4, Abril 2000 (2000-04), páginas
424-428, XP002187507 ISSN: 1087-0156
da a conocer la identificación de dianas de ADN in vivo de
proteínas de cromatina utilizando Dam metiltransferasa de unión.
El documento
EP-A-0755924 da a conocer vehículos
de transporte para macromoléculas.
El objetivo de la presente invención es generar
una enzima que sea específica para un punto en el genoma.
En particular, el objetivo de la presente
invención es disponer de la posibilidad de que el sitio deseado en
el genoma se pueda escoger de manera muy específica. En el caso de
que el sitio elegido en el genoma (una secuencia de nucleótidos
reguladora de un gen) sea responsable de una enfermedad, la presente
invención da a conocer la posibilidad de desconectar este gen
mediante el direccionamiento de una enzima específica a la
secuencia de nucleótidos reguladora del gen. La presente invención
da a conocer esta oportunidad mediante las medidas descritas en la
parte caracterizante de la reivindicación 1.
En la conclusión dependiente 3 se describen
realizaciones ventajosas adicionales.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a la aplicación de un vehículo, que comprende
una molécula SAINT, para el transporte de un compuesto activo a una
célula.
Las moléculas SAINT ya son conocidas, por
ejemplo indicadas como vehículo de transporte, y se han descrito
ampliamente en la Patente Europea, número de publicación
EP-0 755 924-B1 y la Patente de
Estados Unidos US 5.853.694.
Según una realización preferente, la enzima se
acopla a la secuencia reconocedora mediante una molécula
espaciadora. De este modo, se genera una separación espacial entre
la entidad de secuencia reconocedora y la enzima, que como
resultado hace que no se inhiba la actividad de la enzima cuando el
vehículo se une al genoma. De esta manera, la enzima es capaz de
realizar su función de la manera en la que la enzima se utiliza
normalmente.
A efectos de obtener una especificidad deseada
para un sitio favorecido en el genoma, se utilizan preferentemente
unidades formadores de triple hélice u oligonucleótidos que se
intercalan en los surcos menores del ADN. Este tipo de secuencias
reconocedoras tienen una estructura que se ajusta únicamente con el
sitio deseado en el genoma. Como resultado, la especificidad
resulta muy elevada y, cuando se sintetizan estas secuencias
reconocedoras en base a una estructura conocida, serán únicos para
sólo un sitio en el genoma. La tecnología es conocida habitualmente
para un experto en la materia y se describe con mayor detalle en el
artículo de F. Sanger y otros, "Use of DNA polymerase I primed by
a synthetic oligonucleotide to determine the sequence in phage f1
DNA" (Utilización de ADN polimerasa I cebada mediante un
oligonucléotido sintético para determinar la secuencia en ADN de
fago f1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 70, no. 4, pág.
1209-1213, abril 1973. Además, esta técnica se
describe en el Manual "Molecular cloning: a laboratory manual"
Clonación molecular: un manual de laboratorio), ed. T. Maniatis,
publicado por Cold Spring Harbor.
Por lo tanto, se prefiere que la secuencia
reconocedora tenga una estructura de ADN o APN que sea específica
al sitio deseado en el genoma. Dichas estructuras se pueden
sintetizar de manera relativamente sencilla.
Según otra realización preferente, se prefiere
que la enzima deseada tenga una Km baja. De esta manera, la enzima
realizará únicamente su función si está unida a ADN. En el caso de
que la enzima no esté unida al ADN, no será capaz de realizar su
actividad. Según una realización preferente, se prefiere que la
enzima contenga el denominado "interruptor conformacional".
Dicho interruptor conformacional procura que la enzima no sea
activa sin que el ADN se una al sitio deseado. La razón para esto es
la estructura de proteína que en cualquier otro caso se pliega de
manera inadecuada.
A efectos de facilitar un buen transporte de
enzimas modificadoras de ADN a la célula, dichas enzimas
modificadoras de ADN se combinarán preferentemente con el vehículo
que es una molécula SAINT o una combinación de moléculas SAINT.
Opcionalmente, con éstas se pueden presentar compuestos
adicionales.
Es particularmente preferente que la molécula
SAINT interaccione a través de un enlace de hidrógeno. La molécula
SAINT envuelve la secuencia reconocedora y la enzima que está unida
covalentemente a la secuencia reconocedora. La molécula SAINT en sí
no está unida a las enzimas modificadoras de ADN, sino que
simplemente interacciona entre ellas a través del enlace de
hidrógeno. Este enlace de hidrógeno se vuelve más débil cuando el
complejo entra en contacto con el contenido de la célula después de
la fusión con la membrana celular.
La secuencia de ADN, que se basa en un
oligonucleótido de 21 unidades (esto significa una cadena de 21
unidades), PNA u otra entidad, es específica para el genoma humano.
Las 21 unidades sólo aparecen una vez. De manera destacada, cuatro
elevado a la 21ª potencia es mucho mayor que el tamaño del genoma
humano. Tan pronto como se une la TFO, la enzima se plegará
alrededor del ADN y realiza su función. Sin embargo, el
oligonucleótido permanecerá unido al ADN, asegurando de este modo
que la enzima pueda realizar su función únicamente una vez. En el
momento que se divide la célula, se "limpiará" el ADN de estas
proteínas no comunes, la enzima se eliminará y se degradará a
través de la ruta habitual de la ubiquitina.
Claims (3)
1. Vehículo para el transporte de una
enzima/molécula modificadora de ADN al núcleo, que se
caracteriza porque la enzima modificadora de ADN está
combinada con una molécula SAINT o una combinación de diversas
entidades de la misma.
2. Vehículo, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la molécula SAINT está unida a la enzima
modificadora de ADN mediante un enlace de hidrógeno.
3. Utilización in vitro de una molécula
SAINT en combinación con la enzima modificadora de ADN, según la
reivindicación 1 y 2, para el transporte de la enzima a la célula y
al núcleo de la misma.
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