KR20070053853A

KR20070053853A - 단백질 티로신 포스파타아제 카파를 분석하는 방법

Info

Publication number: KR20070053853A
Application number: KR1020050111580A
Authority: KR
Inventors: 고정헌; 김용삼; 강혜연; 오세정; 손호성; 조은위; 유종신; 김진영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-11-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2007-05-28
Also published as: KR100771139B1

Abstract

본 발명은 종양 발생 및 전이에 관여하는 단백질 티로신 포스파타아제 카파(Protein Tyrosine Phosphatase kappa; 이하 "PTPκ")의 당쇄 변화를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 종양의 발생과 전이에 관여하는 PTPκ의 N-연결형 당쇄 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다.

당단백질, 측정, 당쇄

Description

단백질 티로신 포스파타아제 카파를 분석하는 방법{An analyzing method for measuring the changes of glycosylation of PTPκ}

도 1은 N-연결형 당쇄와 당전이효소가 촉매하여 얻어지는 당쇄, 그리고 렉틴 L-PHA가 인식하는 당쇄 가지를 나타낸 모식도이다.

도 2는 당전이효소 GnT-V에 의해 β1,6 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 부가되는 반응을 나타낸 모식도(A)이고, 대장암 세포주 WiDr이 상대적으로 GnT-V(N-acetylglucosaminyltransferase-V; 이하 "GnT-V")의 발현이 낮으며 과발현 세포주의 구축시 GnT-V가 높게 발현됨을 보여주는 노던 블럿(Northern-Blot)결과(B)이며, 대장암 세포주 두 가지(대조구(Mock), GnT-V 과발현 세포주)의 무혈청 배양액을 렉틴 LCA-아가로스 컬럼으로 정제한 후, 2차원 전기영동과 L-PHA 블럿팅을 수행한 사진(C)이다.

도 3은 ESI/Q-TOF을 이용하여 PTPκ의 아미노산 서열을 결정한 한 크로마토그램의 예(A)를 제시한 것이며, 각각의 펩타이드에 대한 서열결정 데이터(B)를 제시하고 있다.

도 4A는 GnT-V에 의해 당쇄가 부가된 PTPκ의 엑토도메인이 떨어져나오는 것을 보여주는 그림이고, 위상차 현미경 하에서 PTPκ의 엑토도메인이 떨어져 나옴으 로 인하여 세포가 염색되지 않고 있음을 제시한 것(B)이고, GnT-V가 과발현되는 세포주에서 PTPκ의 당쇄에 β1,6-N-아세틸글루코사민이 부가됨을 이를 인식하는 렉틴 L-PHA를 통해 확인하였고(C), PTPκ, GnT-V 그리고 PTPκ의 siRNA를 이용하여 여러 변화를 준 결과, 암의 발생에 중요한 이동성(migration)의 차이를 보여주었다(D).

도 5는 세포 간 PTPκ에 의한 단선결합(homophilic binding)과 GnT-V가 매개하는 억제 정도를 보여주는 모식도이다.

본 발명은 종양 발생 및 전이에 관여하는 단백질 티로신 포스파타아제 카파(Protein Tyrosine Phosphatase kappa; 이하 "PTPκ")의 당쇄 변화를 측정하여 분석하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 종양의 발생과 전이에 관여하는 PTPκ의 N-연결형 당쇄 변화를 측정하고 이 당쇄 변화로 인하여 세포막에서 떨어져나오는(shedding) 정도를 확인하는 방법에 관한 것이다.

단백질의 기능을 분석하기 위한 방법으로는 오래전부터 전기영동 방법의 일종으로 2차원 전기영동 방법이 많이 사용되어 왔으나 최근 들어 MALDI-TOF와 같은 질량분석기기의 발달과 N-말단 아미노산 서열 결정이 쉬워지면서 포스트 게놈 (Post-Genome) 시대의 기능 분석 방법으로서 프로테오믹스(proteomics)가 등장하였다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에 대하여 정지된 한 시점이 선택적으로 분석되므로 복잡한 신호 전달의 결과로 발생하는 것으로 알려진 종양에 대한 연구에는 어느 정도 한계를 지니고 있으며, 실제 단순 염색에 의해 새로운 스팟(spot)의 출현보다는 신호전달의 결과물로서 단백질 발현량의 증가나 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)이라는 양상으로 나타나는 것이 일반적이다.

특히 2차원 전기영동 상에서 펼쳐지는 단백질 중 신호전달과 관련되는 단백질은 대단히 소량이어서 단순 염색에 의해서는 고도화된 분석이 어려운 실정이다. 이러한 어려움을 극복하고 분석 상의 차이점을 번역 후 변형의 관점에서 광범위하게 확인할 수 있는 분야가 단백질의 당질화(glycosylation)이다. 대조군과 비교할 때 일반적인 전기영동으로는 스팟(spot)의 차이를 발견할 수 없는 경우에도 당쇄의 변화를 렉틴(lectin)으로 분석하면 더 세밀하게 달라진 양상을 관찰할 수 있다.

최근 들어 이런 당쇄의 변화를 이용하는 분석을 프로테오믹스와 대비하여 "글리코믹스(glycomics)"라 하며, 이는 이미 진행되고 있는 프로테오믹스의 분석 상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 분석방법으로서, 번역 후 변형(PTM) 중 단백질의 당질화 변화를 추적하는 것이다.

발암 및 전이의 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질에 암 유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받아 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 일어나 세포 간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암 전이를 일으킨다(Hakomori and Kannagi, 1983, J. Natl . Cancer Inst., 71:231-251; Feizi, 1985, Nature, 314:53-571). 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)에서 만들어질 때 당단백질의 경우 소포체에서 기본적인(core) 당쇄가 만들어진다. 이어 세포 내 당질화 공장인 골지체로 이동하여 세포 내·외부의 여러 자극과 신호에 따라 여러 당쇄가 부가되는데 잘 알려진 당쇄 가지와 이를 촉매하는 당전이효소를 표현한 것이 도 1이다. 외부 영향에 의해 특정 암 유전자 ras, raf 전사인자 ets 등의 신호전달을 거쳐 도 1의 여러 당전이효소가 활성화된다. 여러 효소 중 N-연결형 당쇄의 아스파라긴(Asn)에 가까운 쪽으로 퓨코스(fucose)를 부가하는 당전이효소 FUT8은 최근에 정제된 효소로서 암의 전이와 연관되어 부각되고 있다. 당단백질 중 퓨코실레이션(fucosylation)과 연관하여 암의 발전단계에 따라 발현이 증가하거나 당질부위의 변화를 보여주는 표식 인자로 α-피토프로테인(α-fetoprotein;"AFP"), 안티트립신(antitrypsin) 등이 이미 알려져 있다(Miyoshi, E., Ko, J. H. et al . (1999) Biochim . Biophys . Acta 1473:9-20). 최근에 이 퓨코실레이션에 관여하는 효소 FUT8이 일본의 다니구치(N. Taniguchi) 등에 의해 정제되고 그 cDNA 서열이 밝혀졌으며 특히 α1,6-FucT의 과발현 세포주(hepatoma Hep3B-FT)를 면역결핍 생쥐(athymic nude mice)의 비장(spleen)에 주사하여 간 조직에서 암전이 정도를 검증한 결과 놀랍게도 대조군 세포(Hep3B)에 비하여 암 조직이 거의 발견되지 않았다(Miyoshi,E., Ko, J. H. et al . (1999) Cancer Research 59:2237-2243). 이 N-연결형 당쇄의 안쪽에 붙은 퓨코스(fucose)는 렉틴 LCA에 의해 인식되는데 그 특이성은 높지 않아 렉틴 Con A처럼 N-연결형 당쇄의 코어 부분을 확인하는데 주로 쓰인다.

한편, 당전이효소 GnT-V(N-acetyl glucosaminyl transferase-V)는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 공격(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 소포체(endoplasmic reticulum)에서 아주 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 도 1에서 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)하여 암을 유발하게 된다.

GnT-V는 1987년 데니스 등에 의해 이런 β1,6의 가지가 암 조직이나 암이 전이가 일어날 때 높은 정도로 나타남이 보고되면서 생물학적 의미가 부각되었다(Dennis, et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 세포 표면 단백질인 gp130이 GnT-V의 주목표 단백질 중의 하나인데 β1,6 N-아세틸글루코사민 부가가 높은 전이 활성이 있음이 밝혀졌으며, 또한 GnT-V가 적중(결손, knock-out)된 ES(embryonic stem) 세포주를 생쥐에서 구축하고, 상기 생쥐에 폴리오마바이러스(polyomavirus)의 중간(middle) T 항원(이하 “PyMT”라 약칭한다) 바이러스성 암유전자를 도입하여 암을 유발시키면 정상 생쥐에 PyMT만을 과발현시킨 생쥐에 비하여 PyMT에 의해 유도되는 암의 성장과 전이가 크게 억제됨을 확인하였고(Granovsky et al ., 2000, Nature Med ., 6:306-312), 동물 내에서 β1,6의 가지화가 쥐 유방암에서 높은 전이성을 보여주었다. 최근의 연구에서 33가지 유형의 검증된 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직에 대해 GnT-V의 활성을 분석한 결과 정상조직에 비하여 50배, 암 주변조직에 비하여는 4배의 높은 효소 활성이 관찰되었다(Yao et al., 1998, J Cancer Res . Clin . Oncol ., 124:27-307). 이렇듯 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 전이 과정에 관여하여 높은 전이 활성을 보이는 것으로 예측되고 있다. 이 GnT-V 효소는 사람의 폐암세포 및 쥐의 신장에서 정제된 이래, cDNA 클로닝, 게놈상의 구조 및 프로모터 영역의 해석이 이루어졌다(Gu et al ., 1993, J Biochem, 113:614-619; Soreibah et al ., 1993, J Biol . Chem ., 268:15381-15385; Kang et al ., 1996, J. Biol . Chem ., 271:26706-26712). 본 발명자들도 전사인자인 ets-1이 GnT-V의 발현에 크게 관여함을 보고하였다(Ko, et al ., 1999, J. Biol . Chem ., 274(33):22941-22948). 대장암의 경우는 동양인의 식생활이 서구화되면서 발병률이 높아가는 암으로서 대장 내시경 등의 어려운 진단 방법을 이용하고 있어 진단과 예방의 측면에서 혈액이나 뇨 등에서 간단히 검출해낼 수 있는 진단방법이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 암이 유발된 세포에서 당전이효소 GnT-V에 의해 부가된 β1,6-N-아세틸글루코사민이 부가된 당단백질을 검출하고 이를 질량분석기로 아미노산 서열을 분석하여 당쇄 변화를 나타내는 여러 당단백질을 발견하고, 세포 밖의 배양액에서 PTPκ의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 발명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질 PTPκ의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 반드시 여기에 포함되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.

본 발명은 정상세포와 비교하여 암세포 및 전이된 세포에서 N-연결형 당쇄변화인 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지 변화를 나타내는 단백질의 당쇄가지 변화를 측정하는 방법을 제공한다. β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄를 만드는 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 발생과 전이에 관여하고, 상기 GnT-V에 의해 부가되는 β 1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄는 렉틴 피토해마글루티닌(Phytohaemagglutinin)-L₄(이하 "L₄-PHA"라 약칭한다)에 의해 검출된다.

본 발명은 대조구 및 분석구 세포에 PTPκ에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 PTPκ를 분석하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 대조구 및 분석구의 세포 배양액에 PTPκ에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 PTPκ를 분석하는 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법들에 부가적으로 대조구 및 분석구의 세포 배양액에 렉틴 L₄-PHA를 첨가하여 렉틴 염색법(lectin blotting)을 수행함으로써 PTPκ를 좀더 정밀하게 분석하는 방법에 관한 것이다.

또한, 상기 분석 방법들에 있어서 PTPκ에 대한 항체는 PTPκ의 엑토도메인을 인식하는 항체인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 분석 방법들에 있어서 PTPκ에 대한 항체는 PTPκ의 세포질 펩타이드, 좀더 바람직하게는 627-640 펩타이드를 인식하는 항체인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 PTPκ에 대한 항체가 흡착된 기질, PTPκ에 대한 동일 항체, 리간드가 결합된 L₄-PHA, 발색 효소로 표지된 2차 항체 및 발색 효소로 표지된 상기 리간드의 수용체를 포함하는 대장암 진단용 ELISA 키트에 관한 것이다.

상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴 리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 발색효소는 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈 등을 들 수 있다.

또한, 상기 리간드와 리간드 수용체의 일례로서 리간드는 바이오틴이고, 리간드 수용체는 아비딘을 들 수 있다.

또한, 상기 ELISA 키트에는 ABTS[2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-Phenylenendiamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)와 같은 발색기질액을 추가적으로 포함시킬 수 있다.

암의 전이는 세포 간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로, 암을 진단할 수 있는 초기 표식 인자들은 혈액이나 소변 등의 체액의 진단을 통해서 암 진단이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 대장암 특이적인 종양표식 인자를 찾아내기 위하여 GnT-V 발현이 상대적으로 낮은 대장암 세포주 WiDr을 대조구로 사용하였으며, GnT-V를 과발현하는 세포주인 GnT-V/WiDr을 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서 글리코믹스(Glycomics)를 수행하였다. 본 발명에서는 전이된 암세포 배양액에 대하여 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하고, 각각 2장의 겔을 확보한 다음 한 장은 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 다른 한 장은 렉틴 블럿팅(lectin blotting)을 수행하여, 정상세포와 비교하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄 변화를 일으키는 단백질을 선별하였다(도 2 참조). β1,6 N- 아세틸글루코사민 가지를 인식하는 렉틴 블럿을 수행한 결과 대조군에 비하여 암세포의 경우 몇 군데에서 진한 강도의 스팟이 나타났는데, 상기 스팟에 해당하는 단백질이 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄 변화를 나타내는 단백질이다.

겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내고, 단백질을 절단한 후 절단된 펩타이드를 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF(Quadrupole Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하고, 기존의 단백질 데이터베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였고, 각각의 서열과 분자량, 등전점 등을 분석하였다(표 1 참조).

번호(Accession No.)	단백질	분자량/pI^ａ	매치되는 펩타이드	Coverage(%)	Total score^ｂ
NP 002284	라미니닐 전구체 (Lamininyl precursor)	177.5/5.0	15	12.3	764
NP 002835	단백질 티로신 포스파타아제 카파(PTPk)	166.0/5.6	4	3.96	289
AAC 61477	카뎁신 Ｘ 프리프로테인 (Cathepsin X preprotein)	33.9/7.1	7	28.0	291
AAA 51547	α1 안티트립신 (α1 antitrypsin)	46.7/5.5	15	45.2	918
CAA 42438	Zn-α2-글리코프로테인 (Zn-α2-glycoprotein)	34.7/5.7	7	31.7	260
NP 001822	클러스테린 (Clusterin)	52.5/5.9	4	13.5	139
NP 005558	갈렉틴 3 결합 단백질 (Galectin 3 binding protein)	65.3/5.1	3	4.20	79
NP 005338	열충격 70kDa 글리코프로테인 5(Heat Shock 70kDa glycoprotein 5)	72.3/5.1	24	48.4	1248
T 46243	이론적 단백질 (hypothetical protein)	84.8/5.3	7	11.2	229
NP 005572	B-세포 접합분자 (B-cell adhesion molecule)	67.3/5.5	5	10.6	187
AA 354765	프롤일 4-하이드록실라제 (Prolyl 4-hydroxylase)	57.1/5.3	14	55.9	845
NP 002067	N-아세틸글루코사민-6-설파테이즈 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase)	62.0/8.6	6	15.0	245
AAA 51827	N-아세틸-α글루코사미니다제(N-acetyl-α-glucosaminidase)	56.2/4.9	10	25.5	561
NP 000512	N-아세틸-β글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase)	63.1/6.3	18	39.9	656

a; 상기 표 1에서 분자량 및 등전점 pI는 글리칸(glycan) 잔기를 계산에서 고려하지 않았을 때의 이론값이다.

b; 단백질을 구성하는 전체 아미노산중 질량분석기로 서열이 확인된 아미노산의 비율을 의미한다.

c; Total score는 각 개별 펩타이드에서 얻어진 스코어 값의 합이며 각 스코어는 -10xLog(P)이다. 여기서 P는 NCBInr 데이터베이스에 대해서 블라스트(blast)하였을 때의 결과가 우연의 사건일 확률을 의미한다.

그 중 단백질 티로신 포스파타아제 카파(Proteins tyrosine phosphatase kappa; 이하 “PTPκ")는 수용체(receptor) 유형의 단백질 티로신 포스파타아제(PTP)이며, MAM 도메인과 4개의 피브로넥틴(fibronectin) III 반복으로 특징지어지는 PTPμ의 서브패밀리(subfamily)로서 전형적인 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)에 속한다. PTPκ는 기질의 탈인산화와 세포들의 단선 결합(homophilic binding)을 매개하는 두 가지의 기능을 지니고 있다. 단선 결합의 방해는 암의 발생과 전개에 아주 밀접하게 연관되어 있다. PTPμ의 MAM 도메인과 Ig 도메인은 수평적 이중화(dimerization)과 PTPμ의 위치화를 통해 단선 결합에 결정적으로 기여하게 된다(Del Vecchio, R.L. et al 2005 J. Biol . Chem . 280, 1603-1612; Cismasiu, V.B., et al 2004, J. Biol . Chem . 279, 26922-26931). MAM 도메인과 Ig 도메인이 PTPκ에서도 동일한 역할을 할 것으로 예상되며 이들 도메인은 내피 세포를 포함한 여러 세포에 산재해 있는데, 내피 세포 유래 세포에서 단선 결합에 중요한 역할을 담당하는 것으로 예측된다. 이를 증명하기 위하여 본 발명은 다음의 실시예를 통해 PTPk가 대장암 세포주 WiDr에서 단선 결합에 관여함을 제시하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 무혈청 배지 유래의 당단백질 정제, 2차원 전기영동

이런 배경에서 GnT-V/WiDr 세포주를 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서의 프로테오믹스(Proteomics)를 시도하였다. 즉 도 2B에 나타나 있듯이 세포주 자체는 GnT-V의 발현이 낮으나 GnT-V를 과발현한 세포주는 계란의 배장요막 (CAM)을 이용한 암전이 활성 조사에서 대단히 높은 혈관신생(암전이 효과)을 보여 주었다(Ko J H et al, 미공개 결과). 암의 전이는 세포 간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로 무혈청 배지 배양액에 대하여 집중적으로 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하였다. 이는 암을 진단하는 초기 표식 인자들은 혈액이나 소변 등 체액의 검사를 통해서만 인식 가능하기 때문에 세포 밖으로 분비되어 나오는 단백질에 집중하였다. 대조구(Mock:WiDr) 세포주와 GnT-V:WiDr 과발현 세포주를 10%의 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI(Gibco BRL사) 배지에서 성장시켰다. GnT-V를 과발현하는 세포주는 미국의 ATCC(American Type Tissue Culture)사에서 구입한 대장암 세포주 WiDr에 진핵세포 과발현 플라스미드(Ko, et al., 1999, J Biol Chem., 274(33):22941-22948)와 여기에 당전이효소 GnT-V를 도입한 후 세포에 감염(transfection)시키고 350㎍/㎖ 농도로 G418을 처리한 후 생성된 콜로니로부터 RNA를 분리하여 GnT-V 단편 cDNA를 이용한 노던 블럿으로 탐색, GnT-V 과발현 세포주를 확립하였다. 2,3일 후 CO₂ 배양기(incubator)에서 80% 정도 세포가 바닥을 덮었을 때(confluent) PBS(phosphate buffered saline)로 2회 이상 씻어 잔존 혈청을 제거하였다. 이어 혈청을 포함하지 않는 RPMI 배지를 넣고 48시간 배양한 후 배양액을 수거하였다. 최종농도 20mM Tris-HCl, pH 7.5가 되게 완충용액을 가한 후 N-연결형 당쇄에서 중심(core) 당쇄를 인식하는 렉틴 LCA가 붙어있는 LCA-아가로스 컬럼에 로딩하였다. 동일 완충용액으로 충분히 씻어주고 280nm의 흡광도가 0.03 이하가 되었을 때(더 이상 단백질이 흘러나오지 않을 때) 0.4M의 메틸만노사이드(metylmannoside)를 가하여 당단백질을 용출시켰다. 이 용액을 밤새 투석하여 메틸만노사이드를 제거한 후, TCA(trichloroacetic acid)를 포함하는 아세톤을 최종 10%가 되게 가하여 단백질만을 침전시켰다. 아세톤으로 3회 이상 씻어 잔류 TCA를 제거하고 말린 다음 겔 로딩 완충용액(8M Urea, 2% Triton X-100, 20mM DTT, 0.5% carrier ampholyte, Bromophenol Blue dye)을 가하여 녹였고, 1차원 전기영동 장치(Multiphor-II, Pharmarcia사)를 이용하여 1차원 전기영동을 실시하였다(13cm drystrip pH 3-10). 상기 전개된 1차원 전기영동 겔을 SDS와 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 평형 완충용액으로 평형화시킨 후 2차원 전기영동 장치(Protean Ⅱ, Bio-Rad사)를 이용하여 12% 폴리아크릴아미드에서 2차원 전기영동을 실시하였다. 각각 2장의 겔을 확보한 다음 한 장은 바이오세이프(Biosafe, Bio-Rad사) 염색액을 이용하여 쿠마지 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색하였다(도 2C). 또 다른 한 장은 반건조 이동장치(Semi-Dry transfer, Bio-Rad사)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 바이오틴(Biotin) 표지된 L-PHA 렉틴을 가하여 이 가지를 지닌 당단백질에 붙도록 한 후 HRP 표지된 스트렙타비딘(Streptoavidin)을 붙이고 ECL 형광반응을 이용하여 필름에 감광시켰다. 대조구(Mock:WiDr)와의 직접적인 비교를 위하여 동일 조건에서 1차원(등전점 분리) 전기영동을 시도하고 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색한 것이 제2C도이며, 겔의 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켜 GnT-V의 산물 특이적인 렉틴 L₄-PHA로 블럿팅을 수행하였다.

< 실시예 2> ESI /Q- TOF 질량 분석기를 이용한 단백질의 서열분석

제2C도의 렉틴 블럿, 즉 엑스레이(x-ray) 필름에 감광되고 난 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 다시 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하여 감광된 필름에 붙여 스팟(spot)의 정확한 위치를 확인하고 처음부터 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색된 겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내었다. 30%의 메탄올과 100% 아세토나이트릴을 이용하여 탈색 후 10U의 트립신(Promega사)을 가하여 밤새 37℃에서 절단하였다. 절단된 펩타이드를 아세토나이트릴로 추출한 후 원심 동결 건조기로 건조하고 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF (Quadruple Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하였다. ESI는 각 펩타이드를 분리해주는 효과가 있으며 연속질량 분석(tandom mass)은 서열분석이 가능하도록 구성된 장치이다. 제3도는 동정된 PTPκ의 예로서 정확하게 아미노산 서열이 어떻게 분석되는지를 제시하고 있다. 결정된 서열은 단백질의 데이터베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였으며, 표 1은 각 단백질의 분자량(MW), 등전점(pI) 그리고 들어맞은 펩타이드의 수 등을 제시하고 있다.

< 실시예 3> PTP κ의 세포질 부위를 인식하는 항체의 제작 및 웨스턴 블럿(western blot )

동정한 단백질 중 단백질 티로신 포스파타아제 카파(PTPκ)는 수용체 유형의 PTP로서 MAM 도메인과 4개의 피브로넥틴 III 반복으로 특징지어지는 PTPμ의 서브패밀리로서 전형적인 세포 접합 분자에 속하며, 기질의 탈인산화와 세포들의 단선 결합을 매개하는 두 가지의 기능을 지니고 있으므로, 이 PTPκ에 대해 ‘잘못된 당질화’가 어떤 기능을 가지는지 조사하였다. 즉, PTPκ에 암과 연관되어 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화를 알려주는 직접적인 보고는 현재까지 발표되지 않았으므로 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지 부가로 인한 생물학적 활성 변화가 본 발명의 주요 골자이다. PTPκ가 무혈청 배양액에서 발견되었다는 사실은 이 효소가 수용체 유형 막관통 단백질이라는 근거에 비추어 보면 ‘잘못된 당질화’로 인하여 막의 바깥부분(이하 '엑토도메인(ectodomain)')이 떨어져 나왔음을 제시해 준다. 이미 시판되는 항체가 PTPκ 엑토도메인을 인식하므로, PTPκ의 아미노산 서열에서 세포질 부분에 해당하는 펩타이드를 이용하여 토끼에서 항체를 제작하였다(Peptron, 대전). 즉 ⁶²⁷CEERPRRTKKTTEIL⁶⁴⁰의 세포질 펩타이드(cytosolic peptide)를 합성하고 이에 대한 항체를 제작하여 대조구(WiDr:Mock)와 GnT-V 과발현 세포주(WiDr:GnT-V) 및 그 배양액에 대하여 웨스턴 블럿(Western Blot)을 수행하였다. 그 결과 도4의 A에서 보여 주듯이 대조구에서는 거의 모든 PTPκ가 세포주에 남아있는 반면(즉 세포에 있는 반면) GnT-V 과발현 세포주의 경우에는 엑토도메인(ectodomain)이 배양액에 있음을 확인하였다. 이를 또 다른 방법인 면역조직화학(immunocytochemistry) 방법으로 확인한 것이 도 4의 B이다. 즉 대조구의 경우 많은 PTPκ가 세포에 남아 있어 염색이 잘 되는 반면 GnT-V 과발현 세포주의 경우는 엑토도메인이 잘려나가 상대적으로 거의 염색이 되지 않음을 확인하였다. 또한 잘려나간 엑토도메인에 GnT-V에 의해 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지가 부가되었는지를 확인하기 위하여 이 가지를 인식하는 렉틴 L-PHA로 블럿팅을 수행하였다. 전개된 SDS-PAGE 겔을 반-건조 이동장치(Semi-Dry transfer, Bio-Rad사)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄를 인식하는 바이오틴(Biotin) 표지된 L-PHA 렉틴을 가하여, 상기 가지를 지닌 당단백질에 붙도록 한 후 HRP-표지된 스트렙타비딘(Streptoavidin)을 붙이고 ECL 형광반응을 이용하여 필름에 감광시켰다(도 4C). 그 결과 GnT-V 과발현 세포주에서 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 부가가 현저함을 확인하였다.

< 실시예 4> PTP κ의 당쇄 변이에 따른 세포의 이동 활성 조사

실시예 3의 결과를 통해 PTPκ가 β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄의 부가로 인해 세포막에서 떨어져 나온다는 사실을 확인하였다. 이러한 떨어져 나옴이 PTPκ의 단선 결합이나 세포의 이동성에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 우선 PTPκ의 cDNA를 과발현하는 벡터를 구성하고 세포주에 한시적(transient)으로 감염(transfection)시키거나, 사람 PTPκ의 5‘-ATGCCAACTCGATCATTGG-3' 서열을 대상으로 하는 siRNA 발현 벡터를 구축하고 세포주에 도입해 보았다. 세포의 이동성 조사(cell migration assay)는 8 ㎛ 포어 크기의 폴리카보네이트 인서트(polycarbonate insert)가 있는 12-웰 트랜스웰 챔버(Corning Inc)를 이용하여 실시하였다(Guo, H.-B.,et al, (2002) Cancer Res . 62, 6837-6845). 막의 구멍을 통해 아래로 이동한 세포를 메탄올로 고정하고 톨루이딘 블루(Toluidine blue)로 염색한 후 400배 위상차 현미경에서 그 개수를 세어 확인하였다. 세포의 이동성 조사(cell migration assay)를 통해 확인한 결과 대조구 세포주에서 PTPκ의 발현은 아주 낮거나 역으로 이동성이 조절되었고 PTPκ의 절단도 거의 관찰되지 않았다. 따라서 PTPκ의 발현 억제(siRNA)나 과발현이 세포의 이동성에는 별 영향을 주지 않고 있으며 이 결과로 세포 간의 접착(adhesion)에서 적어도 부분적으로라도 원형의 PTPκ가 단선 결합에 관여함을 알 수 있다. 반면, GnT-V 과발현 세포주에서는 잘못된 PTPκ(aberrant PTPκ)가 과발현되어 PTPκ가 매개하는 세포 간 접착이 느슨하게 되어 그 결과로 세포의 이동성이 증가하게 되었다(도 4D). 이 단선 결합 능력의 약화는 PTPκ의 엑토도메인 유실에 의한 것으로 사료되며 잘려나간 엑토도메인이 세포 간 접착의 저해제로 작동하는 것으로 보인다. 이상의 결과를 집약하면 PTPκ는 정상적일 때, 세포 간 단선 결합에 관여하여(도 5) 세포 간 접착을 이루는데, 암이 발생하고 전이과정에서 세포의 신호를 받아 GnT-V의 발현이 늘게 되면 그때 "잘못된 당질화"가 일어나 엑토도메인이 잘려나감으로 인해 세포 간 접착이 줄어 세포의 이동성(migration)이 커지고 궁극적으로 공격(invasion)의 전단계를 수행하는 과정을 거치고 있음을 추측할 수 있다. 따라서 세포 밖으로 분비되는 배양액 혹은 사람의 경우 혈액에서 떨어져 나온 PTPκ의 양과 잘못된 당질화 정도를 측정하면 암의 발생과 전이과정을 예측해 낼 수 있는 것이다.

<실시예 5> ELISA법을 이용하여 절단된 PTPκ의 정량 및 당쇄 변이 조사

세포 배양액이나 사람의 혈청으로부터 PTPκ를 포함하는 시료를 준비하였다. 96-웰 플레이트에 PTPκ 단일항체를 첨가하여 한 시간 동안 결합시켰다. PBS로 세 번 세척한 후 1% BSA 용액으로 37℃에서 한 시간 동안 웰을 블로킹했다. 다시 PBS로 세 번 세척한 후 시료를 37℃에서 한 시간 동안 결합시켰다. PBS로 세 번 세척한 후 A 그룹의 웰에는 PTPκ의 또 다른 항체를 처리하고 B 그룹의 웰에는 비오틴이 결합된 L₄-PHA를 처리했다. 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 0.05% Tween 20-TBS로 세 번 세척했다. A 그룹 웰에는 HRP-결합된 IgM 2차 항체를, B 그룹 웰에는 HRP-결합된 아비딘을 처리한 후 37℃에서 한 시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20-TBS로 세 번 세척한 후 기질을 첨가하여 ELISA 판독기로 형광 또는 형광을 측정하였다.

위에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질 PTPκ의 당쇄 변화를 측정하는 방법은 대장암을 비롯한 암의 효과적인 진단에 중요한 단서를 제공한다. 또한 PTPκ는 다른 PTP와는 달리 뇌, 신장, 간, 비장, 전립선, 난소 등에서 폭넓게 발현되는 단백질이므로 (Jiang, Y. et al. 1993 Mol . Cell . Biol . 13, 2942-2951; Yang, Y. et al. 1997 Gene 186, 77-82) 대장암 외 다른 암의 진단에 확대 적용할 수 있을 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> An analyzing method for measuring the changes of glycosylation of PTPk <130> iniKRIBB05001 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Glu Glu Arg Pro Arg Arg Thr Lys Lys Thr Thr Glu Ile Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Leu Gln Gly Thr Ser Phe Glu Asn Ile Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ser Gly Val Ser Asn Phe Ala Gln Leu Ile Val Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Trp His Leu Asp Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Ile Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Ser Glu Glu Thr Ile Ile Gln Thr Asp Glu Asp Val Pro Gly Pro 1 5 10 15 Val Pro Val Lys 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgccaactc gatcattgg 19

Claims

대조구 및 분석구 세포에 PTPk에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 PTPk를 분석하는 방법
대조구 및 분석구의 세포 배양액에 PTPk에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 PTPk를 분석하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 부가적으로 대조구 및 분석구의 세포 배양액에 렉틴 L₄-PHA를 첨가하여 렉틴 염색법(lectin blotting)을 수행하여 PTPk를 분석하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, PTPk에 대한 항체는 PTPk의 엑토도메인을 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 PTPk를 분석하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, PTPk에 대한 항체는 PTPk의 세포질 펩타이드를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 PTPk를 분석하는 방법.
제5항에 있어서, PTPk의 세포질 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 PTPk를 분석하는 방법.
PTPk에 대한 항체가 흡착된 기질, PTPk에 대한 동일항체, 리간드가 결합된 L₄-PHA, 발색효소로 표지된 2차 항체 및 발색효소로 표지된 상기 리간드의 수용체를 포함하는 암 진단용 ELISA 키트.
제7항에 있어서, 상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 ELISA 키트.