KR20070046099A

KR20070046099A - 항혈소판약 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20070046099A
Application number: KR1020077002809A
Authority: KR
Inventors: 고지 사토; 쇼우코 요시다; 쯔토무 야기; 겐지 사쿠라타니
Original assignee: 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2007-05-02
Also published as: AU2005268058A1; IL180988A0; EP1775293A1; NO20070986L; EP1775293A4; CA2574626A1; US20090137600A1; WO2006013962A1; MX2007001566A; RU2007108297A; JPWO2006013962A1; CN101072769A

Abstract

혈소판 응집 억제작용을 가지고, 물성, 경구 흡수성이 우수한 화합물의 제공.

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물 및 그의 제조법.

혈소판 응집 억제작용, 경구 흡수성, 항혈소판약

Description

항혈소판약 및 그의 제조방법{Antiplatelet agent and process for producing the same}

본 발명은, 혈소판 응집억제약(platelet aggregation inhibitor)으로서 유용한 피라졸 유도체(pyrazole derivative)와 그의 제조방법에 관한 것이다.

혈소판은, 혈관 손상시에 응집하여 지혈 혈전(thrombus to stop the bleeding)을 형성하여 출혈을 방지하는 중요한 역할을 담당하고 있지만, 그 한편으로, 혈관 내의 혈관 내피(vascular endothelium)가 손상된 부위, 협착된(constricted) 부위 등에는, 응집하여 혈전이나 색전(embolus)을 유발한다. 이들 혈전이나 색전이 원인이 되어, 심근경색(myocardial infarction), 협심증(angina pectoris), 허혈성 뇌혈관 장애(ischemic cerebro vascular disorder), 말초혈관 장애(peripheral vascular disorder) 등의 허혈성 질환이 발생된다. 따라서, 허혈성 질환의 예방이나 치료에는, 혈소판 응집억제약이 사용되고 있다. 그 중에서도, 저용량의 아스피린(aspirin)은, 예전부터 혈소판 응집억제약으로서 사용되어 오고 있고, 그 효과는 10만명의 환자에게 투여된 복수의 임상시험 결과를 메타분석(metaanalysis)된 APT(Antiplatelet Trialists' Collaboration)로 증명되어 있다(비특허문헌 1 참조).

그러나, 아스피린에는, 위장 등의 출혈, 이른바 아스피린 궤양(aspirin ulcer)을 일으킨다고 하는 부작용이 알려져 있고, 그 부작용은 투여량에 의존하지 않으며, 100명에 1명 비율로 발생하고 있다(비특허문헌 2 참조).

아스피린의 혈소판 응집억제작용은, 시클로옥시게나아제(Cyclooxygenase)의 억제작용을 토대로 한 것이 알려져 있다. 시클로옥시게나아제에는, 시클로옥시게나아제-1(COX-1)과 시클로옥시게나아제-2(COX-2)가 있는데, 아스피린은, 저용량으로 COX-1을 선택적, 비가역적으로(irreversibly) 저해하여 혈소판의 응집을 억제하지만, COX-1을 저해하는 것이 아스피린 궤양을 일으키는 원인으로도 되어 있다(비특허문헌 3 및 4 참조).

이상과 같이, 아스피린은 혈소판 응집억제약으로서 유용하지만, 그 작용 메커니즘(mechanism)인 COX-1 저해작용을 토대로 한 위장장애를 부작용으로서 수반하기 때문에, COX-1 저해작용이 없는 혈소판 응집억제약이 요구되고 있다.

또한, 비스테로이드성 항염증약(nonsteroidal anti-inflammatory drug)은, COX-2를 선택적으로 저해하여 항염증 작용을 나타내는 것이 알려져 있다. 어떤 종류의 선택적인 COX-2 저해약에 대해서는, 심혈관(cardiovascular)에 대한 부작용이나 혈전증을 일으키는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5~7).

한편, 지금까지 항혈전작용을 가지는 피라졸 유도체로서는, 화합물(A)(특허문헌 1 및 비특허문헌 8 참조) 및 화합물(B)(특허문헌 2 참조)가 알려져 있다. 그러나, 이들 화합물의 콜라겐 유발 혈소판 응집억제작용은, COX의 저해작용과 비교하여 강한 것은 아니기 때문에, 아스피린과 동일한 부작용이 발생할 위험성이 있는 것이 우려된다.

[화학식 A, B]

특허문헌 1: 일본국 특허 제2586713호 명세서

특허문헌 2: 국제공개97/29774호 팜플렛

비특허문헌 1: BMJ, 308권, 81-106 페이지, 1994년

비특허문헌 2: BMJ, 321권, 1183-1187 페이지, 2000년

비특허문헌 3: Neurology, 57권, Suppl. 2, S5-S7 페이지, 2001년

비특허문헌 4: Drugs Today, 35권, 251-265 페이지 , 1999년

비특허문헌 5: N. Eng. J. Med. 343권, 1520-1528 페이지, 2000년

비특허문헌 6: JAMA 286권, 954-959 페이지, 2001년

비특허문헌 7: Arthritis Rheum. 43권, 1891-1896 페이지, 2000년

비특허문헌 8: Chem. Pharm. Bull., 45권, 987-995 페이지, 1997년

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은, 강력하게 혈소판 응집을 저해하고, 물성(physical properties), 안전성, 경구 흡수성(oral absorbability) 등이 우수한 화합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은, 이와 같은 혈소판 응집억제약을 구하여 예의 연구한 결과, 어느 특정의 염으로 염화한 피라졸 유도체가, COX-1 및 COX-2를 저해하지 않고 강력하게 혈소판 응집을 저해하고, 추가로 높은 경구 흡수성, 양호한 안정성이라고 하는 의약품으로서 매우 우수한 성질을 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, 화학식 Ⅰa

[화학식 Ⅰa]

로 표시되는, [1-(6-메톡시피리다진-3-일-5-(피리딘-2-일)-1H-피라졸 3-일](4-메틸피페라진-1-일)메타논(이하, 화합물(Ⅰa)로 한다.)의 염산염(이하, 화합물(1b)로 한다.), 및 그의 L-주석산염(tartaric acid salt)(이하, 화합물(1c)로 한다.)을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 화합물과 제약적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 유효성분으로서 함유하는 허혈성 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기의 화합물을 유효량 투여하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환을 예방 및/또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 화합물의, 의약을 제조하기 위한 사용을 제공하는 것이다.

발명의 효과

본 발명의 화합물(1b) 및 화합물(1c)는, COX-1 및 COX-2를 저해하지 않고 강력하게 혈소판 응집을 억제하며, 혈전 형성을 저해하는 작용을 가지고, 또한 결정 안정성(crystal stability)이 높으며, 경구 흡수성도 양호하다. 따라서, 심근경색, 협심증(만성 안정 협심증, 불안정 협심증 등), 허혈성 뇌혈관 장애(일과성 뇌허혈 발작(transient ischemic attack)(TIA), 뇌경색 등), 말초혈관 장애, 인공혈관 치환 후 폐색(occlusion after replacement of a blood vessel with an artificial blood vessel), 관동맥 인터벤션(intervention of coronary artery)(관동맥 바이패스술(coronary artery bypass graft surgery))(CAGB), 경피경관 관동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty)(PTCA), 스텐트 유치(stent indwelling) 등) 후의 혈전성 폐색, 당뇨병 망막증·신증(nephropathy), 심장 인공판막 치환시 폐색(occlusion after replacement of a cardiac valve with an artificial cardiac valve) 등, 혈전·색전을 원인으로 하는 허혈성 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 또한, 혈관 수술, 혈액 체외 순환 등에 수반되는 혈전·색전의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 또한, 만성 동맥 폐색증에 수반되는 궤양, 동통(pain), 냉감(cold sensation) 등의 저해성 증상의 개선에 유용하다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 화합물(1b) 무수물의 X선 회절(도 1A) 및 열분석(thermal analysis)(TG/DTA)(도 1B)의 해석결과를 나타낸다.

도 2는, 화합물(1b) 2수화물의 X선 회절(도 2A) 및 열분석(TG/DTA)(도 2B)의 해석결과를 나타낸다.

도 3은, 화합물(1c) 무수물의 X선 회절(도 3A) 및 열분석(TG/DTA)(도 3B)의 해석결과를 나타낸다.

도 4는, 화합물(1a)(도 4A), 화합물(1b)(도 4B) 및 화합물(1c)(도 4C)의 흡탈습 거동(moisture absorption and desorption behavior)을 나타낸다.

도 5는, 화합물(1b) 경구투여 1시간 후의 기니피그(guinea pig) PRP에 있어서의 콜라겐 유발 혈소판 응집을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 형태

본 발명의 화합물(1a), (1b) 및 (1c)(각각, 화학식 Ⅰa, Ⅰb 및 Ⅰc로 표시된다.)는, 하기의 제조공정에 의해 제조할 수 있다.

본 제조공정에 대해서, 이하에 더욱 상세하게 기술한다.

아세틸피리딘(AP)와 옥살산 디메틸에스테르(DMO)를 나트륨알콕시드(나트륨메톡시드 또는 나트륨에톡시드) 존재하에, 알코올(메탄올 또는 에탈올) 용액 중에서 처리함으로써, 2,4-디옥소-4-(2-피리디닐)부탄산 메틸에스테르(MDP)를 얻을 수 있다. 반응온도는, -10~100℃가 바람직하다. AP 및 DMO는, 시판되는 것을 사용해도 되고, 유기화학의 통상의 지식을 토대로 제조한 것을 사용해도 된다.

이어서, MDP를 메탄올 중, 실온에서 3-클로로-6-히드라지노피리다진(CHP)을 1등량(an equivalent amount) 첨가한 후, 적당량의 염산을 첨가하여 가열 환류함으로써, 1-(6-클로로-3-피리다지닐)-5-(2-피리디닐)-1H-피라졸-3-카르복실산 메틸에스테르(CMP)를 제조할 수 있다. 3-클로로-6-히드라지노피리다진은, 시판되는 것, 또는 디클로로피리다진에 히드라진을 반응시키는 방법 또는 그의 방법에 준한 방법으로 제조한 것을 사용해도 된다.

또한, MDP를 메탄올 중, 실온에서 CHP를 1등량 첨가한 후, 적당량의 산(acid)을 첨가하여 가열 환류하고, 이어서 반응액을 40℃~60℃ 정도로 냉각하며, 추가로, 나트륨메톡시드와 염기를 순차적으로 첨가함으로써, 화학식 Ⅱ로 표시되는, 1-(6-메톡시-3-피리다지닐)-5-(2-피리디닐)-1H-피라졸-3-카르복실산(MCP)로 유도하는 것도 가능하다. 첨가하는 산으로서, 염산, 메탄설폰산 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다. 염기로서는, 수산화나트륨을 사용할 수 있다. CMP 등의 제조 중간체(intermediate)를 정제하지 않고 MDP로부터 MCP를 제조할 수 있기 때문에, 고수율(high yield)로 MCP를 얻을 수 있다.

CMP는, 나트륨메톡시드와 염기를 순차적으로 첨가함으로써, 하나의 공정과 고수율로, MCP로 유도할 수 있다. 염기로서는, 수산화나트륨을 사용할 수 있다. 반응온도는, -20~100℃가 바람직하고, 특히 -5~50℃가 바람직하다. 이 때, 반응액에 염산을 첨가함으로써 MCP를 정석(crystallization)할 수 있다. 이 반응은 메탄올 중에서 행하는 것이 바람직하다.

이어서 MCP와 N-메틸피페라진을 축합반응함으로써, 본 발명의 화합물(1a) 또는 (1b)를 얻을 수 있다.

본 축합반응에는, 펩티드 합성법으로서 일반적으로 사용되는 방법을 적용하면 된다. 펩티드 합성법으로서는, 예를 들면, 아지드법(azide method), 산염화물법(acid chloride method), 산무수물법(acid anhydride method), DCC(디시클로헥실카르보디이미드)법, 활성 에스테르법(active ester method), 카르보닐디이미다졸법(carbonyldiimidazole method), DCC/HOBT(1-히드록시벤조트리아졸)법, 수용성 카르보디이미드를 사용하는 방법, 디에틸 시아노포스페이트(diethyl cyanophosphate)를 사용하는 방법 등을 들 수 있고, 그들의 방법은, M. Bodanszky, Y. S. Klausner 및 M. A. Ondetti저 "Peptide Synthesis"(A Wiley-Interscience pubIication, New York, 1976년); G. R. Pettit저 "SyntheIic Peptides"(Elsevier Scientific Publication Company, New York, 1976년), 일본화학회편 "제4판 실험화학강좌 22권, 유기합성 Ⅳ"(마루젠 가부시키가이샤, 1992년) 등에 기재되어 있다. 첨가제로서는 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물이 바람직하고, 축합제로서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 디시클로헥실카르보디이미드가 바람직하며, 첨가제와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 조합, 또는 첨가제와 디시클로헥실카르보디이미드의 조합이 바람직하다. 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 조합, 또는 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물과 디시클로헥실카르보디이미드의 조합이 바람직하다. 이 축합반응에 사용하는 용매로서는, 각종 용매를 사용할 수 있고, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, N,N-디메틸포름아미드, 피리딘, 클로로포름, 염화메틸렌, 테트라히드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 물 등 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 조합의 경우는, 함수 에탄올(water-containing ethanol)이 바람직하다. 또한, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물과 디시클로헥실카르보디이미드의 조합의 경우는, 아세토니트릴이 특히 바람직하다. 반응온도는 -20~50℃가 바람직하고, -10~30℃가 보다 바람직하다. N-메틸피페라진은, 시판의 화합물을 사용해도 되고, 또한 문헌에 기재된 방법 또는 그들의 방법에 준한 방법에 의해 제조한 것을 사용하면 된다.

이 축합반응시에 농염산을 공존시킴으로써, 화합물(1b)를 결정으로서 얻을 수 있다. 이 반응에서는 화합물(1a)를 정제하지 않고 화합물(1b)를 제조할 수 있기 때문에, 고수율로 화합물(1b)를 얻을 수 있다.

화합물(1b)는 화합물(1a)를 염산으로 처리하는 것에 의해서도 얻을 수 있지만, 그 경우, 염화에 적합한 화합물(1a)의 결정을 얻을 필요가 있다. 염화에 적합한 화합물(1a)를 얻기 위해서는, 헥산 등 의약품의 제조에 사용하는 것이 권하여지고 있지 않은 유기용매(organic solvent)를 사용하여 슬러리 처리(treatment as slurry)를 행할 필요가 있다.

헥산은, ICH의 가이드라인(guideline)에 클래스 2(의약품 중의 잔류를 규제해야하는 용매)로 분류되어 있고, 농도 한계치 290 ppm이라고 하는 매우 엄격한 농도제한이 되어 있다. 한편, 본 발명의 방법에 의하면, 에탄올이나 이소프로판올이라고 하는 클래스 3(독성이 낮고, 인간의 건강에 미치는 위험도 낮은 용매. 5000 ppm까지 허용범위로서 인정되고 있다.)으로 분류되는 용매를 사용하는 것만으로 제조할 수 있다. 따라서, 클래스 2의 용매를 사용하지 않는 방법으로도 제조할 수 있는 화합물(1b)는, 의약품으로서 이용가치가 높은 화합물이라고 생각되어진다.

또한, 본 발명의 화합물(1b)는, 우수한 흡탈습 거동을 나타냄과 동시에, 물, 일본약국방 제1액(JP1액) 및 일본약국방 제2액(JP2액) 전체에 대하여 양호한 용해성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 화합물(1b)는, 인간 및 기니피그의 혈소판 응집을 강력하게 억제하였다. 또한, 양호한 경구 흡수성을 나타내어, 염화철 유발 혈전 모델(thrombus model induced by iron chloride)에 있어서 혈전 형성을 강력하게 억제하였다. 또한, 안전성에 관해서도 문제는 인정되지 않았다.

화합물(1a)는 화합물(1b)를 수산화나트륨으로 처리하는 것에 의해서도 제조할 수 있다. 따라서, 화합물(1b)는 화합물(1a)를 취득하기 위한 중간체로서도 유용하다.

화합물(1c)는, 화합물(1a)를 에탄올에 용해하여, L-주석산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물(1c)는, 결정 다형(crystal polymorphism)이 없고, 우수한 흡탈습 거동을 나타냄과 동시에, 물, JP1액 및 JP2액 전체에 대하여 양호한 용해성을 나타내며, 습도에 관계없이 결정형의 변화는 인정되지 않았다. 또한, 습열(wet heat), 건열(dry heat) 및 광조사(beam irradiation)에 대해서도 매우 안정하였다. 이상과 같이, 본 발명의 화합물(1c)는, 물성적인 관점으로부터, 의약품으로서 매우 높은 자질을 갖는 화합물이다.

본 발명은, 또한, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물(CMP)와 나트륨메톡시드를 메탄올 중에서 반응시키고, 이어서 수산화나트륨으로 처리하는 것을 특징으로 하는 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물(MCP)를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 방법에 의해, 1-(6-메톡시-3-피리다지닐)-5-(2-피리딜)피라졸-3-카르복실산 메틸에스테르(MMP)를 정제하지 않고, 하나의 공정과 고수율로 MMP로부터 MCP를 제조할 수 있다. MCP를 나트륨메톡시드-메탄올 용액으로 처치하여, MMP를 단리(isolating)하고, 이어서 MMP를 염기로 처치하여 MCP를 얻는 경우, CMP로부터 MCP로의 수율은 충분한 것은 아니었다. 본 발명의 방법에 의하면, 97%라고 하는 매우 고수율로 MCP로 유도하는 것이 가능하다.

본 발명은, 또한, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 농염산 또는 메탄설폰산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.

본 방법에 의해, CMP 등의 제조 중간체를 정제하지 않고 DMP로부터 MCP를 제조할 수 있기 때문에, 고수율로 MCP를 얻을 수 있다.

또한 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰc

[화학식 Ⅰc]

로 표시되는 화합물(Ⅰc)의 제조방법으로서, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 MCP를, 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅰa

[화학식 Ⅰa]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 L-주석산과 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 아세토니트릴 또는 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 또는 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키고, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키고, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻으며, 추가로 이것을 아세토니트릴 또는 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 또는 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 또는 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 또는 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 아세틸피리딘과 옥살산 디메틸에스테르를 나트륨메톡시드 존재하에, 메탄올로 처리함으로써, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

또한, 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

또한, 본 발명은, 다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키며, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하고, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

MCP로부터 직접 화합물(Ⅰc)를 합성하는 것, 또는, 화합물(1a)를 단리하지 않고 화합물(1b)로부터 화합물(1c)를 취득할 수 없었다. 본 방법은, 제조하는 것이 매우 곤란한 화합물(1c)를 취득하는 것을 가능하게 하는 방법이다.

본 발명의 화합물(1a), (1b) 및 (1c)는, 모두 콜라겐 유발 혈소판 응집을 강력하게 저해하였다. 또한, 화합물(1a) 및 (1b)는, ex vivo에 있어서도 강력하게 콜라겐 응집을 저해하여, 양호한 경구 흡수성을 나타내었다. 또한, 화합물(1b)는, 고전단응력(high shear stress) 유발의 혈전증 모델에서도 혈전 형성을 강하게 저해하였다. 따라서, 본 발명의 화합물(1b)는, 인간을 포함하는 포유류에 있어서, 심근경색, 협심증(만성 안정 협심증, 불안정 협심증 등), 허혈성 뇌혈관 장애(일과성 뇌허혈 발작(TIA), 뇌경색 등), 말초혈관 장애, 인공혈관 치환 후 폐색, 관동맥 인터벤션(관동맥 바이패스술)(CAGB), 경피경관 관동맥 형성술(PTCA), 스텐트 유치 등) 후의 혈전성 폐색, 당뇨병 망막증·신증, 심장 인공판막 치환시 폐색 등, 혈전·색전을 원인으로 하는 허혈성 질환의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다. 또한, 혈관 수술, 혈액 체외 순환 등에 수반되는 혈전·색전의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다. 또한, 만성 동맥 폐색증에 수반되는 궤양, 동통, 냉감 등의 저혈성 증상(ischemic symptom)의 개선에도 유용하다.

본 발명의 화합물(1a), (1b) 또는 (1c)를 의약으로서 사용하는 경우, 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상 등에 따라 상이하지만, 성인 1인당 1일량은 0.1 ㎎~1 g이 바람직하고, 특히 0.5 ㎎~500 ㎎이 바람직하다. 이 경우, 1일량을 수회로 나누어 투여하는 것도 가능하고, 필요한 경우에는 상기의 1일량을 초과하여 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 화합물(1a), (1b) 또는 (1c)를 유효성분으로 하는 의약은, 필요에 따른 투여법 및 제형에 의해 사용 가능하고, 그의 제제는 통상 사용되고 있는 각종 제제의 조제법으로 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 담체를 배합하여, 투여법에 합치한 제형을 선택하면 되고, 투여법 및 제형은 특히 제한되는 것은 아니다.

경구용 제제로서는, 예를 들면, 정제, 산제, 과립제, 환제, 캡슐제 등 고형 제제(solid preparation) 외에, 액제, 시럽제, 엘릭시르제(elixir), 현탁제, 유제 등의 액체 제제(liquid preparation)를 들 수 있다.

주사제로서는, 화합물(1a), (1b) 또는 (1c)를 용해하여 용기에 충전해도 되고, 또한 그것을 동결 건조 등에 의해 고형으로서 필요시 조제의 제제로 해도 된다.

이들의 제제를 조제하는 경우에는, 제약학상 허용되는 첨가물, 예를 들면, 결합제, 붕괴제(disintegrant), 용해촉진제, 윤활제, 충전제, 부형제 등을 필요에 따라서 선택하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다.

[ 실시예 1] [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일)메탄· 1염산염 (화합물(1b))의 합성

실시예 1-1) 2,4- 디옥소 -4-(2- 피리디닐 )부탄산 메틸에스테르( MDP )

10 L 목이 4개인 플라스크(four necked flask)에 메탄올(5.3 L)을 넣고, 나트륨메톡시드(402 g)을 용해하였다. 계속하여 디메틸옥살산(878 g), 아세틸피리딘(600 g, 556 mL)을 첨가하고, 적하 깔때기(dropping funnel)를 200 mL의 메탄올로 세정하였다. 반응 현탁액을 실온에서 16.5시간 교반하였다. 반응액을 스테인리스 캔(stainless can)에 옮기고, 여기에 11.1 L의 물을 첨가하여 빙냉하였다. 이어서, 5 N 염산(10 L)을 첨가하고, pH를 3.0으로 조정하였다. 빙냉하 2.5시간 교반한 후, 결정을 여과하였다. 얻어진 결정을, 300 mL의 물로 1회, 10 L의 이소프로판올로 2회 세정하였다. 결정을 감압 건조하여, 표제 화합물(904 g, 88%)를 얻었다.

실시예 1-2) 1-(6- 클로로 -3- 피리다지닐 )-5-(2- 피리디닐 )-1H- 피라졸 -3- 카르복실산 메틸에스테르( CMP )

20 L 목이 4개인 플라스크에 메탄올(6.0 L), 3-클로로-6-히드라지노피리다진(CHP, 425 g), 실시예 1-1)에서 얻은 MDP(600 g)를 넣고, 2시간 가열 환류하였다. 농염산 120 mL를 첨가하고, 11시간 환류한 후, 반응액을 실온으로 냉각하여 2.0 L의 물을 첨가하였다. 이어서, 5 N 수산화나트륨 용액을 360 mL 첨가하여 pH를 8.5로 조정하였다. 추가로 물(10.0 L)을 첨가한 후, 실온에서 1시간 교반하였다. 석출한 결정을 여과 분별(separation by filtration)하여, 1.2 L의 물로 세정하였다. 얻어진 결정을 1.2 L의 67% 함수 메탄올 용액으로 슬러리 처리하여 여과하였다. 여과 분별한 결정을 감압 건조하여, 표제 화합물(CMP, 665 g, 73%)을 얻었다.

실시예 1-3) 1-(6- 메톡시 -3- 피리다지닐 )-5-(2- 피리디닐 )-1H- 피라졸 -3-카르복실산( MCP )

20 L 목이 4개인 플라스크에 나트륨메톡시드(171 g)를 7.5 L의 메탄올에 용해하였다. 여기에 실시예 1-2)에서 얻은 CMP(500 g)를 첨가하여, 40℃에서 1.5시간 교반하였다. 이어서 5 N 수산화나트륨 수용액(250 mL)을 첨가하고, 40℃에서 1시간 교반한 후, 반응액의 온도를 실온까지 낮췄다. 반응액에 7.5 L의 물, 활성탄(250 g)을 첨가하여 30분간 교반하였다. 활성탄을 여과하고, 여액에 5 N 염산(550 L)을 첨가하여 pH를 3.3으로 조정하였다. 반응액을 실온에서 하룻밤 교반한 후 석출한 결정을 여과하여 모아, 냉수(1.0 L) 및 메탄올(750 mL)로 결정을 세정하였다. 얻어진 결정은 감압 건조하여, 표제 화합물(MCP, 445 g, 97%)을 얻었다.

실시예 1-4) [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일) 메타논 · 1염산염 (화합물(1b))

5 L의 목이 4개인 플라스크에 95% 에탄올(1.0 L)을 넣고, 실시예 1-3)에서 얻은 MCP(260 g), 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물(HOBt·H₂O, 201 g), N-메틸-피페라진(175 g), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(수용성 카르보디이미드: WsCI, 252 g)을 첨가하여, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응액에 농염산(182 mL)을 적하한 후 에탄올(1.3 L)을 첨가하여, 50℃에서 1시간 교반하였다. 반응액의 온도를 천천히 실온으로 되돌리고(7℃/시간), 추가로 2시간 빙냉하였다. 그 다음, 결정을 여과하여 모아, 600 mL의 에탄올로 결정을 세정하였다. 얻어진 결정을 감압 건조하여, 조제(crude)의 표제 화합물(344 g, 95%)을 얻었다. 3 L의 목이 3개인 플라스크에, 상기 조제 표제 화합물(340 g)을 70% 에탄올(112 mL)에 첨가하여, 60℃로 가열하여 용해 후 글라스 필터(glass filter)로 여과하였다. 플라스크를 70% 에탄올(68 L) 및 에탄올(500 mL)로 세정하고, 세정액을 여액에 첨가하였다. 10 L 목이 4개인 플라스크에 여액을 이동시키고, 에탄올을 3.4 L 첨가하여, 이것을 60℃로 가열하여 2시간 교반하였다. 그 다음 천천히 50℃까지 냉각하여 1.5시간 교반하여, 결정을 서서히 석출(precipitate)시켰다. 추가로 천천히 빙온(ice temperature)까지 온도를 떨어뜨린 후 결정을 여과하여 모았다. 얻어진 결정을 700 mL의 에탄올로 세정한 후 감압 건조하여, 표제 화합물(303 g, 89%)을 얻었다.

[ 실시예 2] 1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일)메타논(화합물(1a))의 합성

(방법 1)

1 L 목이 4개인 플라스크에 아세토니트릴(350 mL)을 넣고, 실시예 1-3)에서 얻은 MCP(35.0 g), HOBt·H₂O(37.1 g), N-메틸-피페라진(23.6 g), WsCI(30.9 g)를 첨가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응액에 트리에틸아민(58 mL)을 첨가하여 감압 농축한 후, 물(200 mL)을 첨가하고, 추가로 포화 탄산수소나트륨 수용액 250 mL를 첨가하여 결정을 석출시켰다. 결정을 석출시킨 현탁액을 클로로포름(220 mL)으로 3회 추출하여, 탄산수소나트륨 수용액 220 mL, 증류수 220 mL로 세정하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후 45 g까지 농축하고, 헥산을 450 mL 첨가하여 슬러리 처리를 행하였다. 그 다음, 결정을 여과하여 모아, 얻어진 결정을 감압 건조하여, 표제 화합물(41.7 g, 93%)을 얻었다.

(방법 2)

1 L 목이 3개인 플라스크에 실시예 1-4)에서 얻은 화합물(1b) 126.7 g을 넣고, 물(640 mL)을 첨가하여, 50℃에서 교반하면서 5N NaOH 수용액(64 mL)을 적하하 였다. 적하 종료 후, 반응액을 2℃까지 냉각시켰다. 석출한 결정을 현탁한 반응액을 여과하여, 얻어진 결정을 물(200 mL)로 세정한 후, 감압 건조하여 화합물(1a)(95.9 g; 83%)를 얻었다.

[ 실시예 3] [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일) 메타논 ·1L- 주석산염(화합물(1c))의 합성

50 mL 목이 2개인 플라스크에 80% 이소프로판올(10 mL), 실시예 2에서 얻은 화합물(1a)(2.5 g), L-주석산(1.0 g)을 넣고 60℃로 가열하여 용해하였다. 이소프로판올(5 mL), 계속해서 이소프로판올(10 mL)을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 그 다음 천천히 실온까지 냉각시킨 후, 빙냉하여, 결정을 여과하여 모았다. 얻어진 결정은 감압 건조하여, 표제 화합물(3.3 g, 96%)을 얻었다.

또한, 실시예 1~3의 NMR 스펙트럼에 있어서, a)는 TMS를 표준으로 하고, b)는 TPS((3-트리메틸실릴)-2,2,3,3-d4-프로피온산나트륨)을 표준으로 하고 있는 것을 의미한다.

[ 실시예 4] [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸 피페라진-1-일) 메타논 · 1염산염 (화합물(1b)) 무수물의 결정

MCP를, N,N-디메틸포름아미드에 용해하고, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-(3-디 메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염, 및 트리에틸아민 존재하, N-메틸피페라진과 반응시켰다. 반응액에 물과 초산에테르를 첨가하여 분액(extract)시키고, 추가로 수층을 초산에틸로 석출하였다. 유기층을 함께 포화 식염수로 세정하여, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 분별 후, 용매를 감압 증류제거하여 얻은 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 화합물(1a)를 얻었다. 얻어진 화합물(1a) 99.98 ㎎을, 10% 함수 에탄올(0.8 ㎖)에 용해하여, 0.022 mL의 농염산을 첨가하여 70℃로 가온, 용해하였다. 실온으로 되돌린 후 2일간 정치하여 결정을 석출시켰다. 석출한 결정을 여과하여 모아, 풍건(dried with air)하여, 화합물(1b) 무수물의 결정을 63.4(58%) 얻었다. 원소 분석(elementary analysis): 이론치(calculated value)(C₁₉H₂₁N₇O₂·HCl); C, 54.87; H, 5.33; N, 23.57; Cl, 8.52. 실측치(measured value); C, 54.63; H, 5.33; N, 23.50; Cl, 8.64.

본 결정에 대해서, 통상적인 방법에 따라 분말 X선 회절, 열분석(TG/DTA)을 실시하였다. 결과를 도 1 및 도 1B에 나타낸다.

[ 실시예 5] [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일) 메타논 · 1염산염 ( 화합물(1b)) 2수화물의 결정

실시예 1-4)에서 얻어진 화합물(1b)의 무수물(200.0 ㎎)을 샬레에 담아, 포화 질산칼륨 수용액(93% RH)을 공존시킨 데시케이터(desiccator) 중에 실온에서 7일간 보존하여, 흡습시킨 결정을 얻었다(216.1 ㎎).

원소 분석: 이론치(C₁₉H₂₁N₇O₂ _·HCl·2H₂O); C, 50.50; H, 5.80; N, 21.70; Cl, 7.85. 실측치; C, 50.42; H, 5.74; N, 21.44; Cl, 7.83.

본 결정의 분석 X선 회절 및 TG/DTA를 통상적인 방법에 따라서 측정하였다. 결과를 도 2A 및 도 2B에 나타낸다.

[ 실시예 6] [1-(6- 메톡시피리다진 -3-일)-5-피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -3-일](4- 메틸피페라진 -1-일) 메타논 ·1L- 주석산염 (화합물(1c)) 무수물의 결정

실시예 2에서 얻어진, 화합물(1a) 3.0 g을 5% 함수 에탄올(30 ㎖)에 용해하고, 1.24 g의 L-주석산을 첨가하여 50℃로 가온, 용해하였다. 실온으로 되돌려, 15시간 스터러(stirrer)로 교반하였다. 석출한 결정을 여과하여 모아, 풍건하고, 화합물(1c)의 결정 4.0 g(96%)을 얻었다.

원소 분석: 이론치(C₁₉H₂₁N₇O₂ _·C₄H₆O₆); C, 52.17; H, 5.14; N, 18.52. 실측치; C, 51.91; H, 4.95; N, 18.56.

본 결정에 대해서, 분말 X선 회절, 열분석(TG/DTA)을 통상적인 방법에 따라서 측정하였다. 결과를 도 3A 및 도 3B에 나타낸다.

[ 실시예 7] 1-(6- 메톡시 -3- 피리다지닐 )-5-(2- 피리디닐 )-1H- 피라졸 -3-카르복실산( MCP )

CHP(3.5 g)의 메탄올 용액(100 ㎖)에 MDP(5.0 g) 및 농염산( 1 ㎖)을 첨가하여, 14시간 가열 환류하였다. 반응액을 50℃로 냉각 후, 그대로의 온도에서 28% 나트륨메톡시드의 메탄올 용액(12.0 ㎖)을 첨가하고, 1시간 교반하였다. 이어서, 반응액에 1 N 수산화나트륨 수용액(15.0 ㎖)을 첨가하고, 50℃에서 1시간 교반한 후, 실온까지 냉각시켰다. 반응액에 물(45 ㎖), 활성탄(250 ㎎)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 활성탄을 여과하여 제거한 후, 여액에 5 N 염산(8.0 ㎖)을 첨가하여, pH 3.0 정도로 조정하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 석출한 결정을 여과하여 모은 후, 감압 건조하여, 표제 화합물(5.73 g)을 얻었다. 각종 스펙트럼 데이터는, 실시예 1-3)과 완전히 일치하였다.

[ 실시예 8] 1-(6- 메톡시 -3- 피리다지닐 )-5-(2- 피리디닐 )-1H- 피라졸 -3-카르복실산( MCP )

CHP(3.5 g)의 메탄올 용액(100 ㎖)에 MDP(5.0 g) 및 메탄설폰산(0.78 ㎖)을 첨가하여, 14시간 가열 환류하였다. 반응액을 50℃로 냉각 후, 그대로의 온도로 28% 나트륨메톡시드의 메탄올 용액(12.0 ㎖)을 첨가하고, 1시간 교반하였다. 이어서, 반응액에 1 N 수산화나트륨 수용액(15.0 ㎖)을 첨가하고, 50℃에서 1시간 교반한 후, 실온까지 냉각시켰다. 반응액에 물(45 ㎖), 활성탄(250 ㎎)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 활성탄을 여과하여 제거한 후, 여액에 5 N 염산(8.0 ㎖)을 첨가하고, pH 3.0 정도로 조정하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 석출한 결정을 여과하여 모은 후, 감압 건조하여, 표제 화합물(5.57 g)을 얻었다. 각종 스펙트럼 데이터는, 실시예 1-3)과 완전히 일치하였다.

[실시예 9] [1-(6-메톡시피리다진-3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일](4-메틸피페라진-1-일)메타논·1염산염(화합물(1b))

MCP(5.0 g)을 아세토니트릴(50 ㎖)에 현탁하여, 1-히드록시벤조트리아졸·1 수화물(HOBt·H₂O, 3.4 g), N-메틸-피페라진(3.7 ㎖), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC, 5.2 g)을 첨가하고, 40℃에서 3시간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하고, 그대로의 온도에서 1시간 교반하였다. 실온까지 냉각하여, 석출한 결정을 여과 분별 후, 얻어진 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 에탄올(50 ㎖)에 용해하고, 농염산(2.8 ㎖)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 얻어진 결정을 여과해서 모은 후, 감압 건조하여, 표제 화합물(6.3 g)을 얻었다. 각종 스펙트럼 데이터는, 실시예 1-4)와 완전히 일치하였다.

[시험예 1] 흡탈습 거동의 검토

상기 실시예에서 얻어진, 화합물(1a), (1b) 및 (1c)에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 흡탈습성을 평가하였다. 즉, 결정 약 20 ㎎을 마이크로밸런스(Microbalance)(자동 수증기 흡착장치)에 부가하여, 상대 습도범위 10~90%에서의 경시적 중량을 계측함으로써 물의 흡탈착량을 측정하였다.

그 결과, 화합물(1a), (1b) 및 (1c) 중, 어느 하나의 화합물도 40~60% RH에 있어서 ±1% 이내의 중량 변화밖에 나타내지 않았다(도 4A, 도 4B, 도 4C).

[시험예 2] 결정 안정성의 검토

상기 실시예에서 얻은 화합물(1a), (1b), (1c) 및 화합물(1a)의 각종 염 화합물을 25℃, 상대습도, 0.52% 또는 93%에서 3일간 보존하여, 중량 및 결정형 변화를 검토하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 푸마르산염은 저습도에서, 화합물(1a) 및 구연산은 고습도에서, 결정형의 변화가 관찰되었다. 또한, 화합물(1a)의 각종 염 화합물은, 실시예 3의 방법에 준하여 제조하였다. 화합물(1c)는, 중량 변화가 약간이고, 결정형의 변화도 없으며, 안정성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.

[시험에 3] 혈소판 응집억제작용

혈액 응고 저해제(anticoagulant)로서 1/10 용량의 3.13% 구연산 나트륨을 사용하여, 인간 또는 마취하 기니피그로부터 정맥혈(venous blood)을 채취하여, 180 g으로 10분간 원심(centrifuge)하여 다혈소판 혈장(platelet rich plasma)(PRP)을 분리하였다. PPR을 분취(分取) 후, 하층을 추가로 1600 g으로 10분간 원심하여 상층의 혈소판 결핍 혈장(platelet poor plasma)(PPP)을 분취하였다. PRP 200 μL에 화합물(1) 또는 비교예 1~3의 용액 1 μL을 첨가하여 37℃에서 2분간 정치 후, 콜라겐 2 μL을 첨가하여 혈소판 응집을 유발(induce)하였다. 혈소판 응집율은 PAM-12C(SSR 엔지니어링)를 사용하여 측정하였다. PPP의 광투과율을 100% 응집값으로 하고, 각각의 화합물의 각 농도 존재하에 있어서의 혈소판의 응집율을 구하여, 각 화합물의 IC₅₀값을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

[시험예 4] 시클로옥시게나아제-1(COX-1) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 저해작용

Cayman Chemical Company의 COX 저해약 스크리닝 어세이 킷트(카탈로그 번호 560101, 560121)를 사용하여, 각 화합물의 COX-1 및 COX-2 저해 활성을 측정하였다.

측정 전에 반응 완충액(Reaction buffer), 헴(heme), 아라키돈산(arachidonic acid), SnCl₂, EIA 완충액(EIA buffer), 세정 완충액, 프로스타글란딘(PG) 스크리닝 EIA 표준액, PG 스크리닝 아세틸콘린에스테라아제(PG screening acetylcholinesterase)(AchE), 트레이서(발색효소 HRP 콘주게이트(conjugate of a chromogenic enzyme), PG 스크리닝 EIA 항혈청을 준비하였다.

(1) COX-1 또는 COX-2에 의한 PGF₂α의 생산

각 농도의 실시예 화합물 및 COX-1 또는 COX-2를 포함하는 반응액을 37℃에서 10분간 정치 후, 아라키돈산 10 μL를 첨가하여 37℃에서 2분간 정치하였다. 반응 후에 1 N-염산 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, SnCl₂ 용액 100 μL를 첨가하여 5분간 실온에서 정치하였다.

(2) ELISA에 의한 PGF₂α의 정량

마우스 항토끼 IgG로 코팅한 96웰 플레이트(96 well plate )의 각 웰에 항혈청(토끼 항PGF₂α 항체) 50 μL를 첨가한 후, 상기의 PGF₂α 생산 반응액을 2000배로 희석시킨 용액 50 μL, AchE 트레이서 50 μL을 순차적으로 첨가하여 실온에서 18시간 정치하였다. 세정 완충액으로 각 웰을 5회 세정하여 과잉의 AchE 트레이서를 제거 후, 엘만(Ellman) 시약 200 μL를 첨가하였다. 60분간 암실에 정치한 후, 405 ㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다.

(3) 저해 활성의 산출

PG 스크리닝 EIA 표준액을 사용하여 표준곡선을 작성하여, 상기의 흡광도로부터 PGF₂α의 생산량을 구하였다. 저해율의 산출에 있어서는, 실시예 화합물을 포함하지 않는 반응액을 사용하여 얻은 PGF₂α의 생산량을 100%로 하고, 실시예 화합물 각 농도에 있어서의 저해율을 산출하여, IC₅₀을 구하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

화합물(1a) 및 화합물(1b)는 저농도에서, 인간 및 기니피그의 혈소판 응집을 저해하였다. 한편, COX-1 및 COX-2에 대해서는, 혈소판 응집을 억제하는 100배 농도의 IC₅₀를 나타내었다.

[시험예 5] 경구 흡수성의 검토

절식시킨 체중 290-360 g의 기니피그에, 화합물(1a)로 산출하여 2 ㎎/mL의 농도가 되도록 0.5% 메틸셀룰로오스(MC)에 현탁한 화합물(1b)를, 10 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 대조군에는 용매인 0.5% MC만을 5 mL/㎏ 투여하였다. 투여 1시간 후, 기니피그를 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine) 마취 후 개복(abdominal section)하여, 복 대동맥(abdominal aorta)으로부터 1/10 용량의 3.13% 구연산 나트륨을 사용하여 채혈하였다. 얻어진 혈액으로부터, 시험예 3과 동일한 방법으로 PRP를 조제하여 콜라겐 유발 혈소판 응집을 측정하였다. 단, 혈소판 응집의 야기에는 종농도(final concentration)로 0.8 ㎍~2.5 ㎍의 콜라겐을 사용하였다.

결과를 도 5에 나타낸다. 화합물(1b)를 10 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여된 기니피그의 혈중에서는, 콜라겐 자극으로 유발되는 혈소판 응집이 강력하게 억제되었다. 화합물(1b)는 양호하게 흡수되어 약효를 나타내는 것을 알 수 있었다.

Claims

다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물.
[1-(6-메톡시피리다진-3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일](4-메틸피페라진-1-일)메타논·1염산염.
제1항 또는 제2항에 있어서, 무수물인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2수화물인 화합물.
다음 화학식 Ⅰc

[화학식 Ⅰc]

로 표시되는 화합물.
[1-(6-메톡시피리다진-3-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일](4-메틸피페라진-1-일)메타논·1L-주석산.
제5항 또는 제6항에 있어서, 무수물인 화합물.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키고, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키고, 이어서 수산화나 트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진 과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 아세틸피리딘과 옥살산 디메틸에스테르를 나트륨메톡시드 존재하에, 메탄올 중에서 처리함으로써, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피 페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 아세틸피리딘과 옥살산 디메틸에스테르를 나트륨메톡시드 존재하에, 메탄올 중에서 처리함으로써, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키며, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하고, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 함수 에탄올 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키고, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키고, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 아세틸피리딘과 옥살산 디메틸에스테르를 나트륨메톡시드 존재하에, 메탄올로 처리함으로써, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이것을 메탄올 중, 나트륨메톡시드와 반응시키며, 이어서 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히 드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰb

[화학식 Ⅰb]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 아세틸피리딘과 옥살산 디메틸에스테르를 나트륨메톡시드 존재하에, 메탄올로 처리함으로써, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 이어서 이것을 메탄올 중, 메탄설폰산 또는 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키며, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하고, 추가로 수산화나트륨으로 처리함으로써, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 디시클로헥실카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시키며, 이어서 농염산으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅰc

[화학식 Ⅰc]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 아세토니트릴 중, 1-히드록시벤조트리아졸·1수화물 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 존재하, N-메틸피페라진과 반응시킴으로써, 화학식 Ⅰa

[화학식 Ⅰa]

로 표시되는 화합물을 얻고, 추가로 이것을 L-주석산과 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물을 제조하는 방법으로서,

다음 화학식 Ⅲ

[화학식 Ⅲ]

로 표시되는 화합물과 나트륨메톡시드를, 메탄올 중에서 반응시키고, 이어서 수산화나트륨으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 메탄설폰산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
다음 화학식 Ⅱ

[화학식 Ⅱ]

로 표시되는 화합물의 제조방법으로서, 화학식 Ⅳ

[화학식 Ⅳ]

로 표시되는 화합물을 메탄올 중, 농염산 존재하, 3-클로로-6-히드라지노피리다진과 반응시키고, 이어서 나트륨메톡시드를 첨가하며, 추가로 수산화나트륨으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물과 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약조성물.
제24항의 의약조성물을 함유하는 의약.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 의약.
제25항 또는 26항에 있어서, 허혈성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하는 의약.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 유효량 투여하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환의 예방 및/또는 치료방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물의, 의약을 제조하기 위한 사용.