KR20070042546A

KR20070042546A - 약제

Info

Publication number: KR20070042546A
Application number: KR1020077002992A
Authority: KR
Inventors: 데이어드레 매킨토시
Original assignee: 아임스코 리미티드
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2007-04-23
Also published as: JP2008505878A; WO2006021814A2; CA2572777A1; KR101235723B1; WO2006021814A3; AU2005276242A1; EP1765377A2; AU2005276242B2; BRPI0513062A

Abstract

많은 치료효과를 갖는 염소 혈장 생성물의 분석결과가 기재되었다. 상기 생성물은 프로오피오멜라노콜틴(POMC) 및 콜티코트로핀 방출인자(CRF) 펩티드들뿐만 아니라, 이들 펩티드들의 분해 생성물을 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 우리는 암, 다발성 경화증 및 신경 장애를 포함하는 장애에 대하여 상기 펩티드 및 그들의 생성물을 사용하여 치료하는 방법에 대하여 기재하였을 뿐 아니라, 그러한 펩티드를 함유하는 약제들 및 그러한 펩티드를 생산하는 방법에 대해서도 기재하였다.

Description

약제{MEDICAMENT}

본 발명은 약제에 관한 발명으로서 보다 구체적으로는 약제학적 조성물에 대한 발명이다. 본 발명의 약제는 다른 많은 장애의 치료에도 적용될 수 있으나, 특별히 신경성 장애의 치료에 적합하다고 생각된다. 본 발명이 다른 측면은 또한 이러한 약물을 조제하는 방법과 언급된 약물을 이용한 장애를 치료하는 방법에 대한 것이다.

예상치 못한 유익한 효과를 보여주는 혈장 조성에 기초한 치료제와 치료방법이 PCT 공개공보 WO03/004049 및 WO03/064472에 개시되어 있다. 상기 각 인용문헌에 개시되어 있는 각각의 내용은 특별한 참조문헌으로 본문서에 완전히 삽입된다. 특별히, 본 문헌의 독자는 어떻게 치료제를 조제해야 하는지에 대한 이해와 치료방법에 대한 지시를 하기 위해 상기 문헌을 참조할 수 있다.

전형적으로, 염소를 H9 세포에서 유래한 HIV-3B 바이러스성 용해물로 면역화시킨다. 그 결과 생성된 혈장은 다른 장애 중에 다발성경화증(multiple sclerosis)에 저항성을 보일 것이라고 생각된다. 본 문헌의 독자는 혈장을 생산과 관련된 더 자세한 내용은 WO03/004049의 3, 4쪽의 '염소 혈장의 생산에 대한 실험예'를 참조할 수 있다. 상기 섹션은 본문서에 참조로 삽입된다. 간략한 요약은 하기에 제시된다.

혈장의 조제

멸균상태에서 대략 400ml의 혈액을 염소에서 채취된다. 실험동물은 한 번 혈액을 채취하고 나면 혈액이 다시 보충되도록 대개 10~14일 정도 지나서 다시 혈액을 채취한다. 혈액을 채취하기 전의 적절한 식이요법(regime)은 활성화된 조성물을 가진 혈장의 생성을 촉진하는데 유용하다. 채취된 혈액은 혈장을 분리하기 위해 원심분리되고, 혈장은 다시 큰 혈전과 미립자를 제거하기 위해 여과된다. 이렇게 처리된 혈장에 과포화된 황산암모늄(47% 용액, 4℃)을 가해 항체와 다른 물질을 침전시킨다. 남은 용액은 Beckman J6M/E 원심분리기로 3500rpm에서 45분동안 원심분리하고, 상등액은 제거한다. 침전된 면역글로불린(immunoglobulin)과 다른 고형물은 다시 PBS(phosphate bufferd saline) 완충용액으로 완전히 용해시킨다.

상기 용액은 4℃에서 분자량 컷-오프를 10000달톤으로 하여 PBS 완충용액으로 투석여과(diafiltration)를 한다. 투석여과를 한 후 상기 용액은 멸균 컨테이너에서 0.2 μm 필터를 이용하여 거른 뒤 단백질 농도가 4 mg/ml이 되도록 맞춘다. 상기 용액을 1 ml씩 유리병(vial)에 넣고 사용하기 전에 -22℃에서 보관한다. 적절한 방법(대개 피하주사)으로 상기 생성물을 환자에게 투여하여 환자를 치료하는 과정에서, 상기 생성물은 혈장 조성물(serum composition), 조성물 또는 생성물이라 고 언급되기도 한다.

항원으로 HIV-3B 바이러스성 용해물을 사용하는 것은 활성화된 혈장을 생산하는데 필수적이라고 판단되지는 않는다. 바이러스를 배양하는데 사용되었던 배지나 이러한 바이러스의 생장에 적합한 배지는 항원으로 사용되는 경우 적합한 반응을 보여줄 수 있을 것이다. HIV-3B를 배양하는데 사용되는 불사(不死)의 암세포주나 PBMC와 같은 세포 배양 성장 배지의 상등액 등을 예로 들 수 있다. HIV나 다른 바이러스는 상기 조성물을 생산하는데 있어 효과적인 항원을 생산하는데 필요하지 않다.

발열성 물질(예를들어, RIBI나 프로인드 보조액(Freund' adjuvant))이 혈장에서 활성 조성물의 생산을 촉진할 수 있다. 또 다른 가능성 있는 인자로 동물을 태양광에 노출시키거나 낮 시간 이상(또는 태양광에 갈음할 정도의 노출) 동안 노출시키면 혈장 활성 성분 수준을 증가시킬 수 있다.

혈장 조성물의 사용

상기 조성물은 많은 장애에 효율적이라고 생각되며, 특히 다발성경화증에 효과적이라고 판단된다. 앞서 언급한 인용문헌에서 상기 조성물은 류마티즘성 관절염; 시각 신경염(optic neuritis); 운동 신경세포 질환; 자가면역 질환; 축색돌기나 신경 손상; 암 등의 질병에 유용하다는 내용이 개시되어 있다. 상기 조성물은 또한 HIV 환자의 바이러스 부하(viral load)를 감소시켜 주는 것으로 보고되었다.

상기 조성물에 의해 치료될 수 있는 여러 다른 질병들도 기재되었고, 본 발 명자는 치료 조건의 성질과 범위를 완벽히 이해하기 위하여 선행문헌을 참고하였다. 특별히, WO03/004049와 WO03/064472는 본 문서에 참조로 삽입된다.

상기의 기재에 덧붙여 혈장 조성물이 효과적이라고 생각되는 장애의 완전하지 않은 목록(non-exhaustive list)은 암, 특정 골수종(myelomas), 흑색종(melanomas), 임파종(lymphomas); 심혈관 장애; 신경 장애, 탈수초성(demyelinating)과 비탈수초성(non-demyelinating) 질환을 포함한다.

본 발명의 치료방법에 부합하는 장애의 예는 뇌혈관 허혈성(ischaemic) 장애; 알츠하이머(Alzheimer's disease); 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea); 혼합성 결합조직 질환(mixed connective tissue diseases); 피부 경화증(scleroderma); 아낙필락시스(anaphylaxis); 패혈성 쇼크(septic shock); 심장염과 심장내막염; 상처치유; 접촉성 피부염(contact dermatitis); 직업성 폐 질환(occupational lung disease); 글로멀네프리티스(glomerulnephritis); 이식 거부반응; 측두 동맥염(temporal arteritis); 혈관 장애(vasculitic diseases); 간염과 화상(burns) 등 이다. 이들 모든 장애는 염증질환성 성분을 가지고 있을 수 있으나, 비탈수초성 신경 장애의 측면에 기초하여 추가적으로 치료가능하다고 판단된다. 또한, 치료가능한 비탈수초성 장애와 퇴행성 성분을 가진 것으로 생각되는 비탈수초성 장애는 다중계 위축(atrophy); 간질; 근 위축증; 정신분열증; 쌍극성 장애(bipolar disorder)와 우울증을 포함한다. 다른 치료가능한 비탈수초성 장애로는 채널병증(channelopathies); 미애스테니아 그래비스(myaesthenia gravis); 악성 신생물(malignant neoplasia)에 기인한 통증; 만성 피로 증후군; 섬유근 염(fibromyositis); 과민성 장 증후군; 작업관련 상지 장애(work related upper limb disorder); 군발성 두통; 편두통과 만성 일상성 두통 등을 포함한다.

치료가능한 탈수초성 질환은 신경계 감염증; 신경 포착성 장애(nerve entrapment)와 국소적 손상(focal injury); 외상성 척수손상(traumatic spinal cord injury); 상완 신경총 병변(brachial plexopathy)(특발성과 외상성, 상완 신경염, 파르소니지 터너 증후군, 신경통성 근 위축증); 신경근병증(radiculopathy); 채널병증과 유통성(有痛性) 티크(tic douloureux)를 포함한다.

상기 조성물은 낭창(lupus), 건선, 습진, 갑상선염과 다발성 근염(polymyositis)을 포함하는 자기 면역의 치료에 유용하다. 또한, 상기 조성물은 염증성 질환에도 효과적인 것으로 생각된다.

상기 조성물은 모든 타입의 유전성 운동 및 감각 신경 장애; 샤코-마리-투스 질환(이하 CMT라 한다) 타입의 CMT1A, CMT1B, CMT2, CMT3(데제린 소타스 질환), CMT4(A, B, C 및 D 타입), CMTX(X-연관된 CMT); 유전성 신경 편향 압박 마비 증세(또는 절단성 신경병증이라고도 한다); 난청의 유전성 운동 및 감각 신경 장애(Lom(HMSNL)); 기부의(proximal) 유전성 운동 및 감각 신경 장애 / 신경세포병증(HMSNP); 유전성 신경통성 근 위축; 유전성 감각 및 자율 신경 장애(HSAN1, HSAN2, HSAN3(또는 레일리-데이 증후군이나 선천성 자율신경 이상(familial dysautonomia)이라 함) , HSAN4, HSAN5); 선천성 아밀로이드 다발성 신경병증 타입 Ⅰ, 타입 Ⅱ, 타입 Ⅲ, 타입 Ⅳ(Familial Amyloid polyneuropathies); 염색변성적 백혈구 발육 이상증(Metachromatic Leukodystrophy); 크라베 질환(Krabbe's Disease); 파브리 질환(Fabry's Disease); 부신백질이영양증(Adrenoleukodystrophy); 레프섬 병(Refsum's disease, HMSN IV); 탕지어 병(Tangier Disease); 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia); 모든 타입의 척수 소뇌 실조증(Spinal cerebellar ataxia, 이하 SCA라 함) - SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, SCA14, SCA16; 척수소뇌성 실조증(Spinocerebellar Ataxia); 코케인 증후군(Cockayne's syndrome) 및 거대 축삭 신경병증(Giant axonal neuropathy)을 포함하는 축색돌기(axonal)와 탈수초성 타입의 모든 종류의 말초 신경염의 치료에 유용하다.

상기 조성물은 또한 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP)와 길리안-바레 증후군에 유용하다.

상기 조성물은 또한 트롬보스폰딘-1(TSP-1)과 혈소판 인자-4(PF-4) 분자로 유발되는 신생혈관 생성을 억제하는 효과가 있다.

상기 조성물은 또한 동물 치료에도 효과가 있으며, 특히, 이에 제한되는 것은 아니나, 개의 아토피성 피부염, 개의 구강 흑색종(oral melanoma)과 말의 폐질환 장애에도 효과가 있다.

혈장의 성질

상기 혈장 조성물이 많은 연구가 진행되었고, 많은 현저한 효과를 보여주었지만, 현재까지 혈장의 활성 성분 또는 활성 성분들이 동정되지는 않았다. 이는 향후 연구에 있어서 활성 성분을 동정하는 점에서나 활성 성분 또는 활성 성분들의 가능한 대체 공급원의 연구의 면에서 불편한 점이다. 나아가, 주사의 형태로 혈장의 형태로 환자에게 투여되는 치료제로 주입할 때와 조성물의 취급과 처리에서 어떤 제한이 있을 수 있음을 내포한다. 상기 혈장은 단백질 분해효소(protease)의 분해에 민감한 생활성(bioactive) 조성물들을 포함하고 있다고 생각된다.

본 발명자들은 혈장의 잠재적인 활성 조성물들을 많이 동정하였다. 이 동정은 하나 또는 그 이상의 활성 조성물을 여러 형태의 새로운 약제학적 조성물의 생산을 가능하게 하였고, 앞에서 언급한 그리고 활성 성분들을 사용하는 우리의 초기 환자들의 약 안에서 하나 또는 그 이상의 장애의 치료법을 재인용하였다. 상기 동정은 다양한 장애들에 대한 치료방법에 있어서 혈장 자체만이 아닌 활성 조성물(들)을 이용한 치료방법의 새로운 장을 열었다.

발명의 개요

본원 발명은 환자들을 치료하는데 있어 분자적 단계적 연속반응(cascade)을 유발하는 생활성(bioactive) 조성물(composition)에 있다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 콜티코트로핀 방출 인자(CRF:corticotropin releasing factor) 펩티드로 구성된 약제학적 조성물을 제공한다. CRF는 콜티코트로핀 방출 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)으로도 알려져 있다.

CRF는 시상하부에서 생성되는 펩티드이며, 스트레스에 대한 반응에 포함되어 있다고 알려져 있다. 인간의 CRF는 OMIM(online mendelian inheritance in man, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/를 통해 접근할 수 있다.)의 일련번호 112560에 상세히 기재되어 있다. 상기 인간 CRF의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 GENBANK의 접속번호 BC011031로도 알려져 있다. 인간 CRF의 서열과 분자량 데이터를 통해 당업자는 염소의 CRF를 포함하는 비인간 CRF에 대한 상당한(equivalent) 정보를 결정할 수 있게 될 것이다.

'CRF 펩티드'는 상응하는 서열, 구조 또는 기능을 가진 어떠한 펩타이드를 의미한다. 상기 기재된 바와 같이 GENBANK에 기재된 인간 CRF에 대한 표준의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열이 주어진 경우 당업자가 그 펩티드의 기능이나 구조에 영향을 주지 않고 어느 정도 변화를 줄 수 있다는 것은 자명하다. 특별히, 대립형질의 변형체와 기능성 돌연변이들은 상기 변화에 포함된다. 돌연변이는 보존적 아미노산 치환과 CRF의 절편과 유도체들을 포함할 수 있다.

환자에게 CRF를 투여하는 경우 내인성 CRF의 생산을 자극하는데, 상기 내인성 CRF는 이어 프로오피오멜라노콜틴(POMC) 및 그와 관련된 성분 펩티드의 생산을 촉진하는 것으로 생각된다.

POMC는 뇌하수체에서(또는, 흑색종과 같은 암세포나 보통의 피부세포 등의 많은 다른 세포에서) 생산되는 펩티드(프로호르몬)로서 일군의 코르티코트로픽 호르몬의 전구체이며 숙주에서 많은 효과를 낸다. POMC는 알파, 베타, 및 감마 멜라노사이트 자극 호르몬(MSH: melanocyte stimulating hormone); 아드레노코르티코트로핀(adrenocorticotrophin, ACTH); 베타 및 감마 리포트로핀(lipotropin, LPH); 및베타 엔돌핀의 전구체이다. 상기 호르몬들 모두 사나의 큰 전구체인 POMC로부터 절단되어 생성되며, 본 문서에서는 "POMC 생성물"로 정의된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 비인간 CRF; 더욱 바람직하게는 유제류(有蹄類)의 CRF; 가장 바람직하게는 염소의 CRF를 포함한다. 특히 염소가 출혈이나 접종 등과 같은 생리학적 스트레스에 의해 자극을 받았을 때, 놀랍게도 염소의 혈장이 CRF를 함유하고 있다는 것이 확인되었다. 이는 본 발명의 CRF에 대한 약제학적 조성물의 편리한 공급원을 제공한다. 또한 CRF는 환자에게서 자기지속 효과(self-sustaining effect)를 가진 것으로 생각되며, CRF의 최초투여가 환자에게서 내인성 CRF의 합성을 유도한다; 결국, 초기에 CRF의 낮은 레벨의 투여도, POMC 펩티드의 레벨 증가를 포함하여, 환자에게 유의한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 경구 또는 비경구 투여에 의하여 이루어질 수 있다. 비경구투여의 방법은 국소적, 동맥주사, 근육주사, 피하주사, 척수내, 수막강내(intrathecal), 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여 등을 포함한다. 활성성분에 부가하여 상기 조성물은 부형제 및 약제학적 투여에 적합한 제제로 상기 활성 성분의 처리를 촉진하는 다른 성분을 포함하는 약제학적으로 적합한 담체를 포함할 수 있다.

경구 투여용 약제학적 조성물은 경구투여에 적합한 당해 기술분야에서 공지의 조제기술인 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 물약, 겔, 시럽, 현탁액, 서스펜션, 및 그와 유사한, 대상에 의해 섭취되는데 적합한 형태로 만드는 것이 가능하다.

경구용 약제의 조제는 고형의 부형제와 활성 성분의 조합에 의하여 얻을 수 있는데, 정제나 당의정의 핵을 얻으려 한다면, 선택적으로 이 결과물을 분쇄하거나 과립 혼합물로 처리한 후 적당한 첨가물을 가함으로써 수득할 수 있다. 적당한 부형제란 락토오스, 수크로오스, 마니톨, 소르비톨과 같은 당류; 옥수수, 밀, 쌀, 감자나 다른 식물에서 추출한 녹말, 메틸셀룰로오스, 수산화 프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시 메틸셀룰로오스화 나트륨 같은 셀룰로오스; 아라비아 고무와 트라가칸스 고무를 포함하는 검(gum); 젤라틴과 콜라겐 같은 단백질 등 탄수화물 또는 단백질 충전물을 포함한다. 만일 필요하다면, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 그의 염과 같은 붕해제나 용해제 등이 첨가될 수 있다.

당의정의 핵에는 아라비아 고무, 탈크(talc), 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커 용액과 적당한 유기 용매나 혼합 유기용매 등을 포함한 농축된 당분 용액과 같은 적당한 코팅이 함께 제공될 수 있다. 제품 구별이나 활성 성분의 양을 표시하기 위해서 색소나 염료가 정제나 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구용으로 사용될 수 있는 약제의 조제는 젤라틴으로 만든 압입(push-fit) 캡슐이나 젤라틴으로 만든 부드럽고 밀봉된 캡슐과 글리세롤이나 소르비톨과 같은 코팅을 포함한다. 압입 캡슐은 락토오스나 녹말과 같은 충진제나 결합제, 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정제와 활성 첨가물을 혼합한 것을 함유할 수 있다. 부드러운 캡슐에서, 활성 성분은 안정제를 포함하거나 포함하지 않는 지방유, 파라핀 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 용액에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.

비경구 투여용 약제의 처방은 활성 조성물의 수용액을 포함한다. 주사제의 경우, 본원 발명의 약제학적 성분은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액이나 링거용액 또는 생리적 완충 염수(saline)와 같은 생리적으로 적합한 완충용액으로 제제화될 수 있다. 수용성 현탁액 주사제는 카르복시메틸 나트륨 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점성을 증가시킬 수 있는 물질을 함유할 수 있다. 부가적으로, 활성 성분의 현탁액은 적절한 지성 주사 현탁액의 형태로 준비될 수 있다. 적절한 친지성(lipophilic) 용매나 운반체는 참기름과 같은 지방유, 에틸 올레인산이나 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르 또는 리포좀 등을 포함한다. 선택적으로 상기 현탁액은 적절한 안정제나 고농축된 용액의 조제를 허용할 수 있도록 조성물의 용해도를 증가시키는 시약을 함유할 수 있다.

국소적인 또는 비강 투여를 위해서, 침투해야할 특별한 장벽에 적절한 침투제가 처방에 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 기술분야에서 알려진 표준 제조방법에 따라 충분히 생산될 수 있다.

상기 조성물은 또한 환자의 다양한 세포에서 더 많은 펩티드를 방출하게 하는 단계적 연속반응을 유발하는 하나 또는 그 이상의 펩티드 조절인자나 방출인자를 함유할 수 있다.

보다 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 바소프레신, 베타 엔돌핀, 및 엔케팔린을 함유할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 조성물은 CRF 결합 단백질(CRF binding protein, CRF-BP)을 함유할 수 있다. 이것은 CRF와 결합하며, 환자에서 CRF의 차후 방출에 대한 저장기(reservoir)로서 작용할 수 있다.

상기 조성물은 POMC 펩티드나 POMC 생성물을 함유할 수 있다. 어떤 POMC 생성물들은 환자들에게서 그 이후의 생산을 촉진하기 위하여 또는 내인성 POMC가 생성될 수 있기 전에 원하는 반응을 얻기 위하여 유용하게 투여할 수 있다.

인간 POMC는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/를 통하여 접근할 수 있는 OMIM의 일련번호 176830의 기재에 상세히 개시되어 있다. 상기 인간 POMC의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 GENBANK의 접속번호 BC065832로도 알려져 있다. 인간 POMC는 분자량 31kDa의 글리코실화된 단백질 전구체를 발생시킨다.

'POMC 펩티드'란 상응하는 서열, 구조 또는 기능을 가진 어떤 펩티드를 말한다. 상기 기재된 바와 같이 GENBANK에 기재된 인간 POMC에 대한 표준의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열이 주어진 경우 당업자가 그 펩티드의 기능이나 구조에 영향을 주지 않고 어느 정도 변화를 줄 수 있다는 것은 자명하다. 특히, 대립형질 변형체와 기능성 돌연변이들은 이러한 정의에 포함된다. 돌연변이들은 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "POMC 펩티드"는 MSH, ACTH, 적어도 하나의 LPH, β 엔돌핀 베타, met-엔케팔린 및 leu-엔케팔린 및 leu-엔케팔린을 언급하며, 바람직하게는 모든 α, β 및 γ LPH; 및 베타 LPH, met-엔케팔린 leu-엔케팔니

환자에게 CRF를 투여하는 것은 내인성 CRF의 생산을 촉진하는 것으로 생각되는데, 이는 프로애피오멜라노크로틴(POMC) 및 이와 관련된 성분 펩티드의 생성을 촉진하는 것으로 생각된다.

POMC는 숙주에 영향을 미치는 일련의 코르코트로픽 호르몬의 전구체인 (다수의 다른 조직, 흑색종과 같은 특정 종양 및 정상의 피부 세포뿐만 아니라) 뇌하수체에서 생성되는 펩티드(프로호르몬)이다. POMC는 알파, 베타 및 감마 멜라노사이트 자극 호르몬(MSH); 아드레노코르티코트로핀(ACTH); 베타 및 감마 리포트로핀(LPH); 및 베타 엔도트로핀에 대한 전구체이다. 상기 호르몬 모두는 단일한 거대 전구체인 POMC로부터 절단되며 이는 "POMC 생성물"로 명명된다.

'POMC 펩티드'란 적어도 한 가지 형태의 MSH, ACTH, 적어도 한 가지 형태의 LPH, β-엔돌핀, met-엔케팔린, leu-엔케팔린; 및 바람직하게는 모든 a, β 및 γ MSH; ACTH; β 및 γ LPH; 및 β 엔돌핀, met-엔케팔린 및 leu-엔케팔린의 전구체로 작용하는 임의의 펩티드를 의미한다. 돌연변이체는 보존적 아미노산 치환; 및 CRF의 단편 및 유도체를 포함한다.

본 연구는 POMC 펩티드의 개별 제품의 약제학적 잠재능력에 대하여 진행되어 왔지만, POMC 자체의 투여는 어떤 의약적 용도로도 결정된 바 없다. POMC 자체로는 불활성일 가능성이 있으며, 활성을 갖기 전에 그것의 생성물로 절단되어야 한다.

바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 비인간 POMC; 보다 바람직하게는 유제류의 POMC; 및 가장 바람직하게는 염소의 POMC를 함유한다. POMC가 뇌하수체에서 생성되고, 그래서 혈장에는 존재하지 않을 것이라고 생각되더라도, 적어도 유의한 수준에서, POMC, POMC 연관 펩티드 및 POMC 단계적 연속반응와 관련된 분자들을 함유하는 염소의 혈장이 확인되었다. 특별히, 염소가 출혈이나 접종과 같은 생리학적 스트레스를 받을 때 촉진되었다.

이것은 본 발명의 POMC에 대한 약제학적 조성물의 편리한 공급원이 된다. 또한, POMC는 환자들에게서 자기지속 효과를 가진 것으로 생각되며, POMC의 최초투여가 환자에게서 내인성 POMC의 합성을 유도한다; 결국, 초기에 POMC의 낮은 레벨의 투여도, POMC 펩티드의 레벨 증가를 포함하여, 환자에게 유의한 효과를 나타낼 수 있다.

POMC 및 그와 연관된 분자들을 환자에게 투여할 때, 상기 펩티드는 가수분해되어 환자가 쉽게 이용가능한 형태의 하나 또는 그 이상의 POMC 생성물을 공급한다. 또한 시상하부-뇌하수체-부신 축(hypothalamo-pituitary-adrenal axis, HPA)을 촉진하는 분자 단계적 연속반응의 유도하는 것이 알려졌다. 이것은 앞서 관찰된 정제되지 않은 염소 혈장의 효과와 일치한다. 예를 들어, 설하 투여에 대한 빠른 버즈효과(buzz effect)는 β-엔돌핀을 방출하는 POMC의 가수분해에 기인하며, β-엔돌핀은 점막을 통해 흡수될 수 있다. 부가적으로 알파 MSH는 항염 효과를 보이는 IL-10과 TGF-β의 생산에 효과를 보이는 것으로 알려져 있으며, 이는 염소의 혈장에서 관찰된 것과 일치한다. 또한, 알파 MSH는 선구-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 방출을 억제하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기 조성물은 항-염증성을 가질 수 있다. 우리는 환자에게 투여할 혈장을 생산하기 위해 사용된 염소나 다른 동물로부터 항염증성 반응의 비활성 전이(passive transfer)가 있다고 생각한다. 이것은 다양한 활성인자가 혈장에서 보존되어 있는 상기 조성물을 조제하는데 사용되는 정제과정의 결과이다. 상기 조성물은 항염증 효과를 가지는 부가적인 활성 성분을 함유할 수 있다.

앞서 살펴본 바와 같이 초기의 POMC의 투여(선택적으로 CRF 및/또는 바소프레신과 함께)는 자연적인 POMC 및 그와 연관된 펩티드들의 생성을 촉진할 것이라고 생각된다. 또한, 본 발명은 외인성 POMC를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 POMC의 생성을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 외인성 POMC는 바람직하게는 비인간, 더욱 바람직하게는 염소의 POMC이다. 편리하게 투여는 피하주사로 하면, 환자의 시스템으로 차후에 서방(slow release)을 위한 활성 조성물의 피하 저장소(depot)를 제공한다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 POMC 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 또한 알파, 베타 또는 감마 멜라노사이트 촉진 호르몬(MSH); 부신피질 자극 호르몬(adrenocorticotrophin, ACTH); 베타 및 감마 리포트로핀(LPH); 및 베타 엔돌핀 을 둘 또는 그 이상 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. POMC의 가능한 가수분해물이 투여된다면, POMC로부터 유도되는 두 개 또는 그 이상의 각각의 호르몬의 투여에 의해 유사한 효과를 유도할 수 있을 것이다. 상기 약제학적 조성물은 개별 펩티드 또는 하나 이상의 선구 분자(예를 들면, POMC의 부분 조각 생성물)와 같은 언급된 호르몬들을 제공할 수 있다. 바람직하게는 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개 또는 일곱 개의 호르몬들이 이러한 분자들의 연속적인 생산에 대한 단계적 연속반응을 유도하는 약제학적 조성물(선택적으로 CRF를 함유하는)에 포함된다. 이러한 여러 가지 조성물은 이 조성물들과 결합하는 하나 또는 그 이상의 담체 분자와의 조합으로 제공될 수 있다. 담체 분자는 POMC 및 그와 연관된 펩티드들과의 조합에 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서 다발성 경화증; 류머티즘성 관절염; 시각 신경염; 운동 신경원 질환(motor neurone disease); 루푸스, 건선, 습진, 갑상선염 및 다발성 근염(polymyositis)을 포함하는 자기면역 질환; 축색돌기 또는 신경 손상; 암, 특히 골수종, 흑색종 및 림프종; 탈수초성 질환과 비탈수초성 질환계의 신경 장애; 성기능 장애, 특히 발기부전; CRF를 환자의 필요에 맞추어 투여하는 것을 포함하는 방법 등으로부터 선택되는 질병의 치료방법을 제공한다.

치료에 있어서 최적의 투여량은 아직 결정되지 않았지만, 환자를 치료하는데 0.01 내지 10 mg/kg 사이의 투여량으로 투여하는 것이 적당하다. 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 mg/kg 사이, 보다 바람직하게는 0.025 내지 2 mg/kg 사이, 가장 바람직하게는 0.05 내지 1 mg/kg 사이의 투여량이 적당하다. 예비 연구에서, 혈장 생성물은 총 단백질 농도를 4 mg/ml로 하여 환자에게 투여하였다.

투여되어야 할 정확한 투여량은 환자의 나이, 성별 및 몸무게, 치료제의 조제 및 방법에 의해 변화될 수 있으며, 치료되어야 할 장애의 성질과 엄중한 정도에 따라 변화될 수 있다. 식이 요법, 투여시간, 환자의 상태, 약의 조합 및 반응 민감성 같은 다른 인자들도 고려될 수 있다. 효과적인 식이요법은 그 치료를 담당한 임상의(clinician)에 의해 결정될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 치료제가 주어질 수 있으며, 일반적으로 3개, 5개 또는 그 이상의 치료제가 연속적으로 투여되고 난 후에 더 좋은 효과가 관찰되었다. 상기 조성물의 좋은 효과를 유지하기 위하여 반복 투여가 바람직할 수 있다.

상기 치료제는 어떤 효과적인 경로에 의해도 상관없지만, 근육내 또는 병소내 주사(intralesional injection), 경구투여, 에어로졸, 비경구 투여, 또는 국부투여와 같은 대안적 경로가 사용될 수 있다고 하더라도 피하주사가 바람직하다.

상기 치료제는 다른 조제형태가 사용될 수 있더라도, 액체 조제의 형태로 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 약제는 약제학적으로 허용되는 적당한 담체와 혼합될 수 있고, 경구투여, 국소투여, 또는 비경구투여의 경우에(정제, 알약, 캡슐, 과립 등) 적당한 성분의 고체로 조제될 수 있다.

본 발명은 또한 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 질병의 치료에 대한 약제의 조제에 있어 CRF의 용도을 제공한다. 또한, 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 질병의 치료에 대한 약제의 조제에 있어 POMC의 용도을 제공한다. 앞서 살펴본 바와 같이 여러 가지 다른 성분들과의 조합으로 투여될 수 있으나, 상기 CRF 또는 POMC는 분리 또는 정제된 CRF 또는 POMC일 수 있다. 특별히, 생활성 담체 단백질과 바소프레신이 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서 CRF 생산방법을 제공하는데, 상기 생산방법은 염소로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; 추출한 혈액 성분에서부터 혈장을 분리하는 단계; 및 고형 성분을 침전시켜 혈장을 정제하는 단계를 포함한다.

상기 침전물은 생리학적으로 허용가능한 완충용액(예를 들어, PBS 완충용액)에서 재현탁시킬 수 있다. 상기 현탁된 침전물은 분자량 컷-오프를 50,000 Da, 바람직하게는 40,000 Da, 보다 바람직하게는 31,000 Da로 설정하여 투석이나 투석여과법을 이용하여 더욱 정제될 수 있다.

상기 침전물은 CRF를 분리하기 위하여 예를 들면 항체나 친화성 정제(affinity purification) 등을 이용하여 더욱 정제될 수 있다.

혈장의 분리는 원심분리에 의하여 이루어질 수 있다.

혈장은 바이러스 여과(viral filtration)에 의해 더욱 정제될 수 있다. CRF 또는 POMC를 포함하는 혈장의 생활성 성분을 불활성화하거나 제거하지 않는 어떤 정제방법도 가능하다.

침전은 황산 암모늄 침전법이나 카프릴산 침전법으로 시행될 수 있다. 다른 적절한 침전제가 사용될 수 있다.

바람직하게는 염소는 면역화된 염소를 사용한다. 염소에 대한 면역화(immunization)는 CRF와 바소프레신의 생산을 촉진한다고 생각되며, 이는 혈장에서 높은 수준으로 나타난다. 또한, 이러한 방법은 염소를 면역시키는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로 염소에게 출혈과 같은 생리적 스트레스를 줄 수도 있다.

어떤 환경에서는 면역원의 사용이 필요하지 않을 수 있다고 생각되며, 그러한 유용한 생산물이 비면역화(즉, 특정한 면역원에 선-면역되지 않은)된 동물에서 얻어질 수 있다. 보통의 염소들도 미리 환경적인 면역원에 노출될 수 있다는 것이 인정되고, 이러한 염소들이 본 발명의 조성물의 준비에 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 면역화되지 않은 염소로부터 얻어진 혈장을 함유하는 약제학적 조성물을 포함하는 것을 의도한다. 또한, 본 발명은 앞서 '혈장 조성물의 사용'이라는 제목이 붙은 항목에서 언급된 여러 가지 질병이나 장애의 치료에 이러한 조성물이나 혈장을 사용하는 것 또는 그러한 질병이나 장애의 치료용 약제를 조제하는 데 상기 조성물이나 혈장을 사용하는 것에도 확장된다. 본 발명은 또한 면역되지 않은 염소로부터 얻어진 혈장으로부터 POMC 및/또는 CRF을 조제하는데에도 확장된다.

발명의 상세한 설명

혈장 조성물의 조제

약 400 cc의 혈액을 염소에서 멸균 기술을 이용하여 취한다. 한 번 출혈시키고 나면 그만큼 부피의 혈액이 다시 채워지도록, 동물은 일반적으로 10 내지 14일 정도 후에 재출혈시키게 된다. 출혈전의 적절한 식이요법(regime)은 활성화된 조성물을 가진 혈장의 생성을 촉진하는데 유용하다. 다음에, 혈장은 과포화된 황산 암모늄(47%용액, 4℃)으로 처리하여 항체와 다른 물질들을 침전시킨다. 남은 용액을 Beckman J6M/E에서 3500 rpm으로 45분동안 원심분리하고 난 후, 상등액은 제거한다. 침전된 면역글로불린과 다른 고형 물질들은 PBS 완충용액(phosphate buffered saline)에서 침전물이 다시 충분히 녹을 때 까지 현탁시킨다.

이 용액은 분자량 컷-오프가 10,000 Dalton으로 PBS 완충용액에 대하여 4℃에서 투석여과를 시킨다. 투석여과를 시킨후 결과물은 멸균 용기에서 0.2 미크론 필터로 여과시키고, 단백질의 농도가 4 mg/ml이 되도록 맞춘다.

검토

혈장의 효과는 앞서 기재되었으나 활성 성분의 결정(determination)은 수행하지 않았다.

혈장 조성물의 분석

상기 조성물의 시료가 젤(gel)에서 크기로 분리되었고, β 엔돌핀에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블랏이 수행되었다. 겉보기 분자량이 대략 31 kDa으로 β 엔돌핀의 예상 크기보다 훨씬 크기는 하지만, β 엔돌핀의 존재를 보여주는 강력한 신호가 검출되었다. 이것은 시료안의 β 엔돌핀은 더 큰 펩티드의 한 부분으로 존재함을 암시한다. 그 크기는 POMC와 일치한다.

우리는 또한 상기 조성물의 질량분석을 수행하였고, 적어도 2개의 POMC-유래 펩티드, 즉 β 엔돌핀과 콜티코트로핀-연관 분자를 검출하였다. CRH-BP (corticotropin releasing hormone binding protein)도 또한 확인되었다.

도 1 내지 4

POMC 펩티드와 CRF-BP는 터모피네간(Thermofinnegan) LCQ 질량분석기로 생성물내에서 확인하였다. CRF는 주로 뇌하수체 전엽에서 ACTH의 합성과 분비를 조절한다. CRF 및 CRF-BP에 부가하여 POMC의 및/또는 그 성분 펩티드의 투여는 단계적 연속반응 효과를 일으켜서 전신에 그리고 지속적으로 POMC 펩티드의 농도를 높이는 작용을 한다고 생각된다. CRF-BP는 CRF의 저장고로서의 역할을 행할 수 있는 능력을 가졌다.

도 1 내지 4는 SDS-PAGE에 의해 트립신 가수분해물의 오염된 단백질로부터 생성물을 분리하여 질량분석기의 분석결과를 얻은 것이다. 상술된 바와 같이, 이러한 몇몇 분자들은 POMC 단계적 연속반응의 조절자와 유도물질이다. 예를 들면, 펩티드 분획물, 면역침전 및 농도 등에 초점이 맞춰진 분석이 사용된 심화된 연구에서는 더 많은 펩티드가 나타나게 된다. 도 1은 POMC-유도 콜티코트로핀의 존재를 보여주며, 도 2는 CRF-BP의 존재, 도 3은 프로엔케팔린 A 및 도면 4는 프로엔케팔린 B의 존재를 보여준다. CRF-BP의 존재는 POMC 및 그와 연관된 펩티드가 명백히 존재하더라도 상기 조성물이 CRF를 어느 정도 함유하고 있다는 것을 제안한다.

우리는 또한 환자 자신의 혈장에 혈장 조성물을 처리한 효과에 대하여 연구하였다. 이러한 효과들은 이하에서 설명한다.

치료는 환자의 혈장에서의 단백질/펩티드 발현을 유도한다.

도 5는 치료 전후의 환자 혈장의 질량분석 결과를 보여준다. 2 내지 10 kD의 스펙트럼이 비교된다. 이 분자량의 범위는 관심의 대상이 된 생활성 펩티드와 관련된 범위이다. 2 내지 6 kD의 영역에서 펩티드 발현에서의 명확한 차이가 혈장 처리 전후의 프로필을 비교함으로써 보여질 수 있다. 용이한 비교를 위하여, 상기 프로필의 중첩 화면 역시 제공된다.

도 6은 6명의 치료받은 펩티드/단백질 발현의 비교이다. 각 환자는 특히 4 kD 영역에서의 펩티드/단백질의 수준이 증가하였음을 볼 수 있다.

도 7a는 백신 접종 전(선-면역 프로필, 맨 위 패널)의 비처리(unprocessed) 염소 혈장의 질량분석 프로필, 면역화후 53일을 경과한 비처리 혈장 및 처리한 생성물이다. 아래 두 개의 패널에서는 혈장의 프로필이 선-면역 프로필의 그것과 유의하게 차이가 나며, 이는 단백질 발현의 유도를 나타냄을 알 수 있다. 여기에 나타난 프로필은 활성 산물을 나타내며, 특별한 면역/출혈 프로토콜은 이러한 혈장 프로필을 유도하는데 유용함을 보여준다. 상기 프로필의 중첩화면은 도 7b에 표시하였다.

POMC 펩티드 유도의 증거

도 8은 치료를 받기 전후 환자의 혈장에서의 ACTH 수준의 비교를 나타낸다. 또한 이 결과는 건강한 자원자들의 혈장에서의 ACTH의 수준과 치료받은 환자에 투여된 생성물에서의 그것과 비교하였다. 혈장은 1:100으로 희석되고 혈장의 ELISA를 이용하여 생성물과 비교하였다. 데이터는 세 번의 측정결과의 평균이며, +/- 표준 오차를 표시하였다. n=5의 처리 후; n=3의 처리 전; 정상인 사람의 n=5의 혈장. 상기 데이터는 치료로 인한 ACTH 수준의 증가를 보여준다.

도 9는 치료를 받은 환자의 혈장과 같은 환자의 치료를 받기 전의 혈장에서의 β 엔돌핀의 수준을 비교하였다. 이 결과는 상기 결과물과 건강한 자원자들의 혈장에서의 수준을 비교한다. 혈장은 1:100의 비율로 희석되어 혈장의 ELISA를 이용하여 조성물을 비교하였다. 데이터는 세 번의 측정결과의 평균이며, +/- 표준 오차를 표시하였다. 상기 데이터는 치료로 인한 β 엔돌핀 수준의 증가를 보여준다.

치료받은 환자에서의 전-염증성 TH -1 프로필에서부터 항-염증성 TH -2 시토카인의 프로필까지의 스위치에 대한 증거

도 10은 치료 전후의 두 개의 환자 그룹의 혈장에서의 TGF-β 수준을 보여준다. 각 그룹의 n=3이며, 두 그룹의 환자는 생성된 TGF-β 농도의 측변에서 다른 반응을 보여주지만, 모든 환자는 치료에 대한 반응의 측면에서 혈장 수준의 증가를 보여주었다(pre sera = 치료전 환자들의 혈장 수준, post 2^nd 및 post 5^th = 2번째와 5번째 치료 후). 상기 자료는 치료가 항-염증성 사이토카인인 TGF-β의 농도 증가를 유도한다는 것을 보여준다.

도 11은 치료 전(pre-sera) 및 후의 환자들 한 그룹의 혈장에서 IL-4의 수준을 보여준다. 치료 후(post 2^nd) 환자의 혈장(n=5)에서 IL-4의 수준은 유의하게 증가하였다. 하지만, 다섯 번째 치료후에는 모든 환자들에서 IL-4의 수준이 감소하였으나, 치료 전의 수준보다는 높은 수준에서 유지되었다. IL-4는 TH-1 세포로부터 pro-염증성 시토카인의 생성을 억제조절(downregulate)하는 것으로 알려져 있다. 이것은 모든 환자들에게서 보여진 농도의 일치하는 변화가 TH-1에서 TH-2로의 스위치에서 IL-4의 역할과 일치한다.

도 12는 치료 전후의 환자들의 한 그룹의 혈장에서의 IL-6의 수준을 보여준다. 환자의 혈장에서 치료 후 (post 2^nd and post 5^th) IL-6의 수준이 감소한 것을 볼 수 있다.

도 13은 치료 전후의 환자들의 한 그룹에서의 혈장에서 IFN- 수준을 보여준다. 치료후(post 2^nd and post 5^th) 환자들의 혈장에서 IFN-가 감소하는 것을 볼 수 있다.

도 14는 인간의 말초 혈액 세포(PBMCs)의 처리는 단핵백혈구의 하위 개체군에서 항-염증성 시토카인 IL-10의 생성을 유도한다는 것을 보여준다. T 및 B 림프구와 단핵백혈구는 인간 지원자로부터 얻어진 PBMCs로부터 분리되었다. 모든 세포 형태가 생성량의 동등한 투여량으로 16시간동안 처리되었고, 이들 상등액은 ELISA를 사용하여 IL-10에 대해 분석되었다. T 세포 개체군에 의해 생성된 IL-10 수준은 치료에 의해 영향을 받지 않음을 볼 수 있고, B 세포에서만 IL-10의 약간의 증가를 볼 수 있다. 하지만, 단핵백혈구 개체군에서는 치료에 의한 IL-10의 농도의 유의적 증가가 있었다. 모든 측정은 세 번의 표준 편차 측정으로 이루어졌다. 상기 데이터는 최소한 세 번의 분리된 실험을 대표한다.

바소프레신과 CRF 유도의 증거

도 15는 대조군의 환자와 조성물로 치료받은 환자 및 pre-treatment의 생성물에서의 바소프레신의 비교 수준을 보여준다. 도면은 어떤 혈장 그룹 간에도 유의적인 차이가 없음을 보여주지만, 조성물은 환자에게서 반응을 이끌어 내기에 충분한 바소프레신 수준의 유의적 증가를 포함한다. 바소프레신은 CRF와 함께 상승적으로 POMC를 분비시키는 것으로 알려져 있다. 모든 측정은 세 번의 표준 편차 측정으로 이루어졌다. 상기 데이터는 최소한 세 번의 분리된 실험을 나타낸다. 환자들은 치료전 n=3; 치료후 n=6이다.

도 16은 위약(plecebo)와 비교하여 생성물에서의 CRF의 증가가 관찰되었고, 치료받은 환자와 치료받지 않은 개인의 비교; 후자는 치료에 대한 반응에서의 환자들의 CRF 유도에 대한 증거가 된다. 모든 측정은 세 번의 표준 편차 측정으로 이루어졌다. 상기 데이터는 최소한 세 번의 분리된 실험을 나타낸다. 대조군인 개인은 n=4; 치료된 환자는 n=13.

요약 및 결론

따라서 예비적이기는 하나, 현재까지의 증거는 POMC의 생산을 유도하는 것으로 생각되는 CRF가 다른 성분들과 함께 주요 활성성분으로 작용한다는 것과 일치한다. 또한, POMC 그 자체 및 POMC-유도 펩티드들은 치료제로 사용될 수 있다는 증거도 있다. 이것은 CRF 및 POMC의 새로운 약제학적 조성물 및 용도를 암시하며, 또한 부가적으로 CRF 및 POMC를 사용하여 치료가능한 다른 장애들도 지적하였다. 우리는 또한 염소로부터 CRF 및 POMC를 편리하게 생산할 수 있는 방법도 제공하였다.

지금까지 상기 데이터는 조성물이 CRF, POMC 펩티드 및 항-염증성 시토카인(IL-10 및 TGF-β)을 포함하고 있을 뿐 아니라, CRF의 발현과 방출을 유도하여 환자들에게서 POMC 펩티드의 증가를 가져오게 하여, 환자들의 면역 프로필을 TH-1 전-염증성 프로필에서 현저하게 TH-2 항-염증성 프로필로 변화시킴을 암시한다.

본 발명의 조성물의 효과에 대한 다른 관찰은 활성 조성물인 CRF가 POMC 생성을 유도한다는 것과 일치한다. 예를 들어, 백혈구의 점착(adherence)에 대한 효과는 베타 엔돌핀에 의한 것으로 돌릴 수 있다. 상기 혈장 생성물은 인간 PBMC에 의한 IL-10의 생성을 증가시키고; 알파 MSH는 IL-10의 생성에 영향을 준다. 신경 전도 및 신경보호에 대한 효과는 ACTH 및 바소프레신에 속한 것이라고 생각할 수 있고; 식욕에 대한 효과는 알파 MSH에 의한 것일 수 있다. 데이터가 보여지진 않았지만, 상기 생성물 그 자체는 또한 유의적 수준의 IL-10 및 TGF-β를 함유한다.

알파 MSH는 모든 주요 형태의 염증에서 잠재적인 항-염증성 효과를 가지고 있고, TNFα 및 IL1-β 같은 전-염증성 시토카인의 효과를 억제한다. 상기 pro-염증성 시토카인 및 IL-10 및 TGF-β 수준의 증가를 포함하는 TH-2 항-염증성 시토카인 프로필의 성립(establishment, 치료과정 동안 계속 유지되는)의 환원에 기인한 조성물로 치료된 환자들에게서 관찰된 시토카인 시스템과 POMC 시스템 사이에 논란이 존재한다. 우리는 또한 혈장 생성물로부터 IL-1β 수준 증가를 확인하였다.

앞서 본 바와 같이 상기 혈장 생성물은 단백질 가수분해에 매우 민감하다; 이는 POMC가 가수분해되어 치료에 사용되는 개개의 호르몬을 제공한다는 가설과 일치하지만, 가수분해가 더 진행될 경우 활성이 감소된다. 특별히, 알파 MSH는 말단의 세 개의 펩티드 서열이 제거되는 경우 활성이 유의하게 감소하는 것으로 알려졌는데; 재언하면, 이것은 POMC를 포함하는 활성 조성물과 일치한다. 상기 조성물 그 자체는 속성상 불안정하여 활성 조성물의 수명이 짧지만 강력한 효과를 보인다.

우리는 혈장이 백혈구에 의한 산화질소 생성을 조절할 수 있다는 것을 제안할 수 있는 실험을 수행하였다; 이는 베타 엔돌핀의 효과와 일치한다. 우리는 또한 혈장의 면역조절 효과의 사실을 주장하며, 상기 혈장이 PHA에 의해 유도되는 PBMC 증식을 억제한다고 생각한다. LPS-유도 자극 및 혼합 림프구 반응에 대하여 상기 생성물이 존재하는 경우 PBMCs의 감소된 반응을 관찰하였다(데이터는 제시하지 않음).

상기 생성물은 또한, 인간의 뇌의 미세아교(microglial) 세포에서 티로신 인산화를 유도할 수 있으며, NFκB 경로를 조절할 수 있다는 것을 웨스턴 블롯을 통해 알 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). NFκB는 전-염증성 시토카인의 조절에 관여하는 유전자의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있으며, NFκB의 억제는 자가면역 질환에서 전-염증성 시토카인의 반응을 억제하며, 염증성 반응을 감소시킬 수 있다. 이에 대한 진전된 실험이 더 진행중이다.

몇몇 POMC 펩티드에 대한 수용체(MCR3 및 MCR4)는 시신경을 생성하는 레티널 신경교(ganglion) 세포에서 발견되며, 약제투여후 POMC 펩티드의 생성을 촉진할 수 있다. 이것은 앞서 기술한 시각 신경염의 MC 환자에게 실시된 실험에 의하여 미래의 어떤 급속한 발전의 원인이 될 수 있을 것이다. ACTH는 20 내지 30분 내에 효과를 나타내는 코리티코이드 경로를 촉발하는 것으로 알려져 있다.

전술한 데이터는 환자의 혈액 부피를 희석한 후의 환자에서의 치료 반응을 유도하기에 상기 생성물에서의 펩티드의 농도가 불충분할 수 있음을 암시한다. 하지만, 상기 생성물은 치료된 환자에서 생활성 펩티드의 합성과 분비를 촉발하는 생화학적 단계적 연속반응을 유도하여 국소적으로 작용할 수 있었다(피하 bolus에 주사된 경우). 현재는, 상기 생성물을 간섭할 수 있는 어떤 약제의 처리는, 예를 들어 수용체에 대한 경쟁제나 HPA에서의 방해제 같은 것은 피해야 한다는 것이 알려져 있다.

이러한 가설을 지지하기 위하여 코르티코트로핀 시스템을 유도하고 조절하는데 관여하는 어떤 부가적인 분자(소위, CRH 결합 단백질, leu-엔케팔린, 코르티코트로핀-리포트로핀 전구체 및 pro-엔케팔린 A 전구체)를 상기 생성물의 질량분석을 통해 확인하였다(도 1 내지 4). 부가적으로, 더 중요할 수 있는데, 우리는 두 개의 중요한 POMC 펩티드가 유의하게 환자의 혈장에서 치료전 및 건강한 대조군 지원자들의 수준과 비교하여 상향 조절되고 있다는 것을 발견하였다. 면역학적 데이터와 함께 이 결과는 상기 치료가 환자에서 환자의 면역학적 프로필을 TH-1 전-염증성 프로필에서 TH-2 항-염증성 플로필로 전환시키는 POMC 펩티드의 발현과 분비를 유도한다는 것을 암시한다. 상기 환자에서의 이러한 단계적 연속반응 기작의 심화된 해석이 현재 실험중이다.

상기 생성물이 속성상 항-염증성을 띄고 있다고 하더라도, 염증 반응을 완전히 억제하는 것은 아니다. 우리의 데이터는 생성물이 자가 면역 질환에서 보여지는 바람직하지 않은 TH-1 사이토카인 프로필로부터 보다 바람직하게 균형잡힌 시토카인 수준으로의 이동을 유도한다는 것을 제안한다. 이것은, 치료후 좀 경과되면 TH-1 신경계가 낮은 수준에서 유지된다고 하더라도, 치료후 초기에 TH-1 신경계가 종료되고 급속한 항-염증성 TH-2로의 이동으로 나타날 수 있다.

상기 보고된 혈장조성물의 종양에 대한 효과는 혈장의 항-혈관생성(angiogenic) 효과에 대한 가능성을 생각하도록 한다. 이러한 관점에서, 단백질 트롬보스폰딘-1(TSP-1)과 혈소판 인자 4(PF-4)가 SDS-PAGE 젤로부터 트립신 가수분해물의 질량분석 결과로부터 확인되었다. 펩티드 동정에 대하여 바이오워크 브라우저(Biowork browser)를 사용하여 컴퓨터 데이터베이스를 검색한 결과는 인간(Homo sapiens)를 포함하는 여러 종을 망라하는 강한 일치(match)를 보여준다. 상기 생성물에서의 TSP-1 및 PF-4 단백질 함량의 정밀한 정량화는 아직 이루어지지 않았으나, SDS PAGE 젤에서의 단백질 밴드의 가시적인 속성은 상기 단백질들이 생물학적으로 유의적인(나노그램 이상의) 양이 나타난다는 것을 보여준다.

상기 생성물의 가정된 성분들의 요약 및 치료방법이 도 17에 나타나 있다. 상기 생성물은 CRF-BP, 베타 엔돌핀, 바소프레신 및 엔케팔린의 어떤 수준과 함께 CRF를 함유하고 있다고 생각된다. CRF는 환자내에서 베타 엔돌핀과 엔케팔린과 함께 CRF의 심화된 생산을 유도한다. 내인성 CRF는 다른 ACTH, 알파 MSH 및 베타 엔돌핀 중에서 일어나는 POMC를 생성하게 한다. 이중 마지막 생성물은 고수준에서는 CRF 분비를 억제하지만, 저 수준에서 심화된 CRF 분비를 촉진하며, 피드백 루프에서 작용한다. 이는 전체적인 CRF/POMC 단계적 연속반응은 환자에서 다양한 조건에서 놀라운 이로운 효과를 설명할 수 있는 면역학적인 스위치를 유도하는 것으로 생각된다.

본 발명의 여러 가지 측면이 동반하는 도면을 참조하여 실험예로서 기재될 것이다.

도면 1 내지 4는 혈장조성물의 트립신 가수분해물의 질량분석 결과이며;

도면 5 내지 7은 상기 조성물로 처리하기 전후의 환자들의 혈장에 대한 질량 분석 결과이며;

도면 8 및 9는 상기 조성물로 처리된 POMC 펩티드의 유도를 분석한 것이고;

도면 10 내지 14는 상기 조성물로 처리한 환자의 염증 프로필에서의 스위치에 대한 증거를 보이고 있고;

도면 15는 인간의 혈장과 조성물에서 바소프레신의 레벨을 보여주며;

도면 16은 인간의 혈장과 조성물에서 CRF의 레벨을 보여주며; 그리고

도면 17은 상기 조성물과 그들의 작용 방법에 대한 제안된 요소들의 정리 도면이다.

Claims

코르티코트로핀 방출인자(CRF) 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 염소의 CRF를 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 바소프레신, 베타 엔돌핀 또는 엔케팔린 중 어느 하나 또는 그 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, CRF 결합 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, POMC 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, α, β 및 γ MSH; ACTH; β 및 γ LPH; met-엔케팔린, leu-엔케팔린 또는 베타 엔돌핀 중 어느 하나 또는 그 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
외인성 POMC를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 POMC 생산 촉진 방법.
제 7항에 있어서, 외인성 CRF를 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 POMC 생산 촉진 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 외인성 바소프레신을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 POMC 생산 촉진 방법.
POMC 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물.
분리된 CRF 펩티드의 의약의 제조에의 용도.
분리된 POMC 펩티드의 의약의 제조에의 용도.
치료를 요하는 환자에게 CRF를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증; 류마티즘성 관절염; 시각 신경염; 운동 신경세포 질환; 루푸스, 건선, 습진, 갑상선염 또는 다발성 근염을 포함하는 자가면역 질환; 축색돌기나 신경 손상; 특별히 골수종, 흑색종 또는 임파종과 같은 암; 탈수초성과 비탈수초성 질환 모두를 포함한 신경 장애; 염증 상태; 비만; 신경 전도 장애; 성기증 장애, 특히 발기부전으로부터 선택된 장애에 대하여치료방법.
치료를 필요로 환자에게 POMC를 투여햐는 단계를 포함하는 다발성성 경화증; 류마티즘성 관절염; 시각 신경염; 운동 신경세포 질환; 루푸스, 건선, 습진, 갑상선염 또는 다발성 근염을 포함하는 자가면역 질환; 축색돌기나 신경 손상; 특별히 골수종, 흑색종 또는 임파종과 같은 암; 탈수초성과 비탈수초성 질환 모두를 포함한 신경 장애; 염증 상태; 비만; 신경 전도 장애; 성기능 장애, 특히 발기부전으로 구성된 군으로부터 선택된 장애의 치료방법.
염소로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계; 상기 수득한 혈액 성분으로부터 혈장을 분리하는 단계; 및 고형 성분을 침전시켜 혈장을 정제하는 단계를 포함하는 CRF를 생산하는 방법
환자에게 CRF를 투여하는 단계를 포함하는

류마티즘성 관절염; 시각 신경염; 운동 신경세포 질환; 축색돌기나 신경 손상;

암, 특히 골수종, 흑색종 및 임파종;

뇌혈관 허혈성 장애, 알츠하이머, 헌팅턴 무도병(chorea), 혼합성 결합조직 질환(mixed connective tissue diseases), 피부 경화증(scleroderma), 아낙필락시스(anaphylaxis), 패혈성 쇼크, 심장염과 심장내막염, 상처치유, 접촉성 피부염, 직업성 폐 질환, 글로멀네프리티스(glomerulnephritis), 이식 거부반응, 측두 동맥염(temporal arteritis), 혈관 장애(vasculitic diseases), 간염과 화상(burns), 다중계 위축(atrophy), 간질, 근 위축증, 정신분열증, 쌍극성 장애(bipolar disorder)와 우울증, 채널병증(channelopathies), 미애스테니아 그래비스(myaesthenia gravis), 악성 신생물(malignant neoplasia)에 기인한 통증, 만성 피로 증후군, 섬유근염(fibromyositis), 과민성 장 증후군, 작업관련 상지 장 애(work related upper limb disorder), 군발성 두통, 편두통과 만성 일상성 두통 등을 포함하는 탈수초성 질환 및 비탈수초성 질환;

신경계 감염증, 신경 포착성 장애(nerve entrapment)와 국소적 손상(focal injury), 외상성 척수손상(traumatic spinal cord injury), 상완 신경총 병변(brachial plexopathy)(특발성과 외상성, 상완 신경염, 파르소니지 터너 증후군, 신경통성 근 위축증), 신경근병증(radiculopathy), 채널병증과 유통성(有痛性) 티크(tic douloureux) 등을 포함하는 탈수초성 질환;

루푸스, 건선, 습진, 갑상선염, 다발성 근염 등을 포함하는 자가면역 질환;

염증상태;

유전성 운동 및 감각 신경 장애; 샤코-마리-투스 질환(이하 CMT라 한다) 타입의 CMT1A, CMT1B, CMT2, CMT3(데제린 소타스 질환), CMT4(A, B, C 및 D 타입), CMTX(X-연관된 CMT); 유전성 신경 편향 압박 마비 증세(또는 절단성 신경병증이라고도 한다); 난청의 유전성 운동 및 감각 신경 장애(Lom(HMSNL)); 기부의(proximal) 유전성 운동 및 감각신경 장애 / 신경세포병증(HMSNP); 유전성 신경통성 근 위축; 유전성 감각 및 자율 신경 장애(HSAN1, HSAN2, HSAN3(또는 레일리-데이 증후군이나 선천성 자율신경 이상(familial dysautonomia)이라 함), HSAN4, HSAN5); 선천성 아밀로이드 다발성 신경병증 타입, 타입 , 타입 , 타입 ; 염색변성적 백혈구 발육 이상증(Metachromatic Leukodystrophy); 크라베 질환(Krabbe's Disease); 파브리 질환(Fabry's Disease); 부신백질이영양증(Adrenoleukodystrophy); 레프섬 병(Refsum's disease, HMSN IV); 탕지어 병(Tangier Disease); 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia); 모든 타입의 척수 소뇌 실조증(Spinal cerebellar ataxia, 이하 SCA라 함) - SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, SCA14, SCA16; 척수소뇌성 실조증(Spinocerebellar Ataxia); 코케인 증후군(Cockayne's syndrome) 및 거대 축삭 신경병증(Giant axonal neuropathy);

만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP: chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)와 길리안-바레 증후군;

개의 아토피성 피부염, 개의 구강 흑색종(oral melanoma)과 말의 폐질환 장애로 구성되는 군으로부터 선택된 질병에 대한 치료, 경감 또는 예방방법.
환자에게 POMC를 투여하는 단계를 포함하는

류마티즘성 관절염; 시각 신경염; 운동 신경세포 질환; 축색돌기나 신경 손상;

암, 특히 골수종, 흑색종 및 임파종;

뇌혈관 허혈성 장애, 알츠하이머, 헌팅턴 무도병(chorea), 혼합성 결합조직 질환(mixed connective tissue diseases), 피부 경화증(scleroderma), 아낙필락시스(anaphylaxis), 패혈성 쇼크, 심장염과 심장내막염, 상처치유, 접촉성 피부염, 직업성 폐 질환, 글로멀네프리티스(glomerulnephritis), 이식 거부반응, 측두 동맥염(temporal arteritis), 혈관 장애(vasculitic diseases), 간염과 화상(burns), 다중계 위축(atrophy), 간질, 근 위축증, 정신분열증, 쌍극성 장애(bipolar disorder)와 우울증, 채널병증(channelopathies), 미애스테니아 그래비스(myaesthenia gravis), 악성 신생물(malignant neoplasia)에 기인한 통증, 만성 피로 증후군, 섬유근염(fibromyositis), 과민성 장 증후군, 작업관련 상지 장애(work related upper limb disorder), 군발성 두통, 편두통과 만성 일상성 두통 등을 포함하는 탈수초성 질환 및 비탈수초성 질환;

신경계 감염증, 신경 포착성 장애(nerve entrapment)와 국소적 손상(focal injury), 외상성 척수손상(traumatic spinal cord injury), 상완 신경총 병변(brachial plexopathy)(특발성과 외상성, 상완 신경염, 파르소니지 터너 증후군, 신경통성 근 위축증), 신경근병증(radiculopathy), 채널병증과 유통성(有痛性) 티크(tic douloureux) 등을 포함하는 탈수초성 질환;

루푸스, 건선, 습진, 갑상선염, 다발성 근염 등을 포함하는 자가면역 질환;

염증상태;

유전성 운동 및 감각 신경 장애; 샤코-마리-투스 질환(이하 CMT라 한다) 타입의 CMT1A, CMT1B, CMT2, CMT3(데제린 소타스 질환), CMT4(A, B, C 및 D 타입), CMTX(X-연관된 CMT); 유전성 신경 편향 압박 마비 증세(또는 절단성 신경병증이라고도 한다); 난청의 유전성 운동 및 감각 신경 장애(Lom(HMSNL)); 기부의(proximal) 유전성 운동 및 감각신경 장애 / 신경세포병증(HMSNP); 유전성 신경통성 근 위축; 유전성 감각 및 자율 신경 장애(HSAN1, HSAN2, HSAN3(또는 레일리-데이 증후군이나 선천성 자율신경 이상(familial dysautonomia)이라 함), HSAN4, HSAN5); 선천성 아밀로이드 다발성 신경병증 타입, 타입 , 타입 , 타입 ; 염색변성적 백혈구 발육 이상증(Metachromatic Leukodystrophy); 크라베 질환(Krabbe's Disease); 파브리 질환(Fabry's Disease); 부신백질이영양증(Adrenoleukodystrophy); 레프섬 병(Refsum's disease, HMSN IV); 탕지어 병(Tangier Disease); 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia); 모든 타입의 척수 소뇌 실조증(Spinal cerebellar ataxia, 이하 SCA라 함) - SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, SCA14, SCA16; 척수소뇌성 실조증(Spinocerebellar Ataxia); 코케인 증후군(Cockayne's syndrome) 및 거대 축삭 신경병증(Giant axonal neuropathy);

만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP: chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)와 길리안-바레 증후군;

개의 아토피성 피부염, 개의 구강 흑색종(oral melanoma)과 말의 폐질환 장애로 구성된 군으로부터 선택된 질병에 대한 치료, 경감 또는 예방방법.