JP2583248B2 - 免疫療法剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は原発性・二次性免疫不全症、細菌・真菌・ウ
イルス・原虫等による感染症及び癌の治療に有効な免疫
療法剤に関する。

より詳細に記すと、本発明はヒトBCDFを有効成分とす
る免疫療法剤に関する。

〔従来技術〕

抗原刺激を受け活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の
助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細
胞にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上の
Ｔ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知ら
れている。この物質の存在はR.W.Duttonら（Transplan
t.Rev.2366（1975））,A.SchimplとE.Wecherら（Nature
N.Biol.237,15（1972））により明らかにされた。

その後、マウス及びヒトにおいて、このような因子の
存在を示す機能上の証拠が蓄積されており、現在ではこ
のようなＢ細胞を抗体産生細胞へと分化させる因子をＢ
細胞分化因子（BCDF）と総称するようになっている。

このようにBCDFはヒトの体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしており、このような重要な作用を有す
るヒトBCDFについて、本発明者等は研究を重ね、そのDN
A配列、及びアミノ酸配列を決定し（特願昭61−184858,
61−200433）し、また大腸菌によりヒトBCDFの生産に成
功している（特願昭61−302699）。

しかしながら、今までこのヒトBCDFの癌・感染症・原
発性免疫不全症あるいは二次性免疫不全症、例えば悪性
腫瘍患者に対する化学療法・放射線療法等の処置によっ
て見られる白血球数の減少、抗体産生の低下に対する薬
効についての報告はない。

なおヒトBCDFをBSF−２あるいはインターロイキン６
（IL−６）と呼ぶことも提唱されているが、（Nature,3
24,73（1986）,EMBO.J.,６,1219（1987））ここでは従
来よりのBCDFなる名称を用いる。またここで用いるヒト
BCDFはインターフェロン活性を有さず、よってインター
フェロン活性を持つ。IFN−B₂標品（ヨーロッパ公開特
許No.0220574）とは異なる。

ここでまずヒトBCDFを含有する免疫療法剤が効果を呈
す癌・免疫不全症及びこれと関連して起こる感染症につ
いて概説するとともに、現在行なわれている治療法につ
いて簡単に説明する。

免疫不全症候群とは免疫系のいずれかに欠陥が存在
し、生体の防御能が低下している状態の総称である。

免疫不全症候群は大きく２つに分けられ、先天的要因
に基づいて発症したと考えられる原発性免疫不全症と、
何らかの外因あるいは他の疾患に付随して起こったと考
えられる二次性免疫不全症に大別される。

原発性免疫不全症の原因はＴ細胞、Ｂ細胞の遺伝的欠
陥による場合が多い。一方、二次性免疫不全症の原因は
多岐にわたるが、主たる原因の一つは細菌・ウイルス等
の感染による場合で、特に最近、ある種のウイルスによ
り惹起されるエイズ（AIDS）は社会的に大きな問題を呈
している二次性免疫不全症の一例である。

また、二次性免疫不全症は悪性腫瘍患者に制ガン剤の
使用、放射線照射療法の実施等により、白血球数が著し
く減少した為に生じる場合もある。免疫不全症になると
生体防御能が低下してくる為に感染症が多発してくる。
その感染症の病原体は多くがそれまで無害であって生体
の変化に応じて病原性を発揮してきたもので、このよう
な感染症を日和見感染と呼んでいる。このような感染症
は抗癌剤投与、とくに急性白血病の化学療法や骨髄移植
時には高頻度にみられ、その死亡率も高い。日和見感染
の一例がガリニ原虫により引き起こされるカリニ肺炎で
あり、これはエイズの末期症状である。

さて、これらの原発性・二次性免疫不全症の治療には
以下の３つの方法が行なわれている。

抗生物質、抗フイルス剤（例えばエイズの場合には
AZT）等化学療法剤の投与。

ヒト免疫グロブリンまたはワクチンの投与。

両者の併用。

しかし、免疫機能が低下している状態ではいずれも大
きな効果を示さない。更に上記治療剤には以下に示す欠
点がある。

まず、抗生物質、抗ウイルス剤は副作用が大きく、し
かも抗生物質の場合は耐性菌の出現や菌交代現象が起こ
るため、有効性が限定されている。また、免疫グロブリ
ン製剤の場合は対象感染菌に対する抗体含有量が微量で
ある為に効果が弱い。またワクチンは免疫不全状態では
効果がほとんど見られない。

さらに二次性免疫不全症をきたす例として、癌患者に
化学治療法剤を投与して造血機能が低下し易感染症状態
を招いたような場合、上記治療剤は低下した造血機能を
回復させたり、癌細胞そのものを正常細胞へと分化誘導
する作用を有さない。従って根本的な治療は不可能であ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

そこで本発明の目的は従来にこない副作用の少な
い、耐性菌の出現や菌交代現象の問題がない、対象
抗原に対する特異的抗体産生を誘導し強化する、造血
機能を回復させる、癌細胞の正常作用への分化誘導を
導く、等の作用を合せもつ癌、原発性・二次性免疫不全
症及び免疫不全症からもたらされる各種感染症の治療薬
の提供である。

〔問題点を解決する為の手段〕

本発明者等は上記問題点を解決する為に鋭意研究を重
ねた結果、ヒトBCDFを有効成分とする免疫療法剤が癌・
原発性・二次性免疫不全症及びこれらから生じる各種感
染症に対して有効であることを見い出し本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はヒトBCDFを有効成分とする免疫療
法剤である。本発明に係るヒトBCDFは例えば下記のアミ
ノ酸配列（Ｉ）を有する。

アミノ酸配列（Ｉ）： アミノ酸配列（II）： アミノ酸配列（Ｉ）は天然型ヒトBCDFであり、アミノ
酸配列（II）は天然型ヒトBCDFのＮ末端にAlaが１つ付
加されたポリペプチドア（以下ヒトAla−BCDFと記す）
である。しかし、本発明で用いるヒトBCDFは必ずしも上
記アミノ酸配列（Ｉ）で示される構造をとる必要はな
い。

即ち、天然型ヒトBCDFのＮ末端及び／又はＣ末端より
１個もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有す
るもの、天然型ヒトBCDFの構造中の１個もしくは複数個
のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された構造を有するも
のも、ヒトBCDF活性を有する限り本発明のヒトBCDFとし
て用いることができる。好ましくは天然型ヒトBCDFを用
いるのがよい。本発明に係るヒトBCDFの含量は該免疫療
法剤中0.0001〜100重量％、好ましくは0.1〜1.0重量％
である。

また本発明のヒトBCDFを有効成分とする免疫療法剤に
は血清アルブミン等の安定化剤、マンニトール等の賦形
剤を含有させてもよい。更に本発明の免疫療法剤にはヒ
トBCDF以外に、助剤としてヒトBCDF以外のサイトカイン
や免疫賦活剤、例えばヒトIL−２、ヒトIL−３、マウス
IL−３、ヒトIL−１、ヒトIL−４、ヒトIL−５、ヒトＧ
−CSF、ヒトGM−CSF、ヒトＭ−CSF及びレンチナンを１
種類以上含有させてもよい。

このような助剤を含有させると、免疫療法剤としての
効果は相乗的に増加する。

例えばIL−2,IL−4,IL−５は抗体産生増強をIL−1,IL
−3IL−4,G−CSF,GM−CSF,M−CSFは造血機能の亢進を、
IL−１は腫瘍細胞の分化誘導を相乗的に増強する。これ
らの助剤の添加量は特に限定しないが、ヒトBCDFを100
とした場合にそれぞれ0.0001〜200000重量％添加すれば
よい。

くり返し述べるが、これら助剤の添加量は決して上述
の値に限定されるものでなく、症状、患者の年令等によ
り適宜決定すればよい。

尚、ヒトIL−２、ヒトIL−３、マウスIL−３及びレン
チナン等の助剤は必ずしもヒトBCDFと同時に薬剤として
投与しなくともよい。即ち、ヒトBCDFを有効成分とする
免疫療法剤の投与前又は後の適当な時期にこれらの助剤
を投与してもかまわない。

もちろん、本発明の免疫療法剤は他の化学療法剤（制
癌剤、抗ウイルス剤、抗生物質等）と併用してもかまわ
ない。またワクチン療法と併用してこれを強化しても良
い。本免疫療法剤は静脈内注射で用いてもよいし、筋肉
内注射・皮下注射で用いても良い。即ち、いずれの方法
を用いて投与してもかまわない。

さて、本発明に用いるヒトBCDFはヒトＴ細胞、Ｂ細
胞、先維芽細胞等より既知の方法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,5490（1985））により生産、精製したもので
も大腸菌、酵母、サル細胞（COS細胞）、ハムスター、
細菌など適当な宿主にヒトBCDFをコードする遺伝子を適
当なベクターを用いて形質転換された株を培養すること
により生産、更には精製したヒトBCDFを用いてもよい。
尚、ヒトBCDFの生産に関しては実施例で再び説明する。

本発明の免疫療法剤は、免疫不全症より派生する各種
感染症（例えばエイズより派生するカリニ肺炎等）の治
療・予防に有効である事は明瞭である。例えば、細菌・
真菌・原虫・ウイルス等の病原体が感染した場合、これ
に対する抗体が生体内でできれば、抗体は１）直接の中
和反応・沈降反応、２）オプソニン作用による食細胞の
食作用亢進、３）補体系活性化により溶菌反応、４）抗
体依存性細胞媒介細胞障害作用等により、生体を病原体
から防御する。

すなわち本発明の免疫療法剤は遺伝的要因等による原
発性免疫不全症及び化学療法剤投与や免疫抑制剤投与及
びウイルス感染等により免疫機能が低下している二次性
免疫不全症患者に対し、患者自身の特異的抗体産生を高
める事により、易感染症状態の改善・治療を導くことが
できる。

更に本発明者らはヒトBCDFが抗体産生増強にとどまら
ず、骨髄細胞の増殖、腫瘍細胞の分化誘導を行うことを
見い出した。これらの作用よりヒトBCDFは原発性免疫不
全症及び二次性免疫不全症患者に対して、抗体産生増強
作用による感染症治療のみならず、免疫不全症患者に対
する造血機能の亢進さらには癌患者に対する治療効果も
可能である事が判明した。

確かに以前にも１）IL−２が抗体産生増強能を有する
こと２）コロニー刺激因子（CSF）が骨髄細胞の増殖を
起こすこと３）γ−インターフェロン（γ−IFN）が腫
瘍細胞を分化誘導する作用を有することは知られていた
が、抗体産生増強骨髄細胞の増殖腫瘍細胞の分化
誘導という３機能を合せ持つ物質は現時点では知られて
いない。従って、本発明に係るヒトBCDFは従来にない画
期的な薬剤である。

〔効 果〕

本発明のヒトBCDFを有効成分として含有する免疫療法
剤は抗体産生増強骨髄細胞の増殖等造血機能の亢進
腫瘍細胞の分化誘導という３機能を合せもつことより
原発生免疫不全症、ウイルス感染や制癌剤・免疫抑制剤
投与及び放射線療法にともなう二次性免疫不全症及び癌
患者の治療に有効である。

また免疫不全症患者は当然、抗体産生が低下している
し、また造血機能が低下している為に各種感染症を併発
しているか、併発しやすい状態になっている。この本発
明のヒトBCDFを有効成分とする免疫療法剤はこれら感染
症の治療及び予防にも有効である。また本発明のヒトBC
DFは生体内由来物質である為に副作用等の問題も少ない
という利点もある。

以下、本発明を実施例に基ずいて更に詳細に説明す
る。

〔実施例1:ヒトBCDF及びヒトAla−BCDFの生産〕 まず天然型ヒトBCDF及びヒトAla−BCDFの製造法につ
いて説明する。尚、以後特別にことわりがない限り、ヒ
トBCDFと記せば、天然型ヒトBCDFを示すこととする。

（１） ΔHIL−２−BCDFの製造 ヒトBCDF及びヒトAla−BCDFは特願昭61−302699号明
細書記載の方法により製造した。すなわちヒトBCDF cDN
Aの５′末端側にヒトIL−2cDNAの一部が結合しているプ
ラスミドpTBCDF−12を保持するHB101株（FERM BP−140
4）を25μg/mlストレプトマイシンおよび25μg/mlアン
ピシリンを含むＬ培地（１％バクトトリプトン、0.5％
酵母エキス、0.5％NaCl、0.1％グルコース、pH7.5）10m
l中で37℃一晩成育させた。ついで培養懸濁液5mlをM9−
カザミノ酸培地（0.6％Na₂HPO₄・12H₂O,0.3％KH₂PO₄,0.
05％NaCl,0.1％NH₄Cl,0.05％MgSO₄・7H₂O,0.00147％CaC
l₂,0.2％グルコース,0.2％カザミノ酸,0.02％Ｌ−ロイ
シン、0.02％Ｌ−プロリン,0.0002％チアミン塩酸塩、1
00μg/mlアンピシリン、25μg/mlストレプトマイシン、
pH7.4）へ接種し、28℃にて３時間培養した。その後25
μg/mlになる様３−インドールアクリル酸（IAA）を添
加し、23℃にて21時間誘導培養した。培養菌体を遠心分
離し集め、10倍濃縮になるように、30mM NaClを含む20m
M Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を添加し、懸濁後、そこに
リゾチーム1mg/ml、EDTA0.05Mを添加し撹拌した後、氷
中にて、１時間放置した。次いで、超音波破砕で菌体を
破壊し、10,000rpm,5分間の遠心分離で顆粒を回収し
た。

この顆粒を6M塩酸グアニジンで可溶化し、ΔHIL−２
−BCDF濃度が100μg/ml、及び2M塩酸グアニジン溶液と
なるように、濃度調整を行ない、これに、酸化型グルタ
チオン1mMと還元型グルタチオン10mMを添加し、pH8.0、
室温で10〜16時間放置した。次にSephadexG−25による
ゲル濾過で塩酸グアニジンを除去すると同時に、カリク
レイン反応用緩衝液溶液となった、ヒトIL−２−BCDF相
当画分（以下ΔHIL−２−BCDF相当画分と記す）を得
た。本物質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より、分子量は、アミノ酸組成から計算した値とほぼ一
致し、又、プロテインシ−クエンサーにて、Ｎ末端側の
アミノ酸配列を検定した結果、ヒトIL−２の配列である
ことが確認された。

すなわち、このBCDF活性を有するポリペプチドは下記
のアミノ酸配列を有する。

（２） カリクレインによる切断 113mM NaClを組む、50mM Tris−HCl緩衝液、pH7.8中
で得られたΔHIL−２−BCDF21.4mgとヒトプラズマカリ
クレイン（シグマ社製）73.5μｇを37℃、16時間反応
後、逆相HPLCでヒトAla−BCDFに相当するアセトニトリ
ル約55％,TFA0.1％の画分を分取した。これをプロテイ
ン・シークエンサーにてＮ未満付近のアミノ酸配列を分
析した結果ΔHIL−２−BCDFがヒトAla−BCDF蛋白に変換
されたことが確認された。ヒトAla−BCDFの回収量は18.
03mg、回収率は84％であった。なお「ヒトAla−BCDF」
とは天然型ヒトBCDFのＮ末端にAla1個が付加したもので
あり、具体的には下記のアミノ酸配列を有する。

（３） アミノペプチダーゼＰによるＮ未満Alaの除去 アミノペプチダーゼＰは、Methods Enzymol.19,521
（1970）に記載されている方法により精製を行なった。

（２）で得られたヒトAla−BCDF溶液を、0.4mM MnCl
₂を含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）で平衡化したSe
phadex G−25によるゲル濾過でAla−BCDF相当画分を得
た。このようにして得られたAla−BCDF2.02mgにアミノ
ペプチダーゼＰを添加し、37℃、16時間反応後、逆相HP
LCでヒトBCDF相当画分を分取した。さらに、プロテイン
シークエンサーにてＮ末端側のアミノ酸配列を分析した
結果、ヒトAla−BCDFが定量的にヒトBCDFに変換された
ことが確認された。ヒトBCDFの回収量は2.0mgであっ
た。ヒトBCDFおよびヒトAla−BCDFの活性は第１表に示
した。活性単位はproc.Natl.Acad.Sci.USA,82,5490（19
85）の方法にて定めた。

（４） ヒトBCDFの製剤化 ヒトBCDFまたはヒトAla−BCDFのHPLC画分を−20℃に
て一夜放置し、上層のアセトニトリルを除去した。下層
をSephadex G−25によるゲル濾過または透析により、残
留するアセトニトリル及びTFAを除去し、PBS溶液に置換
した。これを希釈し、必要に応じてヒト、場合により他
の哺乳動物の血清アルブミン（0.1％）又は血清（２〜1
0％）を加えた後無菌濾過しヒトBCDF製剤及びヒトAla−
BCDF製剤とした。

〔実施例2:ヒトBCDF及びヒトAla−BCDFによるヒトＢ細
胞株SKW6−CL4の抗体産生増強〕 次にヒトBCDFまたはヒトAla−BCDFの特異的抗体産生
増強効果を確認した試験方法および結果について説明す
る。

ヒトＢ細胞株 SKW6−CL4×10⁴個を10％FBSを含むRPM
I1640培地100μに懸濁し、これにヒトBCDF（79ng/m
l）またはヒトAla−BCDF（57ng/ml）の２倍希釈列100μ
を加え96穴プレート（コーニング社25860）にて37℃,
5％CO₂存在下３日間培養し、培養上清のIgM量をELISA法
（Porc.Natl,Acad.Sci.USA,82,5490（1985））にて測定
した。

第１図に示すとおり、ヒトBCDF、ヒトAla−BCDFを加
えて培養したSKW6−CL4細胞からの抗体（IgM）産生はヒ
トBCDF非添加群に比し、有意に上昇した。尚、ヒトBCDF
とヒトAla−BCDFの抗体産生増強能には有意差は認めら
れなかった。

〔実施例3:ヒトBCDFとヒトIL−２の併用による抗体産生
増強〕 実施例２の条件にてヒトBCDF 1U/ml（200pg/ml）にヒ
トリコンビナントIL−２を50,000U/ml〜16U/ml（１μg/
ml〜0.32pg/ml）を加え、３日間培養後、抗体産生細胞
に分化した細胞数をリバースPFC法（Eur.J.Immunol.,1
3,31（1983））にて測定した。

第２図に示すとおり、ヒトBCDFとヒトIL−２を同時添
加する事により、おのおのの単独添加の場合に比べ強い
抗体産生の増強が確認された。

〔実施例4:ヒトBCDFによるヒト扁桃腺由来単核球細胞か
らの抗体産生増強〕 ヒト扁桃腺RPMI−1640＋10％FBS培地を用いて単細胞
化した。これをFicoll−sodium diatrizonate溶液を用
いて赤血球、多核白血球及び血小板と単核球細胞（リン
パ球、マクロファージ）とを分離した。この単核球細胞
（１〜２×10⁵/200μ RPMI 1640＋10％FBS/well）を
種々の濃度のPoke weed mitogen（PWN）及び種々の濃度
のヒトBCDFの存在下に７−８日間培養した。

尚、PWMはＢ細胞を刺激しブラスト細胞へ誘導する物
質である。

また、４日後培養液を一度交換しておいた。培養終了
後、培養上清中のIgM,IgG,IgAの濃度をSandwich enzyme
−linked immunosorbent assay（ELISA）にて測定した
ところ、ヒトBCDF添加によるIgM,IgG,IgA産生の亢進が
認められた（第３図）。

〔実施例5:ヒトBCDFによるPWM刺激ヒトＢ細胞からの抗
体産生増強〕 ヒト扁桃腺をRPMI1640＋10％FBS培地を用いて単細胞
化した。これをFicoll−sodium diatrizonate溶液にて
分離し単核球細胞を得た。この細胞をヒツジ赤血球との
ロゼット形成法、及び抗マクロファージ抗体（Leu−
１）＋補体処理法を用いてＢ細胞に精製した。

尚、ロゼット形成法はＴ細胞を除去する為の操作、ま
た抗マクロファージ抗体＋補体処理法は、マクロファー
ジを除去する為の操作である。

さて、このようにして得た精製Ｂ細胞を放射線照射Ｔ
細胞と0.25％PWMの存在下に３日培養後、パーコール密
度法によりＢブラスト細胞を得た。Ｂブラスト細胞（５
×10⁴〜１×10⁵200μ/well）をヒトBCDFと５日間培養
後、上清中のIgC濃度をELISAにて測定した。ヒトBCDF添
加によるIgG産生の亢進が認められた（第４図）。

〔実施例6:ヒトBCDFとヒトIL−２によるin vitro抗原感
作脾細胞の抗原特異的抗体産生増強〕 DBA/2マウス（雌性・８週令）脾細胞を常法に従い0.9
％NH₄Clで赤血球を除去し、抗Thy1抗体とモルモット補
体で処理してＴ細胞を除去し、Ｂ細胞を得た。

Ｂ細胞7.5×10⁵個と緬羊赤血球（SRBC）抗原１×10⁵
個を５％FBSを含むRPMI 1640培地200μに懸濁し、96
穴プレート（コーニング社25860）にて37℃,5％CO₂存在
下で５日間培養した。ヒトBCDF（125U/ml:50ng/ml）、
ヒトIL−２（400U/ml:8ng/ml）を適時添加した。

培養終了後、抗SRBC抗体産生細胞数を直接PFC法（免
疫実験操作法、P.479,日本免疫学会）にて測定した。

第５図に示すようにヒトBCDFは正常マウス脾細胞の特
異的抗体産生を増強した。またヒトBCDFとヒトIL−２を
併用するとその効果はさらに増強した。同様の効果は他
の系統のマウス、例えばBalb/cでも確認された。また胸
腺欠如によりＴ細胞機能が欠損しているBalb/c nu/nuマ
ウス由来の脾細胞を用いても第６図のように、同様の効
果が確認された。

〔実施例7:ヒトBCDFとヒトIL−２によるin vivo抗原感
作脾細胞の抗原特異的抗体産生増強〕 DBA/2マウス（雌性・８週令）に抗原として１×10⁸個
を尾静脈より注射し、感作した。４日後にマウス脾臓を
摘出し、実施例６の方法に従い感作Ｂ細胞を調製した。
Ｂ細胞7.5×10⁵個と抗原SRBC 1×10⁵個を５％FBSを含む
RPMI 1640培地200μに懸濁しヒトBCDF（50ng/ml）と
ヒトIL−２（8ng/ml〜80pg/ml）存在下で37℃,5％CO₂存
在下４日間培養、抗SRBC抗体産生細胞数を直接PFC法に
て測定した。

第７図に示すようにヒトBCDFを添加する事により、非
添加群に比し有意の特異的抗体産生増強が認められた。
またヒトBCDFとヒトLI−２との明瞭な併用効果が見られ
た。

〔実施例8:ヒトBCDFによるin vivo抗原感作脾細胞の抗
原特異的抗体産生増強〕 LPS低応答性マウスC3H/HeJマウス（雌性、８週令）に
SRBC 1×10⁸個を静脈内注射し、５日後に脾臓を摘出し
脾細胞を得た。脾細胞（５×10⁵/well）をSRBC（１×10
⁵/well）と各種濃度のヒトBCDF存在下に４日間培養し培
養終了後、細胞を回収、カニンガムチェンバーを用いて
SRBC特異的抗体産生細胞数を測定した。第８図に示すよ
うに、SRBCで一次免疫したこの系においては、ヒトBCDF
単独でもSRBC感作脾細胞からの抗体産生を増強した。ま
たこの増強は、ウサギ抗ヒトBCDF抗血清により完全に阻
止された。

〔実施例9:ヒトBCDF投与による血中抗体価の亢進 抗原としてSBRCを用いて１次免疫応答及び２次免疫応
答に対するヒトBCDFの生体内投与の効果を検討した。

１次免疫応答の場合、DBA/2マウス（６週齢♀）１ぴ
きあたりに１×10⁸個のSRBC（１×10⁸/headと略する。
尚、headとは１ぴきに該当する）静脈内（以下ivと略す
る）投与した。投与後５日間連日ヒトBCDFを0.1μg/hea
dもしくは１μg/head皮下（以下SCと略する）投与し
た。SRBC投与後６日目の血清を採取し、SRBC特異的抗体
量を96穴マイクロプレートを用いてSRBC凝集試験にて測
定した。

２次免疫応答の場合、DBA/2マウス（６週齢♀）に１
×10⁶head SRBCをiv投与した。25日後同量のSRBCをiv投
与し、投与後７日間ヒトBCDFを0.1μg/headもしくは１
μg/head SC投与した。最初のSRBC投与後33日目に血清
を採取し、凝集力価を求めた。

第２表に示すように、ヒトBCDF投与は量的依存性に１
次、２次いずれの場合においても血中の抗体レベルを亢
進させた。

次に制ガン剤５−フルオロウラシル（協和醗酵株式会
社製、５−FU）を投与し、免疫不全症モデルを作成し、
ヒトBCDF投与の効果を検討した。即ち、DBA/2マウスに
５−FUを0.5mg/head3日間連日iv投与後、３日目にSRBC
を１×10⁸/head iv投与した。SRBC投与後２日目より３
日間ヒトBCDFを0.01μg/head〜1.0μg/head連続SC投与
した。

SRBC投与後５日目に血清を採取し、SRBC特異的抗体量
を96穴マイクロプレートを用いてSRBC凝集試験にて測定
した。凝集力価は希釈倍率の逆数を用いて表した。

５−FU投与により低下した血中抗体価はヒトBCDF投与
により量的依存性に回復した（第９図）。

〔実施例１％：ヒトBCDF投与による血中抗菌抗体価の上
昇〕 DBA/2マウス（♀性、６週齢）に肺炎桿菌〔klebsiell
a pneumoniae以下K.pneumoniaeとする〕死菌を2.5μg/h
ead腹腔内（ipと略する）投与した。

６日間、連日0.1μg/head量のヒトBCDFを皮下（sc）
投与し、菌体投与７日目に採血した。

K.pneumoniaeに対する特異的抗体量は下記の如くELIS
A法にて測定した。

即ち、K.pneumoniae死菌を96穴マイクロプレートにコ
ーティング後、感作マウス血清を添加し、結合した抗−
K.pneumoniae抗体をアルカリフォスファターゼ標識ヤギ
抗マウスIgM抗体を用いて定量した。

第３表に示うように、ヒトBCDF投与により抗体価の上
昇が認められた。また、二次免疫応答においても、抗原
としてSRBCを用いた場合と同様、ヒトBCDFは血中、抗K.
pneumoniae抗体値を上昇させた。K.pneumoniaeの１回及
び２回目の投与間隔は20日で、１回目投与後上記と同様
にヒトBCDFを投与し、血中抗体価を測定した。

結果は第３表に示した。

〔実施例11:ヒトBCDF投与による造血機能の亢進〕 DBA/2マウス（６週令）にシクロホスファミド（CY）
を4mg/head腹腔内投与後（day0）、ヒトBCDFを0.1〜10
μg/head7日間（day0〜day6）連日皮下及び腹腔内投与
した。翌日、脾臓を摘出後、脾細胞を調整した。

この調整脾細胞7.5×10⁴個を10％PWM刺激脾細胞培養
上清（以下PWM−SUPとする）と共に６日間寒天培地にて
培養し、クラスターの形成を測定した。

第10図に示すようにヒトBCDFの投与によりクラスター
の形成が亢進し、この効果は量的依存性であった。

前述のメチルセルロース系にてPWM刺激脾細胞培養上
清の代わりにIL−３を用いても第８表のように同様の結
果が得られた。

また、増殖している細胞を固定した結果、顆粒球及び
マクロファージ系であった。

尚、投与日数としてはCY投与後８日間連投での効果が
顕著であった。

これらの結果よりBCDFが単独あるいはIL−３と併用で
免疫抑制マウスの造血機能を亢進させる事が確認され
た。

〔実施例11:ヒトAla−BCDFによる癌細胞の分化促進活
性〕 次にヒトBCDFまたはヒトAla−BCDFが癌細胞を分化さ
せ、抗腫瘍活性を示す事を確認した試験方法及び結果に
ついて説明する。

ヒト骨髄性単球様細胞株THP−1,KG−１をそれぞれ２
×10⁵個/mlの細胞濃度に10％FBS含有RPMI1640培地で懸
濁し、24穴プレート（コーニング社25820）に１ウエル
当り1mlを添加し、37℃,CO₂5％条件で２日間培養した。
この培養系にヒトAla−BCDF（20ng/ml〜5pg/ml）を添加
して癌細胞の分化に対する効果を検討した。すなわち２
日後の細胞のFcレセプター発現率を感作牛赤血球を用い
たロゼット法（Cancer Research,44,5127（1984）によ
り求め分化の指標とした。結果は第11図のように、ヒト
Ala−BCDFは骨髄腫単球様細胞株THP−1,KG−１のFcレセ
プター発現を有意に上昇させた。

また、ヒトBCDFと他のサイトカインであるヒト−1L−
１（10U/ml）を同時添加し、骨髄性白血病細胞U937（２
×10⁵/Well）細胞を２日間培養した結果、第５表に示す
ようにヒトBCDFとヒトIL−１は相乗的に作用してU937の
Fcレセプター発現を増強した。他の分化指標であるラテ
ックス貪食能、NBT還元能においても同様の結果が認め
られた。

よってヒトBCDFは単独またはヒトIL−１との併用にて
癌細胞の正常細胞への分化を亢進し、抗腫瘍効果を示す
と考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトAla−BCDF及びヒトBCDFによるヒトＢ細胞S
KW6−CL4からの抗体産生の増強を示す。 第２図はヒトBCDFのSKW6−CL4細胞からの抗体産生誘導
作用がヒトIL−２を同時添加する事により増強される事
を示す図面である。 第３図はヒトBCDFによる扁桃線由来単核球細胞からの抗
体産生の増強を示す図面である。 第４図はヒトBCDFによるPWM刺激Ｂ細胞からの抗体産生
の増強を示す図面である。 第５図はDBA/2マウス脾細胞の抗原特異的抗体産生がヒ
トBCDF及びヒトIL−２を添加する事により増強される事
を示す図面である。 第６図は胸腺機能を欠如したBalb/cヌードマウス脾細胞
の抗原特異的抗体産生がヒトBCDF及びヒトIL−２を添加
する事により増強される事を示す図面である。 第７図は生体内感作した抗原に対する抗原特異的抗体産
生がヒトBCDF及びヒトIL−２を添加する事により増強さ
れる事を示す図面である。 第８図は生体内感作した抗原に対する抗原特異的抗体産
生がヒトBCDFを単独で添加する事により増強される事を
示す図面である。 第９図は免疫不全症モデルにおける抗原特異的抗体産生
の低下が、ヒトBCDFを生体内投与する事により回復する
事を示す図面である。 第10図はヒトBCDFを生体内投与する事により制癌剤投与
マウスの造血機能が亢進する事を示す図面である。 第11図はヒトAla−BCDFがヒト骨髄腫細胞株の分化を誘
導することを示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/54 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 審査官 松浦 新司 (56)参考文献 特開 昭60−169424（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−150297（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａ ｃｔａ，Ｖｏｌ．673，Ｎｏ．４ （1981），Ｐ．552〜569 Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．72，Ｎｏ．６ （1988），Ｐ．2070〜2073

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列（Ｉ）で示されるヒト
   Ｂ細胞分化因子（以下、ヒトBCDFと記す）を有効成分と
   する免疫療法剤。 アミノ酸配列（Ｉ）
2. 【請求項２】免疫療法剤が骨髄細胞増殖作用を有する特
   許請求の範囲第（１）項記載の免疫療法剤。
3. 【請求項３】免疫療法剤が腫瘍細胞の分化誘導作用を有
   する特許請求の範囲第（１）項記載の免疫療法剤。
4. 【請求項４】免疫療法剤がヒトBCDF以外に助剤としてヒ
   トインターロイキン２（以下ヒトIL−２と記す）又はヒ
   トインターロイキン３（以下ヒトIL−３と記す）を含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の
   免疫療法剤。