KR20070004822A - 소포성 구내염 바이러스의 상승적 감쇠, 그의 벡터 및 그의 면역원성 조성물 - Google Patents

소포성 구내염 바이러스의 상승적 감쇠, 그의 벡터 및 그의 면역원성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광범위하게는 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 의 상승적 감쇠에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 포유동물에서 VSV 벡터의 병원성을 상승적으로 감쇠시키는 조합된 돌연변이 클래스의 동정 및 이들을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

소포성 구내염 바이러스의 상승적 감쇠, 그의 벡터 및 그의 면역원성 조성물 {SYNERGISTIC ATTENUTATION OF VESICULAR STOMATITIS VIRUS, VECTORS THEREOF AND IMMUNOGENIC COMPOSITIONS THEREOF}
본 발명은 일반적으로 바이러스학, 미생물학, 감염성 질환 및 면역학의 분야에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 상이한 클래스의 돌연변이화의 조합에 의한 소포성 구내염 바이러스의 상승적 감쇠 및 그의 벡터에 관한 것이다.
랍도바이러스 (Rhabdoviridae) 과의 일원인 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 은 비분절화된, 네거티브-센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 그의 11 kb 게놈은 바이러스의 5 종의 구조 단백질을 코딩하는 5 개의 유전자를 갖는다; 뉴클레오캡시드 단백질 (N), 이는 복제된 RNA 의 캡슐화를 위해 화학량론적 양으로 필요함; 인단백질 (P), 이는 RNA-의존성 RNA 중합효소 (L) 의 보조인자임; 매트릭스 단백질 (M) 및 결합 당단백질 (G) (예를 들어, 참고문헌으로 Gallione 등, 1981, Rose 및 Gallione, 1981; Rose 및 Schubert,. 1987 및 Schubert 등, 1985; U.S. 특허 6,033,886; U.S. 특허 6,168,943 참조).
VSV 는, 가장 일반적으로는 소, 말, 돼지 및 설치류인 각종 포유류 숙주에 옮겨질 수 있는 절지동물 유래 바이러스이다. 인간의 VSV 감염은 일반적인 것이 아니며, 일반적으로 자각증상이 없거나 또는 합병증없이 3 내지 8 일 동안 동반하는 약한 감기 비슷한 증상을 특징으로 한다. VSV 는 인간 병소로 간주되지 않으므로, VSV 에 대한 기존의 면역성은 인간 집단에서는 드물고, VSV 유래성 벡터의 개발은 면역원성 조성물 및 유전자 요법과 같은 영역에 촛점을 두고 있다. 예를 들어, VSV 가 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 (Roberts 등, 1999), 홍역 바이러스 H 단백질 (Schlereth 등, 2000) 및 HIV-1 env 및 gag 단백질 (Rose 등, 2001) 을 발현하는 면역원성 조성물에 대한 고효율 벡터로서 제공될 수 있다는 연구가 확립되어 왔다. VSV 가 유망한 벡터가 되도록 하는 다른 특징들에는 하기가 포함된다: (a) 세포 배양시 활발하게 복제하는 능력; (b) 숙주 세포 DNA 로 통합되지 않거나 또는 유전자 재조합을 겪지 않는 능력; (c) 1 차 접종-부스트 (prime-boost) 면역화 전략을 가능하도록 하는 다중 항원형의 존재성; (d) 관심대상의 외래 유전자가 VSV 게놈으로 삽입되어 바이러스 전사효소에 의해 대용량 발현됨; 및 (e) 바이러스 게놈의 cDNA 복제본으로부터 감염성 바이러스의 포획을 위한 고도의 특정화된 시스템의 개발 (U.S. 특허 6,033,886; U.S. 특허 6,168,943).
자연적인 감염 동안 VSV 신경학적 수반의 미미한 증거가 있지만, 야생형 바이러스, 마우스 뇌 계대 야생형 바이러스 또는 세포 배양 적응 야생형 바이러스가 뇌내 (설치류의 경우, 비내) 접종된 동물 (예를 들어, 영장류, 설치류, 가축) 은 질환의 임상적인 징후를 발생시킬 수 있고, 일반적으로 접종 후 2 내지 8 일 내에 폐사한다. 이들 관찰사항 및 예외적인 안전성 프로파일을 가진 인간용 면역원성 조성물을 위한 벡터 제작에 대한 수요 때문에, 개발 중인 VSV 벡터는 엄격하게, 영장류 및 소형 동물 신경독력 (neurovirulence) 모델에서 시험한다. 이들 시험들은 인간 임상 시험으로의 진출 전에 감소된 VSV 벡터에서의 임의의 잔류 독력을 검출하도록 고안되었다.
기본형-VSV 벡터의 감쇠는 시험관내 연속 계대 및 게놈 cDNA 의 합성 및 조립 동안 바이러스 게놈을 통틀어 다중의 뉴클레오티드 치환의 누적으로부터 초래된다. 상기 돌연변이화는 바이러스로 하여금 마우스에서 그것이 유래된 실험실-적응성 바이러스보다도 덜한 병원성이 되도록 하는 다면발현성 효과를 갖는다 (예를 들어, 참고문헌으로 Roberts 등, 1998 참조). 원형 (prototype) 의 추가로 감쇠된 VSV 벡터는 또한 바이러스 G 단백질의 세포질의 말단 영역의 절단으로 발생하여, 감염된 세포의 세포막으로부터의 버딩 (budding) 에서 검출되는 VSV 돌연변이체를 유도한다 (Schnell 등, 1998).
추정컨대 감쇠되거나 또는 그렇지 않은, 최근 공지된 VSV 벡터는, 소형 동물 및 비-인간 영장류 신경독력 모델에서 시험하는 경우 허용불가한 수준의 잔류 독력을 갖는다. 면역원성 조성물, 유전자 요법 벡터 등을 위한 벡터용의 VSV 벡터의 개발은 동물 신경독력 모델에서 최소한 내지 비검출성 수준의 병원성을 갖는 VSV 벡터를 필요로 한다. 이에 따라, 필연적으로 유전자 개질을 동정하기 위해 바이러스 벡터의 분야에서, 포유류에서 현저하게 감소된 (또는 제 거된) 병원성을 갖는 감쇠된 VSV 돌연변이체가 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 광범위하게는 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 의 상승적 감쇠에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 포유류에서 VSV 벡터의 병원성을 상승적으로 감쇠시키는 조합된 돌연변이 클래스의 동정 및 그의 면역원성 조성물에 관한 것이다.
이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명은 그의 게놈에서 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 포함하는 유전자 개질 VSV 에 관한 것이며, 여기서 2 가지의 돌연변이가 상승적으로 VSV 병원성을 감쇠시킨다. 한가지 특별한 구현예에서, VSV 병원성은 추가로 신경독력으로서 정의된다. 또다른 구현예에서, 돌연변이화의 클래스는 온도민감성 (ts) 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 (G-stem) 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
한가지 특별한 구현예에서, 상기 2 가지의 VSV 돌연변이는 절단형 G 유전자 돌연변이 (이후, "G(ct)") 및 N 유전자 섞기 돌연변이 (즉, N 유전자는 그의 야생형 3' 프로모터-부근의 제 1 위치로부터 VSV 의 유전자 방향으로 더욱 원거리의 위치로 옮겨감) 이다. 또다른 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 VSV G 단백질은 말단부에 20 개의 카르복시-말단 아미노산 (이후, "G(ct-9)") 에 결실이 있다. 또다른 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 VSV G 단백질은 말단부에 28 개의 카르복시-말단 아미노산 (이후, "G(ct-1)") 에 결실이 있다. 또다른 구현예에서, VSV N 유전자는 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대하여 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞이는데, 여기서 N 은 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 는 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 은 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G 는 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 은 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자이다. 특정 구현예에서, VSV 는 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하며, 여기서 N 은 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 는 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 은 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-1) 은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질 말단 영역을 가진 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-9) 은 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질 말단 영역을 가진 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 은 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자이다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-PMNG(ct-1)L-5' 이다. 또다른 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-PNMG(ct-1)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, VSV 은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서, 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입, 유전자 결실 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다.
특정 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 개질된 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100 배 더 큰 LD50 을 갖는다. 특정 다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 1,000 배 더 큰 LD50 을 갖는다. 또다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 10,000 배 더 큰 LD50 을 갖는다. 또다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100,000 배 더 큰 LD50 을 갖는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 절단형 G 유전자 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-9)) 을 갖는다. 다른 구현예에서, M 유전자 비-세포변성 돌연변이 (이후, "M( ncp )") 는 M 단백질의 위치 33 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M33A) 및 위치 51 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M51A) 이다. 한가지 특별한 구현예에서, VSV 는 3'-NPM(ncp)G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM(ncp)G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 또다른 구현예에서, VSV 는 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, G-스템 돌연변이 또는 점 돌연변이이다.
하기에 섹션 A.3 에서 제시되지만, VSV G, M, N, P 또는 L 유전자들 중 임의의 한 ts 돌연변이는 본 발명의 한 구분되는 "돌연변이 클래스" 이다. 이에 따라, 본 발명의 특정 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 ts N 유전자 돌연변이 (이후, "N(ts)") 및 ts L 유전자 돌연변이 (이후, "L(ts)") 이다. 한가지 특별한 구현예에서, VSV 는 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 특정 다른 구현예에서, VSV 는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 또는 유전자 결실 돌연변이이다.
특정 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 G-스템 돌연변이 (이후, "G(stem)") 및 유전자 섞기 돌연변이이다. 다른 구현예에서, VSV 는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터에 관한 것인데, 여기서 2 가지의 돌연변이가 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다. 이후 정의되는 바와 같이, "외래 RNA" 서열은 야생형 VSV 의 게놈에 대해 내재성이 아닌 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 한가지 특별한 구현예에서, 벡터 병원성은 추가로 신경독력으로서 정의된다. 특정 다른 구현예에서, 외래 RNA 는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 으로서 정의된다. 특정 다른 구현예에서, 돌연변이의 클래스는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한가지 특별한 구현예에서, 2 가지의 VSV 벡터 돌연변이는 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이이다. 또다른 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실 또는 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는다. 특정 다른 구현예에서, N 유전자 VSV 벡터는 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인다. 한가지 특별한 구현예에서, VSV 벡터는 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 벡터 게놈은 3'-PMNG(ct-1)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, 돌연변이화 벡터 게놈은 3'-PNMG(ct-1)L-5' 이다.
또다른 구현예에서, VSV 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다. 특정 다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100 배 더 큰 LD50 를 갖는다. 또다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 개질된 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 1,000 배 더 큰 LD50 를 갖는다. 또다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 10,000 배 더 큰 LD50 를 갖는다. 또다른 구현예에서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 는 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100,000 배 더 큰 LD50 를 갖는다.
특정 다른 구현예에서, 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈에 삽입되거나 또는 이를 대체하는 외래 외래 RNA 는 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스 유전자, 수두대상포진 (Varicella-Zoster) 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 (Norwalk) 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 (Marburg) 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 (metapneumovirus) 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 (Vibrio Cholera) 유전자, 폐렴 연쇄구균 (Streoticoccus pneumoniae) 유전자, 화농 연쇄구균 (Streptococcus pyogens) 유전자, 무유성 연쇄구균 (Streptococcus agalactiae) 유전자, 수막염균 (Neisseria meningitidis) 유전자, 임균 (Neisseria gonorrheae) 유전자, 디프테리아균 (Corynebacteria diphtheria) 유전자, 파상풍균 (Clostridium tetani) 유전자, 보르데텔라 백일해 (Bordetella pertussis) 유전자, 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 유전자, 헤모필루스 (Haemophilus) 유전자, 클라미디아 (Chlamydia) 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인 유전자, T-헬퍼 에피토프, CTL 에피토프, 아쥬반트 유전자 및 보조인자 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 유전자이다. 한가지 특별한 구현예에서, 외래 RNA 는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 및 vpu 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 gag 유전자는 위치 1 내지 위치 5 에서 VSV 게놈에 삽입된다. 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 벡터의 게놈은 3'-gag1-PNMG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 이다.
또다른 구현예에서, 외래 RNA 는 종양 (예를 들어, 악성 종양) 에 대한 보호적인 면역 응답성의 유도를 위한 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원을 발현한다. 상기 종양 특이적 또는 종양 관련 항원에는, 이에 제한되지 않으나, KS 1/4 범 (汎)-암종 항원; 난소 암종 항원 (CA125); 전립선 산 인산; 전립선 특이적 항원; 흑색종 연관 항원 p97; 흑색종 항원 gp75; 고분자량 흑색종 항원 및 전립선 특이적 멤브레인 항원이 포함된다.
특정 다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 벡터 돌연변이는 G(ct) 돌연변이 및 M(ncp) 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-9)) 을 갖는다. 또다른 구현예에서, M( ncp ) 돌연변이는 M 단백질의 위치 33 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M33A) 및 위치 51 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M51A) 이다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 게놈은 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다. 특정 구현예에서, VSV 벡터는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 유전자를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-9)L-5', 3'-MPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-MPM(ncp)G(ct-9)L-gag5-5' 이다.
또다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 벡터 돌연변이는 N(ts) 유전자 돌연변이 및 L(ts) 유전자 돌연변이이다. 한가지 특별한 구현예에서, 벡터는 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다. 특정 구현예에서, VSV 벡터는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 유전자를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)gag5-5' 이다.
하기 섹션 A.1 에 제시된 바와 같이, 3' 내지 N, P, M, G 또는 L 유전자 중 임의의 것에 대한 VSV 게놈으로의 외래 핵산 서열 (예를 들어, HIV gag) 의 삽입은 "유전자 섞기 돌연변이" 를 유효하게 제공한다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 2 가지의 VSV 벡터 돌연변이는 G(stem) 돌연변이 및 유전자 섞기 돌연변이이다. 한 구현예에서, 돌연변이화 벡터 게놈은 3'-gag1-MPMG(stem)L-5' 이다. 다른 구현예에서, VSV 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 면역원성 투여량의 유전자 개질 VSV 벡터 및 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 1 가지 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 여기서 상기 2 가지 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다. 또다른 구현예에서, 돌연변이의 클래스는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 2 가지 돌연변이는 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이이다. 특별한 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-9)) 을 갖는다. 또다른 구현예에서, N 유전자는 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해서 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인다. 특정 구현예에서, 면역원성 조성물의 VSV 벡터는 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, 면역원성 조성물의 돌연변이화 벡터 게놈은 3'-PMNG(ct-1)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, 돌연변이화 벡터 게놈은 3'-PNMG(ct-1)L-5' 이다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 VSV 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 점 돌연변이, G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다.
특정 다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 유전자 개질 VSV 벡터에 삽입되는 외래 RNA 는 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인 유전자, T-헬퍼 에피토프, CTL 에피토프, 아쥬반트 유전자 및 보조인자 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한가지 특별한 구현예에서, 외래 RNA 는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 및 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 단백질을 코딩한다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 gag 유전자는 게놈의 위치 1 내지 위치 5 에서 VSV 게놈에 삽입된다. 또다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 VSV 벡터는 3'-gag1-PNMG(ct-1)-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다.
특정 다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 VSV 벡터는 G(ct) 돌연변이 및 M(ncp) 돌연변이를 포함한다. 또다른 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-9)) 을 갖는다. 또다른 구현예에서, M( ncp ) 돌연변이는 M 단백질의 위치 33 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M33A) 및 위치 51 에서의 메티오닌에서 알라닌으로의 돌연변이 (M51A) 이다. 한가지 특별한 구현예에서, 면역원성 조성물은 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 VSV 게놈을 포함한다. 또다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 VSV 벡터는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다. 또다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 유전자 개질 VSV 벡터에 삽입되는 외래 RNA 는 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인으로 코딩되는 유전자, T-헬퍼 에피토프로 코딩되는 유전자, CTL 에피토프로 코딩되는 유전자, 아쥬반트로 코딩되는 유전자 및 보조인자로 코딩되는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, HIV 유전자는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-NPM(ncp)G(ct-9)L-gag5-5' 이다.
특정 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 N(ts) 유전자 돌연변이 및 L(ts) 유전자 돌연변이를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, 면역원성 조성물은 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 VSV 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다. 또다른 구현예에서, 면역원성 조성물의 유전자 개질 VSV 벡터에 삽입되는 외래 RNA 는 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, HIV 유전자는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 이다.
특정 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 G(stem) 돌연변이 및 유전자 섞기 돌연변이를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, 면역원성 조성물은 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 정맥내, 진피내, 피하, 근육내, 복막내, 경구, 직장, 비강내, 협측, 질 및 생체외로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 통상적인 경로를 통해 투여된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은, 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 하나 이상의 HIV RNA 서열을 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터의 면역원성 투여량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, HIV 감염에 대해 포유류 대상체를 면역화시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 2 가지 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시키며, 상기 HIV RNA 는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 및 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원을 코딩한다. 특정 구현예에서, VSV 벡터는 3'-gag1-PNMG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5', 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-gag5-5', 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'- N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 이다.
특정 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b) 를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터의 면역원성 투여량을 투여하는 것을 포함하는 박테리아 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법에 관한 것이다: (a) 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 (여기서 상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킴) 및 (b) 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열 (여기서, 상기 RNA 는 비브리오 콜레라 단백질, 폐렴 연쇄구균 단백질, 화농 연쇄구균 단백질, 무유성 연쇄구균 단백질, 헬리코박터 파일로리 단백질, 수막염균 단백질, 임균 단백질, 디프테리아균 단백질, 파상풍균 단백질, 보르데텔라 백일해 단백질, 헤모필루스 단백질, 클라미디아 단백질 및 대장균 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 단백질을 코딩함).
한가지 특별한 구현예에서, 2 가지의 돌연변이는 G(ts) 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질은 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인 G(ct-9) 을 갖는다. 특정 다른 구현예에서, N 유전자는 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인다. 다른 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-5' 이다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 게놈은 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PNMG(ct-1)L-5' 이다.
다른 구현예에서, VSV 는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b) 를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법에 관한 것이다: (a) 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 (상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킴) 및 (b) 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 부분에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA (여기서, 상기 RNA 는 HIV 단백질, HTLV 단백질, SIV 단백질, RSV 단백질, PIV 단백질, HSV 단백질, CMV 단백질, 엡스테인-바아 바이러스 단백질, 수두대상포진 바이러스 단백질, 볼거리 바이러스 단백질, 홍역 바이러스 단백질, 인플루엔자 바이러스 단백질, 폴리오바이러스 단백질, 리노바이러스 단백질, 형 간염 바이러스 단백질, B 형 간염 바이러스 단백질, C 형 간염 바이러스 단백질, 노워크 바이러스 단백질, 토가바이러스 단백질, 알파바이러스 단백질, 루벨라 바이러스 단백질, 광견병 바이러스 단백질, 마르부르그 바이러스 단백질, 에볼라 바이러스 단백질, 파필로마 바이러스 단백질, 폴리오마 바이러스 단백질, 메타뉴모바이러스 단백질 및 코로나바이러스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 단백질을 코딩함). 한가지 특별한 구현예에서, RNA 는 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 유전자이다.
특정 구현예에서, 2 가지의 돌연변이는 G(ct) 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이이다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, HIV 유전자는 gag 인데, 여기서 상기 gag 유전자는 위치 1 또는 위치 5 에서 VSV 게놈에 삽입되는데, 여기서 상기 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-PNMG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 이다. 또다른 구현예에서, VSV 는 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이이다.
바이러스 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법의 다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 G(ct) 돌연변이 및 M( ncp ) 돌연변이를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-gag5-5' 이다. 또다른 구현예에서, VSV 게놈은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
바이러스 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법의 다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 N(ts) 유전자 돌연변이 및 L(ts) 유전자 돌연변이이다. 한가지 특별한 구현예에서, 돌연변이화 VSV 게놈은 3'-N(ts)PMGL(ts)-5', 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 이다. 또다른 구현예에서, VSV 게놈은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
바이러스 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법의 다른 구현예에서, 2 가지의 VSV 돌연변이는 G(stem) 돌연변이 및 유전자 섞기 돌연변이이다. 한 구현예에서, 돌연변이화 게놈은 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 이다. 또다른 구현예에서, VSV 게놈은 추가로 그의 게놈에 제 3 의 클래스의 돌여변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이이다.
본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 하기의 상세한 설명, 그의 바람직한 구현예 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 야생형 VSV (3'-NPMGL-5'), N 섞기 VSV 돌연변이체 (3'-PNMGL-5' [N2], 3'-PMNGL-5' [N3] 및 3'-PMGNL-5' [N4]), G 단백질 세포질의 말단 (ct) 절단 VSV 돌연변이체 (3'-NPMG(ct-9)L-5' [CT9] 및 3'-NPMG(ct-1)L-gag5-5' [CT1-GAG5]) 및 조합된 VSV N 섞기/G 단백질 ct 절단 돌연변이체 (3'-PNMG(ct-1)L-5' [N2CT1], 3'-PNMG(ct-9)L-5' [N2CT9], 3'-PMNG(ct-1)L-5' [N3CT1] 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' [N3CT9]) 의 성장 동역학 (pfu/mL 대 시간) 을 보여준다. 약자 "in" 은 설정된 도면 주석이 VSV 의 인디애나 균주를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 2 는 야생형 VSV (3'-NPMGL-5') 및 G 단백질 ct-1 VSV 돌연변이체 (3'-NPMG(ct-9)L-gag5-5') 에 대한 N 섞기 VSV 돌연변이체 (3'-PNMGL-5', 3'-PMNGL-5' 및 3'-PMGNL-5') 의 성장 동역학의 비교이다.
도 3 은 야생형 VSV (3'-NPMGL-5') 및 G 단백질 ct-1 VSV 돌연변이체 (3'-NPMG(ct-1)L-gag5-5') 에 대한 조합된 VSV N 섞기/G 단백질 ct-1 돌연변이체 (3'-PNMG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-1)L-5') 의 성장 속도의 비교를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이후 동물 신경독력 모델에서 밝혀진 바와 같이 포유류에서 현저히 감쇠된 병원성, 특히 감소된 신경병원성을 가진 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 벡터에 대한 당업계의 수요를 소개한다. 상기 기재된 바와 같이, VSV 는 면역원성 조성물 및/또는 유전자 요법에서 매력적이 되도록 하는 다수의 특징을 갖는다. 예를 들어, 인간의 VSV 감염은 일반적인 것이 아니며, 일반적으로 자각증상이 없거나 또는 합병증없이 3 내지 8 일 동안 동반하는 약한 감기 비슷한 증상을 특징으로 하며, 이에 따라 VSV 는 인간 병소로 간주되지 않는다. 유망한 벡터가 되도록 하는 VSV 의 다른 특징들에는 하기의 것이 포함된다: (a) 세포 배양시 활발하게 복제하는 능력; (b) 숙주 세포 DNA 로 통합되지 않거나 또는 유전자 재조합을 겪지 않는 능력; (c) 1 차 접종-부스트 (prime-boost) 면역화 전략을 가능하도록 하는 다중 항원형의 존재성; (d) 관심대상의 외래 유전자가 VSV 게놈으로 삽입되어 바이러스 전사효소에 의해 대용량 발현됨; 및 (e) 바이러스 게놈의 cDNA 복제본으로부터 감염성 바이러스의 취득을 위한 고도의 특정화된 시스템의 개발 (U.S. 특허 6,033,886; U.S. 특허 6,168,943) 및 (f) 인간 집단에서의 VSV 에 대한 기존의 면역성이 거의 없음.
당업계에 공지된 감쇠된 VSV 벡터의 초기의 클래스는 온도민감성 (ts) 돌연변이체로서 언급되었는데, 여기서 상기 ts 돌연변이체는 제한 온도에서 바이러스 입자 생산에 실패한다. 예를 들어, 각종 VSV ts 돌연변이체가 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 참고문헌으로는 Holloway 등, 1970; Pringle 등, 1971; Evans 등, 1979; Pringle 등, 1981; Morita 등, 1987; Gopalakrishna 및 Lenard, 1985 참조). 추가로, 감쇠된 VSV 돌연변이체의 추가적인 클래스가 또한 당업계에 고지되어 있으며, 그의 예시에는 VSV G 단백질 절단형 세포질의 말단 (ct) 돌연변이 (Schnell 등, 1998), 유전자 섞기 (또는 유전자 순서 재배열) 돌연변이 (Wertz 등, 1998; Ball 등, 1999; Flanagan 등, 2O01; U.S. 특허 6,596,529), G-스템 돌연변이 (Jeetendra 등, 2003; Jeetendra 등, 2002; Robinson 및 Whitt, 2000), 비-세포변성 M 단백질 돌연변이 (Jayakar 등, 2000; Jayakar 및 Whitt, 2002) 및 앰비센스 RNA 돌연변이 (Finke 및 Conzelmann, 1997; Finke 및 Conzelmann 1999) 가 포함된다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 최근 이용가능한 감쇠된 VSV 벡터는 동물 모델에서의 시험시 잔류 독력을 보유하며, 따라서 인간 임상 시도로의 진출을 위한 벡터 후보물질은 되지 못한다.
본원에 상세하게 제시된 바와 같이, 본 발명은 2 가지 이상의 공지된 감쇠 돌연변이 클래스 (유전자 섞기 돌연변이, G 단백질 삽입 및 절단 돌연변이, ts 돌연변이 및 기타 점 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이 등) 가 달성되는 병원성 감쇠 제공 수준에 상승적 효과 (추가적인 효과와는 대조적임) 를 갖는다. 예를 들어, 본원에서 VSV G 단백질 절단 돌연변이체가, 섞기 N 유전자 돌연변이체와 조합되는 경우, VSV 성장 (실시예 2) 및 신경독력 (실시예 3) 의 상승적 감쇠를 발휘한다는 것이 증명되었다. 추가로, 본 발명의 특정 구현예는 다른 클래스의 돌연변이의 조합에 관한 것으로, 이도 또한 VSV 감쇠에 대해 상승적 효과를 갖는다. 상기 클래스에는, 이에 제한되지 않으나 하기의 것이 포함된다: ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이 (N, P, M, G 및 L 유전자 섞기 포함), G-스템 돌연변이, G 유전자 삽입, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이 (예를 들어, ct 돌연변이체), 앰비센스 RNA 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이.
이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명은, 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 1 가지 이상의 외래 RNA 를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다. 특정 다른 구현예에서, 본 발명은 그의 게놈에 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 1 가지 이상의 외래 RNA 를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다.
A. 소포성 구내염 바이러스 돌연변이 클래스
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자 개질 VSV 벡터는 그의 게놈에 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 포함한다. 이후 정의되는 바와 같이, 용어 "돌연변이 클래스", "돌연변이 클래스들" 또는 "돌연변이의 클래스" 는 호환되어 이용되며, 단독으로 사용되면 VSV 를 감쇠시키는, 당업계에 공지된 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 "돌연변이 클래스" 에는, 이에 제한되지 않으나, VSV 온도민감성 N 유전자 돌연변이 (이후, "N(ts)"), 온도민감성 L 유전자 돌연변이 (이후, "L(ts)"), 점 돌연변이, G-스템 돌연변이 (이후, "G(stem)") 가 포함된다. 비-세포변성 M 유전자 돌연변이 (이후, "M( ncp )"), 유전자 섞기 또는 재배열 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이 (이후, "G(ts)"), 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이 등이 포함된다. 이후 정의되는 바와 같이, "돌연변이" 에는 삽입, 결실, 치환, 유전자 재배열 또는 섞기 개질과 같은 당업계에 공지된 돌연변이가 포함된다.
이후 정의되는 바와 같이, 용어 "상승적" 감쇠는 부가되는 것보다 더 큰 폭의 VSV 감쇠 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 VSV 의 상승적 감쇠는 동일 VSV 게놈에서의 2 가지 이상의 클래스의 돌연변이를 포함함으로써, 각각의 VSV 돌연변이 클래스 단독에 대해 관찰되는 감쇠 효과의 합보다도 훨씬 더 큰 VSV 병원성의 감소를 제공한다. 이에 따라, 특정 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 각각의 돌연변이 클래스 단독에 대해 관찰되는 감쇠 수준의 합 (즉, 두 돌연변이 클래스의 합) 보다 적어도 더 큰 LD50 로서 정의되며, 여기서 감쇠 수준 (즉, LD50) 은 소형 동물 신경독력 모델에서 측정된다.
비제한적 예시로서, 등식 (1) 은 VSV 의 "부가적인 감쇠" 을 나타내며:
(1) ΔaLD50 + ΔbLD50 = xLD50;
식 중, ΔaLD50 은 그의 게놈에 제 1 돌연변이 클래스를 가진 VSV 의 LD50 이며, ΔbLD50 은 그의 게놈에 제 2 돌연변이 클래스를 가진 VSV 의 LD50 이며, XLD50 은 ΔaLD50 및 ΔbLD50 의 합이고; 각각의 돌연변이 클래스 단독에 대해 관찰되는 것보다 적어도 더 큰 LD50 를 갖는 본 발명의 VSV "상승적 감쇠" 는 등식 (2) 로 나타낸다:
(2) Δa,bLD50 > (ΔaLD50 + ΔbLD50);
식 중, Δa,bLD50 은 그의 게놈에 2 가지의 돌연변이 클래스의 조합을 가진 VSV 의 LD50 이며, ΔaLD50 은 그의 게놈에 제 1 돌연변이 클래스를 가진 VSV 의 LD50 이며, ΔbLD50 은 그의 게놈에 제 2 돌연변이 클래스를 가진 VSV 의 LD50 이다. 따라서, 특정 구현예에서, VSV 감쇠의 상승 (즉, 동일 VSV 게놈에서의 2 가지의 돌연변이 클래스) 은 2 가지 VSV 구축물 (각각의 VSV 구축물은 그의 게놈에 단일 돌연변이만을 가짐) 의 LD50 을 기준으로 기재되는데, 여기서 그의 게놈에 2 가지 돌연변이 클래스를 가진 VSV 의 상승적 감쇠는 그의 게놈에 단일 돌연변이 클래스를 가진 2 가지 VSV 구축물의 합 LD50 보다 적어도 더 큰 LD50 로서 정의된다 (예를 들어, 표 7 의 VSV LD50 참조).
특정 다른 구현예에서, VSV 감쇠의 상승 효과는 야생형 VSV 의 LD50 를 기준으로 기재된다. 따라서, 한 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 적어도 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 은 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 한 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 10 배 이상 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 는 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 또다른 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 100 배 이상 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 는 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 또다른 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 1,000 배 이상 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 는 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 또다른 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 10,000 배 이상 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 는 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 특정 다른 구현예에서, VSV 의 상승적 감쇠는 야생형 VSV 의 LD50 보다 100,000 배 이상 더 큰 LD50 로서 정의되는데, 여기서 LD50 는 동물 신경독력 모델에서 측정된다. 특정 VSV 벡터에 대한 50% 치사량 (LD50) 의 측정은 공지된 실험 방법 및 동물 모델을 이용하여 당업자에 의해 손쉽게 측정될 수 있다 (예를 들어, 실시예 1 참조).
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 하기 제시되는 2 가지 이상의 클래스의 돌연변이를 포함하는 유전자 개질 VSV 에 관한 것이다.
1. 유전자 섞기 돌연변이
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 유전자 섞기 돌연변이를 포함한다. 본원에 정의되는 바와 같이, 용어 "유전자 섞기", "섞인 유전자", "섞임", "섞음", "유전자 재배열" 및 "유전자 전위" 는 호환되어 사용되며, 야생형 VSV 게놈의 순서에서의 변화 (돌연변이) 를 지칭한다. 본원에 정의된 바와 같이, 야생형 VSV 게놈은 하기의 유전자 순서를 갖는다: 3'-NPMGL-5'.
당업계에는, 3' 프로모터에 대한 VSV 유전자의 위치가 발현 및 바이러스 감쇠의 수준을 결정한다는 것이 공지되어 있다 (U.S. 특허 6,596,529 및 Wertz 등, 1998, 각각은 본원에 특별히 참고문헌으로 포함됨). VSV G, M, N, P 및 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다 (Rose 및 Gallione, 1981 ; Gallione 등, 1981). 예를 들어, U.S. 특허 6,596,529 는 N 단백질에 대한 유전자가 그의 야생형 프로모터-부근 제 1 위치에서 게놈 상에서 후속하는 더욱 원거리의 위치로 전위된 (섞인) 유전자 섞기 돌연변이 (예를 들어, 3'-PNMGL-5', 3'-PMNGL-5', 3'-PMGNL-5', 이들은 각각 N2, N3 및 N4 로 언급함) 를 기재한다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 유전자 섞기 돌연변이를 포함한다. 한 클래스의 돌연변이에서, 한가지 특별한 구현예에서, 유전자 개질 VSV 는 N 유전자의 전위 (예를 들어, 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5') 를 포함하는 유전자 섞기 돌연변이를 포함한다.
본원에서, 외래 핵산 서열 (예를 들어, HIV gag) 의, 임의의 N, P, M, G 또는 L 유전자에 대한 VSV 게놈 3' 으로의 삽입은 상기 정의된 "유전자 섞기 돌연변이" 를 유효하게 제공한다는 사실에 유의해야 한다. 예를 들어, HIV gag 유전자가 위치 1 에서 VSV 게놈에 삽입되는 경우 (예를 들어, 3'-gag1-NPMGL-5'), N, P, M, G 및 L 유전자는 각각 그의 야생형 위치에서 게놈 상의 더욱 원거리의 위치로 옮겨간다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 유전자 섞기 돌연변이에는 외래 유전자의 임의의 N, P, M, G 또는 L 유전자에 대한 VSV 게놈 3' 으로의 삽입 (예를 들어, 3'-gag1-NPMGL-5', 3'-N-gag2-PMGL-5', 3'-NP-gag3-MGL-5' 등) 이 포함된다.
2. G 단백질 삽입 및 절단 돌연변이체
특정 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 돌연변이화 G 유전자를 포함하는데, 여기서 코딩되는 G 단백질은 G 단백질의 "세포질의 말단 영역" 으로도 언급되는 그의 세포질의 도메인 (카르복시-말단) 에서 절단형이다. 세포질의 도메인의 카르복시-말단이 절단된 G 유전자 돌연변이는 VSV 버딩 (budding) 에 영향을 주며 바이러스 생산을 감쇠시키는 것으로 당업계에 공지되어 있다 (Schnell 등, 1998; Roberts 등, 1999). 야생형 VSV G 단백질의 세포질의 도메인은 29 개의 아미노산 (RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK-COOH; 서열 식별 번호 1) 을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 절단형 VSV G 유전자는 세포질의 도메인의 말단부의 28 개의 카르복시-말단 아미노산 잔기가 결실된 G 단백질을 코딩한다 (서열 식별 번호 1 의 29 개의 아미노산 야생형 세포질의 도메인으로부터 오직 아르기닌만이 잔류). 특정 다른 구현예에서, 본 발명의 절단형 VSV G 유전자는 세포질의 도메인의 말단부에 20 개의 카르복시-말단 아미노산 잔기가 결실된 G 단백질을 코딩한다 (서열 식별 번호 1 의 29 개의 아미노산의 야생형 세포질의 도메인 기준).
특정 다른 구현예에서, 본 발명의 절단형 VSV G 유전자는 그의 세포질의 도메인 (세포질의 말단 영역) 에 단일 아미노산을 포함하는 G 단백질을 코딩하는데, 여기서 상기 단일 아미노산은 임의의 자연 발생 아미노산이다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 절단형 VSV G 유전자는 그의 세포질의 도메인 (세포질의 말단 영역) 에 9 개의 아미노산을 포함하는 G 단백질을 코딩하는데, 여기서 상기 9 개의 아미노산은 임의의 자연 발생 아미노산이다. 특정 다른 구현예에서, 본 발명의 돌연변이화 VSV 유전자는 외래 에피토프를 나타내는 삽입을 포함하는 G 단백질을 코딩한다. 상기 돌연변이체는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Schlehuber 및 Rose, 2003 를 참조).
본원에 정의된 바와 같이, 서열 식별 번호 1 의 야생형 서열을 기준으로 세포질의 도메인의 말단부의 28 개의 카르복시-말단 아미노산 잔기가 결실된 G 단백질을 코딩하는 G 유전자 돌연변이체가 "G(ct-1)" 로 지정되는데, 여기서 G(ct-1) 의 세포질의 도메인은 (R-COOH) 의 아미노산 서열을 갖는다. 본원에 정의된 바와 같이, 서열 식별 번호 1 의 야생형 서열에 대하여 세포질의 도메인의 말단부에 20 개의 카르복시-말단 아미노산 잔기가 결실된 G 단백질을 코딩하는 G 유전자 돌연변이체가 "G(ct-9)" 로 지정되는데, 여기서 G(ct-9) 의 세포질의 도메인은 (RVGIHLCIK-COOH; 서열 식별 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는다. 이에 따라, 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 코딩되는 G 단백질이 G(ct-1) 또는 G(ct-9) 인 돌연변이화 G 유전자를 포함한다.
3. 온도민감성 및 기타 점 돌연변이
이후 정의되는 바와 같이 VSV "온도민감성" ("ts") 돌연변이는, 비허용 온도에서 VSV 성장을 제한하는 VSV 게놈에서의 돌연변이이다. 예를 들어, 본 발명의 VSV ts 돌연변이체는 허용 온도 (예를 들어, 31℃) 에서 정상적으로 및 더 높은 역가까지 성장하나, 그의 성장 또는 재생산은 비허용 온도 (예를 들어, 37℃ 또는 39℃) 에서는 제한된다. 화학물 및 부위 지정 돌연변이화에 의한 ts 돌연변이체의 제조는 당업계에 널리 공지되어 있으며 (예를 들어, Pringle, 1970; Li 등, 1988 을 참조); 다수의 ts 돌연변이체는 특징화되어 기재되어 있다 (예를 들어, Flamand 및 Pringle, 1971; Flamand 및 Bishop, 1973; Printz 및 Wagner, 1971; Gopalakrishna 및 Lenard, 1985; Pringle 등, 1981; Morita 등, 1987; Li 등, 1988; Rabinowitz 등, 1977; Lundh 등, 1988; DaI Canto 등, 1976; Rabinowitz 등, 1976 참조). 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 ts 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 ts 돌연변이는 G, M, N, P 또는 L 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 돌연변이이다.
본원에 정의된 바와 같이, 임의의 한 VSV G, M, N, P 또는 L 유전자의 ts 돌연변이는 본 발명의 별도의 "돌연변이 클래스" 이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현예에서, 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 포함하는 유전자 개질 VSV (상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다) 는 제 1 클래스의 돌연변이로서의 하나 이상의 ts N 유전자 돌연변이(들) (이후, "N(ts)") 및 제 2 클래스의 돌연변이로서의 하나 이상의 ts L 유전자 돌연변이(들) (이후, "L(ts)") 을 포함한다. 비제한적 예시로서, 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 와 같은 게놈을 포함하는 유전자 개질 VSV 는 2 가지 클래스의 돌연변이 (즉, (1) N(ts) 유전자 돌연변이 및 (2) L(ts) 유전자 돌연변이) 를 포함하며, 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 와 같은 게놈을 포함하는 상기 유전자 개질 VSV 돌연변이는 3 가지 클래스의 유전자 돌연변이 (즉, (1) N(ts) 유전자 돌연변이, (2) L(ts) 유전자 돌연변이 및 (3) gag1 삽입 수단으로서의 유전자 섞기 돌연변이) 를 포함한다.
특정 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 점 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 점 돌연변이는 G, M, N, P 또는 L 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 돌연변이이며, 여기서 상기 돌연변이는 냉온-적응성, 저감된 융합 또는 세포변성 효율과 같은 감쇠 표현형을 일컫는다 (예를 들어, Fredericksen 및 Whitt, 1998; Ahmed 및 Lyles, 1997 을 참조). 예를 들어, Fredericksen 및 Whitt (1998) 의 문헌에서는 융합 활성에 대해 변동된 pH 역치를 갖는 G 유전자의 3 가지 감쇠 점 돌연변이 (예를 들어, D137-L, E139-L 또는 DE-SS) 를 기재한다. Ahmed 및 Lyles (1997) 의 문헌에서는 야생형 M 단백질보다 숙주 유전자 발현 저해시 더욱 검출이 쉽고 월등히 더 빨리 변화 (turn over) 하는 M 유전자의 점 돌연변이 (N1 63D) 를 기재한다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.
4. 비-세포변성 M 유전자 돌연변이
특정 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 M 유전자에서의 비-세포변성 돌연변이를 포함한다. VSV (인디애나 항원형) M 유전자는 229 개의 아미노산 M (매트릭스) 단백질을 코딩하는데, 여기서 NH2-말단의 처음 30 개의 아미노산은 프롤린-풍부 PPPY (PY) 모티프를 포함한다 (Harty 등, 1999). VSV M 단백질의 PY 모티프는 VSV 인디애나 (Genbank 접근 번호 X04452) 및 뉴저지 (Genbank 접근 번호 M14553) 항원형 모두에서 아미노산 위치 24 내지 27 에 위치한다. Jayakar 등 (2000) 의 문헌에 의해, PY 모티프 (예를 들어, APPY, AAPY, PPAY, APPA, AAPA 및 PPPA) 에서의 돌연변이는 바이러스 버딩 (budding) 에서의 후기 단계를 차단하여 바이러스 수율을 감소시킨다는 것이 증명되었다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 M 유전자에서의 비-세포변성 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이는 코딩되는 M 단백질의 PPPY 모티프 중에 있다.
최근에는 M mRNA 가 추가로, M2 및 M3 로 지칭되는 2 개의 추가적인 단백질을 코딩하는 것으로 보고되었다 (Jayakar 및 Whitt, 2002). M2 및 M3 단백질은 229 개의 아미노산 M 단백질을 코딩하는 동일한 오픈 리딩 프레임 내의 하류방향 메티오닌으로부터 합성되며 (M1 로 지칭함), M1 단백질의 처음 32 개 (M2 단백질) 또는 50 개 (M3 단백질) 의 아미노산이 없다. M 단백질을 발현하나, M2 및 M3 은 발현하지 않는 재조합체 VSV 로 감염된 세포는 세포변성 효과의 지연 안착을 나타내나 (특정 세포 유형에서), 정상적인 바이러스 수율을 제공하는 것으로 관찰되었다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 M 유전자에서의 비-세포변성 돌연변이를 포함하는데, 여기서 상기 M 유전자 돌연변이는 M2 또는 M3 단백질을 발현하지 않는 바이러스를 제공한다 (예를 들어, Jayakar 및 Whitt, 2002 의 문헌을 참조).
또한 본원에서 Irie 등 (2004) 의 문헌에 기재된, M 단백질 PSAP (PS) 모티프로의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, 결실, 치환, 삽입 등) 가 고려된다.
5. G-스템 돌연변이
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 G 유전자 내에 돌연변이를 포함하는데, 여기서 코딩된 G 단백질은 G-스템 단백질로도 지칭되는 G 단백질 엑토도메인의 멤브레인-근접 스템 영역에 돌연변이를 갖는다. 상기 G-스템 영역은 G 단백질의 421 내지 462 의 아미노산 잔기를 포함한다. 최근의 연구는 G 단백질의 G-스템에서의 삽입 및/또는 결실 (예를 들어, 절단) 돌연변이를 통한 VSV 의 감쇠를 증명했다 (Robinson 및 Whitt, 2000; Jeetendra 등, 2002; Jeetendra 등, 2003). 이에 따라, 특정 구현예에서, 유전자 개질 VSV 는 G-스템 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, G-스템 돌연변이 (및 그의 면역원성 조성물) 을 포함하는 본 발명의 유전자 개질 VSV 벡터는 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 의 게놈을 포함한다.
6. 앰비센스 RNA 돌연변이
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 은 앰비센스 RNA 돌연변이를 포함하는데, 여기서 5' 안티게놈 프로모터 (AGP) 는 3' 게놈 프로모터 (GP)의 복제본으로 대체된다. VSV 의 5' AGP 뿐만 아니라 기타 비분절성의, 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 강력한 복제 프로모터로서 작용하며, 3' GP 는 전사 프로모터 및 약한 복제 프로모터로서 작용한다. VSV 감염의 정상적인 경로에서는, 안티게놈 복제본에 대해 3- 내지 4-배의 우위가 있고; 상기 비율은 광견병 바이러스, 또다른 구성원의 라브도바이러스 과의 구성원에 대해서는 더욱더 높다 (Finke 및 Conzelmann, 1999). 광견병 바이러스를 이용한 선행기술의 업적들은 5' AGP 를 GP 의 복제본 (앰비센스 RNA 돌연변이로 공지됨) 으로 대체하는 것은 감염된 세포 내에서 동등한 수준의 게놈 및 안티게놈 RNA 를 유도한다는 것을 증명했다. 추가로, 외래 유전자가 게놈의 5' 말단에 위치한 GP 의 복제본으로부터 발현된다. 배양 세포에서 연속 계대되는 경우, 앰비센스 RNA 돌연변이를 포함하는 광견병 바이러스는 재조합체 야생형 광견병 바이러스보다 10- 내지 15- 배 더 낮은 역가로 일관되게 복제된다 (Finke 및 Conzelmann, 1997). 상기 돌연변이는 바이러스 복제의 감쇠 및 외래 유전자의 발현 두가지 모두를 위한 VSV 벡터에 사용된다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 유전자 개질 VSV 는 앰비센스 RNA 돌연변이를 포함한다.
7. 유전자 결실
특정 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 VSV 유전자 (예컨대, G 또는 M) 가 게놈으로부터 결실된 바이러스를 포함한다. 예를 들어, Roberts 등 (1999) 의 문헌에서는 G 단백질을 코딩하는 전장 유전자가 결실되고 (ΔG), 인플루엔자 혈구응집소 (HA) 단백질이 치환된 VSV 벡터를 기재하는데, 여기서 상기 VSV 벡터 (ΔG-HA) 는 감쇠된 병독성을 나타냈다.
B. 재조합체 소포성 구내염 바이러스 벡터
특정 구현예에서, 본 발명은 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 그들 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 유전자 개질 (재조합체) VSV 벡터를 제공한다.
재조합체 RNA 바이러스의 제조 방법은 당업계에서 "포획 (rescue)" 또는 "역방향 유전학" 방법으로서 지칭된다. VSV 에 대한 예시적인 포획 방법은 U.S. 특허 6,033,886, U.S. 특허 6,596,529 및 WO 2004/113517 에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참고문헌으로 포함된다. 네거티브-센스, 단일 가닥의 비분절화된 RNA 바이러스 게놈의 전사 및 복제는 리보뉴클레오단백질 코어 (뉴클레오캡시드) 상에 작용하는 다량체성 단백질 복합체의 효소적 활성을 통해 달성된다. 네이키드 게놈 RNA 는 템플레이트로서 제공되지 못한다. 대신, 상기 게놈 서열들은 오직 이들이 N 단백질에 의해 뉴클레오캡시드 구조로 캡슐화되는 경우에만 인식된다. 문맥상, 오직 게놈 및 안티게놈 프로모터 서열이 인식되어 전사 또는 복제 경로를 개시한다.
VSV 게놈의 클로닝된 DNA 등가물은 적합한 DNA-의존성 RNA 중합효소 프로모터 (예를 들어, T7 RNA 중합효소 프로모터) 및 자가-절단 리보자임 서열 (예를 들어, 간염 델타 리보자임) 사이에 위치하는데, 여기서 이는 적합한 전사 벡터 (예를 들어, 증식가능한 박테리아 플라스미드) 에 삽입된다. 상기 전사 벡터는 RNA 중합효소 (예를 들어, T7 RNA 중합효소) 가 충실하게 정확한 또는 거의 정확한, 5' 및 3' 말단에서 VSV 안티게놈 (또는 게놈) 의 단일 가닥 RNA 복제본을 전사할 수 있는, 쉽게 취급가능한 DNA 템플레이트를 제공한다. VSV 게놈 DNA 복제본 및 측면 프로모터 및 리보자임 서열의 배치는 안티게놈 또는 게놈 RNA 등가물이 전사되는지 여부를 결정한다. 신규한 VSV 자손의 포획에 필요한 것은 네이키드, 단일 가닥 VSV 안티게놈 또는 게놈 RNA 전사물을 관능성 뉴클레오캡시드 템플레이트에 캡슐화하기 위해 하기와 같은 필요한 VSV-특이적 트랜스-작용 지지 단백질이다: 바이러스 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 중합효소-관련 인단백질 (P) 및 중합효소 (L) 단백질. 이들 단백질들은 상기 뉴클레오캡시드 템플레이트가 반드시 전사 및 복제를 달성하도록 보장해야만 하는 활성 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소를 포함한다.
이에 따라, 그의 게놈에 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 포함하는 본 발명의 유전자 개질 및 감쇠된 VSV (예를 들어, 섹션 A 참조) 는 당업계에 공지된 포획 방법에 따라 제조된다. 예를 들어, 그의 게놈에 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터는 하기를 이용하여: (1) VSV 의 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터, 및 (2) 캡슐화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 1 가지 이상의 단리된 핵산 분자를 포함하는 1 가지 이상의 발현 벡터; 숙주 세포 내에서 상기 벡터의 공동발현 및 재조합체 VSV 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 제조된다. 본 발명에 따르면, 이에 제한되지 않으나 하기를 포함하는 임의의 적합한 VSV 주 또는 항원형이 사용될 수 있다: VSV 인디애나 (Indiana), VSV 뉴저지 (New Jersey), VSV 칸디푸라 (Chandipura), VSV 이스파한 (Isfahan), VSV 산 주앙 (San Juan), VSV 글래스고우 (Glasgow), 등.
VSV 의 감쇠된 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 더하여, 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 하나 이상의 이종성 (또는 외래성) 폴리뉴클레오티드 서열 또는 오픈 리딩 프레임 (ORFs) (예를 들어, 섹션 C 참조) 을 코딩할 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 바에 따라 달리할 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 보조인자, 싸이토카인 (예컨대, 인터류킨), T-헬퍼 에피토프, CTL 에피토프, 제한 마커, 아쥬반트 또는 상이한 미생물성 병소 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 균류) 의 단백질, 특히 원하는 면역 응답성을 유도할 수 있는 단백질이 포함된다. 특정 구현예에서, 이종성 ORF 는 HIV 유전자 (예를 들어, gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu) 를 포함한다. 한가지 특별한 구현예에서, HIV 유전자는 gag 이며, 여기서 상기 gag 유전자는 위치 1 (3'-gag1-NPMGL-5') 또는 위치 5 (3'-NPMG-gag5-L-5') 에서 VSV 게놈에 삽입된다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 또한 유전자 요법에 사용되는 시약을 제공하기 위해 사용된다. 또다른 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 추가로 싸이토카인, 예컨대 인터류킨-12 를 코딩하는데, 이는 재조합체 VSV 의 예방 또는 치료 특징을 개선하기 위해 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 및 감쇠 VSV 는 통상적인 수단, 예컨대 화학적 돌연변이화에 의해 돌연변이화된다. 예를 들어 세포 배양물 내에서의 바이러스 성장 동안 화학물 돌연변이유발물질을 첨가한 후 하기 단계를 거쳐 돌연변이화된다: (a) 온도민감성 및/또는 냉온 적응성 돌연변이 선별을 위해 최적 온도 미만의 온도에서 계대시킨 바이러스 선별, (b) 세포 배양 내 소형 플라크를 제조하는 돌연변이체 바이러스의 동정, 및 (c) 숙주 범위 돌연변이 선별을 위한 이종성 숙주를 통한 계대. 다른 구현예에서, 감쇠 돌연변이화는 부위-지정 돌연변이화 (예를 들어, 섹션 A 참조) 를 이용한 예비 돌연변이화 후 상기 돌연변이를 포함하는 바이러스의 포획을 포함한다. 상기 제시된 바와 같이, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 그의 게놈에 2 가지 이상의 클래스의 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 클래스의 돌연변이는 추가로 다중 돌연변이, 예컨대 이중 돌연변이 (결실, 삽입, 치환 등), 삼중 돌연변이 등을 포함하는 G-스템 돌연변이 클래스를 추가로 포함한다. 이어서, 상기 감쇠된 VSV 벡터는 동물 모델에서 그의 독력의 감쇠에 대해 스크리닝한다 (예를 들어, 실시예 1 및 실시예 3 참조).
포획에 대한 전형적인 (반드시 절대적인 것은 아니지만) 정황에는 바이러스 게놈 cDNA-포함 전사 벡터 유래의 안티게놈 (또는 게놈) 단일 가닥 RNA 의 전사 구동을 위해 T7 중합효소가 존재하는 적합한 포유동물 세포 환경이 포함된다. 공동전사되거나 또는 바로 다음 신속하게 전사되어, 상기 바이러스 안티게놈 (또는 게놈) RNA 전사물은 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 관능성 템플레이트로 캡슐화되며, 필요한 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질을 코딩하는, 공동트랜스펙션된 발현 플라스미드로부터 동시적으로 제공되는 필요한 중합효소 성분으로 유지된다. 상기 사건들 및 진행은 바이러스 mRNA 의 필수적인 전사, 게놈의 복제 및 신규한 게놈의 증폭을 유도하여, 신규한 VSV 자손, 예를 들어 포획물 제조를 유도한다.
전사 벡터 및 발현 벡터는 전형적으로는 숙주 세포 내에서의 발현을 위해 고안된 플라스미드 벡터이다. 캡슐화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 코딩하는 1 가지 이상의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 동일한 발현 벡터 또는 2 가지 이상의 상이한 벡터로부터 상기 단백질을 발현한다. 상기 벡터는 일반적으로 기본적인 포획 방법으로부터 공지되었고, 본 발명의 개선된 방법에서의 사용을 위해 변경될 필요는 없다.
VSV 와 같은 바이러스의 포획 수행을 위한 추가적인 기술은 U.S. 특허 6,673,572 및 U.S. 임시특허 60/477,389 에 기재되어 있고, 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
VSV 의 포획에 사용되는 숙주 세포는 재조합체 VSV 의 제조에 필요한 필수 성분들을 벡터로부터 발현하도록 하는 것이다. 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 척추동물 세포이다. 일반적으로, 숙주 세포는 인간 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포 (예를 들어, 293) 로부터 유도된다. 베로 세포 (Vero cell), 뿐만 아니라 다수의 기타 유형의 세포가 또한 숙주 세포로서 사용된다. 하기는 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예시이다: (1) 인간 2 배체 1 차 세포주 (Primary Cell Line) (예를 들어, WI-38 및 MRC5 세포); (2) 원숭이 2 배체 세포주 (예를 들어, FRhL-Fetal 붉은털 원숭이 폐 세포); (3) 유사 1 차 연속 세포주 (Quasi-Primary Continues Cell Line) (예를 들어, AGMK-아프리카 녹색 원숭이 신장 세포); (4) 인간 293 세포 및 (5) 기타 잠재적인 세포주, 예컨대 CHO, MDCK (Madin-Darby 개 신장), 1 차 닭 배아 섬유아세포 (primary chick embryo fibroblasts). 특정 구현예에서, 트랜스펙션 촉진 시약은 세포에 의한 DNA 흡수를 증가시키기 위해 첨가한다. 다수의 상기 시약들은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 칼슘 포스페이트). Lipofectace (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 Effectene (Qiagen, Valencia, CA) 은 일반적인 예시이다. Lipofectace 및 Effectene 는 모두 양이온성 지질이다. 이들 모두는 DNA 를 감싸 세포에 의한 DNA 흡수를 증강시킨다. Lipofectace 은 DNA 를 둘러싸는 리포좀을 형성하며, Effectene 는 DNA 를 감싸지만 리포좀을 형성하지는 않는다.
포획된 감쇠 VSV 는 이어서 그의 원하는 표현형 (온도 감응성, 냉온 적응성, 플라크 형상 및 전사 및 복제 감쇠) 에 대해 시험하는데, 우선 시험관내 수단으로써 시험한다. 돌연변이는 또한 필요한 트랜스-작용 캡슐화 및 중합효소 활성이 야생형 또는 백신 헬퍼 바이러스 또는 N, P 및 상이한 L 유전자 잠복 유전자-특이적 감쇠 돌연변이를 발현하는 플라스미드에 의해 제공되는 소형복제단위 (minireplicon) 계를 이용하여 시험한다. 감쇠된 VSV 는 또한 동물 신경독력 모델에서 상승적 감쇠에 대해 생체 내에서 시험한다. 예를 들어,마우스 및/또는 흰담비 모델이 신경독력 검출을 위해 확립되었다. 간결하게, 10 마리의 군에 예상되는 LD50 투여량 (동물의 50% 치사량) 에 널리 편재하는 각각의 소정 범위의 바이러스 농도로 두개내 투여한다. 예를 들어, 바이러스에 대한 예상되는 LD50 은 103 내지 104 pfu 의 범위로 하여 102, 103, 104 및 105 pfu 의 바이러스로 한 IC 접종을 이용한다. 바이러스 제형물은 PBS 에 정제된 바이러스 원액을 일련으로 희석하여 제조한다. 이어서, PBS 의 50 내지 100 ㎕ 중 필요 투여량을 정수리를 통해 주사한다. 체중 감소, 질병률 및 폐사에 대해 매일 모니터링한다. 시험 농도 범위 상의 마우스의 누적 폐사로부터 바이러스 벡터에 대한 LD50 를 계산한다.
C. 이종성 핵산 서열 및 항원
특정 구현예에서, 본 발명은 복제에 필수적인 것은 아닌 게놈의 부위에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 별도의 전사 단위체로서의 외래 RNA 를 추가로 포함하는 상승적 감쇠 VSV 를 제공하는데, 여기서 상기 외래 RNA 서열 (네거티브 센스) 은 VSV 로 감염된 숙주 세포에서 발현될 수 있는 단백질의 생산을 지령한다. 상기 재조합체 게놈은 원래, 단백질을 코딩하는 외래 DNA 를 VSV cDNA 에 삽입하여 제조한다. 특정 구현예에서, 면역원성 항원을 코딩하는 임의의 DNA 서열로서, 질환 또는 장애에 대한 예방 또는 치료적 면역성을 제공하며, 단독으로 또는 동일 또는 상이한 VSV 에 의해 발현되는 다른 항원과 조합되어 재조합체 내에 융합 또는 비융합 단백질로서 발현하는 경우, VSV 를 상승적으로 감쇠시키는 것을 분리하여 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기 위한 VSV 벡터에 혼입시킨다.
특정 구현예에서, 상승적 감쇠 재조합체 VSV 에 의한 항원의 발현은 병독성 미생물에 대한 면역 응답성을 유도한다. 예를 들어, 항원은 질환 또는 장애의 원인제인 박테리아, 기생충, 바이러스 또는 균류 상에서 발견되는 항원의 면역원성 또는 항원성을 나타낼 수 있다. 한 구현예에서, 인간 병소의 항원 또는 관심대상의 기타 항원의 항원성 또는 면역원성을 나타내는 항원이 사용된다.
항체에 대한 결합을 탐지하여 면역원성 또는 항원성을 측정하기 위해, 당업계에 공지된 각종 면역검정법이 사용되며, 여기에는 이에 제한되지 않으나 방사면역검정, ELISA (효소 연관 면역흡수 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역방사측정 검정, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 제자리 (in situ) 면역검정 (예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원서 표지를 이용), 웨스턴 블랏, 면역침강 반응, 유착 검정 (예를 들어, 겔 유착 검정, 혈구응집 검정), 보체 결합 검정, 면역형광 검정, 단백질 A 검정 및 면역전기영동 검정, 중화 검정 등이 포함된다. 한 구현예에서, 항체 결합은 1 차 항체 상의 표지를 검출하여 측정한다. 또다른 구현예에서, 1 차 항체는 1 차 항체에 대한 2 차 항체 또는 시약의 결합을 측정하여 검출한다. 추가 구현예에서, 2 차 항체는 표지된다. 면역검정에서 결합을 검출하기 위한 다수의 수단이 당업계에 공지되어 있다. 면역원성 검출을 위한 한 구현예에서, T 세포-중재 응답성은 표준 방법, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 검정, 4 량체 검정, 엘리스팟 (elispot) 검정 또는 생체내 지연형 과민감응성 검정으로 검정한다.
상승적으로 감쇠된 VSV (외래 RNA 가 기생충 또는 박테리아의 항원 또는 그의 에피토프를 포함하는 그의 유도체의 생산을 지령함) 에 의해 발현되는 기생충 및 박테리아 발현 에피토프 (항원 검출자) 에는, 이에 제한되지 않으나 표 1 에 제시된 것이 포함된다.
VSV 에 의해 발현될 수 있는 에피토프를 발현하는 기생충 및 박테리아
기생충
플라스모듐 속 (Plasmodium spp.)
에이메리아 속(Eimeria spp.)
선충류
주혈흡충 (schisto)
리슈만편모충 (leshmania)
박테리아
비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)
폐렴 연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae)
무유성 연쇄구균 (Streptococcus agalactiae)
수막염균 (Neisseria meningitidis)
임균 (Neisseria gonorrheae)
디프테리아균 (Corynebacteria diphtheriae)
파상풍균 (Clostrieium tetani)
보르데텔라 백일해 (Bordetella pertussis)
헤모필루스 속 (Haemophilus spp.) (예를 들어, 인플루엔자)
클라미디아 속 (Chlamydia spp.)
장독소생성 대장균
헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori)
항산균 (mycobacteria)
또다른 구현예에서, 항원은 선충류에 의해 야기되는 장애에 대해 보호를 하기 위해 선충류의 항원의 에피토프를 포함한다. 또다른 구현예에서,플라스모디움 (Plasmodium) 에피토프를 코딩하는 임의의 DNA 서열은, 재조합체 VSV 로 발현되는 경우 척추동물 숙주에서 면역원성인데, 이는 본 발명에 따라 VSV(-) DNA 로의 삽입을 위해 단리된다. DNA 의 공급원으로서 제공되는 플라스모디움 (Plasmodium) 의 종에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 말라리아 기생충 플라스모디움 팔시파룸 (P. falciparum), 플라스모디움 말라리아 (P. malariae), 플라스모디움 오베일 (P. ovale), 플라스모디움 비박스 (P. vivax) 및 동물 말라리아 기생물 플라스모디움 베리게이 (P. berghei), 플라스모디움 요엘리 (P. yoelii), 플라스모디움 노울레시 (P.knowlesi) 및 플라스모디움 시노몰지 (P. cynomolgi) 이다. 또다른 구현예에서, 항원은 콜레라 독소의 β-서브유닛의 펩티드를 포함한다.
상승적으로 감쇠된 VSV (외래 RNA 가 바이러스의 항원 또는 그의 에피토프를 포함하는 그의 유도체 생산을 지령함) 에 의해 발현되는 에피토프 발현 바이러스에는, 이에 한정되지 않으나, 한정이 아닌 편리의 목적으로 그러한 바이러스들을 과별로 제시한 표 2 에 제시된 것이 포함된다.
VSV 에 의해 발현될 수 있는 에피토프를 발현하는 바이러스
I. 피코나바이러스과 ( Picornaviridae )
장바이러스
폴리오바이러스
콕삭키바이러스
에코바이러스
리노바이러스
A 형 간염 바이러스
II. 노로바이러스과 ( Caliciviridae )
바이러스의 노워크 군 (norwalk group of virus)
III. 토가바이러스과 ( Togaviridae ) 및 플라비바이러스과 ( Flaviviridae )
토가바이러스 (예를 들어, 뎅기열 바이러스)
알파바이러스
플라비바이러스 (예를 들어, C 형 간염 바이러스)
루벨라 바이러스
IV. 코로나바이러스과 ( Coronaviridae )
코로나바이러스
V. 랍도바이러스과
광견병 바이러스
VI. 필로바이러스과 ( Filoviridae )
마르부르그 바이러스
에볼라 바이러스
VSV 에 의해 발현될 수 있는 에피토프를 발현하는 바이러스
VII. 파라믹소바이러스과 ( Paramyxoviridae )
파라인플루엔자 바이러스
유행성이하선염 바이러스
홍역 바이러스
호흡기 합포체 바이러스
메타뉴모바이러스
VIII. 오르토믹소바이러스과 ( Orthomyxoviridae )
오르토믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스)
IX. 분야바이러스과 ( Bunyaviridae )
분야바이러스
X. 아레나바이러스과 ( Arenaviridae )
아레나바이러스
XI. 레오바이러스과 ( Reoviridae )
레오바이러스
로타바이러스
오르비바이러스
XII. 레트로바이러스과 ( Retroviridae )
인간 T 세포 백혈병 바이러스 제 I 형
인간 T 세포 백혈병 바이러스 제 II 형
인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, 제 I 형 및 제 II 형)
유인원 면역결핍 바이러스
렌티바이러스
XIII. 파포바이러스과 ( Papoviridae )
폴리오마바이러스
파필로마바이러스
VSV 에 의해 발현될 수 있는 에피토프를 발현하는 바이러스
XIV . 파르보바이러스과 ( Parvoviridae )
파르보바이러스
XV . 헤르페스바이러스과 ( Herpesviridae )
단순 헤르페스 바이러스
엡스테인-바아 바이러스
싸이토메갈로바이러스
수두대상포진 바이러스
인간 헤르페스바이러스-6
인간 헤르페스바이러스-7
세르코피테킨 (Cercopithecine) 헤르페르 바이러스 1 (B 바이러스)
XVI . 폭스바이러스과 ( Poxviridae )
폭스바이러스
XVIII . 헤파드나바이러스과 ( Hepadnaviridae )
B 형 간염 바이러스
XIX . 아데노바이러스과 ( Adenoviridae )
특정 구현예에서, 감쇠된 VSV 에 의해 숙주의 감염시 발현되는 외래 서열에 의해 코딩되는 항원은 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소; 인간 호흡기 합포체 바이러스 G 당단백질 (G); 홍역 바이러스 적혈구응집소 또는 단순 헤르페스 바이러스 타입-2 당단백질 gD 의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
감쇠된 VSV 에 의해 발현되는 다른 항원들에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 항원의 항원성 또는 면역원성을 나타내는 것이 포함된다: 폴리오바이러스 I VP1; HIV I 의 외피 당단백질; B 형 간염 표면 항원; 디프테리아 독소; 사슬알균 24M 에피토프, SpeA, SpeB, SpeC 또는 C5a 펩티다아제; 및 임균 섬모소.
다른 구현예에서, 감쇠된 VSV 에 의해 발현되는 항원은 슈도라비스 바이러스 (pseudorabies virus) g50 (gpD), 슈도라비스 바이러스 II (gpB), 슈도라비스 바이러스 gIII (gpC), 슈도라비스 바이러스 당단백질 H, 슈도라비스 바이러스 당단백질 E, 전염성위장병 바이러스 (transmissible gastroenteritis) 당단백질 195, 전염성위장병 바이러스 매트릭스 단백질, 돼지 로타바이러스 당단백질 38, 돼지 파르보바이러스 캡시드 (capsid) 단백질, 세르풀리나 히도디센테리아 (Serpulina hydodysenteriae) 보호 항원, 소의 바이러스성 설사병 바이러스 (Bovine Viral Diarrhea) 당단백질 55, 뉴캐슬병 바이러스 적혈구응집소-뉴라미니다아제, 돼지 인플루엔자 적혈구응집소, 또는 돼지 인플루엔자 뉴라미니다아제의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
특정 구현예에서, 감쇠된 VSV 에 의해 발현되는 항원은, 이에 제한되지 않으나, 고양이 백혈병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노바이러스, 개 파르보바이러스 등을 포함하는 개 또는 고양이 병소로부터 유도된 항원의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
특정 다른 구현예에서, 감쇠된 VSV 에 의해 발현되는 항원은 세르불리나 효디센테리아 (Serpulina hyodysenteriae), 구제역 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 아프리카 돼지 콜레라 바이러스, 마이코플라즈마 하이포뉴모니아 (Mycoplasma hyopneumoniae), 소의 전염성 비기관염 바이러스 (예를 들어, 소의 전염성 비기관염 바이러스 당단백질 E 또는 당단백질 G), 또는 전염성 후두기관염 바이러스 (예를 들어, 전염성 후두기관염 바이러스 당단백질 G 또는 당단백질 I) 로부터 유도된 항원의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
또다른 구현예에서, 항원은 라 크로세 (La Crosse) 바이러스, 신생 송아지 설사병 바이러스, 베네주엘라 말 열 뇌척수염 바이러스, 푼타 토로 (Punta Toro) 바이러스, 설치류 백혈병 바이러스 또는 마우스 유암 바이러스의 당단백질의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
다른 구현예에서, 항원은, 이에 제한되지 않으나 인간 헤르페스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스-1, 단순 헤르페스 바이러스-2, 인간 싸이토메갈로바이러스, 엡스테인-바아 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 인간 헤르페스바이러스-6, 인간 헤르페스바이러스-7, 인간 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (타입 1 및/또는 타입 2), 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 열대열원충 (Plasmodium falciparum) 및 보르데텔라 페르투시스를 포함하는 인간 병소의 항원의 항원성 또는 면역원성을 나타낸다.
감쇠된 VSV 에 의해 발현되는 항원으로서 사용하기에 잠재적으로 유용한 항원 또는 그의 유도체는 병원의 전염성의 중화에 동원되는 항원, 타입 또는 군 특이성, 환자의 혈청 또는 면역 세포에 의한 인식 및/또는 항원에 대해 특이적인 혈청 또는 면역 세포의 보호적 효과의 증명과 같은 각종 기준으로 식별된다.
또다른 구현예에서, 감쇠된 VSV 의 외래 RNA 는 에피토프를 포함하는 항원의 생산을 지령하는데, 여기서 감쇠된 VSV 가 원하는 숙주에 도입되는 경우, 에피토프를 포함하는 실체에 의해 야기되는 조건 또는 장애에 대항하여 보호하는 면역 응답성을 유도한다. 예를 들어, 항원은 종양 (예를 들어, 악성 종양) 에 대항하는 보호적 면역 응답성의 도입을 위한 종양 특이적인 항원 또는 종양 관련 항원일 수 있다. 상기 종양 특이적 또는 종양 관련 항원에는, 이에 제한되지 않지만 KS 1/4 범-암종 항원; 난소 암종 항원 (CA125); 전립선 산 인산; 전립선 특이적 항원; 흑색종 연관 항원 p97; 흑색종 항원 gp75; 고분자량 흑색종 항원 및 전립선 특이적 멤브레인 항원이 포함된다.
항원을 코딩하는 외래 DNA 은, 감쇠된 VSV DNA 의 비필수적인 부위에 삽입되는데, 임의로는 추가로 감쇠된 VSV 로 감염된 숙주에서 면역 응답성을 발현 및 자극할 수 있는 싸이토카인을 코딩하는 외래 DNA 서열을 포함단다. 예를 들어, 상기 싸이토카인에는, 이에 제한되지 않지만, 인터류킨 1α, 1β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 α 및 β 이 포함된다.
D. 면역원성 및 약제학적 조성물
특정 구현예에서, 본 발명은 면역원성 투여량으로 그의 게놈에서의 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터 및 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것인데, 여기서 상기 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킨다.
본 발명의 상승적으로 감쇠된 VSV 벡터는 포유류 대상체 (예를 들어, 인간) 에 대한 투여용으로 제형화된다. 상기 조성물은 일반적으로 VSV 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이후 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 는 약제학적 투여물과 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제를 포함하는 것으로 의도한다. 약제학적 활성 물질에 대해 상기 매질 및 시약을 사용하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 시약이 VSV 벡터와 비상용성인 경우만 제외하고, 상기 매질은 본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 수 있다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
따라서, 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 VSV 면역원성 조성물은 그의 의도하는 투여 경로와 상용성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예시에는, 비경구 (예를 들어, 정맥내, 진피내, 피하, 근육내, 복강내) 및 점막 (예를 들어, 경구, 직장, 비내, 협측, 질, 호흡기) 이 포함된다. 비경구, 진피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 하기의 성분들이 포함된다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정 오일 (fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로오스. pH 는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정된다. 비경구용 제제는 앰플, 1 회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 투여량 바이알에 내입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 주사용액 또는 분산물의 임시처방 제제용 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위한, 적합한 담체에는 생리적 식염수, 정균처리수, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 가 포함된다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 반드시 멸균이어야 하며, 용이한 주사성이 존재할 정도로는 액상이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 반드시 안정해야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야만 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산물이다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산된 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용으로 유지된다. 미생물의 작용 방지는 각종 항박테리아제 및 항균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등으로 달성된다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 설탕, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연 흡수는 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 달성된다.
멸균 주사용액은 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적당한 용매 중 필요한 양 (또는 투여량) 의 VSV 벡터를 혼입시킨 후, 멸균 여과하여 제조한다. 일반적으로, 분산물은 기본적인 분산 매질 및 상기 언급한 것들로부터의 기타 필요한 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사용수의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 그의 사전 멸균 여과 용액으로부터의 원하는 임의의 추가적인 성분을 제공하는 동결 건조법 및 진공 건조법이다.
흡입에 의한 투여를 위해서는, 화합물을 적합한 추진체 (예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체 또는 분무기) 를 포함하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 전신 투여는 또한 점막 또는 경피 수단으로 될 수 있다. 점막 또는 경피 투여용으로, 투과시킬 담체에 적합한 침투제를 제형물에 사용한다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막 투여용의, 계변활성제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체가 포함된다. 점막 투여는 비강용 스프레이 또는 좌제의 이용으로 수행된다. 화합물들은 또한 좌제 (예를 들어, 통상적인 좌제용 기제, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드) 또는 직장내 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조된다.
특정 구현예에서, 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위체 형태의 경구용 또는 비경구용 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 이후 사용되는 투약량 단위체 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리되어 있는 단위체를 지칭하며; 각각의 단위체는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약량 단위체 형태의 상세사항들은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과 및 개인의 치료별 상기 활성 화합물의 조합에 있어서 당업계에서의 고유의 제한점에 따라 결정된다.
본원에 인용된 모든 특허 및 공보는 참고문헌으로 포함된다.
D. 실시예
하기 실시예는 표준 기술로 수행되었는데, 이는 달리 상세하게 기재된 것을 제외하고는 당업자에게 널리 공지된 일상적인 것들이다. 하기의 실시예는 설명을 목적으로 제시된 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다.
실시예 1
재료 및 방법
VSV G 단백질 세포질의 말단 돌연변이체
본 발명의 G 단백질 세포질의 말단 돌연변이체의 생성에 이용되는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, Schnell 등 (1998) 의 문헌에 기재되어 있다. 야생형 VSV 인디애나 주 (서열 식별 번호: 1) 의 29 개의 아미노산 세포질의 말단 도메인과 비교해, 상기 G 단백질 돌연변이체는 G 세포질의 말단 도메인에 단일 아미노산 (G(ct-1)) 또는 9 개의 아미노산 (G(ct-9)) 를 보유했다. 세포질의 말단 절단은 트랜슬레이션 정지 코돈을 원래의 정지 코돈 상류방향으로 60 개의 뉴클레오티드 또는 84 개의 뉴클레오티드 (즉, 각각 9 개짜리 아미노산 세포질의 말단 및 1 개짜리 아미노산 세포질의 말단에 대한 것임) 만큼 옮겨 G 단백질의 절단을 형성해 생성되었다.
VSV N 유전자 섞기 돌연변이체
N 유전자 전위 돌연변이체 (N 섞기) 는 바이러스 게놈의 3' 말단으로부터 2 번째, 3 번째 또는 4 번째 유전자만큼 N 유전자를 재위치시켜 생성했다. 예를 들어, 야생형 VSV 의 원래 유전자 순서인 3'-NPMGL-5' 는, 3'-PNMGL-5' 및 3'-PMNGL-5' 로 돌연변이화했다. 독특한 3' RNA 전사 프로모터로부터 더욱더 먼 N-유전자의 전위는 N 유전자 발현의 수준에 있어서 그에 비례하는 감소를 초래했다 (예를 들어, U.S. 특허 6,596,529 를 참조, 이는 전부 본원에 참고문헌으로 포함됨). 감염된 세포에서의 N 단백질의 수준 감소는 바이러스 뉴클레오캡시드 형성을 둔화시켜, 궁극적으로는 게놈 복제 및 바이러스 입자 형성 속도를 감소시켰다. N 유전자 전위에 사용된 방법은 하기에 기재한다.
N 유전자 섞임의 제공을 위한 제 1 단계로서, 전장 바이러스 게놈 cDNA 로부터 N 유전자를 완전히 제거하여, N 유전자 대신 바이러스 리더에 매우 근접하게 P 유전자가 위치하게 했다. N 유전자를 제거하기 위해, 템플레이트로서의 전장 게놈 cDNA 를 이용하여 2 가지 PCR 생성물을 제조했다. 첫번째 PCR 생성물은 T7 프로모터의 상류의 자연 BsaAI 부위로부터 바이러스 리더의 말단까지 이르는 서열을 포함했으며, 하류의 BsmBI 부위를 추가했다. 두번째 PCR 생성물은 P 유전자 내의 자연의 XbaI 부위로부터 추가된 상류의 BsmBI 부위에 근접한 P 유전자에 대한 전사 시작 시그널까지 이르는 서열을 포함했다. BsmBI 부위는 두 PCR 생성물이 이음매없이 결합되도록 하는 방식으로 정렬시켜 (효소절단 및 라이게이션을 따름) P 유전자에 매우 근접한 바이러스 리더를 포함하는 단일한 DNA 절편을 제작했다. 상기 DNA 절편은 전장 게놈 cDNA 의 XbaI/BsaAI 부위에 라이게이션시켜, 바이러스 게놈으로부터 N 유전자를 효과적으로 제거했다.
N 유전자 섞기 발생을 위한 이후 단계에서, N 유전자는 결실된 N 게놈 cDNA 의 P 및 M 유전자의 사이 또는 M 및 H 유전자의 사이 또는 G 및 L 유전자의 사이에 삽입했다. P 및 M 유전자 사이의 N 유전자의 삽입을 위해서, 템플레이트로서의 전장 게놈 cDNA 를 이용하여 3 가지 PCR 생성물을 제조했다. 첫번째 PCR 생성물은 P 유전자 중의 자연 XbaI 부위로부터 M 유전자의 전사 시작 시그널까지 이르는 서열을 포함했으며, 측면 BsmBI 부위를 추가했다. 두번째 PCR 생성물은 N 유전자의 전사 시작 시그널로부터 N 유전자의 3'-AAAAAAA-폴리아데닐화 시그널에 근접한 보존성 TATG 서열에 이르는 서열을 포함했으며, 측면 BsmBI 부위를 추가했다. 세번째 PCR 생성물은 G 유전자의 시작점의 자연 MluI 부위로부터 P 유전자의 보존성 TATGAAAAAAA 폴리아데닐화 시그널에 이르는 서열을 포함했으며, 측면 BsmBI 부위를 추가했다. 3 가지 절편 모두 이후 BsmBI 로 효소절단하고, 다시 라이게이션시켜 P 유전자 및 M 유전자 부분이 측면에 위치한 N 유전자가 있는 단일 DNA 절편을 제조했다. 이어서, 상기 DNA 절편을 XbaI 및 MluI 로 효소절단하고, 델타-N 바이러스 게놈의 XbaI/ MluI 부위에 라이게이션시켜 3'-PNMGL-5' cDNA 를 형성했다.
3'-PMNGL-5' 게놈 cDNA 의 제조를 위해, 2 가지 구분되는 PCR 생성물을 제작했다. 첫번째 PCR 생성물은 P 유전자의 자연 XbaI 부위로부터 G 유전자의 전사 시작 시그널 (5'-AACAG-3') 까지 이르는 서열을 포함하며, 측면 BsmBI 부위를 추가했다. 두번째 PCR 생성물은 측면 상류에 BsmBI 부위를 추가한, 전사 시작 시그널부터 전체 N 유전자 서열로부터 N 유전자 전사 정지/폴리아데닐화 시그널까지 이르는 서열을 포함했으며, 서열은 G 전사 시작 시그널로부터 G 유전자의 자연 MluI 부위까지 이르는 서열이 측면에 위치한다. G 유전자 특이적 서열을, PCR 프라이머 중 하나의 일부로서 N 유전자 서열에 추가했다. 두 PCR 생성물 모두를 BsmBI 로 효소절단하고 라이게이션시켜 단일 DNA 절편을 제조했는데, 이는 이어서 XbaI 및 MluI 로 효소절단하고 N 게놈 cDNA 의 XbaI/MluI 부위에 라이게이션시켜 5'-PMNGL-3' 유전자 배열을 완성했다.
5'-PMGNL-5' 게놈 cDNA 의 제조를 위해, 3 가지 PCR 생성물을 온전한 게놈 cDNA 템플레이트로부터 제조했다. 첫번째 PCR 생성물은, 추가된 BsmBI 부위가 측면에 있는, G 유전자의 자연 Swal 부위로부터 L 유전자의 전사 시작 시그널에까지 이르는 서열을 포함했다. 두번째 PCR 생성물은 추가된 BsamBI 부위의 양 말단이 측면에 있는, 전사 시작 시그널로부터 전자 정지 시그널에까지 이르는 온전한 N 유전자에 대한 서열을 포함했다. 세번째 PCR 생성물은 추가된 BsaBI 부위가 측면에 있는, L 유전자 전사 시작에서부터 L 유전자의 자연 HpaI 부위까지 이르는 서열을 포함했다. 세가지 PCR 생성물 모두 BsmBI 로 효소절단하고 라이게이션하여 단일한 DNA 절편을 제조하고, 이어서 Swal 및 HpaI 로 효소절단하고, 결실된 N 게놈 cDNA 의 SwaI/HpaI 부위에 라이게이션시켜 5'-PMGNL-3' 유전자 배열을 수득했다. 세가지 모든 재배열된 게놈에서, 각각의 유전자 및 측면 조절 서열의 서열 완결성 (sequence-integrity) 은 비변경 바이러스와 동일했으며; 오직 N 유전자의 위치만 상이했다.
G 단백질 세포질의 말단 돌연변이 및 N 섞기 돌연변이의 조합
N 유전자 섞기 및 G 단백질 세포질의 말단 절단의 두 가지의 조합은 이중 돌연변이화 게놈 (예를 들어, 2 가지 돌연변이 클래스), 예를 들어 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-5', 및 3'-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 를 제공했다. 이중 돌연변이체 게놈 cDNA 는 상기 기재된 바와 같은 절단형 G(ct-1) 또는 G(ct-9) 유전자를 이용하여 N 섞기 게놈에 자연 G 유전자를 스와핑하여 구축했다. 상기 스와핑은 공여체 cDNA (5'-NPMG(ct-1)L-3' 및 5'-NPMG(ct-9)L-3') 를 MluI 및 HpaI 로 효소절단한 후, 정제된 절단형 G 유전자를 N 섞기 cDNA 게놈의 MluI/HpaI 부위에 라이게이션하여 수행했다. 상기 이중 돌연변이체를 cDNA 로부터 포획하여, 3 중 플라크를 정제하고 증폭하고, 하기 기재된 바와 같이 플라크 크기 및 성장 동역학으로써 세포 배양 내에서 특징분석을 했다.
비-세포변성 M 유전자 돌연변이
VSV M 유전자는 바이러스 매트릭스 (M) 단백질, 및 2 가지의 더 작은 인-프레임 폴리펩티드 (M2 및 M3) 를 코딩한다. M2 및 M3 폴리펩티드는 동일한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 으로부터 M 단백질로서 트랜슬레이션되며, 각각 처음 33 개 및 51 개의 아미노산이 없다. 비-세포변성 M 유전자 돌연변이를 포함하는 재조합체 VSV 벡터 (예를 들어, M2 및 M3 단백질을 발현하지 않는 VSV 벡터) 는 하기에 기재된 바와 같이 제조했으며, 추가로 하나 이상의 추가적인 돌연변이(들)을 포함함으로써, 세포 배양 및 동물에서 고도로 감쇠된 VSV 벡터를 제공했다.
비-세포변성 M 유전자 돌연변이 (M( ncp )) 는, 메티오닌 33 및 51 을 알라닌으로 변환시키는데 (M33A, M51A), 이는 PCR 기재 클로닝 전략을 이용해 제조되며, 여기서 필요한 뉴클레오티드 치환 (AUG 에서 GCT) 이 PCR 프라이머에 혼입된다 (Jayakar 및 Whitt, 2002; Jayakay 등, 2000). 이어서, M33,51A 돌연변이를 포함하는 수득되는 PCR 생성물은 전장 VSV cDNA 게놈으로 클로닝하여, M2 및 M3 폴리펩티드를 발현하지 않는 바이러스의 포획을 가능하게 한다.
Jayakar 및 Whitt 이 고안한 재조합체 VSV 벡터 cDNA 에 존재하는 M33.51A 돌연변이는 XbaI-MluI 절편 (온전한 M 유전자 및 P 유전자의 일부에 편재함) 을 교환하여 VSV 벡터(들) cDNA 로 이동된다. cDNA 절편 스와핑은 M33,51A 돌연변이를 벗어나는 임의의 추가적인 아미노산 코딩 변화를 제공하지 않았다.
G 단백질 세포질의 말단 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이의 조합
G 단백질 세포질의 말단 절단 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이 두가지의 조합은 이중으로 돌연변이화된 게놈 (예를 들어, 2 가지 돌연변이 클래스), 예를 들어 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 를 제공했다. 상기 이중 돌연변이체 게놈 cDNA 들은 비-세포변성 표현형을 제공하는 돌연변이를 포함하는 M 유전자 cDNA 를 G(ct-1) 또는 G(ct-9) 돌연변이를 포함하는 전장 게놈 cDNA 로 스와핑하여 구축했다. 각각의 경우, 스와핑된 cDNA 절편은 P 유전자의 독특한 Xba I 부위로부터 G 유전자의 5' 비-트랜슬레이션 영역 중의 독특한 MluI 부위에 이르며, 전체 비-세포변성 M 유전자 서열을 포함했다.
상기에 기재한 바와 같이, 오직 2 개의 아미노산 치환 (M33A 및 M51A) 으로 M 단백질과는 상이한 비-세포변성 M 단백질이 그것을 대체하여, 비-세포변성 표현형을 제공한다. 이어서, 상기 이중 돌연변이화 게놈은 HIV-1 gag 유전자를 게놈 중의 위치 5 에서 G 및 L 유전자 사이에 삽입하여 추가로 개질함으로써, 면역원성 연구를 위한 gag 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다른 바이러스 rVSV 벡터에 있어서, gag 유전자를 게놈 cDNA 의 위치 5 에서 독특한 XhoI/NheI 부위체 클로닝했다.
VSV N 유전자 온도 민감성 돌연변이 및/또는 VSV L 유전자 온도 민감성 돌연변이
바이러스 게놈 (rVSV-Gag1) 중의 첫번째 3' 시트론으로부터 HIV Gag 단백질을 코딩하는 재조합체 VSV (rVSV) 는 공지된 생물학적으로 유도된 VSV 온도 민감성 (ts) 돌연변이체 (Pringle, 1970) 로부터 유도된 동종 코딩 서열로 교체하여 개질했다. 수득되는 벡터, (i) rVSV-Gag1tsN (예를 들어, 3'-gag1-N(ts)-PMGL-5') 는 VSV 주 ts41 유래의 ts N 유전자를 포함하며, (ii) rVSV-Gag1tsL (예를 들어, 3'-Gag1-NPMGL(ts)-5') 는 VSV 주 ts11 유래의 L 유전자를 포함하며, (iii) rVSV-Gag1tsN+L (예를 들어, 3'-gag1-N(ts)-PMCL(ts)-5') 는 VSV 주 유래의 ts N 유전자 및 VSV 주 ts11 유래의 L 유전자를 모두 포함한다. VSV 주 ts41 및 ts11 는 또한 당업계에 tsG41 및 tsG11 로서 각각 공지되어 있다.
두 가지의 생물학적으로 유도된 ts 유전자-공여체 주는, 실험실에서 적응시킨 VSV (인디애나 항원형의 글래스고우 (Glasgow) 주) 를 화학적 돌연변이화에 적용한 후 Pringle 의 방법으로 분리되었다 (Pringle, 1970). Pringle 는 또한 ts 돌연변이를 N 또는 L 유전자에 대해 맵핑했다.
감염시킨 세포 RNA 로부터 ts41 N 및 ts11 L 유전자를 클로닝했다. 간결하게는, BHK 세포는 허용 온도 (31 내지 32℃) 에서 ts11 또는 ts41 로 감염시켰다. 상기 감염은 세포변성 효과가 세포 단일층의 75% 를 초과하도록 명확하게 될 때까지 진행되도록 하여, 이 때 총 RNA 를 추출하여 정제했다. 이어서, RNA 를 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 역방향으로 전사하여, cDNA 합성을 지령했고 이후, 상기 cDNA 를 PCR 로 증폭했다. 이어서, 증폭된 cDNA 를 rVSV 벡터 게놈 cDNA 에 클로닝하고, 서열 분석으로 확인했다.
ts11 , ts41 및 이들의 후손 주 (Glasgow) 의 완전한 게놈 서열을 분석하여 ts 표현형을 제공하는 코딩 변화를 식별해 냈다. rVSV 벡터 백그라운드로부터 코딩 서열, Pringle ts 돌연변이체 및 Glasgow 후손 바이러스를 비교함으로써, 어느 코딩 변화가 rVSV-Gag1tsN, rVSV-Gag1tsL 및 rVSV-Gag1tsN+L 벡터의 ts 표현형을 부여하는지 예측하는 것이 가능하게 되었다.
표 3 은 N 단백질 아미노산 서열의 비교이다. 이들 데이터로부터, rVSV 벡터 N 유전자를 ts41 동족체로 치환하는 것은 4 개의 아미노산 치환을 제공한다는 것이 명확해졌다. 임의의 상기 변화들이 벡터 유전자 배경의 문맥상 N 단백질 기능에 영향을 줄 수 있고 ts 표현형을 부여할 수 있다. 오직 1 개의 변화 (위치 74 에서 Tyr 에서 Cys 로, 잔기들을 이탤릭체로 나타냄) 가 ts41 를 그의 후손 바이러스 (Glasgow) 와 구분될 수 있도록 함에 주목할 수 있으며, 이는 상기 치환이 중요한 ts 결정자일 수 있음을 시사한다.
Figure 112006072788585-PCT00001
유사하게, 표 4 는 L 단백질 비교를 제공한다. rVSV 벡터에서 L 유전자의 ts11 상대편 (counterpart) 으로의 대체는 13 개의 아미노산 코딩 변화를 제공한다. N 유전자에 대해 상기 언급한 바와 같이, 임의의 상기 코딩 변화들은 L 유전자의 대체에 의해 제공되는 관찰된 ts 표현형을 제공할 수 있으나, 이들 코딩 돌연변이들 중 몇몇은 (이탤릭체로 표시) 매우 흥미로운 대상인데, 이는 이들이 또한 잠재적으로는 상기 아미노산 치환들을 ts 표현형에 대한 중요한 결정자로서 식별함으로써 ts11 을 그의 Glasgow 후손 바이러스와 차별화되기 때문이다.
Figure 112006072788585-PCT00002
G- 스템 돌연변이 및 G- 스템 /유전자 섞기 돌연변이
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자 개질 VSV 는 G 유전자에서의 돌연변이를 포함하는데, 여기서 코딩되는 G 단백질은 G-스템 단백질로 지칭되는 G 단백질 엑토도메인의 멤브레인-근접 스템 영역에 돌연변이를 갖는다. G-스템 돌연변이는 VSV XN 벡터 유전자 백그라운드 중의 G 유전자 (Schnell 등, 1996) 를 G-스템을 코딩하는 개질된 G 유전자로 대체하여 도입했다. G-스템 (Robison, 2000) 은 512 개의 G 단백질 아미노산 중 하기를 포함하는 108 개로 이루어진다: 1) G 단백질의 첫번째 17 개의 아미노산, 이는 멤브레인 삽입을 표적으로 하는 시그널 서열을 포함함; 2) 스템으로 지칭되는 멤브레인-근접 세포외 도메인의 42 개 아미노산; 3) 20 개의 아미노산 멤브레인-편재 도메인; 및 4) 29 개의 아미노산 카르복시-말단 세포내 말단. G-스템 폴리펩티드의 상기 배치는 바이러스 입자의 성숙을 중재할 만큼 충분한 G 단백질 서열을 포함하지만, 세포 결합 단백질로서 작용하기 위해 필요한 서열은 결핍되었다. 결과적으로, G-스템 벡터가 감염된 세포는 바이러스 단백질 및 코딩되는 외래 항원을 발현하나, 전염성이 아닌 후손 바이러스 입자를 제공할 것인데, 이는 G-스템 벡터가 완전한 기능의 G 단백질을 코딩하는 것이 아니기 때문이다.
표적 세포 감염에 필요한 관능성 G 단백질을 포함하는 G-스템 벡터 입자의 제조를 위해서는, 전장 G 단백질은 반드시 트랜스 (trans) 로 제공되어야 한다. 이는 바이러스 포획 및 후속하는 하기 중 한 가지 과정에 의한 백신 제조 동안 달성될 수 있다: 1) G 단백질을 발현하는 세포주가 개발될 수 있다; 2) G 단백질을 발현하는 상보적 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, MVA 또는 VEE 가 이용될 수 있다; 또는 3) 제조에 사용될 세포가 G 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA 벡터 또는 mRNA 로 트랜스펙션될 수 있다.
현재, G-스템 벡터는 G 단백질을 발현하도록 고안된 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에서의 일시적 보완 (transient complementation) 에 의해 제조된다. 이는, 독성이라 제조하기 어려운 G 단백질을 발현하는 세포주를 제조해야 하는 것을 피할 수 있고, 또한 헬퍼 바이러스와 같은 생물학적 시약을 제조 공정에 도입하는 것을 피하도록 해 준다. G-스템 벡터의 일부 배치에서, 바이러스 단백질을 코딩하는 시스트론 (cistron) 은 하류방향에서 섞여서 외래 유전자가 첫번째 게놈 위치로 삽입되도록 해 준다. 이는 바이러스를 감쇠시키며, 외래 항원 유전자를 고도의 발현을 보장하는 프로모터 근처에 위치시킨다.
섹션 A1 에서 기재한 바와 같이, 위치 1 에서 VSV 게놈에 대한 HIV gag 유전자 (또는 임의의 다른 유전자) 의 삽입 (3'-gag1-NRMGL-5') 이 유전자 섞기 돌연변이를 유효하게 제공하며, 여기서 N, P, M, G 및 L 유전자는 각각 그의 야생형 위치로부터 게놈 상의 더욱 원거리의 위치로 이동된다. 따라서, G(stem) 돌연변이 및 위치 1 에서 VSV 게놈에 대한 gag 의 삽입 (gag1) 의 조합은 이중 돌연변이화 게놈 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 을 제공했다.
293 세포에서의 소포성 구내염 바이러스의 포획
293 세포로부터 성공적인 VSV 의 포획은 국제 공보 WO 2004/113517 (구체적으로는 본원에 참고문헌으로 포함됨) 에 기재된 기본적인 열충격/플라스미드-T7 시스템을 이용하여 하기의 수정된 프로토콜에 따라 수행되었다.
재료
플라스미드 DNA: 1) 전장 바이러스 게놈 cDNA, 2) pT7-N, 3) pT7-P, 4) pT7-L, 5) pT7-M, 6) pT7-G 및 7) pCI-Neo-bcl-T7 (p0061).
칼슘- 포스페이트 트랜스펙션 시약: 1) 2 × BES-완충 식염수: 50 mM BES (pH 6.95 내지 6.98), 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4, 2) 2.5 M CaCl2 및 3) Hepes-완충 식염수 세척 용액 (HBS): 20 mM hepes (pH 7.O 내지 7.5), 140 mM KCl, 1 mM MgCl2.
세포 배양 용액: 1) 10% 공인된, 열-불활성화 FBS 가 보충된 DMEM (DMEM/FBS), 2) 10% 공인된, 열-불활성화 FBS 가 보충된 Iscoves Modified Minimal Essential Medium (IMEM) (IMEM/FBS), 3) 폴리-L-라이신: H20 중 0.01%, 4) PBS 및 5) 돼지 트립신/EDTA.
과정
293 세포 배양: 293 세포는 배양하기에 어려울 수 있으며, 이들을 취급하는 것이 상이한 몇가지 방법이 있다. 현재의 방법은 VSV 및 개질된 VSV 벡터 구축물에 대한 포획 시스템으로서 성공적으로 이용되었다.
일반적인 계대배양 :
1) 배지를 제거하고, 5 ml 의 따뜻한 PBS 를 사용해 융합성 (confluent) 단층 (10 cm 플레이트) 을 세척하며; 세포의 탈착을 방지하기 위해 디쉬 측면을 따라 약하게 피펫팅한다 (실온에 너무 오래 두거나 염기성 (적색) 으로 된 배지 중에서 293 세포는 탈착한다).
2) 2 ml 의 트립신을 가만히 첨가하고 플레이트를 잠궈서 단층 전부를 덮도록 하고, 트립신을 흡출시키고, 플레이트를 실온에서 약 1 분간 정치시킨다. 플레이트를 45 도 각도로 기울여 후드의 작업 표면에 대고 살짝 쳐서 세포들을 떨어뜨린다. 세포가 떨어져 나오지 않으면, 실온에서 1 분 더 인큐베이션한다 (이 단계에서 세포가 떨어져나오도록 하여 심한 피펫팅을 피할 수 있다).
3) 5 ml 의 DMEM/FBS 을 가만히 첨가하고, 상하로 천천히 피펫팅하여 세포를 분산시킨다.
4) 9 ml 의 DMEM/FBS 를 포함하는 플레이트에 1 ml 의 세포를 추가한다.
5) 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션한다.
트랜스펙션을 위한 계대배양 :
1) 폴리-L 라이신으로 원하는 갯수만큼의 플레이트를 코팅한다. 플레이트마다 약 3 내지 4 ml 의 0.001% 폴리-L 라이신을 추가하고, 이를 실온에서 약 30 분 이상 정치시킨다. 폴리-L 라이신 용액을 흡출시킨다. 플레이트를 5 ml 의 배지로 헹구어낸다.
2) 상기 기재된 바와 같이 트립신처리한다. 이튿날, 50 내지 75% 의 융합성 (confluent) 플레이트를 제공하는 스플릿 비율 (split ratio) 을 이용한다 (1:3 내지 1:6).
3) 세포를 탈착시킨 후, IMEM/FBS 를 첨가하고, 세포를 9 ml 의 IMEM/FBS 를 포함하는 코팅된 플레이트에 옮긴다. 트랜스펙션 전에 세포를 분주하여 IMEM/FBS 중에서 밤새 성장하도록 하는 것이 중요하다.
4) 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션한다.
트랜스펙션 :
1) 트랜스펙션 1 내지 3 시간 전에, 세포에 9 ml 의 IMEM/FBS 를 공급하고, 세포를 3% CO2 로 맞춘 32℃ 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
2) 하기와 같은 칼슘-포스페이트-DNA 트랜스펙션 혼합물을 제조한다:
a) 5 ml 폴리프로필렌 관에 하기의 DNA 들을 배합한다: (i) 8 ㎍ T7-N, (ii) 4 ㎍ T7-P, (iii) 1.2 ㎍ T7 L, (iv) 1.0 ㎍ T7-M, (v) 1.0 ㎍ T7-G (vi) 10 ㎍ 의 바이러스 게놈 cDNA 클론 및 (vii) 10 ㎍ 의 hCMV-T7 발현 벡터.
b) 최종 부피가 450 ㎕ 이 되도록 물을 사용하여 부피를 조정한다.
c) 50 ㎕ 2.5M CaCl2 를 첨가한다.
d) 관을 와류시키면서, 500 ㎕ 의 2 ×BBS 를 추가한 후, 관을 실온에서 15 내지 20 분 동안 정치시킨다.
3) 인큐베이터에서 세포를 빼 내어, 배양 배지에 칼슘-포스페이트-DNA 혼합물을 천천히 추가하고, 침전물을 분산시키기 위해 가볍게 휘돌려준다. 세포를 재빨리 32℃-3% CO2 인큐베이터에 되돌려놓는다.
4) 트랜스펙션을 시작한 후 3 시간째에, 플라스틱 백에 배양 디쉬를 밀봉하고, 43℃ 로 고정시킨 수조에 2 시간 동안 완전히 잠기게 두어 세포의 열충격 반응을 유도한다.
5) 열충격 후, 세포를 32℃-3% CO2 인큐베이터에 되돌리고, 밤새 인큐베이션을 지속한다.
6) 이튿날, 세포를 HBS 로 2 회 세척하고, 세포에 10 ml 의 IMEM/FBS 를 공급한다. 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션한다.
7) 트랜스펙션 시작 후 48 내지 72 시간 째에, 트랜스펙션된 세포를 더 큰 용기에 옮기기 위해 20 ml DMEM/FBS 를 포함하는 충분한 T150 플라스크를 준비한다. 트랜스펙션된 10 cm 플레이트마다 1 개의 T150 플라스크를 제공한다.
8) 단층 전반에서 배양 배지를 가만히 피펫팅하여 트랜스펙션된 293 세포를 옮겨 세포 표면으로부터 이를 이동시킨다. 심한 피펫팅을 피하고, 세포를 이동시키기에 충분한 힘만을 사용한다. 세포를 이동시킨 후, 상하피펫팅을 약 5 회하여 세포 덩어리의 크기를 줄인 후, 배지 및 세포를 20 ml 의 IMEM/FBS 를 포함하는 T150 플라스크에 옮긴다.
9) 4 내지 6 시간 후, 상기 배지를 10% FBS 가 보충된 새로운 DMEM 으로 교체한다 (세포가 플레이트에 부착되지 않았다면, 이 단계는 24 시간까지 지연될 수 있음에 유의한다. 또한, 본 단계는 성공적으로 생략되었다).
10) 세포변성 영향의 증거를 탐지하기 위해 세포를 5 내지 7 일 동안 모니터링한다.
11) CPE (cytopathic effect) 가 분명한 것으로 나타나면, 배지 및 확립된 베로 세포 (Vero cell) 단층이 포함된 6 웰 플레이트 중의 웰에 50 ㎕ 의 배지를 옮긴다. 포획이 발생하면 CPE 는 반드시 그 이튿날 볼 수 있게 된다. (293 세포는 T150 플라스크의 표면에서 시시때때로 탈착되며, 이들이 실제로 그렇지 않는 경우 VSV-감염으로 나타나는 것이기 때문에, 본 단계는 중요하다는 것에 유의한다).
12) 소량의 시료를 베로 세포 단층에 옮긴 후, T150 플라스크로부터 세포 및 배지를 수합하고 -70℃ 로 냉동시킨다. 293 세포는 일반적으로 세포를 탈착시키기 위해 단층 전반에 걸쳐 배지를 피펫팅하여 수합될 수 있다.
소포성 구내염 바이러스의 베로 세포로부터의 포획
용액
하기의 용액들은 일반적으로 숙주 세포 트랜스펙션에 유용하다:
1) 280 mM NaCl [16.4 g NaCl (또는 56 ml 5M NaCl)], 50 mM BES [10.7 g BES (유리된 산 형태)], 및 1.5 mM 인산나트륨 [0.21 g Na2HPO4] 의 2 ×BBS (L 당) 용액 (2 × BES-완충 식염수). BBS 용액은 NaOH 를 이용해 pH 6.95 내지 6.98 로 조정한다. 이어서, 용액을 여과-멸균하고 냉동 보관한다.
2) 전체 부피 100 ml 당 36.8 g 의 2.5 M CaCl2 용액을 제조하고, -20℃ 로 저장한다. 니트로셀룰로오스를 이용하여 용액을 여과멸균한다. 셀룰로오스 아세테이트 필터는 피하는데, 이는 이들이 굳어지기 때문이다. 대안적으로, 트랜스펙션 용액은 멸균을 위해 오토클레이브한다. 그러나, 후자의 과정은 덜 바람직할 수 있는데, 이는 2 ×BBS 용액이 오토클레이브 동안 약간 변할 수 있기 때문이다.
하기의 용액들이 일반적으로 배지에 유용하다:
1) 10% 열-불활성화 공인 FBS 로 보충된 DMEM (글루타민이 있는 고급 글루코오스; Gibco/BRL, [Grand Island, NY]) 및 10 내지 20 ㎍/ml (임의로는 50 ㎍/ml 까지) 젠타마이신의 DMEM+FBS 용액.
2) MEM (젠타마이신, 불필수아미노산, 열-불활성화된 공인된 FBS, 및 10 내지 20 ㎍/ml (임의로는 50 ㎍/ml 까지) 의 20 내지 25 mM Hepes 완충액; Gibco/BRL 이 보충됨) (Grand Island, NY) 및 임의로는 1 × Fungizone) 의 MEM+FBS 용액.
3) Hepes-완충 식염수 세척 용액, 2O mM hepes, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 의 HBS 용액.
방법
일반적으로 유용한 숙주 세포는 스플릿 베로 세포 (split Vero cell) 로부터 선택될 수 있는데, 이는 트랜스펙션 전날 DMEM+FBS 에 위치시켜 그 이튿날 약 50% 융합성 [RSV 에 대해서는 80 내지 90%] 이 되도록 한다 (6-웰 플레이트 또는 12.5 ㎠ 플라스크). 더 높은 세포 밀도는 덜 유효하게 작용한다. 이튿날, 트랜스펙션 전 각각의 배양물에 4.5 ml 의 DMEM+FBS 를 공급한다. 이어서, 세포를 3% CO2 및 32℃ 로 설정한 CO2 인큐베이터로 옮긴다. 베로 세포는 이들이 트랜스펙션시 약 50% 의 융합성이기만 하다면, 더 긴 시간 동안 배양할 수 있다.
CaCl2/포스페이트 침전물은 하기와 같이 수득한다: 시작 전 BBS 및 CaCl2 은 실온에서 유지한다. 총 부피가 250 ㎕ 가 되도록 5 ml 폴리프로필렌 관에 DNA 혼합물을 제조하는데, 여기서 플라스미드 DNA 는 총 2 내지 20 ㎍ 이며, 25 ㎕ CaCl2 이 있다. 전장 포획물에 대한 DNA 는 VSV 에 대한 전장 cDNA 구축물 5 ㎍, 400 ng N 단백질, 300 ng P 단백질, 100 내지 200 ng L 단백질, 및 5 내지 10 ㎍ pCI-Neo-Bcl-T7 플라스미드 (서열 식별 번호: 1; 도 2) 를 포함한다. 베로 세포에서의 포획 효율은 낮아서, 포획된 전장 구축물 당 3 내지 6 개의 웰이 트랜스펙션된다.
모든 DNA/CaCl2 용액을 제조한 후, 2 ×BBS 를 추가한다. 이는 일반적으로 연속적인 저속 와류에 의한 관의 조심스러운 교반 및 관 측면으로 250 ㎕ 의 2 ×BBS 을 적가하여 수행된다. 이는 모든 관에 대해 반복했는데, 이는 실온에서 15 내지 20 분간 더 정치시키게 되어 DNA-칼슘-포스페이트 침전물이 형성되도록 한다. 실온 인큐베이션 후, 침전물을 세포 배양 배지에 첨가하고, 플레이트를 잠궈서 고르게 분포되도록 한다. 이어서, 배지를 3% CO2 로 설정된 인큐베이터에서 3 시간 동안 인큐베이션시킨다. 3% CO2 의 수준은 BBS/CaCl2 트랜스펙션 기술에서 중요한데; 5% CO2 는 전적으로 매우 열악하게 작용한다. 3% CO2 는 배지의 pH 를 제어하며, 배지 중에 유효한 칼슘-포스페이트-DNA 침전물의 형성을 가능하게 한다.
이어서, 임의로는 열충격 과정이, 예를 들어 트랜스펙션 시작 후 3 시간 째에 수행된다. 세포를 44℃ 로 설정된 수조에 옮긴다. 세포는 플라스틱 보관용 백에 밀봉하여, 배양물이 물에 완전히 잠길 수 있게 한다. 44℃ 에서 3 시간 후, 세포를 다시 3% CO2 로 설정된 32℃ 인큐베이터로 옮기고, 인큐베이션을 밤새 계속한다.
이튿날, 트랜스펙션 배지를 제거하고, 세포를 HBS 로 2 회 세척한다. 세척 후, 2 ml 의 새로운 DMEM+FBS 를 추가한다. PBS 및 Hank's 완충액은 세척 단계에서 열악하게 작용하는데, 이는 아마도 상기 완충액들 중의 인산염이 트랜스펙션 배지로부터 더 많은 CaCl2 가 침전되도록 하기 때문일 것이다.
이어서, 임의로는 공동배양 과정을 수행한다. 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션 후 48 내지 72 시간 째에 이들을 배지로부터 긁어내어, 세포와 배지를 베로 세포의 50% 융합성 단층을 포함하는 T26 플라스크에 옮긴다. 상기 공동 배양 후 6 시간 째에, 배지를 4 ml 의 MEM+FBS 로 교체한다. 이어서, 배양물을 5 일 동안 인큐베이션한다. 상기 인큐베이션 기간 동안 배지가 소모되는 것으로 보이기 시작하면, 2 ml 의 배지를 제거하고, 새로운 MEM+FBS 로 교체한다. 포획동안 생성된, 배지 중에 존재할 수도 있는 임의의 소량 바이러스조차 보존하기 위해, 배지 전부를 교체하는 것은 권장되지 않는다. 상기 공동 배양 기간 동안 CPE 는 명확해질 수 있으나, 이는 일반적인 경우는 아니다. CPE 가 전혀 나타나지 않는다면, 포획은 지속될 수 있다.
세포는 공동 배양 개시 후 5 일째에 수합한다. 우선, 0.5 ml 의 2.18 M 수크로오스, 37.6 mM KH2PO4, 71.0 mM K2HPO4, 49.0 mM 나트륨 글루타메이트를 배지에 첨가하고, 플라스크를 잠궈 혼합한다. 이어서, 세포를 배지 중으로 스크랩핑하고, 상하로 피펫팅하여 혼합한 후, 이동을 위한 냉동관에 분주한 후, 드라이아이스/에탄올 조에서 급냉시키고, -80℃ 에서 저장한다.
VSV 벡터 정제
포획된 VSV 벡터를 트랜스펙션된 세포의 상청액으로부터 플라크-정제했다. 플라크 정제의 3 회 연속 정제 후, 바이러스를 BHK 세포 상에서 증폭하여 시드 스톡을 제조하고, 이어서 추가로 BHK 세포 상에서 증폭하여 바이러스 작용 스톡을 제조했다. 동물 실험을 위한 대량의 바이러스를 제조하기 위해, 작용 스톡을 사용해 10 내지 20 개의 융합성 BHK 세포의 T-150 플라스크를 0.5 내지 1.0 플라크 형성 단위 (pfu)/세포의 감염 다중도 (MOI) 로 감염시켰다. 32℃ 에서 48 시간 후, 감염된 세포 상청액을 4,000 × g 에서의 원심분리로 정화했다. 이어서, 바이러스를 10% 수크로오스 쿠션 (sucrose cushion) 을 통해 SW 28 로터에서 25,000 rpm 으로 1 시간 동안 원심분리하여 상청액으로부터 농축했다. 바이러스 펠렛을 인산염 완충화 식염수 (PBS) 에 재분산시키고, 에탄올/드라이아이스 조에서 빨리 냉동시켰다. 이어서, 농축한 바이러스 스톡을 원숭이 세포 단일층 상에서 적정하여 제제 내 감염된 입자의 갯수를 측정했다.
바이러스 적정
바이러스 제제 중의 다수의 전염성 바이러스 입자를 표준 플라크 검정으로 측정했다. 간단하게, 6-웰 플레이트 내에서 밤새 지낸 새 융합성 베로 세포 단일층을 상기 바이러스 제제의 10 배 연속 희석물로 감염시켰다. 이를 위해, 성장 배지를 세포 단일층으로부터 흡출시키고, DMEM 중 각각의 바이러스 희석물의 100 ㎕ 분취물의 3 회분을 세포 단일층의 중심에 옮겼다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해, 400 ㎕ 의 DMEM 을 각각의 세포 단일층에 추가하고, 플레이트를 15 분 동안 실온에서 유지한 후, 이어서 뚜껑을 잠궈 37℃, 5% CO2 에서 30 분간 인큐베이션했다. 이어서, 바이러스 접종물을 제거하고, 각각의 세포 단일층에 3 ml 의 0.8% 아가로오스 (DMEM 중) 를 제공했다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2 에서 1 내지 4 일 동안 인큐베이션해 플라크가 형성되도록 했다. 이어서, 아가로오스 플러그를 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛 (50% 메탄올 중 2% 크리스탈 바이올렛) 으로 실온에서 10 분 동안 염색했다. 이어서, 잉여 염색물을 제거하고, 세포 단일층을 물로 헹구어냈다. 이어서, 세포 단일층에서 바이러스 플라크를 청색으로 염색되지 않은 작은 구멍으로서 볼 수 있었다.
실시간 PCR 에 의한 바이러스 RNA 의 정량
동물 조직 중의 VSV 게놈의 검출 및 정량을 위해 정량용 실시간 PCR (RT/PCR) 검정을 사용했다. 상기 검정은 네거티브 센스 바이러스 게놈 RNA 를 특이적으로 검출하는 2-단계 RT/PCT 접근법을 이용하며, 표준 곡선 작성을 위해서는 전체 앰플리콘 (amplicon) 의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 간단하게, 원숭이, 흰담비 및 마우스의 뇌 조직을 SPG 중의 20% W/V 슬러리로서 균질화했다. 상기 슬러리를 3,000 x g 에서 15 분 동안 원심분리하여 입자성 물질을 펠렛화시켰다. 이어서, 상청액을 14,000 x g 에서 추가로 원심분리하여, 수득한 상청액으로부터 총 RNA 를 추출했다. 바이러스 특이적 프라이머를 사용하면서 상기 RNA 를 역방향 전사에 대한 템플레이트로서 사용했고, 이어서 생성물을 실시간 PCR 검정에 사용했다.
마우스에서 VSV 벡터의 50% 치사량 ( LD 50 ) 결정
마우스 LD50 모델을 VSV 벡터의 상대적인 감쇠 측정자로서 사용했다. 야생형 VSV, 3'-NPMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-1)L-5' 의 몇가지 대수적 희석물을 4.5 주령 암컷 Swiss Webster 마우스 (군 당 6 내지 10 마리의 마우스) 에 두개내 주사했다. 마우스들은 3 주간 체중이 감소하고, 마비 및 폐사했다 (LD50). LD50 는 Reed 및 Muench 의 방법으로 누적 백분율 폐사율로부터 계산했다.
마우스 면역원성 연구
마우스 (n = 15) 를 실시예 4 에서 제시할 표시된 VSV 벡터 (인디애나 항원형) 의 1 ×107 pfu 를 근육내로 면역화시켰다. 마우스의 한 무리 ("1 차 접종", n = 5) 로부터 비세포를 최초 접종 7 일후 효과기 기간의 정점에서 분리해냈다. 두 무리의 마우스 (n = 10) 를 1 ×107 pfu 의 표시된 VSV 벡터 (NJ-G-스윗치 버젼) 로 부스트했다. 한 무리 ("부스트", n = 5) 유래의 비세포를 부스트 후 5 일에 효과기 기간의 정점에서 분리해냈다. 또다른 무리 ("기억", n = 5) 유래의 비세포는 부스트 후 30 일에 기억 기간 동안 분리해냈다. Gag 특이적 CD8 T 세포 빈도는 사량체 염색으로 측정했다. Gag 특이적 IFN-γ 분비는 gag 면역우세 펩티드를 이용한 밤새 자극 후 ELIPOT 으로 측정했다.
실시예 2
VSV 돌연변이체의 특징분석
실시예 1 에 기재된 조합된 2 가지 돌연변이 클래스의 VSV 벡터 (N 섞기/G 단백질 ct 절단) 의 플라크 크기 대 단일 클래스 돌연변이 VSV 벡터의 플라크 크기 사이의 실질적인 차이점을 관찰했다 (표 5). 일반적으로, 단일 클래스의 돌연변이 VSV 벡터는 24 시간의 플라크 검정시 계수가 가능한 크기의 플라크를 형성했고, 일부 N 섞기/G 단백질 ct 절단 벡터는 동등한 크기의 플라크 형성을 위해 3 내지 4 일이 필요했다. VSV 벡터에 대한 플라크 크기에서의 상대적이 차이점은 또한 세포 배양시 성장 동역학 연구에서 관찰되는 상대적인 차이점 (도 1 내지 도 3) 과 일치했다.
Figure 112006072788585-PCT00003
실시예 3
VSV 신경독력 연구
단일 클래스 VSV 돌연변이체 벡터와 비교한 2 가지 이상의 돌연변이 클래스의 조합을 포함하는 VSV 의 상승적 감쇠는 일련의 마우스, 흰담비 및 원숭이 신경독력 연구에서 평가되었으며, 그 방법은 실시예 1 에 기재되어 있다. 마우스는 VSV 복제에 대하여 고도로 관용적이며, 이러한 특성은 이들이 상이한 수준의 바이러스 성장 및 감쇠를 차별화하는데 이용되도록 한다. 병원성/감쇠의 차별화되는 기울기가 상이한 VSV 벡터에 대해 관찰된다 (표 6 및 표 7). 예를 들어, 3'-NPMGL-5', 3'-NPMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-5' 또는 3'-PMNG(ct-1)L-5' 가 두개내 접종된 마우스에서의 LD50 은 (표 6), 하기의 상대적인 감쇠 기울기를 나타냈다: 3'-PMNG(ct-1)L-5' (LD50 = 2 × 105) > 3'-PNMG(ct-1)L-5' (LD50 = 1 × 104) > 3'-NPMG(ct-1)L-5' (LD50 =14.5) > 3'-NPMGL-5' (LD50 = 3.2).
Figure 112006072788585-PCT00004
표 7 에 나타낸, 0 가지 (야생형 VSV), 1 가지, 2 가지, 3 가지 및 4 가지 (gag 유전자 삽입) 돌연변이 클래스를 가진 VSV 가 두개내 주사된 마우스에서의 LD50 도 또한 유사한 감쇠 기울기를 나타냈다. 더욱이, VSV 벡터 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5', 3'-gag1-NPMGL(ts)-5', 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L(ts)-5' 및 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 를 두개내 주사한 마우스는 폐사를 나타내지 않았다.
Figure 112006072788585-PCT00005
동일한 일련의 벡터를 시상내 접종한 키노몰구스 원숭이 (Cynomolgus monkey) 의 조직병리학적 데이터는 감쇠의 매우 유사한 기울기를 나타냈다. 두 무리의 동물 데이터는 또한 일련의 흰담비 신경독력 연구로부터의 결과로도 입증되었는데, 여기서 전염성 바이러스 및 두개내 접종된 동물의 뇌에 존재하는 게놈 RNA 는 플라크 검정 및 실시간 PCR 로 각각 주기적으로 측정했다. 상기 데이터를 수집한 것은 2 가지 이상의 돌연변이 클래스의 조합이 단일 돌연변이 클래스 VSV 벡터보다 실질적으로 더 큰 감쇠 수준을 보유한다는 것을 증명한다. 마우스 LD50 역가는 동일한 VSV 벡터에서의 2 가지 상이한 클래스의 돌연변이의 조합에 의한 감쇠 상에 강력한 상승적 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 4
감쇠된 VSV 벡터의 증강된 면역원성
감쇠된 VSV 벡터 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5' 및 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 면역원성을 VSV 원형 벡터 3'-NPMG-gag5-L-5' 및 3'-NPMGL-5' 와 비교했다. 마우스를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 상기 VSV 벡터 중 하나로 면역화했다. 감쇠된 VSV 벡터는 원형 VSV-Gag5 벡터 (3'-NPMG-gag5-L-5') 에 의해 유도되는 것보다 더 강한 면역 응답성을 유도했다. 가장 눈에 띄는 것은 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5' 였는데, 이는 1 차 접종 및 부스팅 후 뿐만 아니라 응답성의 기억 기간 동안에 평가했을 때 원형에 의해 유도되는 것보다 통계적으로 현저히 더 높은 Gag 특이적 T 세포 빈도를 유도했다 (표 8).
Figure 112006072788585-PCT00006
3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5' 는 또한 원형 3'-NPMG-gag5-L-5' 에 의해 유도되는 것보다 더욱 높은 경향의 IFN-γ 분비를 유도했다 (표 9). 3'-gag1- NPM( ncp )G(ct1)L-5' 및 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 에 대한 응답성도 또한 원형 3'-NPMG-gag5-L-5' 에 의해 유도되는 것보다 더 높은 경향이 있다 (표 9).
Figure 112006072788585-PCT00007
실시예 5
히말라야 원숭이 (rhesus macaque) 에서 HIV gag 를 발현하는
감쇠된 VSV 벡터의 근육내 및 비강내 전달의 면역원성
하기의 연구들은 HIV gag 단백질을 발현하는 감쇠된 VSV 벡터로 면역화된 후 히말라야 원숭이에서 유도되는 면역 응답성 측정을 위해 고안된 것이다.
표 10 에 제시된 연구는 총 24 가지의 유전자 선별되지 않은 수컷 히말라야 원숭이로 수행한 것인데, 각각의 동물군 (즉, 군 1 내지 6) 은 하기 VSV 벡터들 중 하나로 1 ×107 (pfu) 의 투여량으로 근육내 또는 비강내로 면역화되었다: 3'-gag1-N(ncp)PMGL(ts)-5' (TsN+L), 3'-gag1-PMNG( ct-9 )L-5' (N4CT9) 또는 3'-NPMG-gag5-L-5' (Gag5).
표 11 에 제시된 연구는 총 24 가지의 유전자 선별되지 않은 수컷 히말라야 원숭이로 수행한 것인데, 각각의 동물군 (즉, 군 1 내지 6) 은 하기 VSV 벡터들 중 하나로 1 ×107 (pfu) 의 투여량으로 근육내 또는 비강내로 면역화되었다: 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-1)L-5', (MncpCT1), 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' (G(stem)), 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5' (N4CT1) 또는 3'-NPMG-gag5-L-5' (Gag5).
일반적으로, 하기의 검정들은 각 동물로부터의 전신성 및 체액성 면역 응답성 및 VSV 발산 (shedding) 시험을 위해 사용되었다.
세포성 면역 응답성: HIV gag 펩티드 특이적 IFN-γ ELISPOT 응답성 및 VSV N 펩티드 특이적 IFN-γ ELISPOT 응답성. 체액성 면역 응답성: ELISA 에 의한 혈청 항-HIV gag 항체 역가, ELISA 에 의한 혈청 항-VSV 항체 역가 및 혈청 항-VSV 중화 항체 역가.
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참고문헌
U.S. 특허 5,258,454
U.S. 특허 5,556,747
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U.S. 특허 6,391,548
U.S. 특허 5,817,879
U.S. 특허 6,168,943
U.S. 특허 6,596,529
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U.S. 특허 6,673,572
U.S. 임시 특허 60/477,389
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<110> Wyeth CLARKE, David K. HENDRY, Michael UDEM, Stephen PARKS, Christopher <120> SYNERGISTIC ATTENUATION OF VESICULAR STOMATITIS VIRUS, VECTORS THEREOF ANd IMMUNOGENIC COMPOSITIONS THEREOF <130> AM101651PCT <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Vesicular stomatitis virus <400> 1 Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg 1 5 10 15 Glu Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 20 25 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Vesicular stomatitis virus <400> 2 Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys 1 5

Claims (144)

  1. 온도민감성 (ts) 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 포함하는 유전자 개질 소포성 구내염 바이러스 (VSV) 로서, 상기 2 가지 돌연변이가 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시키는 VSV.
  2. 제 1 항에 있어서, 병원성이 추가로 신경독력으로 정의되는 VSV.
  3. 제 1 항에 있어서, 2 가지 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이인 VSV.
  4. 제 3 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 VSV.
  5. 제 3 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 VSV.
  6. 제 3 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 VSV.
  7. 제 3 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 VSV.
  8. 제 3 항에 있어서, N 유전자가 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인 VSV 로서, N 이 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 가 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 이 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G 가 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 이 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 VSV.
  9. 제 3 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' 로 이루어진 군으로부터 선택되는 VSV 로서, N 이 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 가 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 이 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-1) 이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-9) 이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 이 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 VSV.
  10. 제 9 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PMNG(ct-1)L-5' 인 VSV.
  11. 제 9 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PNMG(ct-1)L-5' 인 VSV.
  12. 제 9 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 VSV 로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 점 돌연변이인 VSV.
  13. 제 1 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100 배 더 큰 LD50 을 갖는 VSV.
  14. 제 1 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 1,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 VSV.
  15. 제 1 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 10,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 VSV.
  16. 제 1 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 VSV.
  17. 제 1 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 VSV.
  18. 제 17 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 VSV.
  19. 제 17 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 VSV.
  20. 제 17 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 VSV.
  21. 제 17 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 VSV.
  22. 제 17 항에 있어서, M 유전자 비-세포변성 (M( ncp )) 돌연변이가 M 유전자의 메티오닌 33 및 메티오닌 51 에서의 돌연변이인 VSV.
  23. 제 17 항에 있어서, 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 VSV.
  24. 제 17 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 VSV 로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이, G-스템 돌연변이 또는 점 돌연변이인 VSV.
  25. 제 1 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 ts N 유전자 돌연변이 (N(ts)) 및 ts L 유전자 돌연변이 (L(ts)) 인 VSV.
  26. 제 25 항에 있어서, 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 VSV.
  27. 제 25 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 VSV 로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 VSV.
  28. 제 1 항에 있어서, 한 돌연변이 클래스가 G-스템 돌연변이인 VSV.
  29. 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것이 아닌 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터로서, 상기 2 가지 돌연변이가 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시키는 벡터.
  30. 제 29 항에 있어서, 병원성이 추가로 신경독력으로서 정의되는 벡터.
  31. 제 29 항에 있어서, 외래 RNA 가 추가로 오픈 리딩 프레임 (ORF) 으로서 정의되는 벡터.
  32. 제 29 항에 있어서, 2 가지 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이인 벡터.
  33. 제 32 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 벡터.
  34. 제 32 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 벡터.
  35. 제 32 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 벡터.
  36. 제 32 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 벡터.
  37. 제 32 항에 있어서, N 유전자가 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인 벡 터로서, N 은 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 는 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 은 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G 는 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 은 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 벡터.
  38. 제 32 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' 로 이루어진 군으로부터 선택되는 VSV 로서, N 이 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 가 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 이 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-1) 이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-9) 이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 이 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 벡터.
  39. 제 38 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PMNG(ct-1)L-5' 인 벡터.
  40. 제 38 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PNMG(ct-1)L-5' 인 벡터.
  41. 제 38 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 벡터로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 벡터.
  42. 제 32 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100 배 더 큰 LD50 을 갖는 벡터.
  43. 제 32 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 1,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 벡터.
  44. 제 32 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 10,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 벡터.
  45. 제 32 항에 있어서, 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 상기 VSV 가 4 주령 암컷 Swiss-Webster 마우스에 두개내 주사한 야생형 VSV 보다 100,000 배 더 큰 LD50 을 갖는 벡터.
  46. 제 32 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스 유전자, 수두대상포진 (Varicella-Zoster) 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 (Norwalk) 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 (Marburg) 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 유전자, 폐렴 연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae) 유전자, 화농 연쇄구균 (Streptococus pyogenes) 유전자, 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 유전자, 무유성 연쇄구균 (Streptococcus agalactiae) 유전자, 수막염균 (Neisseria meningitidis) 유전자, 임균 (Neisseria gonorrheae) 유전자, 디프테리아균 (Corynebacteria diphtheriae) 유전자, 파상풍균 (Clostridium tetani) 유전자, 보르데텔라 백일해 (Bordetella pertussis) 유전자, 헤모필루스 (Haemophilus) 유전자, 클라미디아 (Chlamydia) 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  47. 제 46 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  48. 제 47 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 벡터.
  49. 제 48 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-PNMG(ct-1)L- 5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 인 벡터.
  50. 제 29 항에 있어서, 2 가지 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 벡터.
  51. 제 50 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 벡터.
  52. 제 50 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 벡터.
  53. 제 50 항에 있어서, M 유전자 비-세포변성 (M( ncp )) 돌연변이가 M 유전자의 메티오닌 33 및 메티오닌 51 에서의 돌연변이인 벡터.
  54. 제 50 항에 있어서, 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 VSV.
  55. 제 50 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 벡터로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 벡터.
  56. 제 50 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  57. 제 56 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  58. 제 57 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 벡터.
  59. 제 58 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-gag5-5' 인 벡터.
  60. 제 29 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 ts N 유전자 돌연변이 (N(ts)) 및 ts L 유전자 돌연변이 (L(ts)) 인 벡터.
  61. 제 60 항에 있어서, 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 벡터.
  62. 제 60 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 벡터로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 벡터.
  63. 제 60 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 사슬알균 무유증 유전자, 수막염 균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  64. 제 63 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  65. 제 64 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 벡터.
  66. 제 65 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 인 벡터.
  67. 제 29 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 G 스템 돌연변이 G(stem) 및 유전자 섞기 돌연변이인 벡터.
  68. 제 67 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 인 벡터.
  69. 제 68 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 벡터로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 벡터.
  70. 제 67 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  71. 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루 어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이 및 복제에는 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터를 면역원성 투여량으로 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 2 가지의 돌연변이가 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시키는 면역원성 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 병원성이 추가로 신경독력으로서 정의되는 면역원성 조성물.
  73. 제 71 항에 있어서, 외래 RNA 가 추가로 오픈 리딩 프레임 (ORF) 으로서 정의되는 면역원성 조성물.
  74. 제 71 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이인 면역원성 조성물.
  75. 제 74 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 면역원성 조성물.
  76. 제 74 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 면역원성 조성물.
  77. 제 74 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 면역원성 조성물.
  78. 제 74 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메 인을 갖는 면역원성 조성물.
  79. 제 74 항에 있어서, N 유전자가 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞인 면역원성 조성물로서, N 은 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 는 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 은 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G 는 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 은 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 면역원성 조성물.
  80. 제 74 항에 있어서, 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' 로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이화 게놈을 포함하는 면역원성 조성물로서, N 이 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자이며, P 가 인단백질을 코딩하는 유전자이며, M 이 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-1) 이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, G(ct-9) 이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산이 결실된 결합 당단백질을 코딩하는 유전자이며, L 이 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자인 면역원성 조성물.
  81. 제 80 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PMNG(ct-1)L-5' 인 면역원성 조성물.
  82. 제 80 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-PNMG(ct-1)L-5' 인 면역원성 조성물.
  83. 제 80 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 면역원성 조성물.
  84. 제 71 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  85. 제 84 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  86. 제 85 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 면역원성 조성물.
  87. 제 86 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-PNMG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 인 면역원성 조성물.
  88. 제 71 항에 있어서, 조성물을 정맥내, 진피내, 피하, 근육내, 복막내, 경구, 직장, 비강내, 협측, 질 및 생체외로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여하는 면역원성 조성물.
  89. 제 71 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 면역원성 조성물.
  90. 제 89 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 면역원성 조성물.
  91. 제 89 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 면역원성 조성물.
  92. 제 89 항에 있어서, M 유전자 비-세포변성 (M( ncp )) 돌연변이가 M 유전자의 메티오닌 33 및 메티오닌 51 에서의 돌연변이인 면역원성 조성물.
  93. 제 89 항에 있어서, 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 면역원성 조성물.
  94. 제 89 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 면역원성 조성물.
  95. 제 89 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  96. 제 95 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  97. 제 96 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 면역원성 조성물.
  98. 제 97 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-gag5-5' 인 면역원성 조성물.
  99. 제 71 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 ts N 유전자 돌연변이 (N(ts)) 및 ts L 유전자 돌연변이 (L(ts)) 인 면역 원성 조성물.
  100. 제 99 항에 있어서, 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 면역원성 조성물.
  101. 제 99 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 면역원성 조성물.
  102. 제 99 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  103. 제 102 항에 있어서, HIV 유전자가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  104. 제 103 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 면역원성 조성물.
  105. 제 104 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 인 면역원성 조성물.
  106. 제 71 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 G(stem) 돌연변이 및 유전자 섞기 돌연변이인 면역원성 조성물.
  107. 제 106 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 인 면역원성 조성물.
  108. 제 106 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 면역원성 조성물.
  109. 제 108 항에 있어서, 외래 RNA 가 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스테인-바아 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A 형 간염 바이러스 유전자, B 형 간염 바이러스 유전자, C 형 간염 바이러스 유전자, 노워크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 파필로마 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라 유전자, 폐렴 연쇄구균 유전자, 화농 연쇄구균 유전자, 헬리코박터 파일로리 유전자, 무유성 연쇄구균 유전자, 수막염균 유전자, 임균 유전자, 디프테리아균 유전자, 파상풍균 유전자, 보르데텔라 백일해 유전자, 헤모필루스 유전자, 클라 미디아 유전자, 대장균 유전자, 싸이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  110. 하기를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터의 면역원성 투여량을 투여하는 것을 포함하는 박테리아 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법:
    (a) 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이, 여기서 2 가지의 돌연변이는 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킴; 및
    (b) 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열, 여기서 상기 RNA 는 비브리오 콜레라 단백질, 폐렴 연쇄구균 단백질, 화농 연쇄구균 단백질, 무유성 연쇄구균 단백질, 헬리코박터 파일로리 단백질, 수막염균 단백질, 임균 단백질, 디프테리아균 단백질, 파상풍균 단백질, 보르데텔라 백일 해 단백질, 헤모필루스 단백질, 클라미디아 단백질 및 대장균 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 단백질을 코딩함.
  111. 제 110 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이인 방법.
  112. 제 111 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 방법.
  113. 제 111 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 방법.
  114. 제 111 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 방법.
  115. 제 111 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 방법.
  116. 제 111 항에 있어서, N 유전자가 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞이는 방법.
  117. 제 111 항에 있어서, 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' 로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이화 게놈을 포함하는 방법.
  118. 제 103 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 방법.
  119. 하기를 포함하는 유전자 개질 VSV 벡터의 면역원성 투여량을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염에 대한 포유류 숙주의 면역화 방법:
    (a) 그의 게놈에서의 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 이 루어진 군으로부터 선택되는 2 가지 이상의 상이한 클래스의 돌연변이, 여기서 2 가지의 돌연변이가 VSV 병원성을 상승적으로 감쇠시킴; 및
    (b) 복제에 필수적인 것은 아닌 VSV 게놈의 영역에 삽입되거나 또는 그를 대체하는 하나 이상의 외래 RNA 서열, 여기서 상기 RNA 는 HIV 단백질, HTLV 단백질, SIV 단백질, RSV 단백질, PIV 단백질, HSV 단백질, CMV 단백질, 엡스테인-바아 바이러스 단백질, 수두대상포진 바이러스 단백질, 볼거리 바이러스 단백질, 홍역 바이러스 단백질, 인플루엔자 바이러스 단백질, 폴리오바이러스 단백질, 리노바이러스 단백질, A 형 간염 바이러스 단백질, B 형 간염 바이러스 단백질, C 형 간염 바이러스 단백질, 노워크 바이러스 단백질, 토가바이러스 단백질, 알파바이러스 단백질, 루벨라 바이러스 단백질, 광견병 바이러스 단백질, 마르부르그 바이러스 단백질, 에볼라 바이러스 단백질, 파필로마 바이러스 단백질, 폴리오마 바이러스 단백질, 메타뉴모바이러스 단백질 및 코로나바이러스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 단백질을 코딩함.
  120. 제 119 항에 있어서, RNA 가 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu 로 이루어진 군으로부터 선택되는 HIV 유전자인 방법.
  121. 제 120 항에 있어서, HIV 유전자가 gag 인 방법.
  122. 제 119 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 N 유전자 섞기 돌연변이인 방법.
  123. 제 122 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 20 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 방법.
  124. 제 122 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 포함하는 방법.
  125. 제 122 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 방법.
  126. 제 122 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 9 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 방법.
  127. 제 122 항에 있어서, N 유전자가 야생형 VSV 게놈 3'-NPMGL-5' 에 대해 3'-PNMGL-5' 또는 3'-PMNGL-5' 로 섞이는 방법.
  128. 제 122 항에 있어서, 3'-PNMG(ct-1)L-5', 3'-PNMG(ct-9)L-5', 3'-PMNG(ct-1)L-5' 및 3'-PMNG(ct-9)L-5' 로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이화 게놈을 포함하는 방법.
  129. 제 122 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 유전자 결실 돌연변이, 유전자 삽입 돌연변이 또는 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 방법.
  130. 제 122 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-PNMG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PNMG(ct-9)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-1)L-5', 3'-gag1-PMNG(ct-9)L-5', 3'-PNMG(ct-1)L-gag5-5', 3'-PNMG(ct-9)L-gag5-5', 3'-PMNG(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-PMNG(ct-9)L-gag5-5' 인 방법.
  131. 제 19 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 절단형 G 유전자 돌연변이 및 비-세포변성 M 유전자 돌연변이인 방법.
  132. 제 131 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 말단의 28 개의 카르복시-말단 아미노산의 결실을 갖는 방법.
  133. 제 131 항에 있어서, 절단형 G 유전자로 코딩되는 G 단백질이 1 개의 아미노산으로 이루어진 세포질의 말단 도메인을 갖는 방법.
  134. 제 131 항에 있어서, M 유전자 비-세포변성 (M( ncp )) 돌연변이가 M 유전자의 메티오닌 33 및 메티오닌 51 에서의 돌연변이인 방법.
  135. 제 131 항에 있어서, 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 방법.
  136. 제 123 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 ts 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 방법.
  137. 제 123 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPM( ncp )G(ct-1)L-5', 3'-gag1-NPM(ncp)G(ct-9)L-5', 3'-NPM( ncp )G(ct-1)L-gag5-5' 또는 3'-NPM( ncp )G(ct-9)L-gag5-5' 인 방법
  138. 제 119 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 ts N 유전자 돌연변이 (N(ts)) 및 ts L 유전자 돌연변이 (L(ts)) 인 방법.
  139. 제 138 항에 있어서, 3'-N(ts)PMGL(ts)-5' 의 돌연변이화 게놈을 포함하는 방법.
  140. 제 138 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 방법.
  141. 제 139 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5' 또는 3'-N(ts)PMGL(ts)-gag5-5' 인 방법.
  142. 제 119 항에 있어서, 2 가지의 돌연변이가 G(stem) 돌연변이 및 유전자 섞기 돌연변이인 방법.
  143. 제 142 항에 있어서, 돌연변이화 게놈이 3'-gag1-NPMG(stem)L-5' 인 방법.
  144. 제 142 항에 있어서, 제 3 의 클래스의 돌연변이를 그의 게놈에 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 돌연변이가 점 돌연변이, ts 돌연변이, 유전자 섞기 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이인 방법.
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