KR20070001984A - 치주 질환을 검출하기 위한 시험 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 구강으로부터의 시료를 분석함에 의해 환자의 치주 질환을 진단하기 위한 시험 키트에 관한 것이다. 상기 시험 키트는 적어도 박테리아로부터 유래된 제1 성분의 검출을 위한 제1 검출 검정기 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 제2 성분의 검출을 위한 제2 검출 검정기를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 제1 성분은 포르피로모나스 진지발리스로부터의 arg-진지페인(arg-gingipain)과 같은 박테리아 병독성 생성물이고, 상기 제2 성분은 인간 호중구 엘라스타아제이다.

Description

치주 질환을 검출하기 위한 시험 키트 {A TEST KIT FOR DETECTING PERIODONTAL DISEASE}

본 발명은 치주 질환을 검출하기 위한 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치주 질환의 진행에 대한 위험의 진단 및 예측 방법에 관한 것이다.

서방 세계에서 성인의 약 7 내지 15%가 치주염을 앓고 있으며, 이는 가장 일반적인 질환의 하나이다. 치아와 잇몸 사이의 낭(pocket)에 병원성 박테리아의 존재가 필수적이기는 하나 충분한 기준이 아닌 경우가 다인성 질환이다. 숙주 염증계 및 면역 계가 또한 상기 질환의 발병에 중요한 역활을 한다. 치주염의 진행은 치아의 지지 조직의 파괴를 초래하는 치은하 박테리아에 대한 만성 염증성 반응이라고 생각된다. 이의 거동은 순환적이며 초기 단계에서는 간과된 채로 있을 수 있다.

파괴 과정은 숙주의 방어 시스템과 치주낭의 특이적 박테리아 종 사이의 복잡한 상호작용의 결과라고 생각된다. 치주 질환의 발생과 질행에 관련된 병원성 박테리아는 비제한적으로 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)(과거, 박테로이데스 진지발리스(Bacteroides gingivalis)), 박테로이데스 포르시터스(Bacteroides forsythus)(탄네렐라 포르시텐시스(Tannerella forsythensis)라고 도 함), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 트리포네마 덴티콜라(Triponema denticola) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)를 포함한다.

보다 최근에, 박테리아의 병독성 생성물(주로 독소 및 효소)의 중요성이 널리 연구되었고 발병에 주요한 역활을 하는 것으로 생각된다(참조: Eley and Cox, 2003). 박테리아는 상이한 증식 단계를 거치고 이러한 증식 단계 동안 치주낭에서 보다 더 또는 덜 파괴적으로 되는 것으로 생각된다. 활성 박테리아는 병독성 생성물을 생성하여 치주낭에서 자신의 생존 및 영양을 돕는다. 상승된 박테리아 활성의 기간 동안 이러한 병독성 생성물은 치아의 지지 조직의 파괴 및 숙주의 방어 시스템의 유효성의 감소에 기여한다.

오늘날 치과의는 치주낭의 탐침 깊이를 측정하고, 치조골에 대한 치아 부착의 엑스레이 상을 검사하고 탐침시 출혈을 참조함으로써 치주염을 검사한다. 위험 인자에는 흡연 습관, 스트레스 및 치주염에 대한 가족 병력이 포함된다. 방법은 치과의의 개인적인 전문 지식에 크게 의존하고 있다. 탐침 깊이는 단지 조직학적 부착 손실의 측정치이며 따라서 치주염의 실제 발생 또는 이의 미래 진행에 대해 도움을 거의 주지 못한다. 탐침시 출혈은 파괴 과정이 아니라 치료 과정을 나타낼 수 있다.

때때로, 미생물 시료가 취해지고 배양 또는 DNA-기술(소크란스키에 의해 개발된 체커보드 DNA-DNA 하이브리드화 기술(1994))에 의한 분석을 위해 실험실로 보내어진다. 그러나, 그 결과는 약 일 주일이 지나서 알 수 있으며 반드시 치주염을 나타낸다고 할 수 없는 특정 박테리아의 존재만을 보여준다.

치주염의 진행을 진단하거나 예측할 수 있는 치은 열구 액(GCF)과 같은 환자의 구강으로부터의 액체 중의 화합물, 주로 효소 또는 사이토카인과 같은 단백질을 발견하기 위하여 광대한 양의 작업이 수행되어 왔다.

지금까지 많은 시험법과 검정법이 개발되었다(참조: Armitage, 2003). 이러한 검정법은 박테리아, 박테리아 병독성 생성물 또는 숙주 단백질을 확인하기 위하여 제공되었다.

치주염에서 진단 또는 예후 가치에 대해 조사되어온 숙주 유래 단백질은 주로 사람 염증계로부터의 생성물을 포함한다. 이들 단백질의 역활은 조직을 개조하는 염증성 반응 및 면역 반응을 지휘하고 침입한 박테리아를 죽이는 것을 돕는 것이다.

치주염 진단을 위해 가장 잘 연구된 숙주 유래 단백질은 천연 세린 프로테아제(카텝신 G, 아주로시딘, 프로테나아제 3, 엘라스타아제, 콜라게나아제, 아미노트랜스퍼라아제 (미국 특허 제4,981,787호, 제5,834,226호 및 제4,801,535호), 알칼리성 포스파타아제, β-글루쿠로니다제(미국 특허 제6,277,587호), 디펩티딜 페디다아제, 호중구 젤라티나아제-관련 리포칼린(미국 특허 제5,866,432호), 기질 메탈로프로테나아제(미국 특허 제5,736,341호 및 제6,280,687호) 및 인터루킨과 같은 사이토카인(특히 IL-1β(미국 특허 제5,328,829호), IL-6, 및 IL-8) 및 염증성 매개체 예를 들어 프로스타글란딘 E₂ 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)를 포함한다.

기질 금속단백질(MMP)는 치주염 질환에 대한 표지로서 제안되었다. 미국 특허 제5,736,341호는 MMP-8의 존재의 검출을 개시하고, 미국 특허 제5,866,432호는 호중구 젤라티나아제-관련 리포칼린의 존재의 검출을 개시하며, 미국 특허 제6,280,687호는 MMP-13의 존재를 개시한다. 이들 세개 특허는 치주염의 진단 및 진행 예측에 대한 면역크로마토그래피 원리에 기초한 고속 체어사이드 시험를 제안한다. 그러나, 문헌[the American Association of Periodontology by Oringer (2002)]으로부터의 정보 페이퍼에서, 치주염 질환의 진행에 있어 MMP의 역활을 검증하기 위하여는 추가의 연구가 필요하다고 주장된 바 있다.

미국 특허 제6,406,873호는 두개의 염증성 매개체(플라스미노겐 활성화제 억제제2 및 조직 플라스미노겐 활성화제)가 단독으로 또는 조합하여 치주염을 진단할 수 있다는 것을 청구하고 있다.

미국 특허 5,248,595는 세개 이하의 상이한 치주 병원균을 동시에 분석하는 방법을 기술하고 있다.

채플(Chapple, 1997)은 전통적이며 현재 사용되는 치주 진단 방법을 검토하고 치주 열구 액 중의 알카라인 포스파타아제의 존재와 같은 마커의 검출이 조직 색의 분석, 치은낭 깊이의 탐침, 및 치아 운동성의 측정과 같은 임상적 검사에 비하여 보다 감도가 강하며 특이적이라고 결론지었다. 채플은 또한 둘 이상의 이러한 마커를 조합하는 것이 진행중이거나 미래의 질환 활성을 진단하는데 가장 정확한 수단을 제공한다고 결론지었지만 이러한 조합례는 제시하지 않았다.

진(Jin, 1999) 등은 DNA 탐침 방법을 사용하여 치주낭 중의 치주 병원균, 즉 박테리아의 존재와 치은 열구 액(GCF) 중의 엘라스타아제 간의 상관 관계를 조사하였다.

니센가드(Nisengard, 1992) 등은 포르피로모나스진지발리스, , 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스, 및 프레보텔라 인터메디아의 존재에 대한 고속 라텍스 교착 시험을 기술하였다.

램스터(1994) 등은 임상적 부착 손실 및 이의 인간 백혈구로부터의 β-글루쿠로니다아제의 상관관계를 검사하였다.

엘레이 및 콕스(1996)는 포르피로모나스 진지발리스로부터의 진지페이(gingipain)에 특이적인 효소 기질에 기초한 체어사이드 시험법을 개발하였다.

지금까지, 치주 질환 활성을 검사하는 많은 방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 상기 언급된 방법 중 어느 것도 치주염 및 이의 파괴 패턴을 진단하기에 충분히 특이적이고 고감도인 검정법을 제공하지 못한다. 비특이적 방법의 한 결과는 몇몇 환자들이 실제로 치주염을 가지지 않고서도 치료될 것이라는 것이다. 탐침 깊이와 같은 임상 관찰은 깊은 치은낭이 반드시 진행되고 있는 염증을 숨기고 있는 것은 아니기 때문에 충분한 신뢰도가 없으며, 방사선 사진술 평가는 정확한 진단을 위하여 상세한 임상 관찰과 조합되어야 하고, 단순한 치주 낭 중 병원성 박테리아의 존재는 정확하게 질환 활성을 반영하지 못한다. 더욱이, 지금까지 숙주 또는 박테리아 유래 단백질에 대한 효소적 방법에 기초하여 개발된 진단법은 효소 기질이 다수의 상이한 효소에 의해 절단될 수 있다는 사실로 인하여 충분히 특이적이지 않다.

상이한 사이토카인이 또한 연구되었으나 빠르고 특이적인 시험법이 설계되지는 않았다.

이와 같이, 치과의는 바람직하게는,

- 빠르고, 즉 수분내에 결과를 내고,

- 최소량의 시간 및 작업 노력을 필요로 하며,

- 견고하고 임상의의 환경에서 험하게 다루져도 되며,

- 실온 또는 냉장고에서 긴 보관 기간을 갖고,

- 치과 치료시 트레이에 고정되고, 친환경적이며, 양호한 환자 정보물을 제공하는,

체어사이드 시험 키트를 필요로 한다.

발명의 요약

본 발명의 일 목적은 종래 기술의 단점을 극복하고 치과의의 현재 필요를 충족시키는 시험 키트를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특이적이고, 고감도이며 사용하기 쉬운 치주염 질환을 검출하기 위한 시험 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 발명자들은 박테리아로부터 유래된 성분과 염증계의 인간 면역으로부터 유래된 성분의 공동 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법이 이러한 목적으로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명은 치과의 및 치위생사가 치주염 질환의 보다 효과적인 치료를 환자에게 제공하는 것을 돕는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 시험 키트 및 방법은 사전 치료를 추구하고, 가장 적절한 형태의 치료를 결정하고, 올바른 종류의 항생제를 선택하고, 환자에게 양호한 매일매일의 치과 위생의 중요성을 전하기 위하여 의심되는 치아의 스크리닝을 위하여 사용될 수 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 환자의 구강으로부터의 시료를 분석함에 의해 환자의 치주 질환을 진단하기 위한 시험 키트로서, 박테리아로부터 유래된 제1 성분을 검출하기 위한 제1 검출 검정기 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 제2 성분의 검출을 위한 제2 검출 검정기를 포함하는 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 환자의 구강으로부터의 시료를 분석함에 의해 환자의 치주 질환을 진단하기 위한 시험 키트로서, 적어도 박테리아로부터 유래된 제1 성분의 결합을 위한 결합 위치를 가지는 하나 이상의 제1 친화성 리간드를 포함하는 제1 검출 검정기 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 제2 성분의 결합을 위한 결합 영역을 가지는 하나 이상의 제2 친화성 리간드를 포함하는 제2 검출 검정기를 포함하는 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 환자는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 인간이다.

상기 제1 검출 검정기로부터의 결과는 상기 제2 검출 검정기로부터의 결과와 조합되어 치주 질환을 검출하는데 사용된다.

바람직하게는, 상기 제1 성분은 상기 박테리아에 의해 생성된 단백질이다. 바람직하게는, 상기 단백질이 박테리아 병독성 생성물이고, 보다 바람직하게는 효소 또는 독소이다. 바람직한 효소는 프로테아제, 예를 들어 포르피로모나스 진지발리스로부터의 아르긴지페인(arggingipain), 박테로이데스 포르시터스로부터의 48kDa 프로테아제이다. 이로운 독소의 예로는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스로부터의 류코톡신이다.

제2 성분은 바람직하게는 백혈구, 사이토카인 또는 인간 염증성 매개체이다. 바람직한 백혈구는 중성 세린 프로테아제, 보다 바람직하게는 인간 호중구 엘라스타아제이다. 바람직한 사이토카인은 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 및 인터루킨-8이다. 유리한 염증성 매개체의 예로는 종양 괴사 인자-α이다.

박테리아 기원의 제1 성분 및 상기 정의된 제2 성분, 바람직하게는 인간 호중구 엘라스타아제 둘 모두의 공동 존재는 활성 박테리아 및 활성 면역계 또는 염증계 둘 모두를 나타내야만 하고 이는 치주 파괴를 나타낸다.

치주 질환이 다인성 질환이라는 것이 과학계에 널리 확립되었을지라고, 시료 중에서 박테리아 유래 생성물 및 숙주 유래 생성물 둘 모두를 분석하기 위한 시험법을 개발하지 못했다는 것이 명확하다.

시험 키트는 또한 박테리아로부터 유래되거나 상기 정의된 환자의 면역계 또는 염증계로부터, 바람직하게는 박테리아로부터 유래된 제 3 성분의 결합을 위한 결합 위치를 가지는 하나 이상의 제 3 친화성 리간드를 포함하는 제 3 검출 검정기를 포함할 수 있고, 또한 일부 구체예에서, 추가 성분의 결합을 위한 추가의 검출 검정기를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 제1 친화성 리간드는 상기 제1 성분의 선택적 결합을 보이는 항체이고 제2 친화성 리간드는 상기 제2 성분의 선택적 결합을 보이는 항체이다.

항체의 사용은 항체가 일단 전개되어 교차-반응성에 대해 시험되면 이들의 표적에 대해 특이적이고 효소 이외의 화학 성분, 즉 독소 및 사이토카인을 검출할 수 있기 때문에 다른 방법(즉, 효소적 방법)에 비해 이점을 가진다. 또한, 새로운 항원에 대한 새로운 항체의 개발 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 시험 키트의 상기 검출 검정기는 면역크로마토그래피 검정기를 포함한다.

면역크로마토그래피 검정기/방법을 사용하는 이점 중에 이들이 용이하게 제조되어 사용되고 긴 보관 기간을 가지고 빠른 결과를 얻을 수 있으며 검출하고자 하는 성분에 대해 매우 특이적이게 설계될 수 있다는 것이 있다.

상기 시험 기트는 추가로 바람직하게는 시료를 받기 위한 시료 저장소가 구비된 지지체를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 검출 검정기는 직접 또는 상기 검출 검정기로부터 상기 시료 저장소를 분리하는 제거가능하게 배치된 분리 수단을 통해 상기 시료 저장소와 접촉하여 상기 지지체에 배열된다. 상기 키트는 또한 바람직하게는 상기 시료 저장소로부터 분리된 완충액 저장소에 상기 검출 검정기를 위한 상기 시료의 희석 및 적합화를 위한 추가의 완충액을 포함하고, 상기 시료를 수득하기 위한 하나 이상의 시료채취 장치를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 시험 키트에 포함된 개개 검출 검정기는 함께 또는 따로 제공될 수 있다. 검출 검정기가 따로 판매되는 경우에, 동시에 취해진 GCF 등의 시료는 따로 각 검정기에서 따로 분석되고, 그 결과가 치주 질환의 진단을 위해 조합된다.

본 발명에 따른 시험 키트 및 방법은 치주 질환을 위한 체어사이드 시험을 위하여 제공되고, 여기서 치과의 또는 치위생사는 치주낭으로부터 예를 들어 GCF 시료를 취한다. 시료는 시험 키트에 제공된 검정기에 의해 분석되고, 이러한 검정기로부터의 결과는 미리 결정된 기준에 따라 판단되어 진행중인 치주 질환의 발생을 평가한다.

제2 측면에서, 본 발명은 치주 질환을 진단하고/거나 상기 질환의 진행에 대한 위험을 예측하기 위한 방법으로서, 박테리아로부터 유래된 하나 이상의 제1 성분 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 제2 성분의 존재에 대한 환자의 구강으로부터의 시료를 분석하는 것을 포함하고, 상기 제1 성분 및 제2 성분은 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명에 따른 진단 방법은 또한 상기와 같은 추가 성분의 존재를 검출하는 방법을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 상기 제1 성분의 선택적 결합을 보이는 제1 항체를 사용하는 것을 포함하고, 상기 제2 방법은 상기 제2 성분의 선택적 결합을 보이는 제2 항체를 사용하는 것을 포함한다.

보다 바람직하게는 하나 이상의 상기 제1 및 제2 방법은 면역크로마토그래피 검정기를 사용하는 것을 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 환자의 구강으로부터의 시료를 분석함에 의하여 환자에서 치주 질환을 검출하기 위한 시험 키트로서, 적어도 박테리아로부터 유래된 제1 성분의 결합에 대한 결합 위치를 가지는 하나 이상의 제1 친화성 리간드를 포함하는 제1 검출 검정기 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 제2 성분과 결합하기 위한 결합 위치를 가지는 하나 이상의 제2 친화성 리간드를 포함하는 제2 검출 검정기를 포함하는 시험 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 환자의 구강으로부터의 상기 시료는 치은 열구 액, 임플란트-주변 구 액(peri-implant sulcus fluid), 침 또는 구강 세정 시료가다.

치은 열구 액(GCF)는 치주낭으로부터 구강으로 흐르는 액이다. 염증의 경우에, GCF는 염증성 세포, 박테리아, 이들 각각의 부산물을 함유하고, 이의 내용물은 파괴적 치주염에 대한 마커로서 사용된다. GCF를 수집하는 것은 최소한의 침입성 과정이고 액체는 박테리아 침입 뿐만 아니라 환자의 반응을 반영하는 생화학적 인디케이터의 정량적 공급원을 제공한다.

임플란트-주변 구 액은 치아가 치아 임플란트로 대체되는 경우에 GCF 등가물, 즉 임플란트의 위치로부터 구강으로 흐르는 액이다.

GCF 및 임플란트-주변 구 액은 제1 및 제2 성분의 위치 특이적 검출이 필요한 경우에 바람직한데, 이는 별개의 시료가 시험되는 치아 표면 각각으로부터 얻어질 수 있기 때문이다.

침 또는 구강 세정 시료는 위치 특이적이지 않은 검출 또는 진단을 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "치주 질환" 및 치주염은 이러한 질환을 치주염, 임플란트주변염(periimplantatis)(여기서 임플란트를 지지하는 조직이 붕괴된다), 및 치주 질환 및 질병의 분류를 위한 1999년 국제 워크샵에서 정의된 바와 같은 치주 질환의 다른 형태를 포함하는 가장 넓은 의미로 해석되어야 할 것이다.

치주 병원성 박테리아, 예를 들어, 포르피로모나스 진지발리스, 박테로이데스 포르시터스, 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스, 트리포네마 덴티콜라 및 프레보텔라 인터메디아는 치주 질환의 진행을 초래하지 않으면서 구강 및 치아와 건강한 잇몸 사이의 낭에 존재할 수 있다. 박테리아는 특정 증식 환경 및 활성이 되는 영양분의 존재를 필요로 한다. 활성 박테리아는 병독성 생성물(예를 들어 상기 언급된 독성 및 효소)를 생성하여 이의 생존 및 영양을 돕는다.

포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 박테로이드 포시더스(Bacteroides forsythus) 모두 약 50 kDa의 분자량을 가진 트립신과 유사한 세린 프로테아제로 알려져 있는 단백질 분해 효소를 생성한다. P. 진지발리스(P. gingivalis)로부터의 프로테아제 중 하나는 arg-진지페인(arg-gingipain)으로 명명되고, B. 포시더스(B. forsythus)로부터의 프로테아제 중 하나는 48 kDa 프로테아제이다. 악티노바실러스 악티노미세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)는 개공 루코톡신의 RTX(repeats-in-toxin) 엑소프로틴(exoprotein) 계열의 일원이고 인간의 다형핵 백혈구로 특별한 세포독성을 나타내는 116 kDa 루코톡신(leukotoxin)을 생성한다.

바람직한 구체예에서, 상기 제1 기질은 박테리아 병독성 생성물, 바람직하게는 프로테아제와 같은 효소, 더욱 바람직하게는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 arg-진지페인 및 박테로이드 포시더스(Bacteroides forsythus)로부터의 48 kDa 프로테아제 또는 독소, 더욱 바람직하게는 악티노바실러스 악티노미세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetem- comitans)로부터의 루코톡신이다.

병독성 생성물의 존재는 염증 반응 및 숙주의 면역체계의 유발이 될 수 있고, 따라서 예를 들어, 다형핵(PMN) 백혈구와 같은 수비 시스템 세포(defence system cells)를 감염의 장소로 동원한다.

백혈구는 감염 장소에서 높은 농도의 박테리아 및 박테리아 물질을 처리할 수 없고 백혈구 입자로부터의 효소는 치주병 포켓으로 방출된다. 원래 침입한 박테리아를 죽이는 목적을 가진, 이러한 효소는 주위 조직에 많은 피해를 준다. 인간 호중구 엘라스타아제는 치아를 둘러싼 많은 지지 조직을 퇴화시키는 것을 보여주어 왔다. 엘라스타아제는 치주병 포켓에서 그것의 프로테아제 억제제(α-1 안티트립신)와 결합하는 것이 자주 발견된다. 그러나, P. 진지발리스로부터의 프로테아제는 엘라스타아제 없이 치주병 또는 주변 이식(periimplant) 포켓에서 그것의 파괴된 형태가 높게 나타나는 인간 혈청에서 프로테아제 억제제 α-1 안티트립신 및 α-2 매크로글로불린(macroglobulin)을 퇴화시키는 것을 보여준다.

여기서 사용된, 물질 "면역 또는 염증 시스템으로부터 유래"는 면역 또는 염증 시스템에서 참여한 세포로부터 유래한 물질로 인용된다. 어떤 물질은 예를 들어, 면역 및 염증 반응을 조정하기 위해 또는 침입한 박테리아를 죽이거나 조직을 리모델링하기 위해 상기 세포로부터 분비될 수 있고, 어떤 세포의 용해로부터 기원할 수 있다.

제2 성분은 천연 세린 프로테아제, 바람직하게 인간 호중구 엘라스타아제와 같은 백혈구 제제, 또는 인터루킨(interleukin) 바람직하게는 인터루킨-1β, 인터루킨-6 및 인터루킨-8로부터 선택되는 인터루킨과 같은 사이토카인(cytokine), 또는 염증 조절제 바람직하게는 종양 괴사 인자 또는 가능하게는 프로스타글란딘 E₂가 될 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 제2 성분은 인간 호중구 엘라스타아제이다.

본 발명에 따라 검출하기에 적당한 환자의 면역 또는 염증 시스템으로부터 유래된 다른 물질들은, 이것에 제한되는 것은 아니지만, comprise 아교질제(collagenases), 아미노트랜스퍼라아제(aminotransferases), 알카라인 포스페타제, β-글루크로니다아제(glucuronidase), 디펩티딜 펩티다아제(dipeptidyl pedidase), 호중구 젤라티나아제-관련(gelatinase-related) 리포칼린(lipocalin) 및 매트릭스 메탈로프로티나아제(metalloproteinases)를 포함한다.

가장 바람직하게, 상기 제1 성분은 박테리아 병독성 생성물이고, 상기 제2 성분은 인간 호중구 엘라스타아제이다.

적어도 박테리아 기원의 제1 성분 및 상기에서 정의된 바와 같은 제2 성분, 바람직하게는 인간 호중구 엘라스타아제의 공존은 활성 박테리아 및 활성 면역 또는 염증 시스템 모두에서 나타나야 하고, 이것은 치주병을 나타낸다. 따라서 적어도 제1 성분 및 상기 제2 성분의 공존을 검출하는 장점이 있다.

어떤 예에서, 본 발명에 따른 시험 키트는 상기 시료에서 추가적인 물질의 검출에 대한 추가적인 검출 검정기를 포함하고, 바람직하게 어떤 추가적인 물질은 상기에서 정의된 바와 같은 박테리아로부터 유래한 물질들로부터 선택된다.

본 발명에 따른 시험 키트의 바람직한 구체예에서, 상기 제1 친화성 리간드(affinity ligand)는 상기 제1 성분로의 선택적인 결합을 보여주는 제1 항체를 포함하고, 상기 제2 친화성 리간드는 상기 제2 성분로의 선택적인 결합을 보여주는 제2 항체를 포함한다.

여기에서 사용된, "항체"는 단클론 항체, 다클론 항체, 합성으로 제조된 항체 또는 항체 등가물(equivalents) 및 그것의 기능적 조각으로 인용된다.

본 발명에서 특별히 관심있는 항체는 상술한 제1 또는 제2 성분의 어느 것에도 특별히 결합하는 항체이다. 인간 호중구 엘라스타아제에 대해 상승된 항체는 MP 바이오메디컬로부터 상업적으로 구매할 수 있다. A. 악티노미세템코미턴스(A. actinomycetemcomitans)로부터의 루코톡신에 대한 항체는 개발되었고(Johansson et al. 2000) P. 진지발리스로부터의 프로테아제에 대한 항체 역시 개발되었다(Nakagawa et al. 2001).

여기서 사용된, "검정"은 시료에서 존재 및/또는 하나 이상의 물질(들)의 양을 검출하기 위한 수단을 인용한다. 검정상의 분석으로부터의 결과는 예를 들어, 색, 형광, 흡수 및/또는 발광의 변화, 전도도의 변화, 방사성의 변화 등과 같은 검출할 수 있는 반응이다.

본 발명에 따른 시험 키트에 사용하기에 적당한 검출 검정기는 다양한 면역학적 방법에 근거할 수 있다. 어떤 방법들은, 제한되는 것은 아니지만, 면역 크로마토그래피 방법, 면역계량 방법, 면역응집 방법, 플루오로면역 방법, 면역발광 방법, 비탁 면역학적 방법, ELISA 및 혼탁 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 시험 키트의 바람직한 구체예에서, 상기 제1 및 제2 검출 검정기는 바람직하게 일명 "띠-시험"로 구체화되고, 측면 흐름 시험와 같이 이행되는 면역 크로마토그래피 검정기를 제공한다. 여러 가지 다른 다양한 면역 크로마토그래피 검정기는 당업계에 잘 알려져 있다. 각 면역 크로마토그래피 검정은 바람직하게 검출될 수 있는 물질의 다른 에피토프에 대해 특별한 두 개의 항체를 사용한다.

또한, 하나 이상의 검출 검정은 특별히 검출될 수 있는 둘 이상의 물질의 존재가 특히 하나의 단일 띠 상에 검출될 수 있도록 한 단일 띠-시험상에 설치될 수 있다.

더욱이, 면역 크로마토그래피 검정은, 당업계에 알려진 바와 같이, 포지티브 신호를 얻기 위해 시료 내에 필요로 되는 목적 물질의 역치량을 미리 결정하도록 디자인될 수 있다.

본 발명은 또한 치주병 진단 및/또는 상기 병의 진행에 대한 위험을 예측하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 박테리아로부터 유래한 적어도 제1 성분 및 환자의 면역 또는 염증 시스템으로부터 유래한 제2 성분의 존재에 대한 환자의 구강으로부터의 시료를 분석하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 환자의 구강으로부터의 시료와 제1 및 제2 성분은 상기에서 정의된 바와 같다.

또한 어떤 예에서, 본 발명에 따른 진단 방법은 시료 내에서 상기에서 정의된 바와 같은 추가적인 물질의 존재를 검출하는 단계를 더 포함한다.

본 발명에 따른 진단 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 제1 방법은 상기 제1 성분의 선택적인 결합을 보여주는 제1 항체를 사용하는 단계를 포함하고, 상기 제2 방법은 상기 제2 성분의 선택적인 결합을 보여주는 제2 항체를 사용하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항체는 상기에서 정의된 바와 같다.

가장 바람직한 하나 이상의 제1 및 제2 방법은 면역 크로마토그래피 방법을 사용하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 시험 키트에 사용하기에 적당한 다른 검출 방법은 다양한 면역학적 방법에 근거할 수 있다. 어떤 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 면역 크로마토그래피 방법, 면역계량 방법, 면역응집 방법, 플루오로면역 방법, 면역발광 방법, 비탁 면역학적 방법, ELISA 및 혼탁 방법을 포함한다.

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도 1은 두개의 면역크로마토그래피 검정기가 시료 저장소가 장착된 지지체 상에 배열되는 시험 키트의 구체예를 도시한다.

바람직한 구체예

도 1에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 바람직한 시험 키트는 시료를 담기 위한 시료 용기(4)가 장치된 지지대(3) 상에 배열된 두 개의 면역 크로마토그래피 검출 검정기(1, 2)를 포함한다. 두 개의 검출 검정기(1, 2)는 제거될 수 있도록 배열된 분리 수단(5)에 직접 또는 경유하여 배열되며, 시료 용기(4)와 접촉한다.

시료 용기(4)는 지지 물질에서 형성되는 것이 바람직하다. 지지대(3)는 플라스틱, 종이, 상자 또는 종이가 플라스틱과 얇은 층을 형성하는 것과 같은 그들의 조합과 같이 여러 가지 다른 물질로 만들어질 수 있다. 검출 검정기(1, 2)는 각 검정기의 시료를 담는 영역이, 제거될 수 있도록 배열된 분리 수단(5)에 직접 또는 경유하여 시료 용기(4)와 접촉하는 방식으로 지지대(3) 상에 고정된다. 상기 분리 수단(5)은 검정기상의 시료를 담는 영역을 덮는, 검정기 등으로부터 상기 용기를 분리하는 막인, 포일(foil)을 제거할 수 있다.

키트는 상기 검출 검정기에 대한 시료의 희석과 적응을 위한 부가적인 버퍼와 검정하기 위한 시료를 얻기 위한 하나 이상의 샘플링 장치를 더 포함할 수 있다. 사용하기에 적당한 샘플링 장치의 타입은 검정되는 시료의 타입에 의존한다. 예를 들어 잇몸 열구액(gingival crevicular fluid)은 점성이 있는 액이며 작은 브러쉬, 치실, 페이퍼 포인트(페이퍼 포인트) 또는 일회용 피펫에 의해 쉽게 수집될 수 있다. 침 또는 마우스 린스(mouth rinse) 시료를 얻기 위한 다른 샘플링 장치는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 버퍼는 분리 플라스크와 같은, 지지대 상에 형성되는 부가적인 용기 또는 시료 용기에 위치한 구멍 뚫을 수 있는 가방 내로 버퍼의 공급에 의해 버퍼 용기에서 시료 용기로부터 분리된다.

시료가 얻어진 후에는, 검출 검정기에 대해 적당한 pH, 이온 세기 및 점도를 얻기 위해 버퍼와 혼합되는 것이 바람직하다. 혼합 후, 상기 시료는 시료 용기로 이송되고, 그리하여, 선택적인 분리 수단의 제거에 의해, 검출 검정기의 담는 영역과 접촉하도록 한다.

모세관 흐름을 통해, 상기 시료는 액체 흐름에 의해 찾아지는 검출 검정기에 의해 분석되도록 단백질(항원)의 한 에피토프로 특정되는 항체로 코팅된 작은 입자(예를 들어 콜로이드 골드 또는 라텍스)가 있는 다른 영역으로 셀룰로오스 띠를 따라 이동하도록 허용된다. 항원은 항체에 결합하는 입자에 첨부된 시료 내에 존재하고 또한 셀룰로오스 띠를 따라 이동한다. 또한 모세관 흐름의 하부 경로는, 띠로 비가역적으로 결합하는, 상기 항원의 다른 에피토프를 인지하는 다른 항체(모노 또는 다클론성) 이다. 항원을 가지는 입자는 상기 제2 항체가 결합되는 곳인, 띠 상의 영역에 각각에 항체가 결합된 입자 및 띠 사이에 끼인 항원과 부착된다.

만약 같은 영역에서 충분한 입자가 만나는 경우에는 띠 상에 가시 라인(시험 라인)이 형성된다. 항원에 잡히지 않는 입자는 계속적으로 띠를 삼키고 일부는 기능 조절 라인 상에서 만난다. 입자는 인간의 눈에 하나씩 보이기에는 너무 작다. 단지 만약 같은 영역에서 충분한 입자가 만나는 경우에는 가시 라인이 형성된다.

상술한 공정은 실질적으로 양쪽 띠에 동시에 일어나며, 이로 인해 각각의 분석되는 물질의 결과는 수 분 사이에 얻어진다.

상술한 본 발명의 바람직한 구체예와 하기의 실험은 단지 설명할 목적으로 계획된 것이며 본 발명의 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해진다.

실험

물질 및 방법

하기의 연구를 위한 시료는 스웨덴의 크리스티안스테드에 있는 공공 치과 서비스의 치근막학과(Periodontology)에서 치주병 치료를 받았던 16명의 지원자로부터 획득하였다. 환자들의 연령 범위는 28-54세이었으며 평균연령은 40세이었다. 모든 개인은 분리된 치아에 위치한 6 mm 또는 그 이상의 탐침 깊이를 가진 셋 이상의 장소를 가졌다. 어떤 환자도 6개월의 진행 기간 동안 의학적으로 손상되거나 치주병 및/또는 항생제 치료를 받지 않았다.

샘플링 및 임상 진찰은 1주씩 따로 복수로 수행되었다. 효소 분석을 위한 시료들은 미생물 샘플링 및 임상 진찰 이전에 수집되었다. 제1차 샘플링 및 진찰은 주어진 치료 이전에 수행되었다(베이스라인, 측정 1). 제2차 샘플링 및 진찰은 제1차 치료가 완료된 후 6개월에서 수행되었고(측정 2), 제3차 치료는 제2차 치료가 끝난 이후의 다른 6개월에서 수행되었다(측정 3).

베이스라인 진찰 이후에 모든 환자들은 구강 위생 지시 및 전체 치열에 전부 치은연상 및 치은연하의 죽은 조직 제거술을 받았다. 제2차 치료기간에 마취 상태하에 치주 수술 또는 재스케일링(rescaling)이 치은연하 시료에 무산소 생존 가능 숫자 전체의 P. 진지발리스(P. gingivalis) ≥ 0.5%으로 구성되거나 P. 인터미디어(P. Intermedia) ≥ 5 %, 또는 A. 악티노미세템코미탄(A. actinomycetemcomitans)이 존재하는 모든 장소에서 수행되었다. 연구를 위한 모든 다른 장소는 치은연상 연마를 받았다.

각 환자로부터, 시료들은 6 mm 이상의 초기 탐침 깊이를 가진 3 내지 10 장소들로부터 수집되었다. 샘플링 영역은 건조되고 코튼 롤(cotton rolls)과 분리되고, 치은연상, 플라크(plaque)는 불임 소파기와 면 가제로 조심스럽게 제거되었다. 효소 검정기를 위해, 세 미디움 페이퍼 포인트(존슨 앤 존슨, 윈저, NJ)가 치주 고랑(periodontal sulcus) 내로 약 1 mm로 계속하여 주입되고 15초가 남는다. 각 페이퍼 포인트의 젖은 부분은 한 쌍의 불임 가위로 잘려지고 100 ㎕ 0.85% NaCl이 포함된 미니소브(minisorb) 튜브(Nunc, Rosklide, 덴마크) 내로 고여진다. 시료는 즉시 -20℃ 및 -80℃에서 6 시간 동안 냉동되고, 분석될 때까지 저장된다. 미생물 분석을 위해 3 페이퍼 포인트는 저항을 만나고 적당히 15초가 남기까지 계속적으로 주입된다. 포인트는 10개 유리 구슬, 3 mm 직경, 및 3.3 ml의 VMGA III 이송 미디움을 포함하는 바이알 내로 고여지며, 호기성으로 제조 및 저장되었다. 상기 시료들은 24 시간 동안 처리되었다. 박테리아는 풍부한 브루셀라 배지상에서 자라고 적당한 방법으로 확인되었다.

진단 시험를 위한 적당한 컷-오프(cut-off)값의 연구를 위해 인간 호중구로부터의 엘라스타아제와 선택적인 기질을 사용한 P. 진지발리스(P. gingivalis)로부터의 arg-진지페인(arg-gingipain)이 연구되었다.

복제 시료의 제1 세트는 효소 검정기에 사용되었다. 모든 시료들은 얼음상에서 해동되었고 13,000 x g에서 3분간 원심분리되었다.

P. 진지발리스(P. gingivalis)로부터의 arg-진지페인(arg-gingipain)을 검출 하기 위한 효소 기질은 5 % DMSO를 포함한 검정 버퍼에서 1 mM의 최종 농도를 가지는 N-벤조일-L-아르기닌-p-나이트로아닐린(BAPNA)이었다. 검정 버퍼는 50 mM 글리실-글라이신을 가진 pH 7.5의 5 mM CaCl이 포함된 0.1 M 트리스-HC1(arg-진지페인(gingipain)의 존재하에서 gly-gly가 선택적으로 BAPNA를 자극하는 것으로 일찍이 미국특허 제5,981,164호의 발명자들에 의해 보고되었던 것처럼) 및 5 mM L-시스테인이었다. 10 ㎕의 시료는 50 ㎕의 기질이 첨가되기 전에 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에서 140 ㎕의 검정 버퍼와 15분간 미리 배양되고, 소혈청 알부민으로 미리 코팅된다. 플레이트는 습기 있는 챔버내에서 37℃에서 배양되고, 방출되는 pNA는 12시간부터 36시간까지 매 시간마다 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용한 0D₄₀₅ 리딩에 의해 분광학적으로 추적되었다. 활성화의 한 단위는 한 시간의 배양 동안에 1 nmol의 기질을 끊는 효소의 양과 동일하였다.

엘라스타아제 검정은 145 ㎕의 검정 버퍼(pH 7.5에서 0.1 M 트리스, 0.5 M NaCl)를 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 5 ㎕의 CGF를 첨가하여 수행되었다. 반응은 15분 후에 20% DMSO를 포함하는 검정 버퍼 내에 50 ㎕의 메톡시석시닐-Ala-Ala-Pro-발린-pNA의 2 mM 용액의 첨가에 의해 응시될 수 있다. 플레이트는 습기 있는 챔버내에서 37℃에서 배양되었다. pNA를 방출하는 효소적 반응은 마이크로타이터 플레이트 리더(Molecular Devices)를 사용하여 0D₄₀₅에서 12시간부터 26시간까지 매 시간마다 읽혀졌고, 희석된 정제 효소의 표준과 비교하였다. 읽혀진 리딩은 시간에 대해 도시되었고 효소 활성도는 도표의 선 부분으로부터 DA₄₀₅/60분으로 계산되었다. 엘라스타아제의 양은 장소당 ng으로 존재하였다.

P. 진지발리스(P. gingivalis)의 성장 또는 gly-gly가 존재하는 환자들은 BAPNA 활성화를 자극하지만 컷-오프 연구에서 포함되는 A. 악티노미세템코미탄(A. actinomycetemcomitans)은 그렇지 않다. 이 기준은 8명의 환자들로부터의 35개 장소에서 얻어진다. 최초 치료 후 1년의 측정이 이 제한된 연구에서 사용되었다. 치주병 포켓의 바닥으로부터 균형된 압력의 탐침을 가진 루트-접합제(root-cement) 간격으로 측정되는 것과 같은 부착 손실은 치주병의 더한 진행을을 측정하는데 사용되었다. 엘라스타아제 및 arg-진지페인은 더한 부착 손실을 예측하기 위한 그들의 능력에 대해 분석된다. 개개의 엘라스타아제 컷-오프 레벨은 장소당 20 ng이고 arg-진지페인에 대해서는 장소당 0.27 유니트(units)로 정해졌다.

결과

엘라스타아제	부착 손실	부착 획득 또는 0
포지티브 시험 (엘라스타아제 >20 ng)	3	2
네거티브 시험 (엘라스타아제 ≤20 ng)	3	27

더한 부착 손실의 예측자로서 엘라스타아제는 50%의 민감도와 93%의 특이성을 나타낸다. 0.0264^*의 p-값은 피셔의 정밀 시험(Fisher's exact test)를사용하여 계산되었다.

Arg-gingipain	부착 손실	부착 획득 또는 0
포지티브 시험 (arg-gingipain >0.27 U)	6	13
네거티브 시험 (arg-gingipain ≤0.27 U)	0	16

더한 부착 손실의 예측자로서 arg-진지페인은 100%의 민감도와 55%의 특이성을 나타낸다. 0.0216^*의 p-값은 피셔의 정밀 시험(Fisher's exact test)를 사용하여 계산되었다.

엘라스타아제 및 arg-진지페인을 단독으로 사용하면 어느 경우에나 민감도 또는 특이성이 희생된다. 이 사실은 우리로 하여금 두 효소의 조합을 조사하도록 하였다. 조사 결과, 우리는 두 효소에 대한 새로운 컷-오프 레벨이 엘라스타아제에 대한 검출 한계가 장소당 2 ng이 되어야 하고 Arg-진지페인에 대해서는 0.30 유니트(units)임을 발견하였다.

조합	부착 손실	부착 획득 또는 0
포지티브 시험 (엘라스타아제 >2 ng 및 arg-gingipian >0.30 U)	5	3
네거티브 시험 (엘라스타아제2 ng 또는 arg-gingipain ≤0.30 U)	1	26

더한 부착 손실의 예측자로서 엘라스타아제 및 arg-진지페인의 조합은 83%의 민감도와 90%의 특이성을 나타낸다. 0,001^***이하의 p-값은 피셔의 정밀 시험(Fisher's exact test)를 사용하여 계산되었다. 이러한 제한된 데이터는 치주병에 대한 표지자로서의 엘라스타아제 및 arg-진지페인의 조합이 단독으로 사용하는 경우보다 통계학적으로 중요한 시험이 될 수 있다는 결과를 보여준다.

Claims (41)

1. 박테리아로부터 유래한 제1 성분을 검출하기 위한 제1 검출 검정(assay); 및

   환자의 면역 또는 염증 시스템으로부터 유래한 제2 성분을 검출하기 위한 제2 검출 검정을 포함하는 환자의 구강으로부터의 분석 시료에 의해 환자의 치주병을 검출하기 위한 시험 키트.
2. 제1항에 있어서,

   상기 제1 검출 검정은 적어도 박테리아로부터 유래한 상기 제1 성분과 결합하기 위한 결합 부위를 가진 제1 친화성 리간드(affinity ligand)를 포함하고;

   상기 제2 검출 검정은 적어도 환자의 면역 또는 염증 시스템으로부터 유래한 상기 제2 성분과 결합하기 위한 결합 부위를 가진 제2 친화성 리간드를 포함하는 시험 키트.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 성분은 박테리아 병독성 생성물(bacterial virulence product)인 시험 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 제1 성분은 효소인 시험 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 효소는 프로테아제인 시험 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 프로테아제는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 arg-진지페인(arg-gingipain) 및 박테로이드 포시더스(Bacteroides forsythus)로부터의 48 kDa 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 시험 키트.
7. 제3항에 있어서, 상기 제1 성분은 독소(toxin)인 시험 키트.
8. 제7항에 있어서, 상기 독소는 악티노바실러스 악티노미세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)로부터의 루코톡신(leukotoxin)인 시험 키트.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 성분은 백혈구 제제(leukocyte product)인 시험 키트.
10. 제9항에 있어서, 상기 백혈구 제제는 천연 세린 프로테아제(natural serine protease)인 시험 키트.
11. 제10항에 있어서, 상기 천연 세린 프로테아제는 인간 호중구 엘라스타아제(human neutrophil elastase)인 시험 키트.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 성분은 사이토카인(cytokine)인 시험 키트.
13. 제12항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터루킨(interleukin)인 시험 키트.
14. 제13항에 있어서, 상기 인터루킨은 인터루킨-1β, 인터루킨-6 및 인터루킨-8 중에서 선택되는 시험 키트.
15. 제12항에 있어서, 상기 사이토카인은 염증 매개체(inflammatory mediator)인 시험 키트.
16. 제15항에 있어서, 상기 염증 매개체는 종양 괴사 인자 및 프로스타글란딘 E₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 시험 키트.
17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 친화성 리간드는 상기 제1 성분의 선택적 결합을 보여주는 제1 항체이고 상기 제2 친화성 리간드는 상기 제2 성분의 선택적 결합을 보여주는 제2 항체인 시험 키트.
18. 제17항에 있어서, 상기 제1 및 제2 검출 검정기는 면역크토마토그래피 검정(immunochromatographic assay)을 제공하는 시험 키트.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료를 받기 위한 시료 용기를 제공하는 지지대(support)를 더 포함하고, 상기 제1 및 제2 검출 검정기는 직접적으로 또는 상기 검출 검정기로부터 상기 시료 용기를 분리하는 제거될 수 있는 배열된 분리 수단을 경유하여, 상기 시료 용기와 접촉하여 상기 지지대 상에 배열되는 시험 키트.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 검정을 위한 상기 시료의 희석 및 적응(adaptation)을 위한 추가적인 버퍼(buffers)를 더 포함하는 시험 키트.
21. 제20항에 있어서, 상기 시료 용기로부터 분리된 버퍼 용기를 더 포함하는 시험 키트.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료를 얻기 위한 하나 이상의 샘플링 장치를 더 포함하는 시험 키트.
23. 치주병을 검출하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따르는 시험 키트.
24. 적어도 박테리아로부터 유래한 상기 제1 성분의 존재와 환자의 면역 또는 염증 시스템으로부터 유래한 상기 제2 성분의 존재에 대해 환자의 구강으로부터의 시료를 분석하는 단계를 포함하는 치주병 진단 및/또는 상기 병의 진행 위험을 예측하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 제1 성분은 박테리아 병독성 생성물인 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 제1 성분은 효소인 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 효소는 프로테아제인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 프로테아제는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 arg-진지페인(arg-gingipain) 및 박테로이드 포시더스(Bacteroides forsythus)로부터의 48 kDa 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
29. 제25항에 있어서, 상기 제1 성분은 독소(toxin)인 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 독소는 악티노바실러스 악티노미세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)로부터의 루코톡신(leukotoxin)인 시험 키트.
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 성분은 백혈구 제제(leukocyte product)인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 백혈구 제제는 천연 세린 프로테아제(natural serine protease)인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 천연 세린 프로테아제는 인간 호중구 엘라스타아제(human neutrophil elastase)인 방법.
34. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 성분은 사이토카인(cytokine)인 방법.
35. 제36항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터루킨(interleukin)인 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 인터루킨은 인터루킨-1β, 인터루킨-6 및 인터루킨-8중에서 선택되는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 사이토카인은 염증 매개체(inflammatory mediator)인 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 염증 매개체는 종양 괴사 인자 및 프로스타글란딘 E₂로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는 상기 제1 성분의 존재를 선택적으로 검출하는 제1 방법과 상기 제2 성분의 존재를 선택적으로 검출하는 제2 방법으로 상기 시료를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 제1 방법은 상기 제1 성분의 선택적 결합을 보여주는 제1 항체를 사용하는 단계를 포함하고 상기 제2 방법은 상기 제2 성분의 선택적 결합을 보여주는 제2 항체를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 상기 제1 및 제2 방법은 면역크토마토그래피 검정(immunochromatographic assay)을 사용하는 단계를 포함하는 방법.

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