KR20060110896A - 항-ｅｇｆ 수용체 단일클론항체 및 이를 생산하는하이브리도마 세포주 - Google Patents

항-ｅｇｆ 수용체 단일클론항체 및 이를 생산하는하이브리도마 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGF 수용체 또는 EGFR) 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EGF 수용체에 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해시키는 단일클론항체와 이의 중쇄 가변영역(VH) 및 이를 코드하는 DNA, 경쇄 가변영역(VL) 및 이를 코드하는 DNA 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 항-EGF 수용체 단일클론항체는 다양한 종류의 종양 또는 암에서 과잉 발현되는 EGF 수용체를 항원으로 인식, 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 효과가 있다.
표피 성장 인자 수용체, EGF 수용체, EGFR, 단일클론항체, 하이브리도마 세포주

Description

항-ＥＧＦ 수용체 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주{MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING THE SAME}
도 1은 선별된 클론에 대해서 EGF 수용체와 EGF 수용체 과발현 세포주인 A431 세포주에 대한 ELISA 결과이고,
도 2는 클론 A431-1 과 클론 A431-96의 면역조직염색결과이고,
도 3은 클론 A431-1 과 클론 A431-96의 세포분석기를 통한 EGF 수용체 결합을 확인한 결과이고,
도 4는 EGF 수용체의 인산화 저해능을 확인한 western blotting 결과로서 레인 1은 분자량을 표시하는 것이고, 레인 2는 아무것도 처리하지 않은 MDA-MB-231세포파쇄물, 레인 3은 EGF만 처리한 세포파쇄물, 레인 4는 항파상풍 항체를 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물, 레인 5는 클론 A431-1을 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물, 레인 6은 클론 A431-96을 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물이다.
도 5는 폐암세포주인 NCI-H727 세포주에 대한 성장저해능을 확인한 것이다.
본 발명은 항-표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGF 수용체 또는 EGFR) 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EGF 수용체에 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해시키는 단일클론항체와 이의 중쇄 가변영역(VH) 및 이를 코드하는 DNA, 경쇄 가변영역(VL) 및 이를 코드하는 DNA 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR , 이하 'EGF 수용체'라 칭함)는 다양한 종류의 종양에서 과잉 발현되는 것으로 밝혀져 있다. EGF 수용체의 과잉발현은, 예컨대 특정 암인, 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부 및 경부 암, 난소암 및 전립선암에서 관찰되었다. 표피 성장 인자(Epidermal Growth Factor; EGF)는 EGF 수용체에 결합하여 세포 증식과 종양 성장을 유도하는 것으로 입증되었다. 따라서, EGF 수용체에 대한 항체를 사용하여 EGF 수용체를 과잉 발현하는 종양세포에 EGF가 결합하는 것을 저해하면 암세포의 성장을 억제하여 암을 치료할 수 있다. EGF 수용체에 대한 다양한 쥐 및 래트의 단일클론 항체가 개발되어 시험관내 및 생체내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 작용에 대하여 시험되었다.
임상 분야에서 전이성 대장암의 치료에 사용되고 있는 C225 항체 (제품명: Erbitux, 미국 ImClone사) 는 키메라 항체로서, 마우스의 가변 영역과 인간항체의 IgG1 불변 영역을 결합한 것으로 시험관내에서 EGF 매개의 종양 세포 성장을 억제하고 또한 EGF 에 의한 EGF 수용체의 인산화를 억제하며 누드 마우스에서 인간 종양이 형성되는 것을 억제하는 것으로 증명되어 있다. 또한, 이 항체는 특정 화학치료제와 상승 작용하여 이종이식편 마우스 모델에서 인간 종양을 근절시키는 것으로 밝혀져 있다.
본 발명의 목적은 다양한 종류의 종양 또는 암에서 과잉 발현되는 EGF 수용체를 항원으로 인식, 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 항-EGF 수용체 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGF 수용체에 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해하는 서열정보 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(VH) 및 서열정보 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항-EGF 수용체 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 중쇄 가변영역(VH)을 코드하는 서열정보 3의 염기서열 및 경쇄 가변영역(VL)을 코드하는 서열정보 4의 염기서열을 포함하는 항 파상풍 단일클론항체 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 A431-96(기탁번호 KCLRF-BP-00114)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리도마 세포주 A431-96(기탁번호 KCLRF-BP-00114)로부터 생산되는 항 파상풍 단일클론항체 A431-96를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열정보 3 또는 서열정보 4의 염기서열 정보에서 발현되는 재조합 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-EGF 수용체 단일클론항체를 이용한 암 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 마우스의 복강에 주사한 다음 3주 후에 같은 암세포를 복강내에 부스터(booster)주사하고 세포융합 전에 피부암 세포주인 A431을 복강내에 부스터(booster)주사하여 마우스를 면역시킨 후 상기면역화된 마우스의 비장세포를 골수종(myeloma) 세포(SP2/0)와 혼합하고 풀리에틸렌클리콜(PEG, 분자량 1,500; Roche)을 넣어 반응시킨 후 배양하여 하이브리도마 세포주를 제조하는 단계; 제조한 하이브리도마 세포주 중에서 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하고, 이 세포주가 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 EGF 수용체에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 선별한 하이브리도마 세포주를 이용하여 마우스 (mouse)로부터 단일클론항체를 대량생산 및 정제하는 단계; 면역조직염색법(immunohistochemistry)에 의해서 EGF 수용체가 과량 발현되는 조직에서의 반응성을 확인하는 단계; 유세포분석기를 통해서 EGF 수용체가 과량 발현되는 암세포주에서 반응성을 확인하는 단계; EGF 수용체의 인산화 억제능을 확인하는 단계; EGF 수용체가 발현되는 폐암세포주인 NCI-H727 세포주에서 성장저해를 확인하는 단계; 성장저해능이 있는 단일클론항체에 대한 DNA 염기서열을 확인하는 단계를 통하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 본 실시예는 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
실시 예 1 : 항파상풍 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 구축
유방암세포주인 MDA-MB-231 세포주를 인산완충액과 잘 혼합하여 4주된 Balb/c 마우스의 복강에 주사하였다. 3주후에 MDA-MB-231 세포주를 마우스의 복강에 부스터(booster)주사하였다. 세포융합실험 4일전에 피부암 세포주인 A431 세포주를 인산완충액과 잘 혼합하여 마우스의 복강에 주사하였다. 면역된 마우스의 비장(spleen)를 적출하여 비장세포를 분리하였다. 분리된 비장세포와 골수종 세포(myeloma cell, SP2/0)를 각각 2회 DMEM 배지로 씻어준 다음 비장세포와 골수종 세포의 세포수를 각각 세어서 비장세포와 골수종세포가 5:1이 되도록 섞어준 다음 1회 씻어 준다. 폴리에틸렌 글라이콜을 1ml 넣어서 섞어준 다음 DMEM배지를 첨가한 후 원심분리를 하여 침전된 세포를 분리배지(HAT 배지)에 현탁시키고 96웰(well) 마이크로 타이터 플레이트에 0.2ml씩 깔은 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
실시 예 2: 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 실시예 1에서 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 EGF 수용체(Sigma사, 미국)에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주의 선별과정은 ELISA 법을 이용하여 EGF 수용체(Sigma사)에 결합하는 항체를 다음과 같이 측정함으로써 이루어졌다. 먼저, EGF 수용체를 2㎍/ml 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)로 희석시키고, 이 희석된 EGF 수용체 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc Immuno Module, Maxisorp, 덴마크)에 분주하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 1% 우혈청 알부민(BSA) PBS 300㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 한 다음, 하이브리도마 배양액 100㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. PBST로 두번째 세척을 한 다음, 1% BSA-PBS 중의 희석된 염소 항-마우스 IgG(Fab 특이적)-퍼옥시다제 접합체(Sigma사, 미국)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 한 번 더 세척한 다음, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-술폰산(ABTS) 용액(KPL사, 미국) 100㎕를 첨가하고 405nm에서 흡광도(O.D.)를 측정하여 9개의 클론을 선별하였다.
도 1은 선별된 클론에 대해서 EGF 수용체와 EGF 수용체 과발현 세포주인 A431 세포주에 대한 ELISA 결과이다.
이 중에서 피부암 세포주인 A431 추출물과 EGF 수용체에 대해서 반응성이 좋은 단일클론항체 A431-1 및 A431-96를 선별하였으며, 이 중 단일클론항체 A431-96를 생산하는 하이브리도마 세포주 A431-96을 2005 년 03월 25일자로 한국세포주연구재단(KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁하였다.(기탁번호 KCLRF-BP-00114)
실시 예 3 : 단일클론항체의 생산 및 정제
실시 예 2에서 얻은 계속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터 단일클론항체를 생산하기 위하여 마우스(Balb/c)에 0.5ml의 2,6,10,14-테트라메실펜타데케인(pristane, Sigma사)를 복강내로 주사하였다.1주일 후에 각각의 하이브리도마세포주를 마우스 1마리당 5 x 106 씩 주사하고 복강이 부풀어 오른 마우스에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액을 -20℃에서 얼린 다음 얼지 않은 부분은 제거해준다. 복수액을 다시 녹인 후 암모늄설페이트((NH4)2SO4)로 침전 시킨 다음 원심분리하여 침전물을 인산완충액으로 녹인다. 그 다음 항체 정제용 결합완충액 (Pierce사, 미국)과 1:1로 섞어 준 후 protein A-agarose gel이 충전된 column을 사용하여 정제하였다.
실시 예 4: 단일클론항체의 면역조직염색법을 이용한 EGF 수용체 결합확인
실시 예 3에서 정제된 단일클론항체들의 면역조직염색법을 이용한 EGF 수용 체 결합 확인을 위하여 EGF 수용체가 과량 발현된 조직인 태반조직슬라이드(Spring Bioscience, 미국)를 먼저 자일렌(xylene)에 10분간 3회 담가줌으로써 파라핀을 제거하였다. 파라핀이 제거된 슬라이드를 에탄올에 적셔준 다음 수돗물에서 5분간 씻어주었다. 그 다음 슬라이드를 10mM citrate pH6.0 완충액에 넣고 끊여준 후 3% 과산화수소에 담구어 조직 내에 들어있는 퍼옥시데이즈를 불활화 시켰다. 단일클론 항체 1ug/mL을 인산완충액에 혼합한 다음 슬라이드에 적신 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에 인산완충액으로 3회 씻어준 다음 염소 항-마우스 IgG (Fab 특이적)-퍼옥시다제 접합체(NICHIREI사, 일본)를 첨가한 다음 상온에서 30분간 배양하였다. StableDAB 퍼옥시데이즈 기질 (KPL사)를 넣고 현미경상에서 염색정도를 확인 한 다음 수돗물에서 5분 동안 씻어주었다. Contrast BLUE 액 (KPL사)으로 1분 동안 염색한 다음 수돗물로 씻어주었다. 슬라이드를 에탄올에 적셔 준 다음 자일렌(xylene)에 2분씩 3회 담구어 주었다. 그 다음 Permount (Fisher사, 미국)액으로 mounting해준 후 보관하였다.
도 2는 클론 A431-1 과 클론 A431-96의 면역조직염색결과이다.
상기 도2에 보이는 바와 같이, 실험결과 클론 A431-1과 클론 A431-96은 태반조직 슬라이드에 염색됨을 확인하였다.
실시 예 5: 세포분석기를 이용하여 EGF 수용체가 과량 발현되는 암세포주에서 EGF 수용체에 대한 결합성 확인
실시 예 4에서 EGF 수용체에 대한 반응성이 확인된 단일클론항체에 대해서 EGF 수용체가 과량 발현되는 암세포주에 대한 결합성을 확인하기 위하여 피부암세포주인 A431 세포주를 1% 우혈청알부민(BSA) PBS로 씻어 주었다. 얼음속에서 단일클론항체 10ug과 A431 세포주를 반응시킨 다음 1%BSA-PBS로 2회 씻어 주었다. 염소 항-마우스 (Fab 특이적) FITC 접합체를 넣고 얼음에서 40분간 반응시킨 다음 1% BSA-PBS로 2회 씻어 주었다. 1% BSA-PBS 1mL로 현탁한 다음 유세포분석기로 분석을 하였다.
도 3은 클론 A431-1 과 클론 A431-96의 세포분석기를 통한 EGF 수용체 결합을 확인한 결과이다.
상기 도 3에 보이는 바와 같이, 실험결과 클론 A431-1과 클론 A431-96은 A431 세포에 반응을 하지만 항 파상풍 단일클론항체인 hTT-2는 반응을 하지 않았다.
실시 예 6: 유방암 세포의 EGF 수용체 인산화 저해 실험
실시예 5에서 EGF 수용체에 결합하는 단일클론항체의 EGF 수용체 인산화 저해능을 확인하기 위하여 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 24웰 마이크로 플레이트(Nunc 사)에 세포수 1x105이 되도록 깔아주었다. 2일이 경과한 후 단일클론항체와 EGF를 처리한 다음 30분이 경과한 후에 MDA-MB-231 세포 파쇄물을 SDS-PAGE 단백질 밴드를 분리하여 이를 nitrocellulose membrane에 전기적인 방법으로 옮겼다. 막에 옮긴 단백질의 비특이적인 반응을 줄이기 위해 5% 소혈청알부민 용액으로 30 분 동안 막을 차단하였고 EGF 수용체의 인산화 형태에 특이적으로 반응하는 항-phosphotyrosine 특이적 퍼옥시데이즈 접합체 (Zymed사, 미국)를 사용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 0.05% 트윈이 포함된 인산완충액으로 세척한 후 0.018%(v/v) 4-클로로-1-나프톨과 0.045% 과산화수소가 인산완충액과 메탄올에 녹아있는 기질을 이용하여 발색 반응을 시켰다.
도 4는 EGF 수용체의 인산화 저해능을 확인한 western blotting 결과로서 레인 1은 분자량을 표시하는 것이고, 레인 2는 아무것도 처리하지 않은 MDA-MB-231세포파쇄물, 레인 3은 EGF만 처리한 세포파쇄물, 레인 4는 항파상풍 항체를 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물, 레인 5는 클론 A431-1을 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물, 레인 6은 클론 A431-96을 처리하고 EGF를 처리한 세포파쇄물이다.
상기 도 4에 보이는 바와 같이, 실험결과 클론A431-1과 클론 A431-96이 EGF 수용체의 인산화를 저해함을 확인하였다.
실시 예 7: EGF 수용체 발현 폐암세포의 성장저해 실험
실시 예 6에서 EGF 수용체의 인산화 저해능이 있는 단일클론항체에 대한 피부암세포의 성장저해 실험을 확인하기 위하여 24웰 마이크로 플레이트(Nunc)에 0.5% 한천을 굳힌 다음 그 위에 폐암 세포주인 NCI-H727 세포와 단일클론항체를 0.3% 한천이 포함된 배지에 혼합하여 굳혔다. 3주가 경과한 후 나이트로 블루 테트라졸륨 (Sigma사)을 사용하여 살아있는 세포를 염색하였다.
도 5는 폐암세포주인 NCI-H727 세포주에 대한 성장저해능을 확인한 것이다.
상기 도 5에 보이는 바와 같이, 실험결과 클론 A431-96이 항파상풍 단일클론항체인 hTT-2에 비해서 NCI-H727 세포주에 대한 성장저해능이 탁월함을 확인하였다.
실시 예 8: 폐암세포주에 대한 성장저해능이 확인된 단일클론항체의 DNA염기서열결정
실시 예 7에서 폐암세포주에 대한 성장저해능이 확인된 단일클론항체에 대한 DNA 염기서열결정을 위하여 하이브리도마를 1x108 정도로 DMEM 배지에서 배양하여 Trizol(Life Technologies사)을 사용하여 설명서에 따라 RNA를 분리하였다. cDNA 합성, 항체의 VH 및 VL DNA의 증폭과 같은 항체 유전자의 클로닝과 관련된 제반 사항은 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사)을 사용하여 제시된 방법에 따라 시행하였으며 클로닝된 항체유전자는 pGEM-T 벡터(Promega사, 미국)에 삽입한 후 염기서열을 확인하였다. 보다 자세한 과정은 다음과 같다.
1. RNA의 분리
하이브리도마 세포 5～10x106당 trizol 1ml을 넣고 피펫으로 세포를 잘 풀어준 후, 실온(15℃～30℃)에서 5분 동안 기다렸다. 다음으로, Trizol 1ml당 클로로포름 200㎕를 넣어 잘 섞고, 뚜껑을 닫고 손으로 15초동안 세게 흔들어준 후 실온에서 3분 동안 기다렸다. 그 후, 2～8℃에서 15분 동안 15,000rpm으로 원심분리 하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. Trizol 1ml당 이소프로필 알콜 500㎕를 넣고 잘 섞어 준 다음, 실온에서 10분 동안 기다렸다. 그 후, 2～8℃에서 10분 동안 15,000rpm으로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. Trizol 1ml당 75% 에탄올 1ml을 넣고 2℃～8℃에서 5분 동안 15,000rpm으로 원심분리하고, 에탄올은 따라 버리고 RNA 펠렛은 잠깐 말렸다. 증류수를 150㎕ 넣고 RNA를 잘 녹인 후, 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 후, -20℃에서 보관하였다. 분리한 RNA의 양은 모두 1.0～2.5 ㎍/㎕이었다.
2. cDNA의 합성 및 증폭
상기에서 얻어진 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 먼저, mRNA를 65℃에서 10분 동안 반응시킨 후 즉시 얼음에서 식혔다. mRNA 10㎕, 증류수 10㎕, 제1가닥 혼합물(first-strand mix) 11㎕, DTT 1㎕를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에서, 상기 제1가닥 혼합물은 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사) 내에 포함되어 있는 것으로, 쥐 역전사 효소(murine reverse transcriptase), 랜덤 헥사데옥시리보뉴클레오티드(random hexadeoxyribonucleotides: pd(N)6), RNase/DNase가 없는 BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 등을 포함하고 있다.
다음으로, 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR을 하였다. 2개의 PCR 튜브를 준비하여 하나의 튜브에는, PCR 키트, cDNA 33㎕, 경쇄 프라이머 혼합물(light primer mix) 2㎕, 증류수 15㎕를 넣었고, 다른 하나의 튜브에는 PCR 키트, cDNA 33㎕, 중쇄 프라이머 혼합물(heavy primer mix) 2㎕, 증류수 15㎕를 넣고 PCR 기계에서 반응을 시켰다. PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 1분, 56℃에서 2분, 72℃에서 2분으로 40회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 15분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다. 상기 경쇄 프라이머 혼합물은 경쇄의 10개 가변영역에 해당하는 프라이머의 혼합물을 말하며, 5′프라이머 및 3′프라이머를 포함하고 있다. 상기 중쇄 프라이머 혼합물은 중쇄의 가변영역에 해당하는 프라이머의 혼합물로서, 5′프라이머 및 3′프라이머 각각으로 존재하며 반응 시에 이를 함께 혼합하여 사용하였다. 상기 혼합물들은 그 자체가 Mouse ScFv and Expression Module(Amersham Pharmacia 사)에 제공된다.
이와 같이 얻어진 PCR 산물 DNA를 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동을 하여 확인하였고, QIAquick PCR purification kit(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 사용하여 분리 정제하였다.
3. 재조합 벡터의 제조
상기에서 얻어진 항체 VH 및 VL DNA 와 pGEM-T vector를 T4 DNA 라이게이즈(Promega 사)를 사용하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터를 E.coli 세포에 형질전환 시킨 다음 X-Gal 과 IPTG가 포함된 LB 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 밤새 배양한 다음 하얀색 콜로니를 선별하여 LB 배지에서 배양한 후 Qiagen plasmid mini kit (Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 이용하여 재조합 플 라스미드를 분리하였다. 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드 DNA를 염기서열 결정에 사용하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항-EGF 수용체 단일클론항체는 다양한 종류의 종양 또는 암에서 과잉 발현되는 EGF 수용체를 항원으로 인식, 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 각종 종양 및 암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> GREEN CROSS HOLDINGS <120> MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR AND HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING THE SAME <130> SP-250002 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain variable region of monoclonal antibody A431-96 against epidermal growth factor receptor <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg His Gly Ser Ser Gly Tyr Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain variable region of monoclonal antibody A431-96 against epidermal growth factor receptor <400> 2 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Val Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding H chain variable region of monoclonal antibody A431-96 against epidermal growth factor receptor <400> 3 caggtccaac tgcaggagtc tgggggaaac ttcgtgaagc ctggagggac cctgaaaatc 60 tcctgtgcag cctctggatt tactttcagt aattatgaca tgtcttggtt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatat ataagtggtg gtagtgaaag aacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg atttaccgtt tccagggaca atgccaagaa caccctgttc 240 cttcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt atttctgtac aagacacggc 300 agctcgggct acgtagacta tggtatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 4 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding L chain variable region of monoclonal antibody A431-96 against epidermal growth factor receptor <400> 4 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gaacgttgta catagtactg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agtagagtag aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

Claims (6)

  1. EGF 수용체에 특이적으로 결합하여 EGF 수용체의 활성을 저해하는 서열정보 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(VH) 및 서열정보 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항-EGF 수용체 단일클론항체.
  2. 제1항의 중쇄 가변영역(VH)을 코드하는 서열정보 3의 염기서열 및 제1항의 경쇄 가변영역(VL)을 코드하는 서열정보 4의 염기서열을 포함하는 항-EGF 수용체 단일클론항체 DNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 하이브리도마 세포주 A431-96(기탁번호 KCLRF-BP-00114)로부터 생산되는 항-EGF 수용체 단일클론항체 A431-96.
  4. 제1항의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 A431-96(기탁번호 KCLRF-BP-00114).
  5. 제2항의 서열정보 3 또는 서열정보 4의 염기서열 정보에서 발현된 재조합 항체.
  6. 제1항의 항-EGF 수용체 단일클론항체를 이용한 암 치료제.
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