KR20060088133A - Ｄｎａ 라이브러리의 작제 방법 및 ｄｎａ 라이브러리를고정화한 기체 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 기체상의 올리고 (dT)n에 mRNA 를 혼성화시킨 후, 역전사효소를 작용시켜 상보적인 DNA 를 고정화시키는 cDNA 라이브러리 작제방법, 또는 제한효소부위를 가진 기체상의 올리고뉴클레오티드에 이중 가닥 염색체 DNA 라이브러리를 라이게이션시킨 후, gDNA 라이브러리를 고정화시키는 gDNA 라이브러리의 작제 방법에 관한 것이다. 또한 이들의 복제품을 작제하는 방법, 복제한 DNA 단편을 고정화한 기체에 관한 것이다.
Description
도 1 은 본 발명의 cDNA 라이브러리 기체의 작제 장치의 개략도이다.
도 2 는 본 발명의 gDNA 라이브러리 기체의 작제장치의 개략도이다.
도 3 은 본 발명의 cDNA 라이브러리 기체 작제의 수순을 도시한 플로우차트이다.
도 4 는 본 발명의 cDNA 라이브러리 기체의 작제 수순을 도시한 개략도이다.
도 5 는 본 발명의 gDNA 라이브러리 기체 작제의 수순을 도시한 플로우차트이다.
도 6 은 본 발명의 gDNA 라이브러리 기체의 작제 수순을 도시한 개략도이다.
도 7 은 기체 (f) 의 확대도이다.
도 8 은 기체 (e) 의 확대도이다.
본 발명의 공업적 분야는, 유전자 공학, 단백질 공학, 세포 공학, 면역학 등 의 분자 생물학 공학 및 생화학 공학, 특히, 미량의 DNA 시료를 사용하여 데옥시리보핵산 (이하, "DNA"라 칭함) 라이브러리를 고정화한 오리지널 기체(基體)의 작제 방법, 그의 레플리카를 작제하는 방법, 및 DNA 단편을 고정화한 기체에 관한 것이다.
종래 기술에 있어서는, DNA를 실험하는 경우, DNA가 매우 중요한 시료이기 때문에, DNA를 폴리머라제 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction, 이하, "PCR"이라 칭함)을 이용하여 증폭시키고 이를 소분하였다. DNA 시료는 극저온에서 냉동고에 보관하였다. 종래 기술에서는, DNA 라이브러리를 용액 상태로 제조하여, DNA 라이브러리의 레플리카는 제조될 수 없었다.
따라서, 미량의 조직 또는 세포로부터 얻어진 용액 상태의 DNA 라이브러리 시료는, 그의 유전자를 연구 및 진단하기 위하여 매우 조심스럽게 다루어야 하였다. 본 발명의 목적은, 미량의 DNA 라이브러리 시료를 이용하여 DNA 라이브러리를 고정화한 DNA 라이브러리 기체 (오리지널 기체)를 작제하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 필요한 수의 레플리카 지지체의 작제 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 레플리카 DNA 단편을 고정화한 기체를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 cDNA (상보성 DNA) 라이브러리 작제 방법은 기체상의 올리고 (dT)n에 mRNA (메신저 리보스핵산, 이하, "mRNA" 라 함)를 혼성화시킨 후, RT (역전사효소, 이하, "RT" 라 함)를 작용시켜 상보적인 DNA 를 고정화시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 cDNA 라이브러리 작제방법은, 기체상에 고정화한 cDNA 라이브러리로부터 mRNA 를 탈혼성화시켜 그 mRNA 를 이용하여 상기 cDNA 라이브러리와 동일한 cDNA 라이브러리를 고정화시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 gDNA (게놈-DNA) 라이브러리 작제방법은, 제한효소부위를 가진 기체상의 올리고뉴클레오티드에 이중가닥 gDNA 라이브러리를 라이게이션시킨 후, gDNA 라이브러리를 고정화시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 단일 가닥 gDNA 라이브러리 작제방법은, 청구항 3 에서 작제한 기체상에 고정화된 gDNA 라이브러리의 센스부분을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 단일가닥 gDNA 라이브러리 작제방법은, 청구항 3 에서 작제한 gDNA 라이브러리의 안티센스부분을 탈혼성화시킨 후, 그 안티센스 부분을 이용하여 기체상에 센스부분을 합성고정화시키는 것을 특징으로 한다.
청구항 1 ∼ 5 항중 어느 한 항의 본 발명에 따른 방법에 있어서, 기체를 미리 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드로 화학수식시킨 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 기체는 청구항 1 ∼ 6 항중 어느 한 항의 방법에 의해 작제한 DNA 라이브러리를 고정화한 것임을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 기체는 단일 가닥 DNA 라이브러리를 고정화한 것임을 특징으 로 한다.
발명을 실시하기
위한
최량의
형태
오리지널 기체 또는 레플리카 기체를 작제하기 위해서는, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 화학수식만을 실시한 오리지널용 기체 1 장과 복제용의 레플리카용 기체 복수장을 제조한다. 그리고, 이들의 기체를 레플리카 작제 장치에 설치한다. 본 발명의 DNA 라이브러리 기체 작제장치를 첨부한 도면을 이용하여 설명한다. 도 1 은 cDNA 라이브러리 기체 작제장치의 개략도이다. 도 2 는 gDNA 라이브러리 기체 작제장치의 개략도이다. 도 3 은 cDNA 라이브러리 기체 작제의 수순을 도시한 플로우차트이다. 도 5 는 gDNA 라이브러리 기체 작제의 수순을 도시한 플로우차트이다.
도 1 은 cDNA 라이브러리 기체의 작제 및 복제를 자동적으로 실행할 수 있는 장치의 개략도를 나타낸다. 도 1 에 있어서, DNA 라이브러리 기체 작제장치 (A) 에는 반응액 등을 용기에 송액하기 위한 송액수단 (105) 과, 반응액을 바꾸어 송액하기 위한 송액전환수단 (220) 과, 시료 주입방출용 노즐 (101) 을 평면내의 전후좌우방향이나 상하방향 등으로 구동시킬 수 있는 노즐구동수단 (100) 과, 기체가 들어간 용기를 지지하기 위한 용기 지지수단 (10) 과, 상기 용기중의 반응액을 가열 냉각하는 용기액온도제어수단 (30) 과, 각각의 고정화 DNA 라이브러리 기체의 작제를 위한 각각의 시료나 시약 등이 들어간 용기를 지지하기 위한 시약용기 지지수단 (20) 과, 상기 시약용기 지지수단을 소정온도로 유지하기 위한 시약용기 온도 제어수단 (40) 등이 구비되어 있다. 용기 지지수단 (10) 은, 장래 PCR 장치와의 접속이나 PCR 산물 해석 장치와의 접속 등을 고려하여, 96 개 또는 이 이상의 시료용기를 유지할 수 있도록 한 것이 바람직하다. 시약 용기 지지수단 (20) 은 레플리카 작제에서는 4개 이상의 시료용기 삽입구멍을 포함하는 것이 바람직하다. 또, 시약용기 지지수단 (20) 에 제공된 용기삽입구멍의 수는 장래의 PCR 장치와의 접속이나 PCR 산물 해석 장치와의 접속 등을 고려하면, 10 개 이상 형성되어 있는 것이 바람직하다. 용기 지지수단 (10) 이나 시료용기 지지수단 (20) 은, 예컨대 펠체소자 등을 이용한 용기액온도제어수단 (30) 이나 시약용기 온도제어수단 (40) 으로 온도제어하는 것을 고려하여 열전도율이 좋은 알루미늄 블록인 것이 바람직하다.
DNA 라이브러리 기체를 작제하기 위한 기체 (기체) 은, 오리지널 기체 및 레플리카 기체 모두 판상, 구체, 입방체, 입자상 등의 형태인 것이 바람직하다. 또한, 그 재질을 특별히 지정하는 것은 아니지만, 반응액 등과 반응하지 않는 것 또는 DNA 고정화 반응에 대한 장해물질이 석출되지 않는 것이 바람직하다. 예컨대 플라스틱, 유리, 실리콘, 금속 등이 바람직한 재료이며, 그 형상은 판상, 구체, 입방체 등이 바람직하다. 특히 다이아몬드, 다이아몬드를 포함하는 탄소원자 등으로 형성된 기체가 바람직하다.
(cDNA 라이브러리의 오리지널 기체 및 그 레플리카 기체의 작제)
도 1, 도 3 을 참조하면서 cDNA 라이브러리를 고정화시킨 오리지널 기체 및 그 레플리카 기체를 작제하는 수순을 설명한다. 먼저, 올리고(dT)n (n은 15 ∼ 30) 를 화학수식한 3 ㎜ ×3 ㎜ ×0.1 ㎜ 크기의 기체를 작제하고자 하는 매수 (T1 ∼ Tn) 만큼 준비한다. 이들 기체는 올리고 (dT)n 에 대한 화학수식만이 되어 있는 기체 (화학수식 기체) 으로, 아직 DNA 라이브러리는 고정화되어 있지 않다. 올리고 (dT)n 가 화학수식된 기체를 이용하는 이유는, 화학수식된 기체상에는 용이하게 전체 RNA (total RNA) 내의 mRNA 가 혼성화되기 때문이다. 그리고, 이들 기체를 용기 (CB1 ∼ CBn) 내에 삽입하여, 그 용기를 용기 지지수단 (10) 에 설치한다. 이 경우, 1 용기당 1 장 삽입하는 것이 소량의 검체시료에서 얻어지는 극미량의 mRNA 를 이용하여 고정화 cDNA 라이브러리의 오리지널 기체 및 그 레플리카 기체를 확실하게 작제한다는 관점에서 바람직하다. 화학수식 기체를 삽입한 용기 (CB1 ∼ CBn) 를 용기 지지수단 (10) 에 설치하는 순서는, 첫번째의 삽입부 (HT1) 에 오리지널 기체용의 화학수식 기체 (T1) 이 들어간 용기 (CB1) 를 놓고, 두번째 이후의 삽입부 (HT2 ∼ HTn) 에 필요한 매수의 레플리카 기체용의 화학수식 기체 (T2 ∼ Tn) 이 들어간 용기 (CB2 ∼ CBn) 를 순차적으로 정렬하여 나열한다.
(오리지널 기체의 작제)
먼저, 소정온도 (예컨대 4℃) 로 유지한 시약 용기 지지수단 (20) 에, 정제된 전체 RNA 용액 (201) 과 역전사 효소용액 (202) 과, 뉴클레오티드 (dT, dA, dG, dC) 를 함유하는 반응액 (203) 등을 설치한다. 또, DNA 의 세정·용출용의 TE 용액 (트리스-에틸렌-디아민-테트라아세트산, 이하, "TE"라고 함; 204), 폐액조 (210) 등을 설치하고, 각각의 용액을 송액하기 위한 용액유로로서의 캐필러리관 (230) 을 송액전환수단 (220) 에 접속한다. 캐필러리관 (230) 은 액체 크로마 토그래피용의 내부식성의 스테인레스관 등을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 송액수단 (105) 을 통과하여 시료주입방출용 노즐 (101) 을 송액전환수단 (220) 과 접속하는 데는 실리콘 튜브 (231) 를 이용하는 것이 바람직하다. 다음에, 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 지지수단 (10) 의 HT1 의 위치로 이동시켜 1번째의 기체 (T1) 이 들어간 용기 (CB1) 중에 노즐 (101) 을 삽입한다. 송액전환수단 (220) 을 반응액 (203) 측에 설정하고, 송액수단인 송액수단 (105)을 구동하여 반응액을 용기 (CB1) 에 주입한다. 송액전환수단 (220) 을 전체 RNA 용액 (201) 으로 전환하여, 소정량을 송액수단 (105) 으로 주입한다. 소정온도 (예컨대 20℃) 이하에서 일정시간 (예컨대 20 ∼ 30분간) 동안 가만히 놓아둔 후에, 송액전환수단 (220) 을 역전사 효소용액 (효소 1; 202) 으로 전환하여, 소정량을 송액수단 (105) 으로 주입한다. 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10)의 온도를 소정온도 (예컨대 약 42℃) 로 하여, 일정시간 (예컨대 30 ∼ 60분간) 가만히 놓고, mRNA 로부터 cDNA 를 작제시키는 역전사효소반응을 진행한다. 그 후, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 소정온도 (예컨대 20℃) 이하로 한 후에, 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 에 삽입하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 용기 (CB1) 내에 있는 반응액을 폐액조 (210) 으로 배출한다. 송액전환수단 (220) 을 TE 용액 (204) 측으로 전환하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량의 TE 용액 (204) 을 용기 (CB1) 내에 주입하고, 그 후 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (210) 측으로 전환하여, 용기 (CB1) 내의 TE 용액을 폐액조 (210) 으로 배출한다. 상기의 조작을 수회 (5 회 이상이 바람직함) 반복하여, 오리지널의 cDNA 라이브러리 기체의 작제를 완료한다. 이 단계에서는, 고정화 cDNA 라이브러리 작제에 이용된 mRNA 는, 아직 DNA 에 혼성화된 상태로 유지되고 있다. 다음에, 고정화 cDNA 라이브러리에 혼성화되어 있는 mRNA 를 탈혼성화시켜 분리용출하기 위해, 송액전환수단 (220) 을 TE단계 (204) 측으로 전환하여 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량의 TE 용액 (204) 을 용기 (CB1) 에 주입한다. 용액온도제어수단 (30) 을 구동시켜 용기 지지수단 (10) 의 온도를 소정온도 (예컨대 90℃) 로까지 상승시켜, mRNA 를 혼성화시킨다. 그 후, 송액전환수단 (220) 을 mRNA 에 대한 일시보류용기 (206)측으로 전환하고, 송액수단 (105) 를 구동하여 탈혼성화된 mRNA 용액을 상기 일시보류용기 (206) 로 이동시킨다.
(레플리카 기체의 작제)
다음에, 상기의 방법에 의해 작성한 오리지널의 cDNA 라이브러리 기체로부터 탈혼성화된 mRNA 를 재이용하여, 그 레플리카 기체를 작제하는 방법을 설명한다. 먼저, 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 그 노즐 (101) 을 다음의 레플리카용 기체 (T2)이 들어간 용기 (CB2) 로 이동시키고, 송액수단 (105) 을 역방향으로 구동시켜 일시보류한 mRNA 용액 (206) 을 용기 (CB2) 에 주입한다. 그 후, 상기의 오리지널 기체의 작제방법에서 설명한 공정을 반복한다. 단, 후반의 전체 RNA 용액 (201) 의 주입공정은 일시보류한 mRNA 의 주입공정으로 바뀌기 때문에 생략할 수 있다. 즉, 이 용기 (CB2) 에 송액전환수단 (220) 을 반응액 (203) 측으로 설정하고, 송액수단인 송액수단 (105) 을 구동하여 반응액을 용기 (CB2) 에 주입한다. 소정온도 (예컨대 20℃) 이하에서 일정시간 (예컨대 20 ∼ 30분간) 동안 가만히 놓아둔 후에, 송액전환수단 (220) 을 역전사 효소용액 (효소 1 ; 202) 측으로 전환하여, 소정량을 송액수단 (105) 으로 주입한다. 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB2) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10)의 온도를 소정온도 (예컨대 약 42℃) 로 하여, 일정시간 (예컨대 30 ∼ 60분간) 가만히 놓는다. 용기 지지수단 (10) 의 온도를 실온 (20℃) 이하로 한 후에, 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB2) 에 삽입하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 용기 (CB2) 내에 있는 반응액을 폐액조 (210) 으로 배출한다. 송액전환수단 (220) 을 TE 용액 (204) 측으로 전환하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량의 TE 용액 (204) 을 용기 (CB2) 내에 주입하고, 그 후 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (210) 측으로 전환하여, 용기 (CB2) 내의 TE 용액을 폐액조 (210) 으로 배출한다. 상기의 조작을 수회 (5 회 이상이 바람직함) 반복한다. 이와 같이 하여 오리지널의 cDNA 라이브러리 기체를 복제한 1장째의 레플리카 기체가 작제된다. 상기의 레플리카 기체 작제를 위한 사이클릭한 조작을 필요 회수 반복하여 필요로 하는 매수의 레플리카 기체를 작제한다. 도 2 는 gDNA 라이브러리 기체의 작제과 복제를 자동적으로 실행할 수 있는 장치의 개략을 도시한다. 도 2 의 DNA 라이브러리 기체 작제장치에는 반응액 등을 용기에 송액하기 위한 송액수단 (105) 과, 반응액을 전환하여 송액하기 위한 송액전환수단 (220) 과, 시료 주입방출용 노즐 (101) 을 평면내의 전후좌우방향이나 상하방향 등으로 구동시킬 수 있는 노즐구동수단 (100) 과, 기체가 들 어간 용기를 지지하기 위한 용기 지지수단(10) 과, 상기 용기중의 반응액을 가열냉각하는 용기액 온도제어수단 (30) 과, 고정화 DNA 라이브러리 기체의 작제를 위한 시료나 시약 등이 들어간 용기를 지지하기 위한 시약용기 지지수단 (20) 과, 상기 시약용기 지지수단을 소정온도로 지지하기 위한 시약용기온도제어수단 (40) 등을 구비되어 있다. 용기 지지수단 (10) 은 장래의 PCR 장치와의 접속이나 PCR 산물해석장치와의 접속 등을 고려하여, 96 개 또는 그 이상의 시료용기를 삽입할 수 있도록 한 것이 바람직하다. 시약 용기 지지수단 (20) 은 레플리카 작제에서는 4개 이상의 시료용기 삽입구멍이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또, 시약용기 지지수단 (20) 에 형성된 용기삽입구멍의 수는 장래의 PCR 장치와의 접속이나 PCR 산물 해석장치와의 접속 등을 고려하면, 10 개 이상 형성되어 있는 것이 바람직하다. 용기 지지수단 (10) 이나 시료용기 지지수단 (20) 은, 예컨대 펠체소자 등을 이용한 용기액온도제어수단 (30) 으로 온도제어하는 것을 고려하여 열전도율이 좋은 알루미늄제가 바람직하다.
(gDNA 라이브러리의 오리지널 기체 및 그 레플리카 기체의 작제)
도 2, 도 5 를 참조하여 gDNA 라이브러리를 고정화시킨 오리지널 기체 및 그 레플리카 기체를 작제하는 경우를 설명한다. 먼저, 제한효소부위소유의 올리고뉴클레오티드 (센스부분) 를 화학수식한 기체 (그 크기는 예컨대, 3 ㎜ ×3 ㎜ ×0.1 ㎜) 을 작제하고싶은 매수 (T1 ∼ Tn) 로 준비한다. 오리지널 기체 (T1) 에 대해서는 그 올리고뉴클레오티드 (안티센스 부분) 를 혼성화시킨 후에, 제한효소처리를 실행하여 완전한 제한효소부위를 미리 만들어 놓는다. 오리지널 기체 (T1) 을 삽입한 용기 (CB1) 와, 제한효소부위소유의 올리고뉴클레오티드 (센스부분) 를 화학수식한 화학수식기체 (레플리카용 기체) (T2 ∼ Tn) 을 용기 (CB2 ∼ CBn) 내에 삽입하여 용액지지수단 (10) 에 설치한다. 그 설치순서는 첫번째의 삽입부 (HT1) 에 오리지널 기체 (T1)이 들어간 용기 (CB1) 를 놓고, 두번째 이후에 필요 매수의 레플리카용 기체가 들어간 용기 (CB2 ∼ CBn) 을 순차적으로 정렬하여 나열한다. 소정온도 (예컨대 4℃) 로 고정된 시약용기 지지수단 (20) 에, 정제된 제한효소처리가 완료된 gDNA 라이브러리 용액 (306) 과, DNA 리가제 (Ligase) 용액 (효소 1 ; 305) 과, DNA 폴리머라제 (Polymerase) 용액 (효소 2 ; 302) 과, 뉴클레오티드 (dT, dA, dG, dC) 를 함유하는 반응액 (303) 등을 설치한다. 또, DNA 의 세정·용출용의 TE 용액 (트리즈마베이스와 EDTA 를 함유하는 완충액 ; 304) 과, 폐액조 (310) 등을 설치하고, 각각의 용액의 용액유로로서의 캐필러리관 (330) 을 송액전환수단 (220) 에 접속한다. 그 캐필러리관 (230) 은 액체크로마토그래피용의 내부식성 스테인레스관을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 캐필러리관 (230) 의 끝에는, 송액수단 (105) 을 통하여 송액전환수단 (220), 시료주입방출용 노즐 (101) 등을 접속한다. 그 접속에는 실리콘 튜브 (231) 를 이용하는 것이 바람직하다. 시료 주입방출용 노즐 (101) 을 용기 지지수단 (10) 의 HT1 의 위치로 이동시켜 첫번째의 기체 (T1) 이 들어간 용기 (CB1) 중에 노즐 (101) 을 삽입한다. 송액전환수단 (220) 을 반응액 (303) 측에 설정하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량 (예컨대 17㎕) 의 반응액 (303) 을 용기 (CB1) 에 주입한다. 송액전환수단 (220) 을 제한효소처리된 gDNA 라이브러리 용액 (306) 측으로 전환하고, 소정량 (예컨대 2 ㎕) 을 송액수단 (105) 으로 주입한다. 소정온도 (예컨대 20℃) 이하에서 일정시간 (예컨대 20 ∼ 30분간) 동안 가만히 놓아둔 후에, 송액전환수단 (220) 을 DNA 리가제 용액 (효소 1 ; 305) 측으로 전환하고, 소정량 (예컨대 1 ㎕) 을 송액수단 (105) 으로 용기 (CB1) 내에 주입한다. 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 소정온도 (예컨대 37℃) 로 하고, 일정시간 (예컨대 30 ∼ 60 분간) 가만히 놓아둔 후, DNA 리가제에 의한 고정화된 gDNA 라이브러리를 기체 (T1) 상에 작제한다. 용기 지지수단 (10) 의 온도를 소정온도 (예컨대 20℃ 이하) 로 한 후에, 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (310) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 내에 삽입하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 CB1 내의 반응액을 배출한다. 송액전환수단 (220) 을 TE 용액 (304) 측으로 전환하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량 (예컨대 500 ㎕) 의 TE 용액을 용기 (CB1) 내에 주입하고, 그 후 송액전환수단 (220) 을 폐액조 (310) 측으로 전환하고, 용기 (CB1) 내의 TE 용액을 배출한다. 이 조작을 수회 (예컨대 5 회 이상) 반복하여 고정화 기체 (T1) 을 세정한다. 고정화 기체 (T1)의 세정후, 송액전환수단 (220) 을 반응액 (303) 측으로 전환하고, 송액수단 (105) 을 구동하여 소정량 (예컨대 19 ㎕) 의 반응액을 용기 (CB1) 내에 주입한다. 다음에, 용기 지지수단 (10) 을 소정온도 (예컨대 90℃) 로 상승시키고, 일정시간 (예컨대 10 ∼ 20분간) 가만히 놓아둠으로써, 고정화 gDNA 라이브러리 (센스와 안티센스의 2 개 사슬) 로부터 안티센스부분을 탈혼성화시킨 후에, 송액전환수단 (220) 을 gDNA 라이브러리 (안티센스부 분) 를 일시보류하는 용기 (306) 측으로 전환하고, 송액수단 (105) 을 구동시켜, gDNA 라이브러리 (안티센스부분) 용액을 용기 (CB1) 로부터 방출한다. 이 단계에서 1 장째의 gDNA 라이브러리 (센스부분)·기체 (오리지널·기체)이 작제완료된다.
(레플리카 기체의 작제)
시료주입방출용 노즐 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 노즐 (101) 을 다음의 레플리카용 기체 (T2)이 들어간 용기 (CB2) 로 이동시키고, 일시보류한 gDNA 라이브러리 (안티센스부분) 용액 (306) 을 그 용기 (CB2) 에 주입한다. 상기의 레플리카 기체 작제를 위한 상기의 사이클릭한 조작을 필요 회수 반복하여 필요로 하는 매수의 레플리카 기체를 작제한다. 그러나, 하기에 설명하는 실시예 2 에서는, 레플리카 작제 단계에서, DNA 폴리머라제 용액 (효소 2 ; 302) 측으로 전환하여, 소정량 (예컨대, 1㎕) 을 송액수단 (105) 로 용기 (CB2) 내에 주입하는 점에 주의한다.
실시예
실시예 1
도 1, 도 3, 도 4 를 참조하면서 오리지널의 고정화 cDNA 라이브러리 기체 및 그 레플리카 기체의 작제에 대하여 설명한다. 먼저, 시료의 전처리로서 ① 세포·조직의 파괴 및 ② 전체 RNA 의 정제를 함으로써 시료를 준비하였다 (도 3 의 S1). 즉, 고정화 cDNA 라이브러리 기체 작제를 위한 시료의 전처리 단계로 서, 약 5㎜ 각의 래트 간 조직을 시판하는 시약 키트 ISOGEN (주식회사 닛뽕진 제조) 중에서 균질화하고, 이하 그의 프로토콜에 따라 전체 RNA 를 정제하였다. 또, 올리고 (dT)n (n 은 15 ∼ 30) 의 화학수식만을 한 3 ㎜ ×3 ㎜ ×0.1 ㎜ 크기의 기체를 10 장 (T1 ∼ T10) 준비하였다 (도 3 의 S2). 이 고정화는, 표면에 아미노기를 부가한 기체 (T1 ∼ T10) 을 활성화시킨 2가 카르복실산 용액으로 처리하고, 에탄올·증류수로 순차적으로 세정한 후, 그 기체를 올리고 (dT)n 수용액중에 넣어 실온에 10분간 유지하였다. 그 후 이들 기체 (T1 ∼ T10) 을 1장씩 각각 따로따로 용기 (CB1 ∼ CB10) 내에 삽입하여, 용기 (CB1 ∼ CB10) 를 온도제어용기용 알루미늄 블록 (10) 에 설치하였다. 다음에, 4℃ 로 고정된 저온시료용 알루미늄 블록 (20) 내에 정제한 전체 RNA 용액 (201) 과 역전사 효소용액 (202), 뉴클레오티드 (dT, dA, dG, dC) 를 함유하는 반응액 (203) 을 설치하였다. 또, 저온시료용 알루미늄 블록 (20) 외에, DNA 의 세정용의 TE 액 (트리즈마베이스와 EDTA 를 포함하는 완충액 ; 204) 및 폐액조 (210) 를 설치하였다. 그리고, 전체 RNA 용액 (201), 역전사 효소용액 (202), 반응액 (203), TE 액 (204), 폐액조 (210) 를 캐필러리관 (230) 으로 자동형 팔방 전환밸브 (220) 에 접속하였다. 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 온도제어용기용 알루미늄 블록 (10) 의 HT1 의 위치로 이동시켜, 1 번째의 기체 (T1)(오리지널 기체) 이 들어간 용기 (CB1) 내에 캐필러리침 (101) 을 삽입하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 반응액 (203) 측에 설정하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 17 ㎕ 의 반응액을 용기 (CB1) 에 주입하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 전체 RNA 용액 (201) 으로 전환하고, 그 2 ㎕ 를 펠리스타형 펌프 (105) 로 주입하고, 기체 표면상에 고정화한 올리고 (dT)n 와 전체 RNA 용액중의 mRNA 를 혼성화시키기 위해 20℃에서 20분간 가만히 놓아 두었다 (도3의 S3 및 도4a참조). 가만히 놓아둔 후, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 역전사 효소용액 (202) 측으로 전환하여, 역전사 효소용액 (202) 의 1㎕ 를 펠리스타형 펌프 (105) 로 주입하였다. 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 42℃ 로 하여, 30 분동안 가만히 놓고, 역전사효소에 의해 기체 (T1) 상에 고정화한 cDNA 라이브러리 (고정화 기체) 를 작제하였다 (도 3 의 S4 및 도 4b 참조). 용기 지지수단 (10) 의 온도를 다시 20℃ 로 한 후에, 자동형 팔방 전환밸브 (220) 를 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에 삽입하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 용기 (CB1) 내에 있는 반응액을 폐액조 (210) 로 배출하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 TE 액 (204)측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 500㎕ 의 TE 액 (204) 을 용기 (CB1) 내에 주입하고, 그 후 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 용기 (CB1) 내의 TE 액을 폐액조 (210) 로 배출하였다. 이 조작을 수회 (5회 이상) 반복하여 고정화 기체 (T1) 을 세정하였다 (도 3 의 S5). 고정화 기체 (T1) 의 세정후, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 반응액 (203) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 19 ㎕ 의 반응액 (203) 을 용기 (CB1) 내에 주입하였다. 다음에, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 90℃ 로 상승시켜 10분간 가만히 놓아둠으로써, 고정화 cDNA 라이브러리로부터 mRNA 를 탈혼성화시켰다 (도 3 의 S6 및 도 4d 참조). 다음에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 mRNA 를 일시보류하는 용기 (206) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동시켜, 탈혼성화한 mRNA 용액을 용기 (CB1)로부터 분리방출하여 용기 (206) 에 일시보류하였다 (도 3 의 S7). 이상의 공정에 의해 cDNA 라이브러리를 고정화한 1 장째의 cDNA 라이브러리 기체 (오리지널 기체) 을 작제하였다 (도 3 의 S8 및 도4c 참조). 다음에, 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 캐필러리 침 (101) 을 다음의 레플리카용 기체 (T2) 이 들어간 용기 (CB2) 로 이동시켰다. 레플리카용 기체 (T2) 에는 미리 상술한 화학수식이 실시되어 있는 것을 사용하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 일시보류용기 (206)측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여, 19 ㎕ 의 일시보류 mRNA 용액을 용기 (CB2) 중에 주입하였다 (도4d 로부터 (a) 로의 화살표 "R" 참조). 다음에, 고정화 올리고 (dT)n 와 mRNA 의 혼성화를 위해, 20℃ 에서 20분간 가만히 놓아둔 후에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 역전사 효소용액 (202) 측으로 전환하고, 역전사 효소용액 (202) 1㎕ 을 펠리스타형 펌프 (105) 로 용기 (CB2) 중에 주입하였다 (도 3 의 S9). 시료 주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB2) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 42 ℃로 하고, 30 분동안 가만히 놓아둔 후, 역전사효소에 의해 기체 (T2) 상에 고정화한 cDNA 라이브러리를 작제하였다 (도 3 의 S10 및 도 4b 참조). 용기 지지수단 (10) 의 온도를 다시 20℃ 로 한 후에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB2) 에 삽입 하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 용기 (CB2) 내에 있는 반응액을 폐액조 (210) 로 배출하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 TE 액 (204) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 500 ㎕ 의 TE 액 (204) 을 용기 (CB2) 내에 주입하고, 그 후 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (210) 측으로 전환하여, 용기 (CB2) 내의 TE 액(204) 을 용기 (CB2) 내에 주입하고, 그 후 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (210) 측으로 전환하고, 용기 (CB2) 내의 TE 액을 배출하였다. 이 조작을 5 회 반복하여 고정화 기체 (T2) 을 세정하였다 (도 3 의 S11). 고정화 기체 (T2) 의 세정 후, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 반응액 (203) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 19 ㎕ 의 반응액 (203) 을 용기 (CB2) 내에 주입하였다. 다음으로, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 90℃로 상승시키고 10분간 가만히 놓아둠으로써 고정화 cDNA 라이브러리로부터 mRNA 을 탈혼성화시켰다 (도 3 의 S12). 다음에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 mRNA 를 일시보류하는 용기 (206) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동시켜 탈혼성화한 mRNA 용액을 용기 (CB2) 로부터 분리방출하고 (도4d 참조), 용기 (206) 에 일시보류하였다 (도3의 S13). 이상의 공정에 의해, 복제 cDNA 라이브러리 기체 (레플리카 기체) 을 작제하였다 (도 3 의 S14 및 도 4c 참조). 기체 (T3 ∼ T10) 이 들어간 용기 (CB3 ∼ CB10) 에 대해서도 동일한 방법으로 상기 조작 (S9 ∼ S14) 을 순차적으로 반복하여 다시 8 장의 레플리카 기체를 순차적으로 작제하였다. 래트 간조직세포의 cDNA 라이브러리를 고정화시킨 기체 (T1 ∼ T10) 을 이용하여 18S rRNA 에 대한 PCR 장치로 유전자증폭을 실행하고, 전기영동장치를 이용하여 cDNA 라이브러리가 고정화되어 있는 것을 확인하였다. 그 결과, 오리지널 기체 (T1) 및 레플리카 기체 (T2 ∼ T10) 모두 정상인 cDNA 라이브러리 기체로 작제되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2
도 2, 도 5, 도 6, 도 7 을 참조하면서 오리지널의 고정화 gDNA 라이브러리 기체 및 그 레플리카 기체의 작제에 대하여 설명한다. 먼저, 시료의 전처리로서 ① 세포·조직의 파괴 및 ② 염색체 DNA (gDNA) 의 정제·제한효소처리를 하여 시료를 준비하였다 (도 5 의 S21). 또, 기체상에 목적제한효소부위의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드의 센스부분을 화학수식한 기체를 10 장을 준비하였다. 크기는 대략 3 ㎜ ×3 ㎜ ×0.1 ㎜ 의 것이다 (도 5 의 S22). 이 기체를 개념적으로 나타낸 것이 도6d 의 파선으로 둘러싸인 부분으로 나타낸 기체 (f) 이다. 그 부분을 확대하여 나타낸 것이 도 7 이다. 다음에, 상기의 화학수식한 기체 중의 1개를 이용하여, 그 올리고뉴클레오티드의 안티센스 부분을 혼성화시킨 후에 제한효소처리를 하여 완전한 제한효소절단부위를 가진 기체 (T1) 을 1 개 작제하였다 (도 5 의 S23 및 도6d 로부터 (a) 로의 화살표① 참조). 이 기체를 개념적으로 나타낸 것이 도 6a 의 파선으로 둘러싸인 부분으로 나타낸 기체 (e) 이다. 그 부분을 확대하여 나타낸 것이 도 8 이다. 상기 기체 (T1) 을 삽입한 용기 (CB1) 와, 상기 제한효소부위를 소유한 올리고뉴클레오티드의 센스부분만을 화학수식한 기체 9 장 (T2 ∼ T10) 을 각각 삽입한 용기 (CB2 ∼ CB10) 를 용기 지지수단 (10) 에 설치하였다. 다음에, 도 2 에 도시한 바와 같이 4℃로 고정된 저온시료용 알루미늄 블록 (20) 내에, 정제한 제한효소처리가 완료된 gDNA 라이브러리 용액 (306), DNA 용액 (효소 1 ; 305), DNA 폴리머라제 용액 (효소 2 ; 302), 뉴클레오티드 (dT, dA, dG, dC) 를 함유하는 반응액 (303) 을 설치하였다. 또, 저온시료용 알루미늄 블록 (20) 외에, DNA 의 세정·용출용의 TE 액 (304), 폐액조 (310) 를 설치하였다. 그리고, 도 2 에 도시한 바와 같이 gDNA 라이브러리 용액 (306), DNA 리가제 용액 (효소 1 ; 305), DNA 폴리머라제 용액 (효소 2 ; 302), 뉴클레오티드 (dT, dA, dG, dC) 를 함유하는 반응액 (303), DNA 의 세정·용출용의 TE 액 (304), 폐액조 (310) 를 캐필러리관 (230) 으로 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 에 접속하였다. 시료 주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 온도제어용기용 알루미늄 블록 (10) 의 HT1 의 위치로 이동시켜, 1 번째의 기체 (T1 ; 오리지널 기체) 이 들어간 용기 (CB1) 내에 캐필러리 침 (101) 을 삽입하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 반응액 (303) 측에 설정하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 17 ㎕ 의 반응액(303)을 용기 (CB1) 에 주입하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 제한효소처리된 gDNA 라이브러리 용액 (306) 측으로 전환하고, 그 2 ㎕ 를 펠리스타형 펌프 (105) 로 주입하였다. 20℃ 에서 20분간 가만히 놓아 둔 후에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 DNA 리가제 용액 (효소 1 ; 305) 측으로 전환하여 그 1㎕ 을 펠리스타형 펌프 (105) 로 용기 (CB1) 내에 주입하였다. 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 용기 지지수단 (10) 의 온도를 37℃ 로 하고, 30 분동안 가만히 놓아두어, DNA 리가제에 의해 고 정화된 gDNA 라이브러리를 기체 (T1) 상에 작제하였다 (도 5 의 S25 및 도 6의 (a) 로부터 (b) 로 이행하는 공정 화살표 ② 참조). 용기 지지수단 (10) 의 온도를 20℃ 로 한 후에, 자동형 팔방 전환밸브 (220) 를 폐액조 (310) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에 삽입하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 용기 (CB1) 내의 반응액을 배출하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 TE 액 (304) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 500㎕ 의 TE 액을 용기 (CB1) 내에 주입하고, 그 후 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (310) 측으로 전환하여, 용기 (CB1) 내의 TE 액을 배출하였다. 이 조작을 5 회 이상 반복하여 기체 (T1) 을 세정하였다 (도 5 의 S26). 기체 (T1) 세정후, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 을 반응액 (303) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 19 ㎕ 의 반응액을 용기 (CB1) 내에 주입하였다. 온도제어용기용 알루미늄 블록 (10) 의 온도를 90℃ 로 상승시켜, 10분동안 가만히 놓아둠으로써 센스와 안티센스의 이중 가닥으로 이루어지는 고정화 gDNA 라이브러리로부터 안티센스부분을 탈혼성화시켰다 (도 5 의 S27 및 도 6 의 (b) 로부터 (c) 로 이행하는 공정 화살표 ③ 참조). 그리고, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 일시보류하는 용기 (306) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동시켜, 안티센스 부분의 gDNA 라이브러리 용액을 용기 (CB1) 로부터 방출하였다 (도 5 의 S29, 및 도 6 의 (b) 로부터 (d) 로의 이행 화살표 (액) 참조). 또한, 기체 (T1) 상에는 센스부분만이 고정화된 1 장째의 단일 가닥 gDNA 라이브러리 기체 (T1 ; 오리지널 기체) 을 작제하였다 (도 5 의 S28 및 도6c 참조). 다음에, 시 료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB1) 에서 꺼낸 후에, 캐필러리 침 (101) 을 다음의 기체 (T2) 가 들어간 용기 (CB2) 로 이동시키고, 20℃로 보온한 용기 (CB2) 에 뉴클레오티드를 함유하는 반응액을 첨가하고, 일시보류한 안티센스 부분만의 gDNA 라이브러리 용액 (306) 을 용기 (CB2) 내에 주입하고, 20분동안 보온하였다 (도 5 의 S30). 다음에, DNA 폴리머라제를 첨가하여 37℃ 로 온도를 올려 1 시간 보온하였다. 그 결과, 기체 (T2) 상에 센스부분이 고정화된 이중 가닥의 gDNA 라이브러리가 작제되었다 (도 5 의 S31 및 도 6 의 (d) 로부터 (b)로 이행하는 공정 화살표 ④ 참조). 다음에, 상기 이중 가닥의 gDNA 라이브러리가 고정화된 기체 (T2) 이 삽입된 용기 (CB2) 를 20 ℃로 한 후에, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (310) 측으로 전환하고, 시료주입방출용 캐필러리 침 (101) 을 용기 (CB2) 내에 삽입하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 CB2 내의 반응액을 배출하였다. 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 TE 액 (304) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 500 ㎕ 의 TE 액을 용기 (CB2) 내에 주입하고, 그 후 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 폐액조 (310) 측으로 전환하고, 용기 (CB2) 내의 TE 액을 배출하였다. 이 조작을 5 회 이상 반복하여 기체 (T2) 을 세정하였다 (도 5 의 S32). 기체 (T2) 의 세정후, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 반응액 (303) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동하여 19 ㎕ 의 반응액을 용기 (CB2) 내에 주입하였다. 알루미늄 블록 (10) 의 온도를 90℃로 상승시켜, 10분 동안 가만히 놓아둠으로써, 센스와 안티센스의 이중 가닥으로 이루어지는 고정화 gDNA 라이브러리로부터 안티센스부분을 탈혼성화시켰다 (도 5 의 S33, 및 도 6 의 (b) 로부터 (c) 로 이행하는 공정 화살표 ⑤ 참조). 그리고, 자동형 팔방 전환 밸브 (220) 를 일시보류하는 용기 (306) 측으로 전환하고, 펠리스타형 펌프 (105) 를 구동시켜, 안티센스 부분의 gDNA 라이브러리 용액을 용기 (CB2) 로부터 방출하였다 (도 5 의 S35, 및 도 6 의 (b) 로부터 (d) 로 이행하는 공정 화살표 (액) 참조). 기체 (T2) 상에 센스부분만이 고정화된 2 장째의 복제품인 단일 가닥 gDNA 라이브러리 기체 (T2 ; 레플리카 기체) 을 작제하였다 (도 5 의 S34, 및 도 6c 참조). 이상과 같은 반복 조작을 실행함으로써, 기체상에 2 개 사슬의 gDNA 라이브러리를 고정화하고, 그 후 2 개 사슬로 이루어지는 고정화 gDNA 라이브러리로부터 안티센스 부분을 탈혼성화시켜 1개 사슬 gDNA 라이브러리 기체 (레플리카 기체) 을 남은 매수 (T3 ∼ T10) 작제할 수 있었다. 즉, 도 6 에 도시한 (b) → (d) →(b) →(d) →…의 공정을 반복함으로써, 기체상에 동일한 1 개 사슬 gDNA 라이브러리를 고정화한 기체 (도 6c 에서 나타냄) 을 몇장이라도 복제할 수 있다.
본 발명의 장치를 이용하면, 발현하고 있는 mRNA 로부터의 cDNA 라이브러리 및 염색체 DNA 의 제한효소처리된 gDNA 라이브러리에 대한 고정화 DNA 기체의 작제가 용이할 뿐만 아니라, 종래의 용액상태에서의 DNA 라이브러리에서는 작제할 수 없었던 이들의 레플리카가 고정화 DNA 기체로서 필요한 매수만큼 (원칙적으로는 mRNA 및 gDNA 가 화학적·물리적으로 분해되지 않는 한 무제한으로 작제 가능) 간단하게 또한 단시간에 작제할 수 있다. 또, 1 회의 배양세포로부터의 소량의 유전자시료의 채취 또는 귀중한 검체조직으로부터의 한 번의 유전자시료의 채취에 의해, 고정화 DNA 라이브러리 기체 및 그 여러장의 레플리카 기체를 작제할 수 있어, 동일 시료에 의한 여러 종류의 유전자연구나 유전자검사를 용이하게 실행할 수 있게 되는 헤아릴 수 없는 이익이 발생하게 된다. 또한, 고정화 DNA 라이브러리 기체 및 그 레플리카 기체의 이용에 의해 장래의 유전자 진단기술의 개발에서의 경비적인 절감이나 대폭적인 자원절약에서의 비약적인 발전이 기대된다. 또, 유전자진단에 사용되는 환자로부터의 한번의 채혈채취나 조직적출수술에서 반영구적인 복수의 고정화 DNA 라이브러리 기체를 작제할 수 있음으로써, 예방의학적인 검사 등에 대한 그 재이용도 간단하게 실행할 수 있게 된다. 이 것은 환자 본인에 대한 정신적 및 경제적인 고통을 최소한에 그치게 할 수 있다는 매우 큰 이점이 있다.
Claims (3)
- 오리지널 기체 및 하나 이상의 레플리카 기체 상에 cDNA 라이브러리를 고정화시키는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:(a) 오리지널 기체의 표면 상에 아미노기를 고정화시키는 단계;(b) 오리지널 기체에 올리고 (dT)n 를 접촉시켜 오리지널 기체 상에 올리고 (dT)n 을 고정화시키는 단계(여기서 n 은 15 내지 30 임);(c) 오리지널 기체를 전체 RNA, 역전사 효소, 및 뉴클레오티드를 포함하는 반응액으로 처리하여 mRNA 로부터 cDNA 를 작제하는 단계;(d) 오리지널 기체를 20 ℃ 의 반응액에 놓아둠으로써 오리지널 기체 상의 올리고 (dT)n 와 전체 RNA 용액내의 mRNA 를 혼성화시키는 단계;(e) 오리지널 기체를 역전사 효소용액으로 처리하고, 오리지널 기체를 역전사 효소와 접촉시켜둠으로써 오리지널 기체 상에 고정화된 cDNA 라이브러리를 작제하는 단계;(f) 오리지널 기체를 세척하고 가열하여 오리지널 기체로부터 mRNA 를 탈혼성화시키는 단계; 및(g) 오리지널 기체를 대신하여 레플리카 기체를 사용하여 상기 (b) 내지 (f) 단계를 반복함으로써 기체 상에 고정화된 레플리카 cDNA 라이브러리를 작제하는 단계.
- 제 1 항에 의해 작제된 DNA 라이브러리를 고정화한 기체로서, 상기 기체가 판상, 구체, 입방체 또는 입자상이며, 플라스틱, 유리, 실리콘, 금속, 다이아몬드 및 탄소원자로 만들어진 기체.
- 단일 가닥 DNA 라이브러리가 고정화된 기체로서, 상기 기체가 판상, 구체, 입방체 또는 입자상이며, 플라스틱, 유리, 실리콘, 금속, 다이아몬드 및 탄소원자로 만들어진 기체.
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