CN112218954A - 用于从样品液体提取核酸的方法和设备 - Google Patents

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西蒙·施米德鲍尔
丹尼尔·格罗德
塞西莉亚·雷布福-舍尔
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Abstract

本发明涉及用于从样品液体(26)提取核酸(22)的方法。该方法包括提供加热元件(10)，和提供是与加热元件(10)结合的提取核酸(14)和/或提供提取核酸(14)使得提取核酸(14)结合至加热元件(10)，其中提取核酸(14)与待从样品液体(26)提取的核酸(22)至少部分互补。该方法还包括使加热元件(10)与样品液体(26)接触，使得待从样品液体(26)提取的核酸(22)至少部分结合至提取核酸(14)，和分离加热元件(10)与样品液体(26)，使得结合至提取核酸(14)的核酸(22)保留在加热元件(10)处。另外，该方法包括使加热元件(10)与反应溶液接触，和将加热元件(10)加热至等于或高于结合至提取核酸(14)的核酸(22)的变性温度的温度。本发明还涉及用于从样品液体(26)提取核酸(22)的设备(24)。

Description

用于从样品液体提取核酸的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于从样品液体提取核酸并且任选地扩增所述核酸的方法和设备。特别地，本发明涉及提取和/或纯化和/或扩增核酸的领域，扩增例如通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。
背景技术
US2002/0127569A1公开了用于通过样品分子所附接的固体支撑物结合样品中的靶多核苷酸的方法。经由捕获探针分子，靶多核苷酸可随后与探针分子一起结合至固体支撑物。在这种情况下，固体支撑物优选由磁性颗粒组成，所述磁性颗粒可以通过磁力从溶液中去除。
US6090592A公开了用于在支撑物上进行核酸杂交和扩增的方法和设备。杂交条件优选由工作站提供，在该工作站可以优选通过开口引入试剂或加热元件。
WO91/14788公开了用于扩增多核苷酸的方法和试剂。在这种情况下，纯化靶序列并且检测PCR产物。靶核酸经由其他分子与固体支撑物结合。对于扩增，将溶液加热至90℃至100℃的温度持续数分钟。
WO93/09250公开了用于扩增和检测患者样品中的靶核酸的测定和方法。在这种情况下，将扩增方法与固定在容器或量油尺上的引物结合使用。
此外，EP1466018B1公开了用于纯化和扩增靶核酸的方法，其中，靶核酸与磁性玻璃颗粒结合。
EP0415978A1公开了用于分析基因的方法，其中，引物与超顺磁性颗粒结合。在这种情况下，介质的温度通过金属块来改变。
WO9010716A1公开了用于分离和鉴定样品中的靶核酸的方法，其中，样品键合至与底物杂交的固体支撑物。通过添加加热的缓冲溶液来加热样品。
从现有技术已知的方法的缺点在于，提取要复制的核酸在大多数情况下非常复杂，并且在可对经提取的核酸进行扩增之前需要大量的时间。
因此，本发明的目的是提供一种方法和设备，通过该方法和设备可以在短时间内和/或以省力的方式提取并任选地扩增核酸。
发明内容
该目的通过具有相应独立权利要求的特征的方法和设备来实现。从属权利要求和以下描述涉及优选的实施方案。
在第一方面，本发明涉及用于从样品液体提取核酸的方法。该方法包括提供加热元件和提供是与加热元件结合的提取核酸，和/或提供提取核酸使得提取核酸结合至加热元件，其中，提取核酸与待从样品液体提取的核酸至少部分互补。该方法还包括使加热元件与样品液体接触，使得待从样品液体提取的核酸至少部分结合至提取核酸，和分离加热元件与样品液体，使得结合至提取核酸的核酸保留在加热元件处。另外，该方法包括使加热元件与反应溶液接触，和将加热元件加热至等于或高于结合至提取核酸的核酸的变性温度的温度。
在另一方面，本发明涉及用于从样品液体提取核酸的设备。该设备包括加热元件，其是与提取核酸键合或连接的和/或被设计以便以这种方式键合或连接至提取核酸，其中，提取核酸与待从样品液体提取的核酸至少部分互补。在这种情况下，加热元件是可加热的，即可将其加热至等于或高于结合至普通周围环境中(如反应溶液中)的提取核酸的核酸的变性温度的温度。样品液体中的变性温度可不同于反应溶液中的变性温度，其中，对于加热元件能够加热至样品液体中的变性温度或以上，这并不是绝对必要的。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的设备用于从样品液体提取核酸的用途。
在本发明的上下文中，术语“核酸”和“寡核苷酸”不仅涵盖(脱氧)核糖核酸或(脱氧)寡核糖核苷酸，即使这些是优选的；它们也涵盖含有在其主链(如膦酸甲酯、硫代磷酸酯或肽核酸(PNA))上、特别是在主链的糖(如2’-O-烷基衍生物、3’-氨基核糖和/或5’-氨基核糖、锁核酸(LNA)、己糖醇核酸、吗啉代、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)或三环-DNA；参见论文“Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”，D.Renneberg和C.J.Leumann,J.Am.Chem.Soc.,2002,第124卷，第5993-6002页，其相关内容通过引用是本公开的一部分)上具有修饰的一种或多种核苷酸类似物的核酸和寡核苷酸，或含有碱基类似物(如7-脱氮嘌呤、或通用碱基诸如硝基吲哚、或经修饰的天然碱基诸如N4-乙基胞嘧啶)的核酸和寡核苷酸。在本发明的一个实施方式中，核酸或寡核苷酸是具有非核苷类似物(如PNA)的缀合物或嵌合体。在本发明的一个实施方式中，核酸或寡核苷酸在一个或多个位置处含有非核苷单元和/或非核苷酸单元诸如间隔子，如六乙二醇或Cn-间隔子，其中n是3至6。如果核酸或寡核苷酸含有修饰，则选择这些修饰使得与天然DNA/RNA分析物的杂交甚至在修饰的情况下是可能的。优选的修饰影响熔融行为，优选熔点，特别是为了能够使在其碱基中具有不同程度的互补性的杂合体之间得以区分(不匹配区分)。优选的修饰包括核酸或寡核苷酸中的LNA、8-氮杂-7-脱氮嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶和/或无碱基断裂或修饰。在本发明的含义内的另外修饰是，例如，使用生物素和/或硫醇和/或硫和/或荧光供体分子和荧光受体分子的修饰。
从样品液体中提取核酸意味着，核酸至少部分与样品液体分离(isolated)，并且优选可以与样品液体分离(separated)。待从样品液体提取的核酸也可以称为靶核酸。因此，特别地，提取核酸可包括将核酸与样品液体分离或用于此类分离。在此过程中，可以设计核酸的提取，使得仅从样品液体提取待提取的核酸，或使得还提取样品液体的其他组分，诸如其他核酸。然而，特别优选地，仅从样品液体提取待提取的核酸，结果特别是样品液体的其他核酸和其他成分也没有被提取，而是保留在样品液体中。优选地，在提取核酸之后，样品液体中被提取的核酸的浓度和/或拷贝数比提取前低，前提是待提取的核酸在提取前实际上存在于样品液体中。优选地经提取的核酸保留在加热元件处意指经提取的核酸保持结合和/或连接和/或附接至加热元件。
在这种情况下，提取核酸与靶核酸至少部分互补意指提取核酸和靶核酸可以经由至少一个碱基对杂交在一起或彼此结合。换言之，在其序列中，提取核酸包含至少一个与靶核酸或待提取的核酸的至少一个碱基互补的碱基。优选地，然而，提取核酸与靶核酸具有更高程度的互补性；即，提取核酸的碱基序列优选不仅在一个碱基中，而是在多个优选连续碱基中与靶核酸碱基序列的一个或多个部分互补。更优选至少5个、甚至更优选至少10个、更优选至少15个、最优选至少20个碱基对(其特别优选连续排列，而无任何其他碱基对排列在中间)与靶核酸的相应序列互补。优选至少1％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、更优选至少20％、甚至更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、特别优选至少60％、相当特别优选至少70％、最优选至少80％和最优选至少90％的提取核酸碱基序列与靶核酸的相应序列互补。根据特别优选的实施方式，提取核酸可以与靶核酸的相应序列基本上完全互补；即，除少数缺陷外，提取核酸碱基序列与靶核酸的相应序列部分完全互补。如果提取核酸包含碱基序列的多个不同部分，例如用于提取靶核酸的提取部分以及用于将提取部分与加热元件间隔开的连接部分(诸如间隔子或间隔子序列)，以上关于提取核酸与靶核酸之间互补性的陈述优选仅涉及提取核酸的提取部分。
就提取期间的选择性而言，提取核酸和靶核酸之间的更高程度的互补性可以提供优势。例如，提取核酸和靶核酸之间的高度互补性可以确保基本上只有靶核酸可以结合至提取核酸，而来自样品液体的其他核酸结合至提取核酸是异常的。另一方面，提取核酸和靶核酸之间的低程度的互补性可以优选地允许来自样品液体的不同核酸结合至提取核酸，结果是当提取核酸仅具有与靶核酸的低程度的互补性时(例如由于未充分了解靶核酸的碱基序列，因此提取核酸不能精确地适配靶核酸)，来自样品液体的其他核酸也可以被提取，和/或靶核酸也可以被提取。
优选地，样品液体的至少一个参数可以适配于允许靶核酸在当前互补程度的情况下与提取核酸杂交。例如，可以增加样品液体中的MgCl2的浓度，以也能够在低互补性的情况下进行杂交，然而优选地，可以降低样品液体中的MgCl2的浓度，以能够仅在特定的更高互补程度以上进行杂交。
样品液体优选是可以包含待提取的核酸以及其他成分的液体。特别地，样品液体可包含不打算也被提取的其他成分。这些其他成分可以包括其他核酸，即具有不同核苷酸序列的核酸。其他成分也可以具有非核苷酸性质的杂质。特别地，样品液体可以是例如人类和/或动物和/或植物和/或其他有机来源的液体。例如，样品液体可以含有以下或由以下组成：血液和/或分泌物和/或身体排泄物和/或粘膜排出物和/或唾液和/或细胞液。优选地，样品液体可以在提取之前经历一种或多种处理，以便至少部分释放样品液体中包含的任何核酸。例如，样品液体可以经过处理以裂解或分解其中包含的任何细胞，以便至少部分地从细胞中释放其中包含的任何核酸，结果是核酸优选在样品液体中游离存在，并且至少部分不被或不再被封闭在细胞核和/或细胞中。优选裂解细胞，使得经释放的核酸至少没有被完全破坏，并且特别地优选完全保留或保持完整。
特别地，样品液体可优选存在，使得不能进行用于复制样品液体中被提取的核酸的扩增反应。例如，样品液体可以具有防止在样品液体中进行扩增反应诸如例如PCR的物理和/或化学和/或生物性质。例如，样品液体可具有防止进行扩增反应的粘度和/或pH和/或盐浓度和/或极性和/或酶和/或蛋白酶，例如因为该目的所需的聚合酶的活性受到抑制，或存在可降解聚合酶的酶，诸如蛋白酶。
提取核酸与加热元件结合意指，提取核酸机械牢固地键合至加热元件，特别是通过化学键和/或静电键机械牢固地键合至加热元件。例如，提取核酸可通过一个或多个硫醇键和/或硫键结合至加热元件的表面。为了该目的，在加热元件的至少一部分表面上，加热元件优选具有允许核酸结合的材料。例如，可以使用镀金的表面，以便经由一个或多个硫醇键和/或硫键将提取核酸和任选的其他核酸与加热元件结合。如果例如两个伴侣(链霉亲和素或生物素)中的一个已经结合至加热元件(优选事前)并且提取核酸连同两个伴侣中的另一个一起经修饰(优选在5’端处)然后从而结合至加热元件，则链霉亲和素-生物素键也可以用于例如将提取核酸和/或其他核酸与加热元件结合。也可以使用其他修饰，诸如例如氨基或羧基基团，以将提取核酸结合至加热元件；为此，可以例如优选事先地使用环氧基和/或金属对加热元件的表面进行修饰。优选地，形成键，使得将提取核酸的5’端结合至加热元件，结果是3’端是游离的。当提取核酸打算在提取之后进行的扩增反应中用作引物时，这会是特别有利的。
提供提取核酸使得提取核酸结合至加热元件意指使提取核酸与加热元件在物理和/或化学和/或生物条件下接触，使得提取核酸可特别是直接地结合至加热元件。例如，为了该目的可需要在特定范围内的温度和/或pH。根据优选的实施方式，在样品液体中提供提取核酸，使得当样品液体与加热元件接触时，提取核酸结合至加热元件。换言之，优选在样品液体中提供提取核酸。为了该目的，样品液体特别优选具有物理和/或化学和/或生物质量，其允许提取核酸结合至加热元件。优选地，提取核酸键合至加热元件和/或可以键合至加热元件，使得键合至加热元件的提取核酸排列在反应容器或反应溶液中。
提取核酸结合和/或被结合至加热元件可意指提取核酸直接或间接结合至加热元件。在直接键的情况下，例如，上述结合类型之一可以将提取核酸直接键合至加热元件。在间接键的情况下，例如，可以经由衔接子核酸将提取核酸结合至加热元件，其中衔接子核酸优选例如通过硫醇键和/或前述结合类型的另一种牢固地结合至加热元件，同时提取核酸可继而结合至衔接子核酸。优选地，提取核酸可以与衔接子核酸杂交并且以这种方式间接结合至加热元件。这可以提供以下优势：加热元件可以被提供具有一个或多个衔接子核酸，并且可以通过添加一个或多个设计成与衔接子核酸结合的提取核酸以简单的方式定制或适应各自要求。可以优选地将多个提取核酸结合至各自的加热元件，其中在每种情况下所有提取核酸都直接地或经由至少一个衔接子核酸间接地结合至加热元件。可替代地，至少一个提取核酸还可优选直接结合至加热元件并且至少一个提取核酸经由衔接子核酸被间接结合或可以经由衔接子核酸被间接结合。
使加热元件与样品液体接触使得待从样品液体提取的核酸至少部分结合至提取核酸可以意指，促进被提取的核酸与提取核酸的杂交和/或使得被提取的核酸能够与提取核酸杂交的杂交条件至少在加热元件和样品液体之间的接触表面(即在加热元件的表面上和/或在紧邻的周围环境中)至少部分占优势。例如，杂交条件可以包括在特定范围内的温度和/或pH和/或盐浓度。根据一个优选的实施方式，可以加热加热元件以便至少在紧邻的周围环境中临时提供所需的温度，以使得所提取的核酸能够与提取核酸杂交。根据另一个优选的实施方式，加热元件和样品液体也可以优选地被尽可能均匀地加热，即，使得加热元件与反应溶液处于相同或近似相同的温度，以允许被提取的核酸有效地杂交至提取核酸。优选地，这可以通过加热元件和/或通过优选设置在样品液体外部的任选的另外的加热设备来实现。为了该目的，可以将含有加热元件和样品液体的整个设备加热至例如35℃至80℃并且特别优选40℃至70℃的基础温度。优选地，这种基础温度可以在提取期间至少临时地设定。任选地，在提取之后的任选扩增期间，可以放弃为反应溶液设定相同的基础温度和/或可以为反应溶液设定不同的基础温度或总体温度。
在这种情况下，变性温度对应于核酸双链变性的温度，即，核酸双链分离成其两条单独的链的温度。例如，在变性步骤中，可将提取核酸与同其杂交的核酸分离。根据本发明优选的变性类型是热变性(还被称为“融合”)。为了该目的，将核酸双链的至少一部分或整个双链暴露于等于或高于导致或至少促进核酸双链分离的变性温度的温度。一方面，选择的优选变性温度要高到可以使核酸双链分裂的程度。另一方面，选择的优选的变性温度要低到使得反应溶液中也可能含有的DNA聚合酶不受到明显的破坏。例如，变性温度的典型值可以是95℃。优选地，将加热元件加热至等于或高于变性温度的温度可以带来以下优势：所提取的核酸至少部分地与提取核酸脱离并自由地进入反应溶液中。例如，当随后扩增所提取的核酸时和/或如果所提取的核酸要从加热元件中去除或分离，这可以是有利的。
反应溶液优选是液体，在该液体中经提取的核酸因此可以作为单链和/或双链在本情况下存活和/或稳定。然而，反应溶液不同于样品液体。换言之，反应溶液优选经设计，使得所提取的核酸不会因与反应溶液的相互作用而受损。例如，可以将反应溶液作为水溶液和/或作为缓冲溶液提供。如果打算在一旦提取后就对经提取的核酸进行扩增，则反应溶液可以优选地被设计成，使得反应溶液允许进行此类扩增溶液。例如，反应溶液可呈缓冲溶液的形式，其中可以进行PCR以便至少部分复制经提取的核酸。反应溶液优选提供于反应容器中。提供的反应溶液优选具有至少1μl且不大于10ml、更优选至少5μl且不大于1ml、最优选至少10μl且不大于100μl的体积。
本发明提供的优势是，通过提供具有至少一个提取核酸的加热元件，可以将加热元件直接用于提取待从样品液体提取的核酸。换言之，根据本发明，核酸优选地直接在加热元件上、特别是在加热元件的表面上及其紧邻的周围环境中从样品液体中提取。优选地，加热元件因此可以用来在加热元件的紧邻的周围环境中提供杂交条件，特别是适合的杂交温度。
本发明还提供了一种或多种经提取的核酸在提取之后已经与加热元件结合的优势。这使得可以在提取之后使用加热元件进行扩增反应，如PCR。由此可以减少提取和扩增经提取的核酸所需的时间。特别地，根据本发明并不是严格必须在进行扩增反应之前将经提取的核酸从提取基质(即根据本发明从加热元件)中首先分离或再次去除；相反，根据本发明，经提取的核酸可以保留在加热元件上。随后扩增反应的开始和/或过程可以从而例如通过使用加热元件而被显著加速，因为经提取的核酸已经排列在可由加热元件局部加热的反应溶液体积或空间区域中。应当注意，根据本发明，在提取之后，核酸并非严格必须保留在加热元件上，但是由于上述原因，这会是特别有利的。
本发明还提供了还可适用于和/或经设计进行扩增反应的加热元件还可用于从样品液体提取核酸并因此用于浓缩待提取和任选地被扩增的核酸的优势。特别优选地，设备被设计成进行扩增反应以复制从样品液体中提取的核酸，其中加热元件的加热优选地被实现成仅紧邻地围绕加热元件的区域被局部至少加热至变性温度。当进行扩增反应时局部加热反应溶液的部分的优势例如在DE102012201475A1中解释。由于当使加热元件与样品液体接触时，待提取的核酸可经由经提取的核酸结合至加热元件，因此一旦提取完成，可将剩余的样品液体与加热元件分离，其中核酸保持结合至加热元件。加热元件和与其结合的提取核酸可因此用于纯化或浓缩待提取的核酸，该待提取的核酸还可被称为靶核酸。结果，本发明首先允许对核酸进行浓缩或纯化或提取，其次允许对经提取的核酸进行扩增。因此，不需要提供用于纯化和扩增的单独设备，因为根据本发明，根据本发明的设备可以用于两个方法步骤。
换言之，本发明可以提供的优势是，实际上设计用于扩增的设备还可以用于纯化或浓缩通过使用根据本发明的方法和/或通过设计为根据本发明的设备来扩增的核酸。
本发明还提供的优势是，其中提供待提取的核酸的样品液体可以优选还含有不利于待提取的核酸的扩增的物质。由于在提取核酸后再次将样品液体与加热元件分离，所以优选留在加热元件上的所有核酸都是从所述液体中提取的任何核酸，结果是也从加热元件中再次提取了会损害扩增的物质。因此，在提供样品液体时，无需考虑对任何后续扩增反应的需求和/或要求。相反，可以以非纯化样品的形式(例如血液和/或粘液和/或身体分泌物的形式)提供待提取(和扩增)的核酸，由此可以减少纯化和扩增所需的时间和必要的努力。
本发明还可以提供的优势是，为了从样品液体提取核酸和/或为了任选地随后扩增该来自样品液体的核酸而稀释样品液体这不是严格必须的，因此不需要接受不利的浓度降低。因为可以使用未稀释的样品液体进行提取，因此可以显著提高核酸检测的灵敏度。
可替选地或另外地，本发明可以提供的优势是，借此可将可有助于提取但还可任选地阻碍任何随后的扩增的一种或多种物质添加至样品液体和/或一种或多种此类物质可已经包含在样品液体中。例如，可以将促进从样品液体中提取的核酸与提取核酸的结合或杂交的物质添加至样品液体，以增加被提取的核酸的产量，例如即使存在此类物质将在扩增反应期间是不利的，例如存在高氯化钠或氯化镁浓度和/或裂解缓冲液(例如可包含裂解酶和/或离液盐)。由于除了从中提取的核酸以外，样品液体再次与加热元件分离，因此当随后在扩增反应中使用加热元件时，对扩增不利的物质不再存在于反应溶液中，并且因此可不再破坏扩增反应。因此，本发明使得可以优化样品液体用于提取并不依赖于其，优化反应溶液以用于扩增经提取的核酸。在一个优选的实施方式中，在已经去除样品液体后，使用洗涤溶液将加热元件洗涤一次或几次，该洗涤溶液适合于去除能够对PCR反应有害的物质同时不影响提取核酸和待提取的核酸之间的键合。这种洗涤溶液可以包含以下或由以下组成：含有如MgCl2和/或NaCl的缓冲溶液。
本发明还提供的优势是，特别在提取核酸期间和/或在任选地扩增核酸期间，还可根据需要通过加热元件整体升温或加热样品液体和/或反应溶液，即整个样品液体或反应溶液。这可以例如促进被提取的核酸与提取核酸的至少部分杂交。可替选地或另外地，样品液体和/或反应溶液的此类整体加热也可用于至少部分变性待提取的核酸，这可特别在待提取的核酸不以单链形式存在或不仅以单链形式存在时是有利的。任选地，还可以根据需要通过加热元件对样品液体进行加热，以例如裂解或分解和/或杀伤或失活样品液体中的微生物，并提供接近其中所含的待提取的任何核酸的途径。
优选地，用于提取核酸的设备还包括反应容器。特别优选地，加热元件连接至反应容器和/或形成为反应容器的一部分。更优选地，将加热元件设置在反应容器中，使得加热元件优选地全部或几乎全部、但至少部分地延伸通过至少部分地被反应容器包围的反应体积。这提供的优势是，待从其中提取核酸的样品液体、和/或反应溶液可特别仅通过填充样品液体或反应溶液至反应容器中来从而与加热元件接触。
优选地，将加热元件加热，使得仅将加热元件和紧邻地围绕加热元件的区域加热至变性温度或加热至更高的温度，优选地在该温度下结合至提取核酸的核酸优选至少部分熔融和/或变性。特别优选地，仅将一个或多个加热元件的紧邻的周围环境局部加热短的时间，直到达到变性温度或更高的温度，同时大部分反应体积保持在基础(在“整体”的意义上)温度。例如，还可在任选的随后扩增期间设定基础温度，并且基础温度可使得在基础温度下可优选进行伸长和/或杂交(即退火)。优选地，在这种情况下，基础温度也可以任选地通过单独的加热设备来设定，其中基础温度决定了假定至少当没有热量输入到反应溶液中时通过加热元件实现的反应溶液的反应溶液温度。例如，用于控制反应溶液的温度至基础温度的加热设备可位于反应体积之外，并可经设计以尽可能恒定地保持反应溶液的温度在基础温度处。例如，基础温度可以是至少55℃和/或至多70℃。可替选地或另外地，还可以提供冷却设备，每当需要达到基础温度，该冷却设备就可从反应溶液中去除热。同时，根据优选的实施方式，通过(外部)加热设备诸如加热块将反应溶液的温度达到基础温度，一个或多个加热元件(至少部分但优选大部分或全部位于反应溶液中)，可以例如仅将反应溶液的至少一部分加热至变性步骤。
然而，根据其他优选的实施方式，一个或多个加热元件至少部分地和/或至少暂时地可用于将反应溶液的温度控制至基础温度和/或可以支持加热反应溶液至基础温度。根据其他优选的实施方式，反应溶液的温度可以完全或仅仅通过一个或多个加热元件控制至基础温度，并因此任选地，可以不需要提供(外部)加热设备。
此外，根据优选实施方式的设备可包括可加热盖，所述可加热盖可用于例如密封容纳反应溶液的反应容器。可以将盖加热至优选高于反应溶液温度几摄氏度的温度，以便至少部分地防止反应溶液的蒸汽部分至少部分冷凝在盖上。
可以例如通过施加短暂的电脉冲至加热元件(该加热元件被设计为例如电阻加热元件)来实现加热元件的加热，使得仅将加热元件和加热元件的紧邻的周围环境加热至变性温度或更高的温度，在该温度下，结合至提取核酸的核酸优选至少部分熔融和/或变性。特别地，这可以优选地通过加热元件的加热持续时间如此短以致于在周围的反应体积中(即在紧邻的周围环境中)产生的热场仅可散布几微米并从而形成优选仅包含微小部分的反应体积的加热区域来实现。换言之，优选如此快速加热加热元件及其紧邻的周围环境，以使热量不能散布到整个溶液中，并且除了加热元件的紧邻的周围环境外，溶液因此基本上保持在基础温度。
为此目的，将加热元件特别优选地加热小于100ms、相当特别优选小于10ms、并且相当特别优选小于1ms，以确保在这些加热期期间，温度场可以通过扩散从加热元件散布至反应溶液中，其中散布优选小于100μm、特别优选小于35μm、并且非常特别优选小于10μm。可以使用以下关系式将水中热量的扩散范围x(t)量化为时间(t)的函数：
Figure BDA0002709946230000121
由于一个或多个加热元件因为其导热性质和最大可能的表面积-体积比而可以优选地非常有效地将热量散发至其周围环境，因此可以实现与加热元件表面结合的核酸暴露于比联合的退火和延长温度(其之前被设定并将在变性步骤之后再次被设定)热大于5℃的温度场，优选仅持续优选小于100ms、相当特别优选小于10ms、和相当特别优选小于1ms的短暂变性期。特别优选地，当以这种方式局部加热加热元件的紧邻的周围环境时，没有对反应溶液作为整体进行基本上整体加热，即反应溶液的平均温度优选不经历任何显著的温度上升。优选地，通过一个或多个加热元件的每个加热过程的反应溶液的平均温度的温度上升不大于5℃、更优选不大于3℃、甚至更优选不大于1℃、更优选不大于0.5℃、非常更优选不大于0.25℃、最优选不大于0.1℃。任选地，通过一个或多个加热元件的每个加热过程的反应溶液的平均温度的温度上升不大于0.05℃或不大于0.01℃。特别优选地，加热元件的加热包括至少一个加热过程，并且被优选实现使得每个加热过程和/或跨过所有加热过程加热元件的加热使反应溶液的平均温度增加不大于5℃、优选不大于3℃、还优选不大于1℃、更优选不大于0.5℃、非常更优选不大于0.25℃、最优选不大于0.1℃。本文的加热过程包括将加热元件加热至等于或高于结合至提取核酸的核酸的变性温度的温度。
这提供了以下优势：可以以特别低的能量和热量输入来加热加热元件的紧邻的周围环境，和/或加热元件的紧邻的周围环境中的温度可以特别快速地改变和/或特别快速地再次降低。特别地，由于加热后反应溶液的快速热化，加热期间形成的温度梯度可以非常迅速地再次消散，这使得热循环持续时间非常短。
特别地，因此热量输入量可以如此低，以致于反应体积(即整个反应溶液)没有发生显著的整体加热。在本发明的意义上的“整体温度”是基于容量或整个反应溶液的反应体积或反应溶液的平均温度，即，在反应体积热化之后其中被设定或将被设定的温度。“整体加热”是因此定义的整体温度的升高。这使得可以减少供应给反应溶液的能量的量，以便在加热元件的紧邻的周围环境中达到变性温度，由此可以使能量以及时间需求最小化。
此外，这提供了以下优势：一旦已经加热了加热元件的紧邻的周围环境，从加热区散布至剩余反应体积中的输入热量仅使那里的整体温度升高可忽略不计。本文中“可忽略不计”特别意指对于核酸分子的变性温度升高优选太低，并且特别优选地，意指温度升高太低以致于不会破坏杂交和延长。因此，使用所提取的核酸所结合的加热元件的变性以及任选的任何核酸复制的其他步骤可以局部发生在加热元件的紧邻的周围环境中。此外，可以特别迅速地和/或在能量输入特别低和/或反应溶液的整体加热特别低的情况下，进行经由提取核酸与加热元件结合的一个或多个(提取的)核酸的任选期望的熔融和/或变性。
由于在通过上述短暂的热脉冲进行局部加热期间，输入热能最初仅分布至加热元件，并且最初只能扩散几微米到反应溶液中，因此热输入的量被分配至整个反应溶液的非常小的部分。由于该初始加热区含有待进行热变性并且特别是至少部分结合至加热元件的表面的核酸，因此可以在相对小体积的加热区中用少量的能量实现足够的变性加热。然而，一旦将这一输入量的能量分配至反应溶液的大得多的其余部分，加热区就会冷却，并且整个反应溶液升温至极其小的程度，优选至可忽略不计的程度。
特别优选地，在变性步骤中经由加热元件输入至反应溶液中的能量小于加热整个反应溶液所需的能量，优选小5℃或特别优选3℃并且非常特别优选2℃。
换言之，由于局部加热，实现了接近加热元件的经提取的核酸的变性，并且同时与去杂交步骤开始之前的温度相比，反应溶液的整体加热被限制在很小和/或可忽略不计的程度。这是优于常规PCR的另外优势，在常规PCR中，在每个变性步骤中必需输入一定量的能量，该一定量的能量通常导致反应溶液(整体)温度上升>20℃(例如，以便使反应溶液从延长温度72℃至去杂交温度95℃)。可以从反应溶液的热容量(和加热元件的热容量，除非假定这可以忽略不计)中计算出引起反应溶液中特定温度升高所需的能量，因为实验人员已知优选的水性反应溶液的比热容及其质量。应考虑实际在反应溶液中消耗的能量(而不是例如在供应管线和/或反应容器中)。
优选地，反应溶液被设计为进行扩增反应以在反应溶液中复制经提取的核酸的至少一部分。这提供的优势是，加热元件可用于提取核酸并且也可用于扩增核酸。因此，并非严格必须要有两个单独的设备，其中首先必须单独提取或浓缩核酸，然后才可以在另一个设备中扩增核酸。特别地，这使得可以将用于扩增反应的反应溶液添加到与加热元件结合的被提取的核酸，并进行扩增反应。特别优选地，这可以在反应溶液不被样品液体污染和/或玷污的情况下实现。特别地，没有必要将一些样品液体混入反应溶液中(除了与加热元件结合的核酸之外)。而是，由此可以以提取形式(即优选没有样品液体的其他组分的任何残余物)借助于加热元件将结合到加热元件的核酸转移至反应溶液中。这进一步提供了以下优势：待扩增的经提取的核酸已经与加热元件结合，并因此可以通过局部加热直接加热至变性温度。换言之，扩增可以与待扩增的核酸被加热至变性温度一起作为扩增过程的一部分直接进行。
优选地，在用于复制至少一部分的经提取的核酸的扩增反应的情况中实现加热元件的加热，并且该加热优选重复至少一次。特别地，扩增反应可优选包括或被设计为聚合酶链式反应。扩增反应可以包括若干个运行以扩增核酸的循环，并且优选可以包括若干个加热步骤，在该加热步骤中，加热元件至少部分地并且至少暂时地、特别是局部地将反应溶液加热至预定温度。如果提供的待扩增的核酸已经结合至加热元件，这是特别有利的，因为由加热元件提供的热量可以因此直接且立即作用在被扩增的核酸上，优选一旦提取核酸(在本文用作引物)已被聚合酶延长之后。
优选地，用于扩增反应的至少一种引物是与加热元件结合的。可替选地或另外地，提供至少一种引物，使得至少一种引物结合至加热元件。换言之，至少一种所需的引物被固定至加热元件(以下称为“功能化”)。这提供的优势是，扩增子也可以在该位点产生，因此可以通过局部加热来变性。换言之，因为PCR步骤(特别是杂交、延长和/或变性)并且优选还有用于观察PCR进展的信号的产生由于加热装置已被功能化而位于加热装置的紧邻的附近，故反应体积的加热可被限制至反应体积的一部分。
特别地，这提供的优势是，可以比常规方法更快地复制核酸，在常规方法中必需加热整个反应溶液，即在常规方法中必须进行整体加热。特别地，不同于其中加热和冷却过程持续数秒的常规热循环，本发明使得扩增反应的持续时间不再由诸如加热速率和冷却速率的技术限制来决定。由于热量总是产生在加热装置的周围环境中，因此在反应容器中也不再有任何热化时间。即使进行了40轮PCR复制循环，其也花费总共小于一秒以变性核酸分子并将其冷却至延长和杂交温度。由此可以实现PCR的持续时间可以主要由聚合酶进行扩散和反应过程与生化过程(诸如延长)所需的变性步骤之间的时间段来决定。这进一步提供了与常规方法相比以较低的能量消耗复制核酸的优势。此外，可以更有效地控制复制过程，并且例如，可以在很大程度上避免常规方法在温度控制期间经常发生的反应体积温度过冲和下冲。
另外，因此可以提供成本有效且紧凑的设备，其可用于提取或纯化核酸，并且也可用于复制核酸。例如，优选可以提供呈通用串行总线(USB)杆(stick)形式用于复制核酸的这类设备。
优选地，将提取核酸设计为扩增反应的引物。这提供的优势是，例如可以形成为寡核苷酸的相同核酸可用于提取和扩增核酸。这进一步提供的优势是，仅用一种类型的提取核酸对加热元件进行功能化可以就足够了，该提取核酸可以用作提取核酸和引物。另外，这提供的优势是，当加热元件被加热(可以最早在扩展反应的第一周期中发生)时，待扩增的核酸已经键合至引物并被排列在被局部加热的加热元件的紧邻的周围环境中。因此可以特别迅速地开始和/或进行扩增反应。
优选地，提供多个加热元件。换言之，优选地提供多样的加热元件。换言之，提供至少两个加热元件，其中多个加热元件中的每个加热元件优选具有所述的性质和/或功能。优选地，提供多个提取核酸。换言之，优选提供多样的提取核酸，其中加热元件或多个加热元件各自优选是与若干个提取核酸键合的，和/或其中提供一个或多个提取核酸以便结合至加热元件或多个加热元件。可提供具有不同提取核酸的多个加热元件，其中每个加热元件可提供有类似的提取核酸，并且提取核酸在各个加热元件之间不同，和/或其中至少一个或一些加热元件各自提供有不同的提取核酸。特别优选地，提供多个加热元件，其各自用多个提取核酸进行功能化。优选地，加热元件用至少10个、更优选至少1,000个、甚至更优选至少100,000个、最优选至少1,000,000个提取核酸进行功能化。优选地，将多个加热元件中的一个或多个或所有用提取核酸进行功能化，使得它们的表面密度为至少0.001个提取核酸分子/平方纳米、特别优选为至少0.01个提取核酸分子/平方纳米、相当特别优选为至少0.1个提取核酸分子/平方纳米。这可提供的优势是，有效的反应动力学是可能的。同时，加热元件表面上的表面密度优选小于100个提取核酸分子/平方纳米、特别优选小于10个提取核酸分子/平方纳米、相当特别优选小于1个提取核酸分子/平方纳米。这可以提供的优势是，在待提取的核酸的杂交期间，良好的可及性和/或低空间位阻是可能的。
优选地，加热元件被设置在反应容器中并且优选地机械地连接至反应容器。可替选地或另外地，加热元件形成为反应容器的一部分。这提供的优势是，可以通过用样品液体或反应溶液至少部分填充反应容器，使得加热元件至少部分被样品液体或反应溶液覆盖，来使加热元件与样品液体和/或反应溶液接触。另外，分离加热元件与样品液体可包括从反应容器去除样品液体。优选地，反应容器具有至少一个开口用于填充样品液体至反应容器中和/或用于从反应容器去除反应溶液。例如，可以将样品液体从反应容器中抽吸出。换言之，使加热元件与样品液体接触包括用样品液体至少部分填充反应容器，和/或分离加热元件与样品液体包括从反应容器中至少部分去除样品液体。特别地，反应容器可以配备有进料管线和/或排出管，经由其可以将样品液体和/或反应溶液和/或任何其他液体或试剂填充至反应容器中或从反应容器中排出。因此，这提供了可以使加热元件特别简单地与样品液体和/或与反应溶液接触和/或分离的优势。这还提供了以下优势：将加热元件设置在反应体积中，即在反应溶液随后至少部分占据的体积中，并且即使在已经提取了核酸之后，加热元件与反应溶液接触并可与反应溶液相互作用。
例如，用于从样品液体提取核酸的方法于是可包括提供反应容器，设置于反应容器中的提取核酸键合至该反应容器，其中提取核酸与待从样品液体提取的核酸至少部分互补。该方法还可以包括以这样的方式用样品液体填充反应容器，使得提取核酸被样品液体覆盖，并且待从样品液体中提取的核酸可以结合至提取核酸，以及包括以这样的方式从反应容器去除样品液体，使得结合至提取核酸的核酸至少部分保留在反应容器中。
换言之，使加热元件与样品液体接触优选地包括用样品液体润湿加热元件和/或将加热元件浸没于样品液体中和/或用样品液体至少部分填充反应容器。
优选地，该方法还包括在将加热元件与样品液体分离之后清洗反应容器，其中清洗反应容器包括从反应容器中去除样品液体的残余物。为此目的，例如，可以使用洗涤溶液，该洗涤溶液与加热元件和/或与反应容器接触，以便从加热元件和/或从反应容器中去除样品液体的任何残余物。清洗可以包括一个或多个洗涤过程，即，可以使加热元件与一种或多种洗涤溶液接触一次或多次。例如，如果反应容器包括进料管线和排出管，则可以分别通过进料管线和排出管将洗涤溶液填充至反应容器中或从反应容器中排出。可替选地或另外地，可将加热元件浸入一种或多种洗涤溶液中和/或用一种或多种洗涤溶液喷射和/或冲洗。这提供的优势是，可以可靠地去除可破坏反应溶液中的任何扩增反应的任何样品液体残余物。
优选地，加热元件具有导电体，垂直于流动方向、优选在垂直于流动方向的一个空间方向上、并且特别优选在垂直于流动方向的每个空间方向上，该导电体具有延伸R，延伸R优选测量为至少0.2μm且至多0.5mm。另外优选地，延伸R测量为至少0.2μm且至多0.3mm、更优选至少0.5μm且至多200μm、更优选至少1μm且至多100μm、特别优选至少2μm和且至多50μm、相当特别优选至少5μm且至多30μm。这提供的优势是，通过以这种方式确定尺寸的一个或多个加热元件，可实现适合的热输入至反应溶液中，以及一个或多个加热元件足够稳定和/或稳健以耐受加工和/或以用作加热元件。
然而，如果对于垂直于流动方向的延伸R选择小于规定的最小值的值，则这可导致结构对于其加工或生产而言过于脆弱。相反，如果选择过高的值，则这可导致加热元件在通电时向溶液中输入过多的热，因为它们的表面积-体积比对预期用途不利。根据优选的实施方式，一个或多个加热元件可以被设计为一个或多个加热导线，并且可优选地具有圆形和/或多边形和/或椭圆形的横截面形状。根据其他优选的实施方式，然而，也可能使用在纵向上通电并且直径或圆周直径对应于尺寸R的不同形状的加热导线。根据另一个优选的实施方式，一个或多个加热元件可具有蜂窝状结构。例如，可以使用将一个或多个期望的蜂窝状结构蚀刻到其中的金属箔来生产这种类型的一个或多个加热元件。具有大的表面积-体积比的加热元件也可以使用印刷技术(如导电结构的丝网印刷)和厚膜方法应用于合适的基质。
这提供的优势是，加热导线相对于其体积具有特别大的表面积。通过相对于体积的尽可能大的表面积，与样品液体接触的表面积可以特别大，结果使得可以有效地加热反应溶液。此外，大的表面积允许大量负载提取核酸和/或其他核酸诸如寡核苷酸和/或引物，以允许从样品液体可靠地提取核酸和/或允许核酸在加热元件上可靠地扩增。此外，因此最小化加热元件的热容，同时具有尽可能大的表面积，以当加热和冷却加热元件时，最小化慢度，从而可以实现非常快速且显著的温度梯度；这特别是对于局部加热加热元件的紧邻的周围环境是非常有利的。
优选地，设备不仅具有一个加热元件，而且具有多个加热元件。这些加热元件可以类似地和/或不同地形成。此外，这些加热元件可以单独或连续形成。特别地，可以排列加热元件，使得可以一起对加热元件施加电压和/或电流和/或可以单独地对加热元件施加电压和/或电流。例如，加热元件可以至少部分地形成加热装置。例如，可将多个加热元件形成为排列好的装置和/或网格和/或导线网。这提供的优势是，可以改善从样品液体提取核酸和/或反应溶液的加热或局部加热，因为可以使样品液体或反应溶液与多个加热元件之间的接触面积比当仅存在一个加热元件时大。
优选的是，加热元件具有尽可能高的表面积-体积比(SVR)，以便允许热量尽可能有效地散发至(紧邻的)周围环境，同时具有尽可能低的体积，以确保加热元件的低热容。优选的实施方式对于加热元件具有大于103m-1(每米)、优选大于104m-1、并且特别优选大于5×104m-1的SVR。然而，太大的SVR在某些情况下可导致非常脆弱并因此在机械上不稳定的结构，并且会有利的是保持SVR优选小于109m-1、特别优选小于108m-1和最优选甚至小于107m-1。
例如，加热元件可具有长导线和/或薄膜和/或箔，其优选具有适合的SVR。对于长导线(长度比直径大得多)，计算SVR，例如通过2/r，其中r是导线的半径。对于薄膜或箔(厚度远小于长度和横向延伸)，SVR通过1/d计算，其中d是膜或箔的厚度。对于以上实施方式，根据本发明优选的是仅考虑与反应体积接触的表面积；此外，仅优选考虑其一个或多个表面积与反应体积接触的体积(例如，这意味着未贯穿溶液的供应管线将不被视为根据本发明的相关体积和表面积)。经适当修改后，同样也适用于随后考虑的体积填充系数和热容。
在本发明的一个优选的实施方式中，加热元件的与反应体积接触的表面积与反应体积之比是大于0.1m-1、特别优选大于1m-1、特别优选大于5m-1、特别优选大于10m-1、特别优选大于20m-1、特别优选大于50m-1、特别优选大于100m-1。利用本发明的该实施方式，可以有利地实现有利的反应动力学，因为在反应体积的很大一部分中，反应体积的成分能够通过扩散迅速到达加热元件的表面，以便参与在那里进行的核酸复制步骤。如其他地方所述，在用一种引物在其表面上至少部分功能化的加热元件的情况下，还可以利用以下事实：由于更大的表面积，可用甚至更多的反应伴侣。
为了防止加热元件结构变得过于脆弱或防止反应体积中包含的核酸或核酸分子和/或其他反应物的运动受到太多表面的阻碍，一个或多个加热元件的表面积相对于反应体积的大小的比率优选小于106m-1、更优选小于105m-1、更优选小于104m-1、相当特别优选小于103m-1。
为了使在变性步骤中由加热元件供应给反应体积的热量保持尽可能低，也保持低的加热元件的热容这会是有利的，这是因为加热元件的热容越大，在加热元件的表面上实现特定温度上升所需的能量的量也越多。在变性步骤中，由加热元件供应给反应体积的一定量的能量于是扩散到整个反应体积。加热元件的热容由相应的体积与组成相应体积的相应材料的比体积热容的乘积计算得出。就其尺寸而言，加热元件的设计具有相当大的自由度。因此，使加热元件的体积、特别是材料厚度保持尽可能低这会是有利的。在此值得注意的是，热扩散范围不取决于加热元件的尺寸，而仅取决于加热的持续时间。在本发明的优选的实施方式中，所有加热元件或该加热元件的体积是反应体积的小于10％、优选小于5％、特别优选小于3％、且相当特别优选小于1％。在本发明的这种设计中，可以通过低的体积填充系数来实现加热元件的低热容。
优选地，至少一种提取核酸直接与加热元件结合和/或经由衔接子核酸间接与加热元件结合。可替选地或另外地，加热元件包括至少一种衔接子核酸，当提供提取核酸使得提取核酸结合至加热元件时，经由该衔接子核酸提取核酸结合至加热元件。换言之，提取核酸可以直接或经由衔接子核酸间接结合至加热元件。为了这个目的，衔接子核酸可以例如牢固地结合至加热元件，并且可以被设计成使得提取核酸可例如通过核苷酸序列的结合部分(其优选不同于另一个提取部分)与衔接子核酸至少部分杂交。这提供的优势是，衔接子元件可被设计为具有通用的衔接子核酸，可以通过添加相应设计的提取核酸至样品液体以简单的方式被定制用于所需目的。
根据说明书和附图，本发明的其他优点和实施方式将变得显而易见。
毋庸置疑，在不脱离本发明范围的情况下，不仅可以在每种情况下以所述的组合使用以上提及且仍待在下面说明的特征，而且还可以以其他组合或单独地使用这些特征。
本发明参照实施方式实例被示意性地表示在附图中，并且将在下面参照附图进行描述。
附图说明
图1A至图1D是根据两个优选的实施方式的加热元件的示意图。
图2A和图2B是根据优选的实施方式的用于从样品液体提取核酸的设备的示意图。
图3A示出了作为控制装置和/或用于产生用于加热元件的电脉冲的电源供应的适合的电路的实例。
图3B和图3C是穿过用于提取核酸的设备的优选实施方式的示意性简化的横截面。
图3D是根据优选实施方式的用于提取核酸的设备的结构的示意分解图。
图4A和图4B是具有蜂窝状结构的加热元件的示意图。
图5至图8是显示荧光信号的图，该荧光信号已基于各种样品液体通过PCR扩增反应进行了测量。
具体实施方式
图1A是根据第一优选实施方式的加热元件10的示意图。加热元件10呈导线或加热导线12的形式，该导线或加热导线12已在其表面上用若干个提取核酸14功能化。在此应该提到的是，加热元件10仅是示意性地示出，实际使用的加热元件10可以具有不同的尺寸，特别是不同的长径比。提取核酸14呈寡核苷酸形式，并且至少部分地具有与至少一部分的从样品液体待提取的核酸22的核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。例如，提取核酸14可以通过硫醇键和/或硫键结合至加热元件10的表面。优选地，加热元件10具有促进提取核酸14与加热元件10或导线12结合的表面。例如，加热元件10或导线12可以由贵金属诸如金制成，和/或至少部分地在其表面上涂覆有金，以促进提取核酸14与加热元件10的可靠结合。
加热元件10具有电源供应16，通过该电源供应16可以给加热元件10供应电压和/或电流，以便加热加热元件10并局部加热加热元件10(即加热的导线12)的紧邻的周围环境。此外，围绕加热元件10的整个反应溶液可以任选地根据需要通过加热元件10整体地(即完全地)被加热。例如，可以通过闭合开关18将由电压源20提供的电压施加至加热元件10，结果是电流以可控制的方式流过加热元件10并以电阻方式加热加热元件10。例如，可以以脉冲形式提供电流，以便在加热元件的紧邻的周围环境内的反应溶液中获得就时间和/或空间而言尽可能急剧的温度梯度。
为了从样品液体中提取待提取的核酸22，加热元件10可以至少部分地被样品液体覆盖。例如，加热元件10可以至少部分浸入在样品液体中和/或可以将样品液体倒在加热元件10上。如果样品液体中存在待提取的核酸22并且待提取的核酸22在样品液体中优选是游离的(即未结合的)，则核酸22的单链可以附接至提取核酸14并与其杂交，除非提取核酸14已被另一个核酸占用。图1B显示了图1A的加热元件，从样品液体中提取的核酸22结合至所述加热元件。核酸22至少部分与提取核酸14一起形成双链。根据优选的实施方式，加热元件10可用于在加热元件10的紧邻的周围环境中提供适用于核酸22与提取核酸14杂交的温度，以便例如提高和/或加速杂交。
如果核酸22经由提取核酸14与加热元件10结合或杂交，则可以再次将加热元件10和核酸22一起与样品液体分离，其中核酸22保留在加热元件10上。例如，如果已经将加热元件10浸入样品液体中和/或可以倒出和/或吸出样品液体，则可以从样品液体中去除加热元件10。为了尽可能充分地去除可能已经沉积在加热元件10上的任何样品-液体残余物，也可以进行一个或多个洗涤过程。然而，就洗涤试剂或洗涤溶液而言和/或就其执行而言，洗涤过程将被选择，使得甚至在洗涤过程之后，核酸22仍然至少部分结合至具有提取核酸14的加热元件10。
图1C和图1D是根据另一个优选的实施方式的加热元件10的示意图，其在很大程度上对应于图1A和图1B的实施方式，但是在使用提取核酸14进行功能化方面有所不同。然而在图1A和图1B所示的实施方式中，提取核酸14(如通过硫醇键)直接结合至加热元件10，根据图1C和图1D所示的第二个优选实施方式，提取核酸14经由衔接子核酸15间接结合至加热元件10。例如，衔接子核酸15可以通过硫醇键结合至加热元件10。然后，提取核酸14可与衔接子核酸15杂交，并因此间接结合至加热元件10。为了该目的，提取核酸14可优选具有结合部分和提取部分，经由该结合部分提取核酸14可与衔接子核酸15杂交，通过该提取部分提取核酸14可与待提取的核酸结合。
图2A是用于从样品液体26提取核酸22的设备24的示意图。设备24具有反应容器28，该反应容器28包围反应体积，其中可以安置样品液体26和/或反应溶液。根据图2中的表示，反应容器28填充有样品液体26，使得排列在反应容器28中的加热元件10被样品液体26覆盖。
加热元件10牢固地连接至反应容器28，即，在与样品液体分离期间，加热元件10保留在反应容器中。特别地，加热元件10可以牢固地连接至反应容器28，使得它们优选与反应容器28形成单件式单元。可替选地，加热元件10可以与反应容器28单独地形成，并且仅可以排列和任选地固定和/或锚固在其中。固定和/或锚固可以是永久的(即不可拆卸的)或可拆卸的。根据优选的实施方式，加热元件10可以经由反应容器28的容器壁电接触。可替选地或另外地，加热元件10可经由反应容器28中的开口30电接触，所述开口根据所示的实施方式用盖32封闭。例如，即使当盖32封闭时，也可以提供衬套以允许用于接触反应容器28中的加热元件10的连接线。例如，每个加热元件10可以分别通过其自己的电压源(未示出)被提供电能，和/或所有加热元件10可以经由共享电压源(10)供应有电能。
待提取的核酸22在样品液体26中至少部分游离。选择条件，特别是至少一部分的样品液体26的温度，使得样品液体26中的至少一些核酸22至少部分地杂交至提取核酸14并因此可各自结合至加热元件10。一旦完成杂交，就可以再次将样品液体26与加热元件10和/或反应容器28分离。例如，一旦核酸22有足够的时间与提取核酸14杂交，就可以通过将样品液体26倒出和/或从反应容器28中抽吸出样品液体26进行分离。例如，数秒可以是足够的。由于核酸22与提取核酸杂交，因此在分离样品液体26时和分离样品液体26之后，核酸22保留在加热元件10上并因此保留在反应容器28中。
一旦已经将样品液体26与加热元件10分离，即例如一旦已经将样品液体26倒出和/或抽吸出，就可以进行一个或多个洗涤步骤，为此目的，可以将例如一种或多种洗涤试剂或洗涤溶液倾倒至反应容器28中以去除样品液体的任何残余物。然而，洗涤试剂和洗涤步骤必须被设计成使得并非所有与加热元件10结合的核酸22都被破坏和/或去除，而是至少一些核酸22，但是优选所有核酸22，保持完整并结合至加热元件。当一种或多种清洗试剂与加热元件10分离时，以确保核酸22至少部分保留在加热元件10上，这是特别重要的。
一旦已经将核酸22与加热元件10分离并且在任选的一个或多个洗涤过程之后，可通过将反应溶液填充至反应容器28中来使加热元件10与反应溶液接触，以此方式使得加热元件10至少部分地、但优选完全地被反应溶液覆盖。然后，通过加热至少一些加热元件10、但优选所有的加热元件10，可以将加热元件10的紧邻的周围环境中的反应溶液加热至等于或高于变性温度的温度，结果是核酸22与提取核酸14脱离，并以游离形式进入反应溶液中。特别地，这可以用于扩增核酸22。根据这个优选的实施方式，然而，选择提取核酸14与加热元件的键合，使得甚至当将加热元件10被加热至变性温度或稍微更高的温度时，提取核酸14也优选不与加热元件10脱离。
根据另一个优选的实施方式，然而，还可设计提取核酸14与加热元件10的键合，使得提取核酸14例如经由衔接子核酸(即，间接地)结合至加热元件10。特别地，为了结合至加热元件10，提取核酸14可以与一个或多个衔接子核酸杂交，以便然后经由该一个或多个衔接子核酸结合至加热元件。优选地，衔接子核酸例如通过硫醇键牢固地结合至加热元件10，并且优选甚至在加热加热元件10时和/或在加热加热元件10之后依然牢固地结合至加热元件10。根据这些优选的实施方式，在加热加热元件10的同时，至少一些间接结合至加热元件10的提取核酸14可以至少部分与衔接子核酸脱离，因此与加热元件10脱离。例如，这可能是由于提取核酸14与与其结合的衔接子核酸的至少部分去杂交。即使提取核酸14至少部分与加热元件10脱离，即至少一些提取核酸14与加热元件10脱离和/或仅一些提取核酸14与衔接子核酸去杂交，已经与加热元件10脱离的提取核酸14在下一加热步骤开始时仍可以位于靠近加热元件10，其中再次加热加热元件10，和/或已经与加热元件10脱离的提取核酸14可以再次结合至之前与提取核酸14结合的衔接子核酸，或可结合至另一提取核酸14。这特别可以通过在反应溶液中没有活跃地产生流动和/或相继加热步骤仅在其间具有例如数秒的小间隔来促进。例如，这可以实现为，尽管至少一些提取核酸14已经与加热元件10脱离，但是已经与之脱离的提取核酸14仍然至少部分位于加热元件10的被加热元件10加热的空间周围环境中。
为了进行一个核酸22或多个核酸22的扩增，优选将反应溶液设计为适合于在其中进行扩增反应。例如，扩增反应可包括或经设计为聚合酶链式反应(PCR)。在这种情况下，反应溶液可特别有利地设计为PCR的缓冲溶液。在PCR的情况内的几个热循环的执行可以因此通过加热加热元件10在加热元件10的紧邻的周围环境中局部进行，所述热循环包括加热(至少部分的)反应溶液至变性温度、和冷却所述溶液至杂交温度。优选地，为此目的，至少一种类型的用于PCR的引物也被功能化至加热元件10和/或经由一个或多个衔接子核酸结合至一个加热元件10或多个加热元件10。特别优选地，至少一些提取核酸14形成为PCR的引物，并因此具有提取核酸和引物两者的作用。此外，相同和/或不同的引物可以在反应溶液中游离，和/或可以被官能化至一个或多个加热元件10，和/或可以经由一个或多个衔接子核酸间接地结合至一个加热元件10或多个加热元件10。
例如，第一轮的PCR复制循环可以如下进行：通过提供在反应溶液中的聚合酶延长与引物(优选呈正向引物的形式)或提取核酸14杂交的核酸，从而就表示靶核酸的核酸22而言，由于加热元件10上的引物加长，形成与靶核酸22互补的链。变性，即靶核酸22的分子与现在延长的引物的分离不是由于整个反应体积或整个反应溶液的整体加热，而是由于电流脉冲引起的通过加热元件的热脉冲实现的。以下轮次的PCR复制循环可以类似的方式进行：原始靶核酸22的分子与结合至一个或多个加热元件的引物重新杂交，并且聚合酶使加热元件10上的引物伸长，从而生成与靶核酸22(或至少与靶核酸22的一部分)互补的链。同时，其他引物，例如正向引物(游离悬浮的或也与加热元件结合的)，现在可以结合至与加热元件结合的并在第一轮的PCR复制循环中产生的延长的正向引物的延长部分(其现在代表与靶核酸22的至少一部分互补的链)，并且然后通过聚合酶相应地延长反向引物。结果，在第一时间产生了至少一部分原始靶核酸22的真实拷贝。现在通过由电流脉冲引起的通过加热元件10的热脉冲再次实现变性，即通过聚合酶的延伸而产生的双链的分离(该双链在任何情况下都与加热装置10再次结合)。从PCR复制循环的第三轮开始，原始靶核酸22和由延长引物序列的聚合酶产生的核酸链(所述链是游离混悬于反应体积中或结合至加热元件，这取决于实施方式)现在均用作进一步复制的模板。通过与相应的引物(游离混悬或结合至加热元件，这取决于实施方式)杂交，然后通过聚合酶进行延伸，和随后通过电流脉冲引起的通过加热元件10的局部热脉冲进行变性，来进行扩增。优选重复多次刚刚描述的一轮的PCR复制循环，以便在每个另外轮次中进一步生成靶核酸22的至少一部分的另外拷贝。例如，如有必要经常重复各轮次，直到存在足够数量的靶核酸22的至少一部分的拷贝，以便能够检测出靶核酸22已经被复制或最初存在于样品中。使用上面进一步描述的方法之一，例如利用例如TaqMan化学、分子信标和/或嵌入染料(如SybrGreen)的荧光方法，可以优选地检测由此生成的扩增子。
图2B是根据另一优选实施方式的用于从样品液体26提取核酸22的设备24的示意图。该实施方式在很大程度上对应于图2A所示的实施方式，但是，与图2A所示的实施方式不同，其另外包括外部加热设备33。加热设备33呈加热块的形式，反应容器28可以设置在该加热块中，以便在反应容器28和加热设备33之间建立热接触。借助于加热设备33，例如于是可以使反应溶液26达到基础温度和/或保持在基础温度。
因此，加热设备33可以特别用于对反应容器28中反应溶液26的温度进行整体控制；这在核酸22的提取期间和/或在随后扩增或PCR期间会是有利的，例如以便实现有效的杂交。
图3A显示了适合作为控制装置和/或用于生成电脉冲以便施加电流至一个或多个加热元件10的电源供应11的电路100的实例。该电路经构建，使得意在加热加热装置的电压(在该说明书中总是被称为“U”)施加在接地(GND)与U+(如5V至50V之间的电压)之间。加热装置设置在位点R3“负载”处，因此R3是加热装置电阻。在启用状态下，作为实例使用的电源MOSFET Q1(IRFP4468,International Rectifier)在触点T2和触点T3之间建立低电阻连接，使得电流流过加热装置R3。在接地和MOSFET的栅极(触点T1)之间，经由栅极端FET GNDrt/ge施加例如由脉冲或频率发生器或A/D转换器提供的控制电压。特别适合的是测量为5V且持续时间为例如50μs至500μs之间的脉冲，这些脉冲允许MOSFET适当连接。在位点C1处提供具有足够的电容(如>4mF)以及尽可能低的ESR值的电容器，这使得即使在使用低电阻加热元件10(其中所有加热元件的电阻总共通常小于0.5Ω(欧姆))时，也可以在热脉冲期间保持施加的电压。例如，电阻器R1、电阻器R2、电阻器R7和电阻器R9的电阻值为1kΩ(千欧)、100kΩ和24kΩ。
图3B是通过用于提取核酸22的设备24的实施方式的示意性简化截面图，所述设备24包括多个反应容器28，并且其中加热元件10由导线12的部分形成，导线12穿过多个反应容器28并连接至电压源20。导线由寡核苷酸功能化，所述寡核苷酸既可用作提取核酸14，又可用作扩增反应的引物。为了简化表示，未示出用于生成电脉冲的设备，也未按比例绘制附图。导线12穿过呈样品板34中的样品液体室(还被称为孔)的形式的多个单独的反应容器28，样品板34位于用作外部加热设备的两部分温度控制块36之间。温度控制块36具有使反应容器28中的反应体积达到杂交/延长温度并将它们保持在所述温度的功能。例如，温度控制块36可以形成为加热块和/或冷却块。为了使加热元件10与样品液体和/或反应溶液接触和/或使它们从中分离，可以将样品液体26或反应溶液分别填充至反应容器28中或从中抽吸出。
在本文所示的实施方式中，在每个反应容器28下方的温度控制块36的下部中，有激发光源(在这种情况下为具有光学低通滤波器的LED 38的形式)用于在各个反应体积中激发染料，并且在每个样品液体室上方的温度控制块14的上部中，有呈用于检测反应体积中激发染料的荧光的光传感器(所述传感器包括使荧光光线通过的光学高通滤波器)形式的光电二极管40。这些可用于通过使用适合的染料诸如嵌入染料和/或TaqMan探针，例如检测经扩增的核酸22。来自光传感器的信号可以例如通过A/D转换器读出，并因此可以观察到荧光信号的时间曲线。特别地，可优选在进行PCR的同时实时记录荧光光线，作为PCR循环的函数，因此以使得能够进行“实时PCR”。
图3C是通过根据另一个优选实施方式的用于提取核酸22的设备24的示意性简化截面图，其与图3B的实施方式的不同之处在于，加热元件10被设计成来自连接至电压源20的导线12的部分的线圈。为了简化表示，这里也未示出脉冲生成设备。呈缠绕成线圈的导线12形式的加热元件10与相应的反应容器28中的反应体积接触。与如该图所示不同，线圈优选被反应溶液完全包围。在该实施方式中，反应容器28形成为呈反应管形式的多个单独的样品液体室，反应管位于温度控制块36中，以使反应体积达到杂交/延长温度并使其保持在所述温度。在这里所示的实施方式中，在每个样品液体室下方的温度控制块36的下部中，有用作用于激发反应体积中的染料的激发光源的LED 38，并且在每个样品液体室上方有用作光传感器以用于检测反应体积中激发染料的荧光的光电二极管40。
图3D示意性地显示了可以从中产生根据一个优选的实施方式的具有导线加热元件10的提取核酸22的设备的样品板的部件。这里，直径为25μm的镀金包裹的导线12的部分(24.8μm带有约100nm金鞘的钨核，LUMA-METALL AB，卡马尔，瑞典)用作加热元件10。所述导线缠绕在厚度为0.5mm的丙烯酸玻璃板42(未显示阴影的中间的板)周围。在丙烯酸玻璃板42中，有七个开口(6mm x 6mm)，通过它们形成反应容器28或样品液体室(孔)。导线12的缠绕会在每个反应容器28中产生两个平行层，每个平行层由25个平行的加热元件10(取决于位置，不同数量的加热元件，通常为10个至75个加热元件也可能是有利的)组成(仅在组装设备时才能识别)。由于该板，两层的加热元件10彼此间隔开0.7mm；一个层内的加热元件10彼此间隔约0.24mm。通过例如具有用于样品液体室的相应凹口的双面粘合箔44(用阴影示出，100μm至250μm厚的VHB胶带，来自3M)，具有相同开口的另外的丙烯酸玻璃板46粘贴到包裹板42的每一侧(下板的厚度为0.5mm，上板的厚度为3mm)并根据胶带44的制造商的说明书进行按压。从下文看，将孔或反应容器如用粘附至下部丙烯酸玻璃板46的薄箔48(用无阴影显示，Adhesive PCR Foil Seal,4titude)密封。这产生了具有七个孔的样品板，用作加热元件10的平行导线12穿过所述孔。导线12是互连的(即，所有导线/加热元件并联连接)并且在样品板的两个外端处电接触。这使得可以以串联方式发送穿过所有孔或反应容器28的电流脉冲。然后可以用薄膜50(用无阴影显示)密封样品板中的开口(这里在顶部)。根据该优选实施方式，样品板具有20mm的宽度和90mm的长度(使得当考虑根据需求用于接触的导线12在样品板的末端处的3mm的多余长度时，热脉冲的电压在大约96mm的长度上基本上下降)。通常，在样品板的长度上产生约250毫欧的总电阻(50根导线并联连接)。
图4A和图4B是加热元件10的设置的优选实施方式的示意图，其中加热元件10连续地形成为一体并且一起形成加热装置52。加热元件10或加热装置52具有蜂窝状结构。为了产生此，通过光化学精细蚀刻工艺从不锈钢箔生成蜂窝状结构，然后将该结构用金涂覆。在该实施方式中，格子是六边形的，但是其他格子或图案当然也是可以的。电流纵向流过该结构，其中，如图4A所示，仅在反应容器(未在该图中显示)的区域中蚀刻了蜂窝状结构，即其中箔形成待设置在反应容器28中的蜂窝状加热元件10。加热元件10的长度f是例如8.2mm，并且加热元件10之间的距离g是例如3.8mm。样品室或反应容器28优选设置在加热元件10上方的中心中，并且优选具有比加热元件10小的尺寸(例如6mm x 6mm)，以便仅使用加热元件10的尽可能均匀的温度受控的区域。例如，箔的总长度h是100mm，即电接触在短边处发生，使得电压在大约100mm的长度上下降。蜂窝状结构的脊由于传导通过它们的电流而变热，并且脊可使结合在其上的双链核酸变性。
图4B是图4A的具有邻接边缘的加热元件10的蜂窝状结构的放大图示。在通过实例示出的蜂窝状结构中，脊宽度被设计为使得在整个蜂窝状结构中实现尽可能均匀的电流密度并因此尽可能均匀的体积加热密度。在该实施方式实例中，这是通过使纵向脊的宽度d恰好是横向脊的宽度b的两倍来实现的。示例尺寸为：蜂窝直径a为0.87mm，横向脊的宽度b为0.065mm，脊长度c为0.5mm，纵向脊的宽度d为0.13mm，长边缘的宽度e为0.57mm。长边缘e主要用于机械稳定性，并且暴露于与蜂窝状结构不同的电流密度。
下面，将参考技术背景和实施例更详细地解释本发明，但本发明不限于这些实施例。相反，这些实施例是用于解释本发明的功能的可能优选的实施方式。
实施例
酶促裂解
以下解释涉及样品液体的产生。将含有0.4mM Tris EDTA的Rinder全血样品与适量的MRSA细菌混合，并作为样品液体提供。为了裂解MRSA细菌，然后将溶菌酶和溶葡球菌酶添加至样品液体，以达到0.1U/μl溶葡球菌酶和2ng/μl溶菌酶的最终浓度。这种添加了酶的细胞混悬液形成样品液，在37℃下孵育5分钟。然后将细胞混悬液与溶解的蛋白酶K(量：样品体积的15％)混合。还添加来自Qiagen的AL缓冲液(量：混合有蛋白酶K的样品体积的51％)。将该混悬液在恒温振荡器中以550rpm和56℃孵育5分钟。最后，将裂解物在99℃下失活10分钟，其中基因组DNA也被变性和片段化。
用提取核酸和引物对加热元件进行预功能化
对于一些优选的实施方式，将在反应板的反应容器中存在的呈镀金导线形式的加热元件与功能化溶液(参见表2)一起在室温下预先(即在添加样品液体之前)孵育至少三小时。为了随后用于提取核酸，每个反应容器首先用去离子水洗涤五次，每次洗涤后将水从反应室中去除。
使用预功能化的加热元件提取核酸
基本上是在核酸与结合至加热元件的提取核酸预杂交的情况下，使用如上所述的已用提取核酸预功能化的加热元件从样品液体中提取核酸。提取包括至少一个杂交步骤和一个或多个洗涤步骤。杂交步骤分为两个步骤。在第一杂交步骤中，将呈酶促裂解物形式的样品液体吸移至包括功能化的加热元件的反应容器中。接下来，将反应容器用自粘箔密封，然后在45℃下孵育5分钟，其中加热是通过外部加热设备实现的(即不经由用作加热元件的导线，而是通过位于样品载体的下方和上方的加热块)。在第二杂交步骤中，在室温下两分钟的静置期后，将填有裂解物的反应容器开封。在一个洗涤步骤中，每个反应容器均使用特殊的洗涤溶液(参见表4)洗涤两次，并在每个洗涤后再次将洗涤溶液去除。一旦已经提取核酸，将PCR检测MRSA基因组中出现的抗性基因MecA所需的反应溶液(参见表1)移液至每个反应容器中，然后将其再次密封。根据该实施例，扩增所需的温度由具有表3中所述设置的用于扩增核酸的设备提供，其中该设备具有呈加热块形式的外部加热设备33，例如为了从而控制反应溶液26的温度至基础温度，可以将所述加热块的块温度设定为所需的基础温度。此外，设备具有可加热盖32，其密封反应容器28并且其温度可被控制以便防止或减少反应溶液26的蒸汽部分凝结在盖32上。为此目的，特别优选使盖32的温度达到比基础温度高几摄氏度的温度。盖32例如也可以呈加热块的形式，并且被设计为能够同时覆盖多个反应容器28。
核酸复制
在说明书末尾的附表中列出了以下所有命名的序列。
表1：用于进行扩增反应的反应溶液的组分的列表：
物质 浓度
H<sub>2</sub>O -
Tris pH 9 20mM
MgCl<sub>2</sub> 3mM
Apta Taq Genotyping Master(Roche) 1x
含序列1的反向引物(参见附表)： 500nM
含序列5'FAM-[序列2]-3'BHQ1的TaqMan探针 50nM
尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG(PEQLAB) 2.4U/μl
表2：功能化溶液的组分：
Figure BDA0002709946230000321
名称/iSP9/指示无碱基修饰“间隔子9”，其用于防止多-A间隔子序列(序列3)被聚合酶覆盖或补充。间隔子是内部间隔子，即，间隔子没有掺入到寡核苷酸的末端，而是内部整合在核苷酸链中。排列在5’-硫醇结合位点和提取序列(序列4)之间的间隔子序列可提供的优势是，所述提取序列由于其与加热元件的距离更大，因此在空间上更易于接近。对于扩增反应，优选提供的反应溶液的体积为至少10μl且至多100μl。
表3：通过局部加热设备或样品载体中的加热元件进行后续PCR扩增反应的物理参数：
Figure BDA0002709946230000322
当使用选定的物理参数时，在每个PCR循环的每个变性步骤中输入例如W≈150μs·(38V)2/250mΩ≈0.9J的能量。
该能量分布在整个样品板和PCR反应溶液中，PCR反应溶液在整个样品板中的体积约为0.5ml(如，当在八个室的每一个中使用约62μl的PCR体积时)。即使假定样品板和加热元件的热容完全可以忽略，并且总能量仅输入到反应溶液中，反应溶液中的整体温度升高至多
Figure BDA0002709946230000331
其中对于反应溶液的热容c，这里已经假设水的值(c＝4.2J/(g℃))。
相反，在常规PCR的变性步骤期间，为了在这种PCR溶液中实现最小20℃的温度升高，因此需要输入能量
Figure BDA0002709946230000332
作为最小值。
在整个PCR期间，针对每个样品室记录使用FAM染料作为发射体的TaqMan探针的荧光。为了该目的，在PCR期间用激发光照亮每个样品室，并记录发射光，以便以此方式记录实时数据。
表4：用于清洗加热元件以去除样品液体残余物的洗涤溶液的组分：
物质 浓度
H<sub>2</sub>O -
MgCl<sub>2</sub> 9mM
Tris pH 8 10mM
在无先前提取的情况下扩增核酸
作为参考测试，使用相同的设备进行PCR反应，但是没有任何先前的提取。用PCR引物对加热元件进行功能化，但是在扩增之前，不使加热元件与样品液体接触。相反，恰好在开始时使加热元件与用于PCR的反应溶液接触，然后将预定量(少量)的含有靶核酸作为目标的样品液体引入反应溶液中。特别地，引入反应溶液中的样品液体的量如此之低，以致于不妨碍和/或防止PCR在反应溶液中进行。将不同量的血液裂解物或样品液体直接添加至反应溶液以进行不同的测量。如果血液裂解物每微升含有100个MRSA细菌的菌落形成单位(CFU)(CFU/μl)(其DNA在酶促裂解期间释放)，则当将血液裂解物直接混入反应溶液中并且仅占最终PCR反应体积的1％(0.6μl血液裂解物，总PCR体积为60μl)时，大约8分钟后可检测到阳性TaqMan荧光信号。然而，如果血液裂解物的添加量增加至最终PCR反应体积的3％，则不再可能检测到阳性TaqMan荧光信号。在这种情况下，由于所用样品的量较大，更多的DNA拷贝也将被引入反应溶液中。然而，由于过量的破坏性成分或物质已经从血液裂解物中进入PCR反应物或反应溶液中并且反应溶液含有太多杂质，故将不再能够进行扩增或检测。
这些测量结果显示在图5的图表中，其中以分钟为单位的时间标绘在横轴上，并且所测量的荧光信号以任意单位标绘在纵轴上。所显示的图代表PCR反应的扩增曲线，其中实线代表将1％血液裂解物混入反应溶液中的测量值，虚线代表将3％血液裂解物混入反应溶液中的测量值。在每种情况下，血液裂解物均含100CFU/μl。当比较两条扩增曲线时，可以清楚地看到，即使CFU或从其中释放的核酸的数量或浓度是在其他扩增曲线的情况下的三倍，反应溶液中含3％血液裂解物的PCR反应物也没有达到任何阳性扩增结果。然而，在反应溶液中含有1％血液裂解物的测量的扩增曲线(实线)显示，在大约8分钟后，扩增信号急剧增加，因此表明阳性扩增结果。这表明仅通过增加混合到反应溶液中的血液裂解物或混合至反应溶液中的样品液体的浓度，无法改善扩增反应的灵敏度，因为在这种情况下，样品液体或血液裂解物中所含的物质会破坏扩增反应和/或阻止检测。
如果减少了血液裂解物中最初添加的细菌或CFU的量，使得血液裂解物仅含有1CFU/μl，则在PCR反应中不能在1％或3％的血液裂解物含量下阳性检测到核酸。诚然，在样品含量为1％的情况下，鉴于图5中显示的结果，预计不会对扩增反应产生明显的抑制或阻碍。然而，在统计学上，仅来自六个CFU的核酸仍进入扩增反应，在当前情况下，这些核酸可能不再可靠地被检测到。该比较测量的结果示于图6中，其中以分钟为单位的持续时间同样标绘在横轴上，荧光信号以任意单位标绘在纵轴上。其中血液裂解物在混合之前的细菌浓度仅为1CFU/μl的扩增反应在含量为1％(实线)或3％血液裂解液混入反应溶液中的情况下均不提供任何可检测出的扩增信号。
核酸的提取和随后扩增
在另外的实验中，在每种情况下，根据优选实施方式，使用提取方法处理80μl作为具有100CFU/μl或1CFU/μl细菌浓度的样品液体的血液裂解物，以便在扩增之前至少部分提取待扩增的核酸。为此目的，在用也用作扩增中正向引物的提取核酸进行预功能化后，通过将相应的样品液体填充至反应容器中，使在反应室中用作加热元件的导线与血液裂解物接触(即与样品液体接触)。然后来自样品液体的核酸可与已预功能化至导线上的提取核酸杂交，所述提取核酸以寡核苷酸的形式结合至加热元件。为此目的，通过样品载体下方的外部加热块，将整个样品载体的温度和因此还有样品室或反应容器中的样品溶液和加热元件的温度控制在45℃，保持5分钟，以便使得能够在所述温度下杂交，然后在室温下有两分钟的静置期。样品液体的去除和随后的洗涤步骤从样品液体中去除对扩增反应有害的成分或物质，留下与导线杂交的经提取的核酸。接着，每个反应容器填入60μl作为根据表1的PCR主混液提供的反应溶液，并通过加热元件使用局部加热进行PCR。
这些PCR反应的结果显示在图7的图表中，其中再次以分钟为单位的持续时间标绘在横轴上，荧光信号标绘在纵轴上。其中样品液体的细菌浓度为100CFU/μl(实线)的PCR现在仅在大约3分钟后就已经显示出阳性扩增结果或荧光信号，并且甚至其中样品液体的细菌浓度为仅1CFU/μl(虚线)的PCR也提供了明显的荧光信号(在约8分钟之后增加)，并获得明显的扩增结果。相反，如果使用事先未添加MRSA细菌的血液裂解物，则相应的测量结果仍为阴性(本文未显示数据)，并因此没有提供阳性扩增结果。因此这表明，通过使用根据本发明的方法，从含有对扩增有害并因此不能以高浓度直接添加至反应溶液的物质的样品液体中提取核酸，扩增反应的灵敏度可大大提到。裂解物不限于特定的起始物质或裂解物类型。例如，裂解物可以以血液裂解物的形式存在。可以如通过超声作用以不同方式诸如以化学和/或机械方式裂解血液裂解物，这意味着该方法可以灵活地应用于许多不同的裂解物起始形式。也可以相应地用血浆、血清和鼻拭子裂解物获得相当的结果。根据本发明的方法因此适用于多种不同的样品液体。
使用尚未预功能化的加热元件提取核酸
为了与上述方法比较，现在使用一种方法，其中与上述方法不同，未进行预功能化的导线用作反应容器中的加热元件，即其中加热元件尚未使用提取核酸进行预功能化。相比之下，在与导线接触之前，将血液裂解物或样品液体与提取核酸混合，所述提取核酸呈寡核苷酸的形式并具有可以与金表面结合的硫醇基团(最终浓度为100mM)，并将该血液裂解物或样品液体放入含有非功能化金导线连同样品液体的其他成分的反应容器中。然后将反应容器密封并在45℃下孵育10分钟。在室温下两分钟静置期后，反应容器再次被开封。接下来正好在如上所述的每种情况下进行洗涤过程和进行PCR。
如本发明人所指出的，在这种情况下也可以检测到阳性扩增信号。这是令人惊讶的，因为当使用溶液中游离的过量的提取核酸时，似乎优选出现未与导线结合的提取核酸与靶核酸之间的杂交，因为根据该实施方式，未结合至导线的过量提取核酸和靶核酸都均匀地分布在溶液内。根据期望，在加热元件与样品液体接触时与加热元件结合的提取核酸应在数量上要多一些，并且由于它们被固定化，因此它们对于待提取的游离混悬的核酸而言，应该比在样品液体中游离且未结合至导线(即未结合至加热元件)的过量提取核酸更难以接近。因此，本领域技术人员将预期很少的靶核酸与导线结合，并因此提取和扩增显著较差或不存在。另外，与预期相反，本发明人发现，在血液裂解物或样品液体中的化学条件下，导线被功能化有功能化寡聚物(如提取核酸)，因为功能化通常必须在相当不同的化学条件下实现(参见表2)。
然而，该实施方式使得能够以令人惊讶的可靠方式使用尚未进行预功能化的导线(即事先未用提取核酸功能化的加热元件)成功地提取和扩增核酸。提取核酸不能附接至加热元件并功能化所述元件直至加热元件与样品液体接触的事实，并不妨碍根据本发明的根据该实施方式的方法的运行。不仅由此可以简化用于提取核酸的方法，而且还可以简化设备和/或必要组件的生产和/或存储和/或运输，和/或可以提高根据客户特异性要求定制用于提取核酸的设备或加热元件的能力。
刚刚描述的实验结果显示在图8的图表中，其中再次以分钟为单位的持续时间标绘在横轴上，荧光信号标绘在纵轴上。使用含有100CFU/μl的血液裂解物获得两个图表。实线扩增曲线对应于使用预功能化的金导线作为加热元件的扩增。虚线扩增曲线对应于使用未预功能化的金导线作为加热元件的扩增。
附图标记列表
10 加热元件
12 导线或加热导线
14 提取核酸
15 衔接子核酸
16 电源供应
18 开关
20 电压源
22 (待提取的)核酸
24 用于提取核酸的设备
26 样品液体
28 反应容器
30 (反应容器中的)开口
32 盖
34 样品板
36 温度控制块
38 LED
40 光电二极管
42 丙烯酸玻璃板
44 胶带
46 丙烯酸玻璃板
48 箔
50 箔
52 加热装置
100 用于电源供应的电路
附表
序列列表(在每种情况下序列从5’至3’)：
序列1:TGAAGATGTGCTTACAAGTGCTA(SEQ ID No.1)
序列2:TCCACCCTCAAACAGGTGAATTAT(SEQ ID No.2)
序列3:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID No.3)
序列4:AAATGATTATGGCTCAGGTACTGC(SEQ ID No.4)
序列表
<110> GNA生物解决办法有限公司
<120> 用于从样品液体提取核酸的方法和设备
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<170> PatentIn版本3.5
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成功能核酸
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tgaagatgtg cttacaagtg cta 23
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<220>
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成功能核酸
<400> 4
aaatgattat ggctcaggta ctgc 24

Claims (23)

1.一种用于从样品液体(26)提取核酸(22)的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供加热元件(10)；
-提供是与所述加热元件(10)结合的提取核酸(14)和/或提供所述提取核酸(14)使得所述提取核酸(14)结合至所述加热元件(10)，其中，所述提取核酸(14)与待从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)至少部分互补；
-使所述加热元件(10)与所述样品液体(26)接触，使得待从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)至少部分结合至所述提取核酸(14)；
-分离所述加热元件(10)与所述样品液体(26)，使得结合至所述提取核酸(14)的所述核酸(22)保留在所述加热元件(10)处；
-使所述加热元件(10)与反应溶液接触；
-将所述加热元件(10)加热至等于或高于结合至所述提取核酸(14)的所述核酸(22)的变性温度的温度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述加热元件(10)加热，使得仅将所述加热元件(10)和紧邻地围绕所述加热元件(10)的区域加热至所述变性温度或加热至更高的温度，在所述变性温度或所述更高的温度下，优选地，结合至所述提取核酸(14)的所述核酸(22)至少部分熔融和/或变性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述加热元件(10)的加热包括至少一个加热过程，并且被实现成使得每个加热过程和/或跨过所有加热过程所述加热元件(10)的加热使所述反应溶液的平均温度增加不大于5℃。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应溶液被设计用于进行扩增反应，以在所述反应溶液中复制至少一部分的经提取的所述核酸(22)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在用于复制至少一部分的经提取的所述核酸(22)的所述扩增反应的情况中实现所述加热元件(10)的加热，并且所述加热优选重复至少一次。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，用于所述扩增反应的至少一种引物是与所述加热元件(10)结合的，和/或其中，提供所述至少一种引物，使得所述至少一种引物结合至所述加热元件(10)。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述提取核酸(14)被设计为用于所述扩增反应的引物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供多个加热元件(10)，和/或其中，提供多个提取核酸(14)，
其中，所述加热元件(10)或所述多个加热元件(10)是各自与多个提取核酸(14)键合的，和/或其中，提供一个或多个所述提取核酸(14)以便结合至所述加热元件(10)或所述多个加热元件(10)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供所述提取核酸(14)使得所述提取核酸(14)结合至所述加热元件(10)，包括在所述样品液体(26)中提供所述提取核酸(14)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少一个所述提取核酸(14)直接结合至所述加热元件(10)和/或经由至少一个衔接子核酸(15)间接结合至所述加热元件；和/或其中，所述加热元件(10)包括至少一个衔接子核酸(15)，经由所述衔接子核酸(15)，所提供的提取核酸(14)结合至所述加热元件。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述加热元件(10)设置在反应容器(28)中并且优选地机械地连接至所述反应容器(28)，和/或所述加热元件(10)被设计作为所述反应容器(28)的一部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，使所述加热元件(10)与所述样品液体(26)接触包括用所述样品液体(26)至少部分填充所述反应容器(28)，和/或其中，分离所述加热元件(10)与所述样品液体(26)包括从所述反应容器(28)中至少部分去除所述样品液体(26)。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括在分离所述加热元件(10)与所述样品液体(26)之后清洗所述反应容器(28)，其中，清洗所述反应容器(28)包括从所述反应容器(28)中去除所述样品液体(26)的残余物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述加热元件(10)与所述样品液体(26)接触包括，用所述样品液体(26)润湿所述加热元件(10)和/或将所述加热元件(10)浸没于所述样品液体(26)中，和/或当从属于权利要求9至11中任一项时，用所述样品液体(26)至少部分填充所述反应容器(28)。
15.一种用于从样品液体(26)提取核酸(22)的设备(24)，所述设备具有加热元件(10)，所述加热元件(10)是与提取核酸(14)连接的和/或被设计成能以此方式连接至所述提取核酸(14)，其中，所述提取核酸(14)与待从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)至少部分互补，并且其中，所述加热元件(10)能够加热至等于或高于结合至所述提取核酸(14)的所述核酸(22)的变性温度的温度。
16.根据权利要求15所述的设备(24)，其中，至少一个所述提取核酸(14)直接结合至所述加热元件(10)和/或经由衔接子核酸(15)间接结合至所述加热元件；和/或其中，所述加热元件(10)包括至少一个衔接子核酸(15)，通过所述衔接子核酸(15)，所述提取核酸(14)能够间接结合至所述加热元件(10)。
17.根据权利要求15或16所述的设备(24)，所述设备还包括反应容器(28)，其中，所述加热元件(10)连接至所述反应容器(28)和/或形成作为所述反应容器(28)的一部分，并且其中，所述反应容器(28)包括用于填充所述样品液体(26)至所述反应容器(28)中和/或用于从所述反应容器(28)去除所述反应溶液的至少一个开口。
18.根据权利要求17所述的设备(24)，其中，所述加热元件(10)具有导电体，所述导电体具有垂直于流动方向、优选在垂直于流动方向的一个空间方向上、并且特别优选在垂直于流动方向的每个空间方向上的延伸R，所述延伸R优选测量为至少0.2μm且至多0.5mm。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的设备(24)，其中，所述设备具有多个加热元件(10)。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的设备(24)，其中，所述设备(24)被设计用于进行扩增反应以复制从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)，其中，所述加热元件(10)的加热优选地被实现成仅紧邻地围绕所述加热元件(10)的区域被局部至少加热至所述变性温度。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的设备(24)，所述设备还包括用于用来复制从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)的聚合酶链式反应的至少一种引物，所述引物结合至至少一个所述加热元件。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的设备(24)，其中，所述提取核酸(14)适用于用来复制从所述样品液体(26)提取的所述核酸(22)的聚合酶链式反应。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的设备(24)用于从样品液体(26)提取核酸(22)的用途。
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