KR20060043134A - 피브리노겐 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 오염 단백질이 양이온 교환제, 소수성 겔 및/또는 염료 겔을 사용하는 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착에 의해 고갈되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 피브리노겐의 정제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되고 현저하게 안정성이 개선된 피브리노겐, 및 이 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

피브리노겐, 오염 단백질, 양이온 교환제, 소수성 겔, 염료 겔, 음흡착, 피브리노겐 제제, 음성 크로마토그래피

Description

피브리노겐 정제 방법{Fibrinogen purification}

도 1a 내지 1c는 피브리노겐 분해 단편에 대한 피브리노겐-함유 용액의 SEC-HPLC에 의한 검사를 도시한다. 피브리노겐 분해 단편의 비율은 30℃에서 2개월 동안 저장시에 상당히 감소될 수 있고, 따라서 용액 중의 피브리노겐의 안정성이 음성 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용으로 증가됨을 나타낸다.

도 1a는 저장을 시작하기 전에, 음성 크로마토그래피(negative chromatography) 방식으로 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된 피브리노겐-함유 용액을 도시한다.

도 1b는 30℃에서 2개월 동안 저장 후에, 음성 크로마토그래피 방식으로 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된 피브리노겐-함유 용액을 도시한다.

도 1c는 30℃에서 2개월 동안 저장 후에, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되지 않은 초기 피브리노겐-함유 용액을 도시한다.

본 발명은 하나 이상의 오염 단백질이 양이온 교환제, 소수성 겔 및/또는 염료 겔을 사용하는 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착에 의해 고갈되는, 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 피브리노겐의 정제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되고 현저하게 안정성이 개선된 피브리노겐, 및 이 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

피브리노겐은 혈액의 응고에 중요한 역할을 한다. 혈관은 외상 또는 수술의 경우에 거의 항상 손상되며, 출혈이 일어난다. 혈액의 응고는 혈액이 최소한의 상처 부위에서 고화되는 것을 유발하여, 출혈이 정지된다. 따라서, 응고 시스템은 다량의 혈액 손실로부터 신체를 보호한다. 혈액의 응고에 있어서, 혈장에 존재하는 가용성 피브리노겐은 트롬빈의 존재하에 섬유상 불용성 피브린으로 전환된다. 피브리노겐이 부족할 경우, 혈액의 응고는 정확하게 작용하지 않는다. 예를 들어, 사람 혈장으로부터 분리된 피브리노겐을 투여하여 부족분을 보충할 수 있다. 지혈 및 상처 치유에 대한 이의 중요성 때문에, 피브리노겐은 임상적 용도에 대단히 중요하다.

피브리노겐은 이렇게 임상적으로 대단히 중요하기 때문에, 문헌은 이러한 중요한 단백질을 정제하는 많은 방법과 관련된 다양한 참조 문헌을 포함한다. 피브리노겐은 주로 사람 혈장으로부터, 더욱 드물게는 또한 동물 혈장으로부터 정제된다. 마찬가지로 재조합성 피브리노겐을, 예를 들어, 재조합 발현 후에 세포 배양물로부터 또는 트랜스제닉 동물의 우유로부터 정제할 수 있다.

사람 혈장은 100개 이상의 단백질과, 단백질 총량의 약 2%를 차지하는 피브리노겐의 복합 혼합물을 함유한다. 따라서, 피브리노겐의 정제 및 분리는 일반적으로 다수의 단계를 필요로 하며, 이러한 개별적 공정 단계를 위해 다양하게 조합할 수 있다.

사람 혈장으로부터 피브리노겐 정제의 한가지 중요한 요소는 통상적으로 침전이다. 공지된 침전 방법은 글리신 또는 알라닌과 같은 아미노산[참조: EP 제0 383 234호, 국제 공개공보 WO 제01/48016호 또는 문헌: Jakobsen & Kierulf, Thrombosis Research 3 (1973) 145-159], 황산암모늄[참조: 미국 특허 제5,773,033호, 미국 특허 제6,037,457호 또는 문헌: Takeda, Journal of Clinical Investigation 45 (1966) 103-111], 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 중합체[참조: 국제 공개공보 WO 제95/25748호 또는 문헌: Vila et al., Thrombosis Research 39 (1985) 651-656], 에탄올[참조: EP 제0 408 029호(여기서, 피브리노겐이 침전되고, 다른 혈장 단백질로부터 5 내지 10% 에탄올을 사용하여 분리된다) 또는 미국 특허 제5,090,003호 또는 문헌: Blomback & Blomback, Arkiv For Kemi 10 (1956) 415-443], 황산화된 다당류(SPS, 예를 들어, 헤파린)[참조: 국제 공개공보 WO 제99/37680호 및 미국 특허 제4,210,580호] 및 낮은 이온 강도 용액[참조: 미국 특허 제4,188,318호 및 DE 제26 36 757호]을 사용한다.

그러나, 침전을 기본으로 하여 단독으로 수득된 피브리노겐의 순도는 특정한 적용에 아직 충분하지 않아 다양한 흡착 및 크로마토그래피 단계가 선행 기술에서 피브리노겐의 정제에 대해 추가로 또는 대안으로 기술되도록 한다.

음이온 교환 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피 영역에서 빈번하게 사용된다. 이와 관련하여 EP 제0 555 135호를 참조할 수 있으며, 여기서 피브리노겐은 주요 공정 단계에서 음이온 교환 컬럼에 결합되는 반면, 예를 들어, 알부민 및 불활성화제는 결합되지 않는다. 피브리노겐은 계속해서 컬럼으로부터 용출된다. 국제 공개공보 WO 제93/05067호에서, 음이온 교환제에 대한 피브리노겐의 결합을 사용하여 바이러스 불활성화를 위해 첨가된 세정제를 다시 제거한다. 국제 공개공보 WO 제01/48016호에는 바람직하게는, 부하 및/또는 세척 완충제 중의 피브린 분해를 지연시키는 ω-아미노산(예: ε-아미노카프로산(EACA))을 사용하여 피브리노겐을 이온 교환 물질에 결합시키는 것이 기술되어 있다. 이러한 공정 단계에 의해 특히 오염 플라스미노겐을 피브리노겐-함유 용액으로부터 효율적으로 고갈시킬 수 있다.

양이온 교환 크로마토그래피는, 예를 들어, 국제 공개공보 WO 제00/17234호에 기술된 트랜스제닉 동물의 우유로부터 피브리노겐를 정제하는 데 사용된다. 이러한 경우에 선택된 조건은 또한, 피브리노겐의 컬럼 물질로의 결합을 초래하고, 따라서, 예를 들어, 카제인을 제거할 수 있다.

양이온 교환제로의 피브리노겐 결합 특성은 국제 공개공보 WO 제91/01808호에서 사용되어 피브리노겐, 지단백질 및 우레아를, 예를 들어, 혈액과 같은 체액으로부터 선택적으로 제거한다.

국제 공개공보 WO 제89/12065호에서, 피브리노겐은 헤파린-세파로스 컬럼에 의해 하나의 공정 단계로 정제된다. 피브리노겐이 컬럼 물질에 흡착되고, 특히, 알부민, 면역글로불린 및 바이러스-불활성화 물질이 제거될 수 있도록 조건을 선택한다.

소수성 상호작용에 의한 피브리노겐의 정제 가능성도 또한 기술되어 있다. 국제 공개공보 WO 제00/17239호에서, 피브리노겐은 염의 존재하에 소수성 컬럼에 결합시키고 후속적으로 용출시킴으로써 트랜스제닉 동물의 우유로부터 하나의 공정 단계로 정제된다. 사람 혈장으로부터의 피브리노겐에 대해 소수성 컬럼의 사용 가능성이 마찬가지로 언급되어 있다.

피브리노겐을 선택적으로 결합시킬 수 있는 상이한 리간드를 갖는 다양한 친화성 크로마토그래피가 또한 기술되어 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 미국 특허 제6,037,457호 또는 국제 공개공보 WO 제99/05176호를 참조할 수 있으며, 여기에는 피브리노겐 또는 피브리노겐 펩타이드에 특이적으로 결합되어 특히 피브리노겐을 정제하는데 사용할 수 있는 항체가 기술되어 있다. EP 제0 789 030호, 미국 특허 제5,723,579호 및 미국 특허 제5,783,663호에는 피브리노겐을 결합시키고 상응하게 피브리노겐을 정제시키기 위한 친화성 컬럼에서 리간드로서 사용될 수 있는 펩타이드가 기술되어 있다. 고정 리스토세틴이 마찬가지로 피브리노겐 결합용으로 사용되고 있으며, 후자는 8M 우레아를 사용하여 다시 용출된다[참조: Suzuki et al., Thrombosis Research 18(1980) 707-715]. 국제 공개공보 WO 제99/20655호에서, 최종적으로, 불활성화 트롬빈이 트롬빈 기질용 리간드로서 사용되며, 이는 피브리노겐을 포함한다. 국제 공개공보 WO 제90/12803호에는 특정 단백질을 정제시키기 위한 소위 IMAC(고정된 금속 친화성 크로마토그래피)가 기술되어 있다. 사람 피브리노겐은 또한, 금속 킬레이트 매트릭스에 결합되는 가능한 단백질로서 언급되어 있다. 피브리노겐은 또한, 프로타민-아가로스에 결합되며, 계속해서 산성 pH에서 용출될 수 있다[참조: 미국 특허 제6,037,457호 또는 문헌: Dempfle & Heene, Thrombosis Research 46(1987) 19-27].

언급된 이러한 모든 공정 또는 공정 단계에서, 피브리노겐이 크로마토그래피 또는 흡착 물질에 결합되고 계속해서 겔 물질로부터 다시 분리되도록 조건을 선택하는 것이 일반적이다.

피브리노겐이 컬럼을 통과하는 공정은 지금까지, 출발 물질을 각종 "유용한 분획"으로 분별시키는 것을 목적으로 하거나 피브리노겐이 불순물인 공정에 대해서만 기술되어 있다.

혈장 또는 동결침전물은 피브리노겐 이외에 또한, 다량의 다른 임상적으로 중요한 혈장 단백질을 함유하여, VIII(F VIII) 인자, 피브로넥틴 및 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자의 분별 및 분리용 출발 물질로서 사용하게 된다. 이러한 이유로, 주요 단백질 4가지 모두 또는 이들 중의 둘 이상을 분리할 수 있는 크로마토그래피 공정 단계가 또한 사용된다. 이러한 목적으로, 음이온 교환제는 피브리노겐을 결합시키지 않지만, 예를 들어, F VIII, 폰 빌레브란트 인자 및 피브로넥틴은 결합시키는 조건하에 사용되며, 이들은 계속해서 상이한 이온 강도로 선택적으로 용출된다. 이와 관련하여, 예를 들어, 국제 공개공보 WO 제89/12065호, EP 제0 359 593호 또는 미국 특허 제5,252,709호를 참조할 수 있다. 음이온 교환제에 대해 EP 제0 383 234호에서 선택된 조건은 F VIII만 결합시키는 반면, 폰 빌레브란트 인자, 피브로넥틴 및 피브리노겐은 컬럼을 통과시키거나 상등액에 잔류하도록(배치식) 하는 것이다. EP 제0 408 029호 및 미국 특허 제5,138,034호는 최종적으로 특히, 처음에 F VIII 및 피브로넥틴이 동결/해동 처리를 통한 침전에 의해 제거되고, IX 인자(F IX)가 후속 음이온 교환제 컬럼에 흡착되고, 피브리노겐이 에탄올을 사용하는 컬럼의 병류(flow-through)로부터 침전되는 분별 공정을 포함한다. 이러한 경우에 모두 목적은 임상적으로 중요한 주요 단백질을 분리시키는 것이며, 이는 다음에 약제학적으로 사용하기 전에 추가 정제 단계에 일회 적용할 수 있다. 음이온 교환제 컬럼을 사용하는 유사한 공정 단계가 또한, 피브리노겐의 정제에서 가능한 중간 단계로서 사용되어 EP 제0 555 135호에서 F VIII을 제거한다. 국제 공개공보 WO 제96/02571호 또는 미국 특허 제5,834,420호에서의 한 양태에서, 국제 공개공보 WO 제89/12065호와 유사한 이온 교환제 물질을 사용하여 F VIII 및 폰 빌레브란트 인자를 제거하여 피브리노겐을 정제시킨다. 그러나, 단백질(예: F VIII 및 폰 빌레브란트 인자)은 피브리노겐의 안정성에 영향을 주지 않는다. 이러한 공정 단계는 또한 빈번하게 F VIII 농축물을 제조하는 데에 사용되어 오염물질(예: 면역글로불린, 피브로넥틴 및 피브리노겐)로부터 가능한 한 완전하에 이들을 유리시킨다. 이와 관련하여, 예를 들어, 미국 특허 제5,043,428호 및 EP 제0 173 242호를 참조할 수 있다. 미국 특허 제4,210,580호에는 피브리노겐을 헤파린 침전 후에 후속 음이온 교환제 컬럼을 세척함으로써 제거할 수 있는, 피브로넥틴의 정제 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 제5,099,003호에서는 또한 음이온 교환제를 사용하지만, 이러한 경우에 II, VII, IX 및 X 인자를 제거하며, 이들은 β-프로피올락톤을 사용 하는 바이러스-불활성화 처리 및 자외선 조사 후에 피브리노겐-함유 용액의 겔화 및 클러밍(cluming)을 달리 유발한다. 피브리노겐, 프로트롬빈 착물, 항트롬빈 III 및 저장-안정성 혈청 단백질 용액을 제조하는 방법이 기술되어 있는 DE 제29 02 158호에는, 처음에 프로트롬빈 착물(F II, F VII, F IX 및 F X)이 음이온 교환제 위에 흡착에 의해 수득되며, 계속해서 피브리노겐이 또한 콜로이드성 실리카를 사용하는 흡착으로 병류로부터 분리되는 변형태가 기술되어 있다. 그러나, 섬유소용해가 이러한 정제 순서 동안에 빈번하게 일어나고 피브리노겐의 분리에 악영향을 미치므로, 바람직한 변형태는 먼저 실리카에 흡착시켜 피브리노겐을 제거하고, 계속해서 음이온 교환제를 사용하여 프로트롬빈 착물을 분리시키는 것이다. 따라서, 이러한 경우에 음이온 교환제의 사용은 병류로부터 동시에 분리되는 피브리노겐의 품질에 불리한 효과를 주는 경향이 있다.

최종적으로, 국제 공개공보 WO 제99/51724호에는 트랜스제닉 동물의 우유로부터, 피브리노겐을 포함하여 이형 단백질을 정제시키기 위한 "음성(negative)" 크로마토그래피 방법이 기술되어 있다. 그러나, 이러한 경우에, 하이드록시아파타이트가 겔 물질로서 사용되어 오염 우유 단백질을 결합시킨다.

또한, 예를 들어, 특이적 결합을 통해 피브로넥틴을 고갈시킬 수 있는 고정 젤라틴과 같은 특이적 음성 친화성 크로마토그래피가 기술되어 있다[참조: Vuento & Vaheri, Biochem. J. (1979) 183, 331-337]. 그러나, 피브로넥틴은 피브리노겐의 안정성에 영향을 주지 않는 구조 단백질이다.

플라스미노겐을 매우 특이적으로 결합시키는 리신 또는 동족체 화합물의 능 력 및 L-리신-치환된 세파로스를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 통해 플라스미노겐을 정제시키는데 이의 능력의 사용 가능성이 또한 기술되어 있다[참조: Deutsch & Mertz, Science 170(1970) 1095-1096; Matsuda et al., Thrombosis Research 1(1972) 619-630]. 이러한 리신 리간드의 능력은 공정 단계로서 일부 피브리노겐 정제 방법에 사용되어 오염 플라스미노겐을 고갈시킨다. 이와 관련하여, 예를 들어, 국제 공개공보 WO 제95/25748호 또는 국제 공개공보 WO 제93/05067호를 참조할 수 있다. 그러나, 이러한 경우에 유일한 단백질, 플라스미노겐이 매우 특이적으로 고갈되는데, 이는 리신이 플라스미노겐의 특정 에피토프(크링 영역)에 매우 특이적으로 결합되기 때문이다.

국제 공개공보 WO 제01/27623호에는 동종응집소(혈액형 항체)가 혈액 또는, 예를 들어, 피브리노겐과 같은 혈액 구성 성분으로부터 제거되도록 하는 방법이 기술되어 있다. 이러한 경우에, 항원(예: 올리고당)이 친화성 컬럼에서 동종응집소에 특이적으로 결합될 수 있는 리간드로서 사용된다. 동종응집소의 제거는 공여된 혈액 또는 공여된 혈액 성분의 혈액형이 수령자의 혈액형과 상이한 경우, 합병증을 방지하는 데에 유리하다. 동종응집소는 단백 분해에 대한 피브리노겐의 안정성에 영향을 주지 않는다.

예를 들어, 혈장, 동결침전물, 응집 인자 및 피브리노겐과 같은 생물학적 물질로부터 지용성 공정 화학물질을 제거하는 방법을 기술하고 있는 EP 제0 366 946호 및 미국 특허 제5,094,960호가 또한 사용된다. 이러한 경우에, 선택된 조건하에 공정 화학물질은 흡착하지만 생물학적 물질의 단백질은 흡착하지 않는 소수성 크로마토그래피 컬럼이 사용된다. 이러한 공정의 목적은 첨가되어, 예를 들어, 바이러스를 불활성화시키는 화학물질을 제거하는 것일 뿐이다. 예를 들어, 특히 피브리노겐-분해 인자(예: XI 인자(F XI))[참조: Scott et al., Arch Biochem Biophys 249(1986) 480-488]를 포함하는 응집 인자와 같은 단백질은 선택된 조건하에 결합시키려는 것이 아니며 이 특허 문헌에서 고갈시키려는 것이 아니다. 유사하게, DE 제29 03 131호에서의 목적은 이온 교환 물질의 사용을 통해 이온을 교환시키는 것일 뿐이다. 이 특허 문헌에는 4가지 생성물(항호혈성 글로불린 A, 프로트롬빈 착물, 저장-안정성 혈청 단백질 용액 및 피브리노겐)의 동시 정제 방법이 기술되어 있으며, 이러한 경우에 칼슘 이온이 제거되고, 시트레이트화 혈장의 사용시에 추가로 시트레이트 이온이 제거되는 혈장이 출발 물질로서 필요하다. 이러한 경우에, 양이온 교환제는 칼슘 이온을 나트륨 또는 수소 이온으로 대체시키고, 음이온 교환제는 시트레이트 이온을 클로라이드 또는 하이드록사이드 이온으로 대체시킨다. 다음에, 이러한 방식으로 수득된 이온 교환제 혈장으로부터 특히 피브리노겐을 실리카로의 흡착에 의해 분리시킬 수 있다. 그러나, 이러한 경우에 사용된 양이온 교환제만 사용하여 칼슘 이온을 대체시켜 응집 반응의 개시를 방지하고, 정제는 이러한 단계에 의해 일어나지 않는다.

흡착이 마찬가지로 혈장 단백질을 정제하는 데 사용된다. 따라서, DE 제29 03 131호에서는 인산삼칼슘(TCP) 흡착을 사용하여 프로트롬빈 착물을 정제시킨다. 국제 공개공보 WO 제95/25748호에서는 이를 사용하여 피브리노겐을 정제하기 위한 하나의 공정 단계로서 트로트롬빈 착물을 제거한다. 또한, 수산화알루미늄 (Al(OH)₃)을 사용하는 흡착이 언급되어야 하고, 이는 프로트롬빈 착물의 인자에 결합되고, 예를 들어, 지질의 제거에서 중요한 역할을 할 수 있다. Al(OH)₃은, 예를 들어, EP 제0 383 234호 또는 국제 공개공보 WO 제01/48016호에서 사용된다. 또한, 이와 관련하여 황산바륨(BaSO₄)을 사용할 수 있음이 언급되어야 한다.

EP 제0 366 946호 또는 미국 특허 제5,094,960호(여기서, 공정 화학물질만 제거된다) 및 DE 제29 03 131호(여기서, 칼슘 및 시트레이트 이온만 제거된다)를 제외한, 음성 크로마토그래피/음흡착에 대해 기술된 모든 방법에, 본 발명의 공정 단계(들)에 대해 기술된 것과 다른 겔 물질을 사용하는 것이 일반적이다. 본 발명의 공정 단계의 특정한 이점은 하나 이상의 오염 단백질, 특히 피브리노겐-분해 단백질 또는 이의 전구체의 효율적 고갈에 의해 용액 중의 안정성이 상당히 증가된 피브리노겐 제제를 수득할 수 있다는 것이 추가 포인트이다. 공업적으로 분리하기 위해서 공업적 관점에서 경제적으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라 용액 중에 장기간 저장시에 매우 실질적으로 안정한 채로 남아 있는 피브리노겐을 유도하는 정제 방법을 개발하는 것이 특히 중요하다.

피브리노겐은 복잡한 구조를 갖는 매우 큰 단백질이다. 이는 두개의 대칭 반쪽으로 이루어진 약 340kDa의 당단백질이다. 알파(Aα), 베타(Bβ) 및 감마(γ) 쇄의 짝은 연신된 분자 구조를 형성하며(약 47nm), 이는 3개의 영역(중앙의 E 영역 및 두개의 동일한 D 영역)을 형성한다. 이러한 복합한 구조는 안정한 피브린 매트릭스의 효율적 형성에 필수적이다. 알파 쇄는 특히 피브리노겐 분해 프로테아제에 의한 초기 단백 분해에 의해 영향을 받는다. 알파 쇄에 대한 이러한 유형의 손상은, 트롬빈의 작용 후에, 지연된 응집 출발을 초래하며, 알파 쇄(들)의 단백 분해는 피브린 중합에 영향을 줄 수 있음을 암시한다. 피브린 응괴의 삼차원 구조는 또한 손상된 알파 쇄에 의해 영향을 받는다. 피브린 망은 미세하며 더욱 얇은 원섬유 및 낮은 기계적 안정성을 갖는다. 알파 쇄의 C-종결 말단은 활성화 F XIII에 의해 촉매화된, 인접한 피브린 분자 사이의 결합을 기본으로 하는 아미노산 서열을 포함한다. 가교결합 고갈은 피브린 매트릭스의 안정성을 감소시킨다. 이는 모두 심각하게 손상된 알파 쇄를 갖는 피브리노겐의 품질이 감소되고, 예를 들어, 피브린 아교에서 약제학적으로 사용하기에 바람직하지 않음을 나타낸다. 상당하는 언급이 또한, 다른 피브리노겐 쇄의 단백 분해에 적용되지만, 이는 일반적으로 더욱 느린 역학으로 일어난다. 본 발명의 공정 단계의 이점은 피브리노겐-분해 단백질의 고갈이며, 이의 결과, 수용액 중의 피브리노겐의 안정성이 증가된다.

따라서, 피브리노겐-분해 단백질 및 이의 전효소의 제거를 최대화하는 방법이 특히 유리한데, 수득된 피브리노겐 용액의 안정성 및 효능이 액체 형태로 장기간 저장시에도 결정적으로 개선되기 때문이다. 액체 형태로 저장이 피브리노겐에 특히 유리한데, 환자에게 활성 물질의 즉시 사용이 가능하고, 따라서 동결건조된 제제의 복원 또는 동결된 제제의 해동 및 가온에 더욱 많은 시간이 소모되기 때문이다. 그러나, 동결건조물 또는 동결된 상태로 저장되는 경우에도, 복원되거나 해동된 피브리노겐이 장기간 안정한 것이 유리하다. 이는, 예를 들어, 물질이, 예를 들어, 수술하기 위해 예방책으로서 복원된 상황에서 명백하지만, 사용은 다음에 의 학적 고려를 근거로 하여 필수적이지 않다. 이 물질은, 안정성이 단기간에 불과하고 나중에 더 이상 사용할 수 없는 경우, 폐기해야 한다. 피브린 아교의 사용시에 피브리노겐이 액체 형태인 것이 특히 유리하다. 시판되는 아료는 대부분 두가지 성분을 포함한다. 한가지 성분은 피브리노겐을, 빈번하게 XIII 인자 및 섬유소용해 억제제(예: 아프로티닌)와 함께 포함하며, 다른 성분은 트롬빈을, 빈번하게 칼슘 이온과 함께 포함한다. 즉시 사용하능한 아교를 제조하기 위한 복원은 비교적 장시간을 필요로 하는데, 이는 특히 피브리노겐이 고 농도로 존재하기 때문이다.

본 발명의 방법에 의해 분리되는 피브리노겐의 다른 큰 이점은 실온에서도 특정 시간 동안 액체로서 저장 가능하고, 따라서, 예를 들어, 응급 상황에서 사용 특성을 개선시킬 수 있다는 것이다. 또한, 이는 긴 수송 경로에 유리하며, 여기서, 적합하다면, 안정성이 이 기간 동안에 실온에서 보장될 수 있는 경우, 저온이 전체에 걸쳐 보장되지 않을 수 있다. 따라서, 용액 중의 피브리노겐의 저장 안정성은 많은 측면에서 제조, 사용, 수송 및 환자에게 투여를 용이하게 한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 피브리노겐의 유리하게 증가된 안정성에 기인하여, 추가로 많은 약제학적 제제에서, 특정 환경에서, 원하지 않는 부작용을 유도할 수 있거나 잠재적 위험을 방지하기 위해 피해야 하는 섬유소용해 또는 피브리노겐융해 억제제를 첨가할 필요가 없도록 할 수 있다.

따라서, 요약하면, 기술된 많은 정제 방법에도 불구하고, 공업적 규모로 가능한 안정한 피브리노겐 용액을 경제적으로 제조할 수 있는 개선된 방법이 계속 필요하다.

따라서, 본 발명은 안정성이 높은 피브리노겐을 우수한 수율로 제공하는 피브리노겐의 정제 방법을 지시할 목적을 근거로 한다. 놀랍게도, 경제적으로 공업적 규모로 수행할 수도 있고 용액 중의 안정성이 상당히 증가된 피브리노겐을 유도하는 정제 방법이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 오염 단백질이 유기 양이온 교환제, 소수성 겔 및/또는 염료 겔을 사용하는 음성 크로마토그래피(들) 및/또는 음흡착(들)에 의해 고갈되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 피브리노겐의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 기술된 공정 단계에 의해 수득가능하고 실온에서 저장 후에 개선된 안정성 및/또는 피브리노겐-분해 프로테아제 또는 이의 전효소의 감소된 함량이 현저한 피브리노겐 제제에 관한 것이다.

다양한 염료 리간드를 포함하는 본 발명에서 제안된 다양한 염료 겔은 많은 단백질을 고갈시킬 수 있어서, 피브리노겐의 안정성이 높은 피브리노겐-함유 용액을 제조할 수 있도록 한다.

그러나, 약간 가용성 무기 염{예: TCP, Ba(SO₄) 및 Al(OH)₃}을 사용하는 경우 본 발명의 피브리노겐 제제가 유도되지 않는다. 그러나, 본 발명의 겔 물질은 또한 약간 가용성 무기 염{예: TCP, Ba(SO₄) 및 Al(OH)₃}과 함께 사용할 수 있다.

30℃에서 저장시에 저분자량 피브리노겐 분해 단편의 비율은 피브리노겐의 안정성의 척도로서 간주된다. 이들 분해 단편은 주요 피브리노겐 피크보다 작은 분자량을 갖는 피크로서 크기 배제 크로마토그래피로 측정한다(피크 4 또는 ≤ 피크 4). 피브리노겐 제제는, 액체 상태로 30℃에서 저장시에 피브리노겐 분해 단편의 절대 비율(피크 4 또는 ≤ 피크 4)이 1개월 후에, 3% 미만, 더욱 바람직하게는 2.5% 미만인 경우, 본 발명의 의미 내에서 안정한 것으로 고려된다.

본 발명의 의미 내에서 정제는 크로마토그래피 정제 방법 또는 배치식 흡착 방법일 수 있다.

유용한 것으로 판명된 방법은 초기에 순도가 50%(w/w) 이상, 더욱 바람직하게는 70%(w/w) 이상인 피브리노겐 제제가 하나 이상의 침전 단계로 제조된 다음에, 양이온 교환제, 소수성 겔 및/또는 염료 겔을 사용하는 음성 크로마토그래피(들) 및/또는 음흡착(들) 및, 적합한 경우, 추가의 기술된 방법에 의해 추가로 정제되는 것이다.

선행 기술 방법은 본 발명의 음성 크로마토그래피 또는 음흡착 공정 단계와 근본적으로 상이하며, 이때 비교적 적은 비율의 피브리노겐만 결합되거나 피브리노겐이 전혀 결합되지 않고 따라서 크로마토그래피 분리에서 컬럼을 통과하도록 조건을 선택한다. 따라서, 우세한 비율의 피브리노겐이 병류 중에 또는 흡착의 경우, 상등액 중에 존재한다. 본 발명의 공정 단계의 이점은 특히, 피브리노겐의 구조 및 관능기를 손상시키지 않고, 또한 고수율을 유도하는 조건을 선택할 수 있다는 것이다. 본 발명의 공정 단계에서, 특히 침전에 의한 선행 정제 후에, 결합되어 필수적으로 유일한 보조 성분을 제거하는 것이 필수적이므로, 비용-효율적인 공업적 수행은 소형 컬럼 치수 및 간단한 기술 장치에 기인할 수 있다. 이와 비교에 의해, 앞에서 기술된 피브리노겐 결합과 함께 크로마토그래피/흡착은 몇가지 단점을 포함한다. 피브리노겐이 결합되므로, 큰 컬럼 치수가 필수적이며, 다량의 겔 물질에 기인하여 및 더욱 복잡한 기술 장치 때문에 공정을 더욱 고가로 만든다. 예를 들어, 염 구배를 통한 용출은 또한 대량 생산에 대한 방해를 나타낼 수 있다. 또한, 특별한 경우에 피브리노겐의 관능기를 손상시켜 결합된 피브리노겐을 다시 용출시킬 수 있는 엄격한 화학적 조건을 사용하는 것이 필수적이다. 특별한 경우에, 또한 기술된 정제는 다량의 피브리노겐 손실과 연관되거나 달리 피브리노겐의 공업적 정제에, 예를 들어, 고비용으로 또는 시판되지 않는 겔 물질에 기인하여 경제적으로 사용하지 못한다.

다음 양태가 유리한 것으로 판명되었다:

양이온 교환제의 관능성 그룹으로서, 설포메틸 그룹(S 타입), 설포프로필 그룹(SP 타입), 카복시메틸 그룹(CM 타입) 또는 다른 적합한 음전하 관능성 그룹을 사용하는 상기 방법.

양이온 교환제가 프락토겔(Fractogel) EMD SO₃ ^- 650, 마크로-프렙(Macro-Prep) 50 S, CM-세파로스 CL-6B, 프락토겔 EMD CM-650, 프락토겔 TSK CM 650, 프락 토겔 EMD CM, SP 세파로스, 헤라핀 프락토겔 및/또는 헤파린 세파로스 CL 6B인, 앞에서 기술된 방법.

소수성 겔이 관능성 그룹으로서 알킬 그룹을 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

소수성 겔이 관능성 그룹으로서 페닐 그룹 또는 유도체화된 페닐 그룹을 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

소수성 겔이 관능성 그룹으로서 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 옥틸 그룹을 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

사용된 소수성 겔이 마크로 프렙 메틸, 프락토겔 EMD 프로필 650, 프락토겔 EMD 부틸 650, 프락토겔 TSK 부틸 650, 마크로 프렙 3급-부틸, 부틸 셀루핀, 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(Fast Flow), 부틸 S-세파로스 6 패스트 플로우, HIC-프락토겔 펜틸, 헥실 S-세파로스 6 패스트 플로우, 옥틸 세파로스 CL 4B, HIC-프락토겔 HW 65 프로필텐타켈, 프락토겔 HW 65 부틸텐타켈, 프락토겔 TA 650, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 패스트 플로우, 페닐알라닌 세파로스, 티오프로필 세파로스 6B 및/또는 피리딜 S-세파로스 6 패스트 플로우인, 앞에서 기술된 방법.

블루 염료 겔이 염료 겔로서 사용되는, 앞에서 기술된 방법.

레드 또는 그린 염료 겔이 염료 겔로서 사용되는, 앞에서 기술된 방법.

염료 겔이 블루 하이퍼 D, 미메틱 블루 아가로스, 미메틱 블루 SA P6XL, 미메틱 블루 1 P6XL, 블루 트리스아크릴 플러스 LS, 블루 유니플로우, 블루 세파로스 6FF, 블루 세파로스 CL 6B, 레드 세파로스 CL 6B, 프락토겔 TSK AF 그린 및/또는 매트렉스 겔 그린 A인, 앞에서 기술된 방법.

6 내지 9의 pH가 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착을 사용하는 공정 단계 동안에 사용되는, 앞에서 기술된 방법.

음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착에 의한 공정 단계가 0 내지 30℃의 온도에서 수행되는, 앞에서 기술된 방법.

음성 크로마토그래피의 병류 중 또는 음흡착의 상등액 중의 피브리노겐의 수율이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상인, 앞에서 기술된 방법.

음흡착 또는 음성 크로마토그래피를 포함하는 공정 단계가 피브리노겐에 대한 플라스미노겐의 결합을 약화시키는 물질의 존재하에 수행되는, 앞에서 기술된 방법.

혈액, 트랜스제닉 동물로부터 우유, 발효 상등액 또는 이로부터 생성된 분획으로부터 수득된 혼합물이 출발 물질로서 사용되는, 앞에서 기술된 방법.

사람 혈장, 혈장 분획 또는 동결침전물이 출발 물질로서 사용되는, 앞에서 기술된 방법.

하나 이상의 공정 단계가 수산화알루미늄 처리를 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

피브리노겐이 침전되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

하나 이상의 침전을 글리신 또는 다른 아미노산과 함께 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

플라스미노겐이 관능성 그룹으로서 리신 또는 리신 동족체를 갖는 겔 물질을 경유하여 제거되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

감염성 입자의 고갈 및/또는 불활성화를 위한 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

하나의 공정 단계가 저온멸균 및/또는 자외선 조사 및/또는 나노여과인, 앞에서 기술된 방법.

하나 이상의 한외여과 및/또는 투석을 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

분자량 한계(컷오프(cutoff))가 100 내지 500 kDa인 여과 물질을 사용하는, 앞에서 기술된 방법.

하나 이상의 멸균 여과를 포함하는, 앞에서 기술된 방법.

혈장 분획의 제조, 수산화알루미늄에의 흡착, 감염성 입자(예: 바이러스)의 불활성화, 침전, 추가 정제 및/또는 불활성화 단계, 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착, 한외여과 및 멸균 여과와 같은 공정 단계를 병행하는, 앞에서 기술된 방법.

추가 정제 단계가 플라스미노겐을 제거하는 공정 단계인, 앞에서 기술된 방법.

개별적 공정 단계의 순서 및/또는 수가 변경된, 앞에서 기술된 방법.

본 발명의 공정 단계 중의 한가지가 사용되고, 제거되는 혈장 단백질이 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착을 수행한 후에 양이온 교환제, 소수성 겔 및/또는 염료 겔로부터 용출되는, 앞에서 기술된 방법.

F XII, 플라스미노겐, t-PA 및/또는 F XI를 분리하기 위한, 앞에서 기술된 방법.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 수득가능한 피브리노겐 제제.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조된 F XII, 플라스미노겐, t-PA 및/또는 F XI.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조된 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제의 제조방법.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조된 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제.

F XI 함량이 1ng 이하/OD_260-320, 바람직하게는 0.2ng 이하/OD_260-320인 약제학적 피브리노겐 제제.

F XII 함량이 20ng 이하/OD_260-320, 바람직하게는 10ng 이하/OD_260-320인 약제학적 피브리노겐 제제.

t-PA 함량이 0.02ng 이하/OD_260-320 , 바람직하게는 0.01ng 이하/OD_260-320인 약제학적 피브리노겐 제제.

액체 상태로 30℃에서 저장시에 피브리노겐 분해 단편의 절대 비율이 1개월 후에, 3% 미만, 바람직하게는 2.5% 미만인, 앞에서 기술된 약제학적 제제. 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조되는 약제학적 제제의 용도.

피브리노겐 결핍 상태 처리용 생성물로서의, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조되는 약제학적 제제의 용도.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조되는 약제학적 제제의, 피브린 아교의 성분으로서 용도.

피브린 매트릭스를 제조하기 위한 성분으로서의, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조되는 약제학적 제제의 용도.

앞에서 기술된 방법 중의 하나에 의해 제조되는 약제학적 제제의, 진단 보조제의 성분으로서의 용도.

다성분 아교의 성분으로서 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 제제. 다성분 아교의 성분으로서 제형화 성분 아르기닌을 포함하는, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 제제. 다성분 아교의 성분으로서 제형화 성분 NaCl, Na₃ 시트레이트, Arg x HCl 및 CaCl₂를 포함하는, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 제제. 다성분 아교의 성분으로서 제형화 성분 NaCl(0 내지 500mM), Na₃ 시트레이트(0 내지 50mM), Arg 또는 Arg x HCl(0.05 내지 2.0mol/l) 및 CaCl₂(0.1 내지 5mM) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 제제. 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 성분, 별도 성분으로서 F XIII 성분 및 트롬빈 성분을 포함하는 피브린 아교.

F XIII이 첨가된, 앞에서 기술된 방법 중의 하나에 따르는 피브리노겐 성분, 및 별도 성분으로서 트롬빈 성분을 포함하는 피브린 아교.

다른 양태는 청구범위의 주제에 관한 것이며, 본 발명의 다른 특징 및 이점 은 바람직한 양태의 설명, 및 실시예 및 도면으로부터 명백하다.

"피브리노겐"이란 용어는 바람직하게는, 예를 들어, 피브리노겐을 함유하고 사람 혈액으로부터 수득된 혼합물로부터 정제될 수 있는 사람 피브리노겐을 의미한다. "혈액으로부터 수득된 혼합물"이란 용어는, 예를 들어, 전혈, 혈장, 혈장 분획 또는 혈장 침전물을 의미한다. 사람 혈장, 동결침전물 또는 콘(Cohn) 분획 1로부터의 피브리노겐이 특히 바람직하다. 피브리노겐은 충혈된 혈장 공여체 및 개별적 공여체 모두로부터 분리될 수 있다. 사람 피브리노겐은 또한, 트랜스제닉 동물의 우유로부터 수득될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,639,940호]. 세포 배양물로부터 재조합 발현에 의해 수득된 피브리노겐[참조: 미국 특허 제6,037,457호]이 또한 포함된다. 따라서, 적합한 발효 상등액 또는 이로부터 생성된 분획으로부터 피브리노겐을 분리시킬 수 있다. 그러나, 피브리노겐을 함유하고 동물 혈액으로부터, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개)과 같은 동물로부터 수득된 혼합물로부터 분리된 피브리노겐도 또한 포함된다.

"오염 단백질"은 본 발명의 목적을 위해서 원칙적으로 피브리노겐 이외에 혈장에서 생기거나 트랜스제닉 동물의 우유에서 또는 세포 배양물 상등액에서 나타나는 모든 단백질을 의미한다. 이들은 특히 바람직하게는 피브리노겐을 단백 분해에 의해 분해시킬 수 있는 피브리노겐-분해 단백질, 또는 피브리노겐의 단백 분해를 위해 먼저 활성화된 피브리노겐-분해 단백질의 전구체(전효소), 또는 피브리노겐-분해 프로테아제의 활성화제이다. 단백 분해 방법에 의해 피브리노겐보다 작고 분자량이 낮은 피브리노겐 분해 단편이 생성된다. 이와 관련하여 피브리노겐의 알파 및/또는 베타 및/또는 감마 쇄가 단백 분해에 의해 영향받을 수 있다. 혈장으로부터 피브리노겐를 정제시키는 데 가능한 오염물질로서 생길 수 있는 가능한 피브리노겐-분해 또는 분해-보조 단백질 또는 이의 전구체는, 예를 들어, 플라스민, F XIa, 칼리크레인, VII-활성화 프로테아제 인자(FSAP), F XIIa, 플라스미노겐 활성화제(예: t-PA 및 u-PA), 트롬빈, 메탈로프로테아제(MMP) 및 상응하는 전구체, 예를 들어, 플라스미노겐, F XI, 프리칼리크레인, sc-FSAP, F XII, 단쇄 플라스미노겐 활성화제(예: sct-PA 및 scu-PA), 프로트롬빈 및 프로-MMP이다. 다음 문맥에서, 활성화 형태 및 개별적 전구체 사이의 구분은 없으며; 반대로, 비활성화 전효소를 표시하여 두가지 형태를 나타낸다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 본 발명의 공정 단계(들)을 통해 피브리노겐-분해 프로테아제 또는 이들의 전효소 및 활성화제의 고갈을 가능하게 만든다. 후자는, 예를 들어, 플라스미노겐, F XI, 프리칼리크레인, F XII, 프로-MMP 및/또는 플라스미노겐 활성화제 sct-PA 및 scu-PA일 수 있다. 고갈 인자(DF)는 1 이상, 바람직하게는 2 이상이다. 이러한 경우에 F XII의 비율이 특히 바람직하게는 20ng 이하/OD_280-320으로 최소화될 수 있다. F XI의 비율은 1ng 이하/OD_280-320으로, 특히 바람직하게는 0.2ng 이하/OD_280-320으로 최소화될 수 있다. 플라스미노겐의 비율은 특히 바람직하게는 5ng 이하/OD_280-320의 수준으로 감소될 수 있다. 본 발명의 공정 단계는 용액 중의 피브리노겐의 안정성, 특히 피브리노겐 쇄의 단백분해 안정성을 증가시킨다. 피브리노겐-분해 단백질에 의한 피브리노겐의 단백분해에 의해 생성된 분해 단편은 다양한 방법으로 검출할 수 있다. 본원에서 언급될 수 있는 예는 환원 또는 비환원 조건하에 SDS 폴리아크릴아미드 겔 중의 분별, HPLC 방법(예: SEC(크기 배제 크로마토그래피) HPLC) 또는 면역학적 방법이다. 또한, 잔류 피브리노겐의 활성은 문헌에 기술된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다[참조: Clauss (Acta-Haematol. 17(1957) 237-246]. 피브리노겐-분해 단백질의 고갈은, 예를 들어, 공지된 ELISA(효소-결합된 면역흡수성 검정) 또는 RIA(방사선면역측정) 방법에서와 같은 항체를 사용하여, 예를 들어, 특이적으로 검출할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 특히 언급되거나 달리 공지된 피브리노겐-분해 프로테아제에 대한 항체이다. 그러나, 고갈은 또한, 액체 상태로 피브리노겐 용액을 저장하고 마찬가지로 저장된 비고갈 대조군과 비교된 저장 후에 분해 반응의 정도를 측정하여 비특이적으로 검출할 수 있다.

"크로마토그래피"는 본 발명의 목적을 위한 분리 방법을 의미하며, 여기서, 피브리노겐-함유 용액이 고정 상 위의 액체 스트림을 사용하여 통과되고, 혼합물의 성분은 분별되게 된다. 고정 상은 바람직하게는 크로마토그래피 컬럼 내의 충전 물질이다. 이후에 소위 겔 물질이라고도 부르는 충전 물질은 바람직하게는 대략 동일한 크기의 다공성 또는 비다공성 입자로 이루어진 고형 지지 물질로 이루어지며, 이 위에 분리 방식을 설정하는 관능성 그룹이 공유 결합되어 존재한다. 지지 물질은, 예를 들어, 아가로스, 셀룰로스 및 덱스트란(바람직하게는 세파로스 및 세파덱스)와 같은 생물중합체, 또는 예를 들어, 메타크릴레이트, 폴리비닐벤젠, 폴리스티렌 및 폴리아크릴아미드와 같은 합성 중합체 또는 예를 들어, 실리카 또는 다 공성 유리 비이드와 같은 무기 중합체일 수 있다. 정제되는 피브리노겐이 오염 단백질과 함께 용해되는 용액, 및 가능한 세척 완충제 및 평형 완충제는 이동 상으로 간주해야 한다. "음성 크로마토그래피"는 본 발명의 목적을 위해서, 한편으로는 피브리노겐과 고정 상의 상호작용이 가능한 한 약하거나 0이고, 다른 한편으로는, 하나 이상의 오염 단백질과 고정 상의 상호작용이 피브리노겐의 것보다 강하도록 정지 및 이동 상이 선택됨을 의미한다. 따라서, 피브리노겐은 컬럼을 통과하여 주로 병류에 위치하는(50% 초과) 한편, 하나 이상의 오염 단백질은 주로 고정 상에 결합된다. 컬럼을 예비처리하고 겔 물질의 요건에 따라 평형화시킨 후, 피브리노겐-함유 용액과 함께 부하시킨다. 평형 완충제는 바람직하게는 피브리노겐 및 오염 단백질이 용해된 용액에 상당한다. 피브리노겐 손실을 최소화하기 위해서, 컬럼의 이동 상에 여전히 잔류하는 피브리노겐은 바람직하게는 컬럼의 용량에 대략 상당하는 용량의 세척 완충제으로 세척할 수 있다. 세척 완충제는 바람직하게는 피브리노겐 및 오염 단백질이 용해된 용액에 상당한다. 세척 완충제는, 적합한 경우, 병류와 합칠 수 있다. 고정 상에 결합된 오염 단백질은 적합한 용액으로 용출시킬 수 있으며, 고정 상은, 적합한 경우, 음성 크로마토그래피 정제 단계에, 비용을 절약하기 위해서 재생에 의해 수차례 사용할 수 있다. 재생이 가능하지 않거나 경제적이 아닌 경우, 사용된 겔 물질을 폐기한다. 그러나, 고정 상으로부터 용출된 단백질은, 필요한 경우, 이들 단백질 성분을 분리하기 위한 출발 물질로서 사용할 수도 있다. 단백질 농축물은 적합한 경우, 추가 정제 또는 공정 단계에 의해 수득할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 플라스미노겐, F XII 및 특히 F XI 의 농축물을 제조할 수 있다.

원칙적으로 본 발명의 목적을 위한 음성 크로마토그래피에서 고정 상에 대해, 선택된 조건, 특히 선택된 이동 상하에, 피브리노겐보다는 하나 이상의 오염 단백질과 강한 상호작용에 들어갈 수 있는 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 공정 단계에 포함되는 겔 물질(고정 상)은 양이온 교환제, 소수성 겔 또는 염료 겔의 그룹에 속하는 것들이다. 광범위한 시판되는 컬럼 물질 또는 예비충전된 컬럼이 있으며, 예를 들어, 아머샴(Amersham), 바이오-라드(Bio-Rad), 바이오세프라(Biosepra), 머크(Merck), 퍼셉티브 바이오시스템즈(Perseptive Biosystems), 파마시아(Pharmacia), 프로메틱(Prometic), 토소 하스(Toso Haas)로부터의 것들이 포함되는 것으로 고려해야 한다. 몇가지는 제시된 예에서 예로서 시험된다. 이동 상은 각각의 겔 물질에 적합되어야 한다. 그러나, 일반적으로, 5 내지 9 범위의 pH 값이 바람직하다. 상응하게는, 선택되는 완충 시스템은 이 범위에서 잘 완충시키는 것이다. 예에는 시트레이트, 포스페이트 및 트리스 완충제가 있다.

음성 크로마토그래피 공정 단계는 바람직하게는 2 내지 30℃의 온도에서 수행된다.

양이온 교환제는 이온 교환 크로마토그래피의 겔 물질이며, 여기서, 단백질은 고정 상, 이온 교환 매트릭스 위에 충전된 위치에 대해 이동 상의 염 이온과 경쟁한다. 양이온 교환제는 음하전 그룹을 함유하고, 따라서 단백질의 양전하 그룹과 상호작용할 수 있다. 상호작용은 양이온 교환제 및 단백질의 표면에서 양 전하의 강도 및 전하 밀도에 따라 다르다. 단백질은 특정 아미노산의 염기성 및 산성 측기에 기인하여 양전하 또는 음전하를 운반하며, 이때 총 하전 상태는 용액의 pH에 따르는다. 그러나, 아미노산 조성 외에, 번역 후 개질(예: 인산화)은 또한 단백질의 등전점(pl)에 기여하며, 여기서, 양전하 및 음전하는 서로를 중성화시킨다. 피브리노겐의 pl은 약 5.1 내지 5.5이며, 오히려 산성 단백질에 속한다. 바람직한 양이온 교환제는 교환 기능으로서(관능성 그룹, 리간드), 설포메틸 그룹(S 타입), 설포프로필 그룹(SP 타입) 또는 카복시메틸 그룹(CM 타입)을 포함한다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 양이온 교환제의 범위는 또한 다른 적합한 음하전 관능성 그룹(예: 헤파린)을 사용하는 것을 포함한다. 양이온 교환제가 기술되어 있으며, 예를 들어, 아머샴, 바이오-라드, 바이오세프라, 머크, 퍼셉티브 바이오시스템즈, 파마시아, 프로메틱 또는 토소 하스와 같은 회사로부터 시판된다. 바람직한 양이온 교환제는 동일 반응계에서 위생화될 수 있는 겔이며, 예를 들어, 프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(머크), 마크로-프렙 50 S(바이오-라드), CM-세파로스 CL-6B(파마시아), 프락토겔 TSK CM 650(머크), 프락토겔 EMD CM, SP 세파로스, 헤라핀 프락토겔(머크) 또는 헤파린 세파로스 CL 6B(파마시아)이다.

양이온 교환제를 갖는 이동 상은 바람직하게는, 피브리노겐이 선택된 pH에서 모두 음전하를 갖고/갖거나 상호작용이 일어나지 않거나 약간의 상호작용만 선택된 이온 강도에서 고정 상의 음하전 그룹과 일어나는 반면, 상호작용이 여전히 고정 상 및 하나 이상의 오염 단백질 사이에서 일어나도록 선택해야 한다. pH는 pH 5.5 이상, 특히 바람직하게는 pH 6.0 내지 약 9여야 한다. 사용될 수 있는 염은 양이 온 교환제에 대해 전문가에게 공지된 염이며, 특히 바람직하게는 염화나트륨이다. 염 농도는 바람직하게는 0 내지 400mM, 특히 바람직하게는 0 내지 100mM이다.

소수성 크로마토그래피는 일반적으로 비교적 높은 염 농도에서 고정 상의 소수성 관능성 그룹(리간드)와 상호작용하는 단백질의 비극성 표면 영역을 포함한다. 고정 상으로서 소수성 겔은 바람직하게는 합성 중합체, 실리케이트 또는 바이오중합체(예: 세파로스)이며, 이들의 표면은 관능성 그룹으로서 소수성 리간드에 의해 개질된다. 소수성 리간드는 바람직하게는 1 내지 24개 이상의 탄소원자(C)를 갖고, 선형이거나 분지될 수 있는 알킬 그룹, 또는 방향족 리간드이다. 가능한 예는 C1(메틸), C3(프로필), C4(부틸), C5(펜틸), C6(헥실) 및 C8(옥틸) 그룹, 특히 바람직하게는 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 및 옥틸 그룹이다. 알킬 그룹은 유도체화될 수 있으며, 예를 들어, 티오프로필 그룹이다. 페닐 그룹 또는 페닐 유도체를 함유하는 방향족 그룹(예: 페닐알라닌 그룹)이 바람직하게 사용될 수 있다. 페닐 그룹은 또한, 예를 들어, 알킬 쇄에 결합될 수 있다. 또한, 예를 들어, 피리딜 그룹 또는 이의 유도체를 사용할 수 있다. 소수성 물질은 전문가에게 광범위하게 공지되어 있으며, 예를 들어, 아머샴, 바이오-라드, 바이오세프라, 머크, 퍼셉티브 바이오시스템즈, 파마시아, 프로메틱 또는 토소 하스로부터 시판된다. 고정 상으로서, 예를 들어, 마크로 프렙 메틸 HIC 지지체(바이오-라드), 프락토겔 EMD 프로필 650(머크), 프락토겔 EMD 부틸 650(머크), 마크로 프렙 3급-부틸 HIC 지지체(바이오-라드), 부틸 셀루핀(아미콘(Amicon)), 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(파마시아), 부틸 S-세파로스 6 패스트 플로우(원형, 파마시아), HIC-프락토겔 펜틸(머크 ), 헥실 S-세파로스 6 패스트 플로우(원형, 파마시아), 옥틸 세파로스 CL 4B(파마시아), 프락토겔 HW 65 프로필텐타켈(머크), 프락토겔 HW 65 부틸텐타켈(머크), 프락토겔 TA 650(머크), 페닐 세파로스 하이 퍼포먼스(파마시아), 페닐 세파로스 패스트 플로우(파마시아), 페닐알라닌 세파로스(파마시아), 티오프로필 세파로스 6B(Pharmacia) 또는 피리딜 S-세파로스 6 패스트 플로우(Pharmacia)가 특히 바람직하다.

단백질과 고정 상의 소수성 상호작용은 관능성 그룹에 의해 영향을 받을 뿐만 아니라(예를 들어, 알킬 그룹의 쇄 증가는 소수성 특성을 증진시킨다), 이동 상을 형성하는 용액의 이온 강도 및 pH에 의해 매우 크게 영향을 받는다. 이동 상은 사용된 고정 상에 따라 선택하여 하나 이상의 오염 단백질이 고정 상과의 소수성 상호작용에 들어가는 한편, 바람직하게는 50% 이상의 피브리노겐이 컬럼을 통과하도록 된다. 가능한 이동 상 및 각각의 고정 상에 대한 적응은 전문가에게 공지되어 있다. pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 9의 범위이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 공지된 염을 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 예를 들어, NaCl, Na₂SO₄ 및 (NH₄)₂SO₄이다. 염 농도는 바람직하게는, 고정 상에 따라 0.01 내지 2M의 범위이다.

친화성 크로마토그래피는 지지 매트릭스에 결합된 각각의 리간드로 단백질의(또는 단백질 그룹의) 특이적, 가역적 흡착을 포함한다. 적합한 지지 매트릭스는, 예를 들어, 세파로스(예: 세파로스 4B 또는 세파로스 CL)이며, 이들의 OH 그룹은 리간드의 공유 결합에 사용될 수 있다. 다른 적합한 지지체는, 예를 들어, 프락토겔, 세파크릴, 셀루핀 등과 같은 공지된 중합체이다. 가능한 단일특이적 리간드는, 예를 들어, 피브리노겐-분해 단백질(예: 플라스미노겐, F XI, 프리칼리크레인 등)에 대해 배향된 항체이다. 그러나, 항체를 함유하는 친화성 컬럼은 대량생산 규모로 비용이 많이 들고 조건부로만 경제적 효율적으로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 구조 내에서, 하나 이상의 오염 단백질, 특히 피브리노겐-분해 단백질에 결합되는 염료는 그룹-특이적 리간드로서 포함된다. 블루, 레드 및 그린 염료 겔이 특히 바람직하다. 상응하는 물질의 예에는 블루 세파로스 6FF(파마시아), 블루 세파로스 CL 6B(파마시아), 블루 트리스아크릴 플러스 LA(바이오세프라/시페르겐(Ciphergen)), 블루 하이퍼 D(바이오세프라/시페르겐), 미메틱 블루 아가로스(프로메틱), 미메틱 블루 SA P6XL(프로메틱), 미메틱 블루 1 P6XL(프로메틱), 레드 세파로스 CL 6B(파마시아), 프락토겔 TSK AF 그린(머크) 및/또는 매트렉스 겔 그린 A(아미콘)가 있다. 다른 염료 겔이 전문가에게 충분히 익히 공지되어 있으며, 상업적으로 수득할 수 있거나 해당 제조업체에서 제조할 수 있다.

이동 상의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 9의 범위이다.

본 발명의 목적을 위한 음흡착은 피브리노겐-함유 용액이 적합한 용기에서, 피브리노겐을 선택된 조건하에 소량으로만 흡착하거나 전혀 흡착하지 않는 반면, 하나 이상의 오염 단백질이 흡착되는 흡착 물질과 혼합되는 것을 의미한다. 이 방법은 또한 불연속적 또는 배치식 방법으로 공지되어 있다. 흡착에 대한 조건은 오염 단백질이 흡착 물질에 결합되기에 충분한 시간 및 기회를 갖도록 선택해야 한 다. 예를 들어, 혼합은, 예를 들어, 적당한 온도에서 조심스러운 교반에 의해 일어날 수 있다. 적합한 온도는, 예를 들어, 2 내지 30℃이다. 원칙적으로, 선택된 조건하에 하나 이상의 오염 단백질을 결합시키고 피브리노겐을 소량으로만 결합시키거나 전혀 결합시키지 않을 수 있는 물질을 흡착 물질로서 사용할 수 있다. 물질은 크로마토그래피에서 이미 언급되었으며, 따라서 양이온 교환제, 염료 겔 및 소수성 겔의 그룹에 속하는 겔 물질을 포함한다. 바람직한 용액은 크로마토그래피에 바람직한 이동 상에 상당한다. 결합된 오염 단백질을 갖는 흡착 물질은 피브리노겐-함유 용액으로부터 전문가에게 공지된 방법에 의해 분리시킬 수 있다. 바람직하게는 본원에서 여과, 원심분리 및/또는 침강 방법을 언급할 수 있다. 흡착 물질은 바람직하게는 오염물질을 용출시키고 완충제를 교환함으로써 재생시켜 1회 넘게 사용할 수 있다. 흡착 물질로부터 용출된 단백질은, 필요한 경우, 이들 단백질 성분을 분리하기 위한 최초 근거로서 사용할 수 있다. 따라서, 적합한 경우, 추가 정제 또는 공정 단계에 의해 단백질 농축물을 수득할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 특히 플라스미노겐, F XII, F XI의 농축물을 제조할 수 있다.

배치식의 음흡착은 음성 크로마토그래피 이외에 또는 이 대신에 사용할 수 있는 기술이다.

본 발명의 공정 단계는 일반적으로 단계 수율이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상인 병류 또는 상등액 중의 피브리노겐으로 될 수 있게 만든다.

추가 양태에서, 피브리노겐에 플라스미노겐의 결합을 약화시키는 물질이 본 발명의 방법 동안에, 특히 본 발명의 공정 단계 동안에 첨가된다. 피브리노겐은 다른 단백질, 예를 들어, 플라스미노겐에 결합되는 경향이 있다고 공지되어 있다. 이는 반복적으로 오염물질(예: 플라스미노겐)의 부분적 동시정제를 유도한다. 동시정제는 결합-약화 물질에 의해 최소화될 수 있다. 이들 물질은 바람직하게는 트라넥삼산, PAMBA(p-아미노메틸벤조산), 리신 및 다른 리신 동족체 이외에, ω-아미노산(예: ε-아미노카프로산)을 포함한다.

피브리노겐의 풍부화 및 분리는 보통 다수의 공정 단계를 필요로 하며, 이러한 개별적 정제 단계의 많은 가능한 조합이 있음이 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 하나 이상의 공정 단계(들) 이외에, 원칙적으로 선행 기술에서 피브리노겐 정제에 대해 밝혀지고 이와 함께 포함되는 추가 공정 단계를 포함할 수 있다. 피브리노겐의 정제에 대한 기술의 상태는 이미 실질적으로 설명되었으며, 상응하게 인용된 특허 및 공보가 이와 함께 포함된다. 바람직한 공정 단계는 피브리노겐이 상당한 정도로 결합되는 크로마토그래피 또는 흡착을 포함하지 않으며, 따라서 모든 단점을 갖는 용출이 필수적이다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 수산화알루미늄(Al(OH)₃)이 정제되는 피브리노겐-함유 용액에 첨가되는 하나 이상의 공정 단계를 포함한다. Al(OH)₃은 먼저 프로트롬빈 착물의 인자를 흡착시키며, 예를 들어, 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거할 수 있다.

바람직한 양태에서, 방법은 피브리노겐이 침전되는 하나 이상의 공정 단계를 포함한다. 특히 바람직하게는 글리신 또는 다른 아미노산을 첨가하여 침전시킨다. 글리신 농도가 충분히 높은 경우, 이는 피브리노겐의 직접 침전(1단계 글리신 침전)을 유도한다. 그러나, 대체 또는 추가 가능성은 2단계 글리신 침전이며, 여기서, 피브리노겐이 상등액에 실질적으로 잔류하도록 제1 단계의 글리신 농도가 선택되며, 침전된 단백질은, 예를 들어, 원심분리에 의해 제거되고, 대부분의 피브리노겐 양은 2단계에서만, 실시예에도 나타난 바와 같이 글리신 농도를 증가시킴으로써 침전된다. 위에 언급된 바와 같이, 아미노산 글리신 대신에 다른 아미노산을 사용할 수도 있다. 알라닌, 글루타민 또는 글루탐산이 본원에서 예로서 언급될 수 있다. 그러나, 다른 공지된 침전제(예: 염화나트륨, 황산암모늄 또는 폴리에틸렌 글리콜)가 또한 이러한 경우에 사용될 수 있다.

다른 바람직한 양태에서, 당해 방법은 플라스미노겐이 겔 물질을 거쳐 리신 리간드 또는 유사한 리간드와 함께 고갈되는 하나 이상의 공정 단계를 포함한다. 이의 예에는 리신-세파로스, Lys-하이퍼 D, Lys-프락토겔, 아미노헥실-세파로스 등이 있다. 이는 플라스미노겐의 유리한 고갈을 유도하며, 이는 추가로 액체 형태로 저장시에 피브리노겐의 안정성에 유리한 영향을 줄 수 있다. 또한, 플라스미노겐의 고갈은 또한, 피브리노겐 농축물이 피브린 아교의 성분으로서 사용되는 경우, 유리하다.

다른 바람직한 양태에서, 당해 방법은 잠재적으로 존재하는 감염성 입자(예: 바이러스)가 불활성화되거나 가능한 한 실질적으로 고갈되는 하나 이상의 공정 단계를 포함한다. 피브리노겐이 사람 혈장으로부터 분리되는 경우, 이는 본 발명의 방법의 특히 바람직한 구성 성분이다. 감염성 입자의 불활성화 또는 고갈은 전문 가에게 공지된 기술에 의해 일어날 수 있으며, 이는 본원에 포함된다. 이들은, 예를 들어, 저온멸균, 무수 상태로 가열, 나노여과, 화학적 첨가(예: 세정제), 조사 또는 이들이 조합된 상태와 같은 방법이다.

다른 바람직한 양태에서, 당해 방법은 나노여과 및/또는 투석을 포함하는 하나 이상의 공정 단계를 포함한다. 이들 방법은 피브리노겐-함유 용액의 완충제를 변경, 즉 용액의 성분을 변경시키거나 단백질 용액을 농축시키기 위해 유리하게 사용된다. 이는 정제 단계를 위한 준비에 또는 본 발명의 방법의 종말에서, 저장에 적합한 제형화 성분을 선택하고 약제학적 제제로서 사용하기 위해서 특히 바람직하다.

한외여과는 또한, 오염 단백질이 통과하도록 허용하는 필터를 선택함으로써 오염 단백질을 고갈시키는 기회를 추가로 제공하지만, 예를 들어, 국제 공개공보 WO 제93/17776호에서도 기술된 바와 같이, 피브리노겐을 보유한다. 본 발명의 과정에서, 분자량 한계(컷오프)가, 예를 들어, 300 kDa인 적합한 필터를 선택하는 경우, 피브리노겐-분해 단백질의 고갈이 또한 가능하다는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 양태에서, 분자량 한계(컷오프)가 50 내지 500 kDa인 필터가 한외여과에 사용된다.

다른 바람직한 양태에서, 방법은 멸균 여과를 포함한다. 이는 약제학적 제제를 제조하는 방법의 결론에서 특히 가치있다.

바람직한 양태에서, 위에 언급된 다수의 공정 단계를 본 발명의 하나 이상의 공정 단계와 조합하여 본 발명의 방법을 제공한다. 개별적 공정 단계의 순서는 또 한 변할 수 있다. 또한, 개별적 공정 단계(예: 침전)는 1회 이상 적용할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 하나의 조합은 본 발명의 하나 이상의 공정 단계 이외에, 적어도 Al(OH)₃ 흡착 단계, 1단계 및/또는 2단계 글리신 침전 및 저온멸균을 포함한다. 이들 공정 단계는 리신 리간드를 갖는 친화성 컬럼과 결합된다. 정제의 완결 후에, 용액 성분은 저장에 적합한 용액으로 대체된다. 가능한 방법(예: 투석, 한외여과 등)이 전문가에게 공지되어 있으며, 본원에 포함된다. 멸균 여과는 정제 후에 진행될 수 있다. 본 발명의 정제 방법은 다음과 같은 공정 단계의 특히 바람직한 양태로 이루어진다.:

- 혈장 분획의 제조

- 수산화알루미늄에의 흡착

- 감염성 입자(예: 바이러스)의 불활성화

- 침전

- 추가 정제 및/또는 불활성화 단계

- 음성 크로마토그래피(들) 및/또는 음흡착(들)

- 한외여과/투석여과

- 멸균 여과

특히 바람직한 양태에서, 추가 정제 단계는 리신 리간드(예: Lys-세파로스)를 갖는 친화성 컬럼을 포함한다. 개별적 공정 단계의 수 및 순서는 변할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하나 이상의 음흡착 또는 크로마토그래피 단계는 Al(OH)₃ 흡착 직후에 일어날 수 있다. 이는 가능한 피브리노겐-분해 단백질이 초기에 고갈되고, 따라서 정제의 후속 과정에서 피브리노겐의 안정성에 더이상 역효과를 주지 못한다는 이점을 갖는다.

특히 바람직한 양태가 사용되는 경우, 액체 형태의 피브리노겐을 30℃에서 1개월 동안 저장시에 피브리노겐의 분해는 첨가된 단백분해 억제제의 부재하에 상당히 감소될 수 있으며, 즉 상당히 많은 저분자량 분해 단편이 이 저장 시기에 생성된다. SEC-HPLC 분석에 의해서, 잔류 피크와 비교된 저분자량 분해 단편의 비율 증가율은 리신 리간드를 갖는 친화성 컬럼을 추가로 사용하는, 특히 바람직한 양태의 사용시에 2.5% 미만, 특히 1.5 내지 2% 미만임을 알 수 있다. 따라서, 본원은 또한 피브리노겐 농축물 또는 피브리노겐을 갖는 상응하는 약제학적 제제에 관한 것이며, 이는 액체 형태로 30℃에서 1개월 동안 저장 후에 SEC-HPLC에 의해 측정된, 2.5 내지 3% 미만의 피브리노겐 분해 단편, 또는 총 피크 면적을 기준으로 하여, 분해 단편에서 약 1.5 내지 2.5% 미만의 증가를 나타낸다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 정제된 피브리노겐에 관한 것이다. 이러한 방식으로 수득된 피브리노겐, 또는 상응하는 약제학적 제제는 바람직하게는 이제 0.2ng 이하/OD_280-320의 F XI 및/또는 20ng 이하/OD_280-320의 F XII 및/또는 5ng 이하/OD_280-320의 플라스미노겐 및/또는 0.02ng 이하/OD_280-320, 바람직하게는 0.01ng 이하/OD_280-320의 t-PA를 포함한다.

음성 크로마토그래피 또는 흡착에 의해 피브리노겐을 정제하기 위한 본 발명 의 공정 단계 동안에 염료 컬럼, 양이온 교환제 또는 소수성 겔에 결합되는 오염 단백질은 이들 단백질 성분을 분리시키기 위한 개시 기제로서 사용할 수 있다. 상응하는 단백질 농축물은 상응하는 겔 물질로부터 단백질을 용출시켜 및 적합한 경우, 추가 정제 또는 공정 단계에 의해 수득할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 플라스미노겐, t-PA, F XII 또는 F XI의 농축물을 제조할 수 있다. 따라서, 본원은 하나 이상의 혈장 단백질을 분리하는 방법을 포함하며, 하나 이상의 혈장 단백질에 결합되는 겔 물질을 사용하는 상응하는 약제학적 제제는 선택된 조건하에 피브리노겐을 결합시키지 않으며, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 염료 컬럼 상의 친화성 크로마토그래피에 적합하다.

본원은 추가로 본 발명의 방법에 의해 정제된 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제의 제조에 관한 것이다. 가능한 약제학적 제제는 전문가에게 공지되어 있으며, 첨가는 계획된 용도에 따르는다. 전문가에게 공지되고 피브리노겐의 정맥내 투여에 적합한 제형화 성분은 피브린 아교로서 사용하기 위해 상이할 수 있다. 또한, 중간체 저장이 액체 또는 동결된 상태의, 동결건조물로서 계획되는 경우, 특정한 첨가를 고려할 수 있다. 단백질에 대해 공지된 동결건조 보조제에는, 예를 들어, 당(예: 수크로스, 만노스, 갈락토스 및 글루코스), 당 알콜(예: 만니톨 또는 소르비톨) 또는 아미노산이다. 상기 저장 형태에 가능한 제형화 성분은 일가 금속염(예: 염화나트륨 또는 염화칼륨), 이가 금속염(예: 염화마그네슘 또는 염화칼슘), 아미노산(예: 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 이소류신), 탄수화물(예: 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 셀룰로스, 소르 비톨, 만니톨 및 글리코스아미노글리칸), 세정제(예: 폴록사머 또는 폴리소르베이트), 카오트로픽(chaotropic) 제제(예: 우레아 및 구아니딘 또는 이의 유도체), 억제제, 예를 들어, 아프로티닌, 알파-2-항플라스민, 알파-2-마크로글로불린, 알파-1-항플라스민, C1-억제제, 항트롬빈, 플라스미노겐 활성화제 억제제(PAI), 트롬빈-활성화가능한 섬유소용해 억제제(TAFI) 및 리신 동족체(예: ε-아미노카프로산), 혈장 단백질(예: F XIII), 항산화제(예: 아스코르브산), 완충제 물질{예: 아미노산(예: 아르기닌), 완충 시스템(예: 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 석시네이트, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 글리실 글리신, 카보네이트 및 비카보네이트) 또는 이들의 혼합물이 있다. pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이다.

다음 첨가제는, 예를 들어, 액체 피브린 아교의 성분으로서 피브리노겐 용액의 제조에 적합하다: NaCl(0 내지 400mM), Na₃-시트레이트(0 내지 50mM), L-Arg x HCl(0.1 내지 1M), CaCl₂(0 내지 10mM) 및 적합한 경우, 다른 안정화제(예: 아미노산, 탄수화물 및 세정제).

본 발명은 추가로 피브리노겐의 또는 본 발명의 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 방법에 의해 정제된 피브리노겐을 포함하는 약제학적 제제의 용도에 관한 것이다. 가능한 적용이 전문가에게 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 의해 제조된 피브리노겐은 피브리노겐의 모든 공지된 용도에 사용할 수 있다. 의학적 용도는 바람직하게는 사람에 관한 것이지만, 수의학에서의 용도가 또한 포함된다. 본 발명의 피브리노겐 제제는 일반적으로 피브리노겐 결핍 상태의 치료에 적합하다. 이러한 결핍 상태는 예를 들어, 심한 상처, 심각한 출혈, 심한 화상, 약물을 통한, 응고의 병적 활성화(DIC(전이된 혈관내 응고)로도 칭명되는 소모성 응고병) 또는 심각한 간 질환(예를 들어, 간 실질 손상에 기인하는 손상된 합성과 함께)과 연관되어 일어날 수 있다. 기술된 후천성 저섬유소원혈증(혈중 감소된 피브리노겐) 및 무섬유소원혈증(혈중 피브리노겐의 부재 또는 상당한 감소) 이외에, 간에서 피브리노겐 합성의 부재 또는 감소에 의해 유발될 수 있는 선천성 무섬유소원혈증 또는 저섬유소원혈증의 희귀한 경우도 있다.

저섬유소원혈증 및 무섬유소원혈증에 대해, 본 발명의 피브리노겐 제제를 바람직하게는 환자에게 정맥내 주사하여 상응하는 피브리노겐 결핍 상태를 보충한다. 용량은 발생 결핍의 수준에 의해 지배된다.

피브리노겐은 피브린 치료에서 소위 피브린 아교의 중요한 성분으로서 대단히 중요하다. 피브린 아교는 혈액 응고의 마지막 단계를 자극하는데, 안정화된 섬유소는 트롬빈 및 보조제(예: 칼슘 및 F XIII)와 피브리노겐의 배합시에 형성되기 때문이다.

충분히 익히 공지된, 의학에서 피브린 아교의 많은 가능한 용도가 있다[참조: Sierra, Journal of Biomaterials Applications 7(1993) 309-352; Martinowitz & Spotnitz, Thrombosis and Haemostasis 78(1997) 661-666; Radosevich et al. Vox Sanguinis 72(1997) 133-143]. 중요하게 언급하는 것은 지혈, 창상 봉합, 봉합부의 밀봉 및 창상 치유이다. 국소적인 수술 동안의 지혈은 실질성 기관 및 심혈관 전공에 특히 중요하다. 간 또는 비장에 손상 후에 심각한 출혈조차 이러한 방식으로 중단시킬 수 있다. 피브린 아교는 또한 피부 창상의 봉합 및 고정에(피부 이식을 포함) 및 봉합부 밀봉(예를 들어, 십이지장 컷오프부 상에서)에 사용된다. 또한, 가소성 경막 대체물의 밀봉에 및 강의 밀봉 및 흉막 삼출의 일시적 치료를 위해 흉막 막을 접착시키기 위한 용도의 예로서 언급할 수 있다. 피브린 아교는 또한, 연결 조직(예: 골, 연골 및 건)을 접착시키기 위해 유리하게 사용할 수 있다. 합성 섬유소용해 억제제가 유리된 피브리노겐 성분은, 예를 들어, 특히 경막 밀봉을 위한 적용에 유리한데, 이는 트라넥삼산과 같은 물질이 신경독성인 것으로 판명되었기 때문이다[참조: M.G. Schlag, R. Hopf, U. Zifko and H. Redl; Acta Neurochir 144: 63-69(2002)]. 그러나, 피브린 아교는 또한 사용하여 수술후 접착을 방지할 수 있다.

피브리노겐은 또한 피브린 매트릭스를 제조하기 위한 성분으로서 사용할 수 있다. 이러한 담체 물질을 사용하여 활성 물질, 예를 들어, 성장 인자(예를 들어, 또한 골 및/또는 연골 재생을 위한 매트릭스로서 골유도성 단백질과 함께), 항생제, 세포증식억제제, 소염 첨가제 및/또는 창상 치유를 촉진하는 첨가제를 서방출시킬 수 있다. 담체는 또한, 피브린과 다른 물질의 혼합물로 이루어질 수 있다.

피브린 매트릭스는 추가로 생물공학에서, 예를 들어, 조직 공학에서 세포 및 조직을 위한 지지 물질 및 배양 배지로서 또는 이식물(예: 바이오센서)을 싸기 위해서 광범위하게 가능한 용도를 갖는다.

본 발명의 피브리노겐은 또한 진단 보조제의 구성 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명은 추가로 다음 실시예로서 예시되지만, 제한 효과를 주려는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예는 양이온 교환제 물질 및 소수성 겔 및 염료 겔이 피브리노겐-함유 용액을 음성 크로마토그래피에 의해 피브리노겐의 안정성이 출발 물질과 비교하여 증가되는 방식으로 정제시킬 수 있음을 제시한다.

피브리노겐 출발 물질은 EP 제0 103 196호에 기술된 바와 같이 저온멸균된 피브리노겐 농축물의 제조 및 글리신의 첨가에 의한 분별 침전에 의해 수득된다.

피브리노겐-풍부 침전물은 처음에 적합한 수성 용매(50mM NaCl; 20mM 시트르산삼나트륨 이수화물, 0.05% NaN₃, pH 7.3)에 용해시키고, 음성 크로마토그래피를 사용하는 추가 정제 단계에 대한 출발 물질로서 사용한다.

이 정제에 사용된 크로마토그래피 컬럼(φ 0.7cm)은 각각 1.0ml의 개별적 겔 물질로 충전시킨다. 컬럼은 개별적 겔 물질에 따라 완충제 1 내지 3 중의 하나로 평형화시킨다.

완충제 1: 양이온 교환제 및 비교용 컬럼에 대해 50mM NaCl, 50mM 인산나트륨, pH 7.4

완충제 2: 소수성 겔에 대해 1000mM NaCl, 50mM 인산나트륨, pH 6.5

완충제 3: 염료 겔에 대해 50mM 인산나트륨, pH 7.4

30 내지 40ml 분량의 피브리노겐-함유 용액을 적합한 완충제(1 내지 3)에 대 해 투석시키고(표 1 참고), 적합한 완충제를 사용하여 OD_280-320 10으로 희석시킨다. 15ml의 피브리노겐 용액을 각각의 컬럼에 놓고, 컬럼을 각각 1.0ml의 개별적 완충제(1 내지 3)로 세척한다. 컬럼 병류 및 세척액을 합친다. 처음에, 광 밀도는 광도계로 280 및 320nm에서 측정하여(OD_280-320) 수율(%)을 출발 물질과 비교하여 측정한다. 이 물질의 분취액은 보유되어 후속 저장 시험의 분석에 대해 제로 값을 측정한다. 개별적 세척액과 합친 컬럼 병류, 및 출발 물질을 100mM NaCl, 20mM Na₃ 시트레이트, 5% L-Arg, pH 7.2를 포함하는 완충제에 대해 투석시키고, 이의 1ml 분량을 나트륨 아지드와 혼합한다(최종 농도 0.05% w/v). 이러한 상이하게 정제된 피브리노겐 제제, 및 대조군으로서의 출발 물질을 30℃에서 3개월 이하의 저장 기간 동안 저장한다. 피브리노겐의 안정성은 각각의 경우에 적당한 저장 기간 후에 SEC-HPLC에 의해 측정한다. 이는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함하며, 이는 분자량에 따라서 존재하는 단백질 및 분리 생성물을 분별시킨다. 피브리노겐의 단백 분해로부터 생성되는 저분자량 단편은 새로운 피크(단편 피크 4) 및 적합한 경우, 추가의 새로운 피크로서 증가된 보유 시간에 나타난다. 단편 피크의 면적(≤피크 4)을 측정하고 모든 피크의 비율로서 계산한다. 값을 저장 개시 전에 소량에 대해 보정하고(제로 값), 이러한 방식으로 밝혀진 값은 표 1의 결과로서 나타난다. 이들은 가속된 조건하에 저장 동안에 분해 단편의 증가에 영향을 준다.

SEC 컬럼(TSK 겔 G 4000 SWXL, 7.5 x 300mm; 토소 하스)을 갖는 적합한 HPLC 시스템을 사용하여 분석을 수행한다. 단백질 및 단백질 단편은 적당한 저장 시간 후에 0.5ml/분의 유속에서 적합한 수행 완충제 중에 20 내지 25℃에서 분별시킨다. 단백질 및 단백질 단편 피크가 280nm에서 검출된다.

도 1a 내지 1c는 대표적인 피브리노겐 분리가 SEC HPLC를 사용하여 수행되는 일례를 도시한다. 이는 리신-세파로스 크로마토그래피 및 음성 HIC를 사용하여 저장 개시 전에(t = 0, 제로 값, 도 1a) 및 30℃에서 2개월 동안 저장 후에(t = 2개월, 도 1b) 정제된 피브리노겐-함유 용액의 분별을 나타낸다.

도 1c는 대조용으로 30℃에서 2개월 동안 저장 후에(t = 2개월) 음성 HIC를 통한 추가의 정제 없이 피브리노겐-함유 용액의 분별을 도시한다. 이러한 피브리노겐-함유 용액에 대한 제로 값(t = 0)은 나타나지 않는데, 이는 도 1a에 상당하는 분리 결과를 나타내기 때문이다.

약 15 내지 16분의 보유 시간에서 주 피크는 피브리노겐에 상당하는 것이다. 약 24분의 보유 시간에서 피크, 및 더 많은 보유 시간에 피크는 피브리노겐 분해 단편이다. 도 1b로부터, 30℃에서 2개월 동안 저장 후에 분해 단편에 상당하는 피크 아래의 면적은 HIC 정제의 부재하에 마찬가지로 30℃에서 2개월 동안 저장되는 대조 물질과 비교하여 소수성 겔의 사용을 통해 뚜렷하게 감소됨이 명백하다(도 1c). 분해 단편의 적은 발생은 음성 HIC에 의한 정제 후에 피브리노겐의 안정성이 더욱 커진다는 증거로서 간주해야 한다.

표 1a 및 1b는 보유 시간의 증가시에 분해 단편의 비율 증가는 대조(출발 물질)에 대해서보다 언급된 겔 물질 중의 하나에 대해 사용된 피브리노겐의 정제 후에 명백히 더 적음을 나타낸다. 대조군(음성 크로마토그래피 전에 출발 물질)과 비교하여 이에 의해 입증된 피브리노겐의 증가된 안정성은 불과 1개월 후에 명백하게 밝혀지지만, 다음에 긴 저장 시간에 걸쳐 추가로 증가한다. 또한, 특정한 경우에 3개월의 긴 저장 시간 후에, 그러나, 불과 2개월 후의 경향으로 컬럼 물질의 다양한 품질 사이에 구별할 수 있다. 당해 분야의 상태에서 공지된, 플라스미노겐을 고갈시키는 리신-세파로스 4B를 사용하는 친화성 크로마토그래피와 비교하는 경우에도 개선이 달성될 수 있다. 일반적으로 약 70% 이상의 매우 우수한 수율 결과가 또한 전체에 걸쳐 수득된다. 본 실시예는 추가로, 다량의 상이한 양이온 교환제, 소수성 겔 및 염료 겔을 사용하여 피브리노겐의 실질적 안정화, 따라서 분해 단편의 형성에서의 감소를 달성하여, 일반적으로 언급된 크로마토그래피 분리 원칙의 그룹으로부터 지지 물질을 사용하여 개선된 안정성 결과를 확실히 수득할 수 있도록 됨을 명백하게 만든다.

실시예 2

본 실시예에서, 다른 블루 염료 겔을 시험하고, 추가로 실시예 1에서 사용된 양이온 교환제 프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(M) 및 소수성 겔 페닐 세파로스 HP에 대한 이동 상의 완충 조건을 변화시킨다. 피브리노겐의 개선된 안정성은 다시 저장 시험 동안에 분해 단편의 감소된 형성을 통해 설정된다. 피브리노겐-분해 단백질 또는 이의 불활성 전구체(전효소)가 고갈되는지 여부를 추가로 체크한다.

사용된 출발 물질은 예를 들어, 유사한 정제 이외에, 적합한 수성 용매(50mM NaCl; 20mM 시트르산삼나트륨; 0.05% NaN₃ pH 7.4, 표 2에서 완충제 SM)에 용해된 후에, 바람직하게는 용매에 대한 투석 후에 리신-세파로스 상에서 정제되는 피브리노겐이다.

사용된 크로마토그래피 컬럼(컬럼 바디 φ = 0.7cm, h = 2.5cm; 제조원: 퀴아겐(Qiagen))은 각각 1.0ml의 개별적 겔 물질로 충전시킨다. 겔 물질은 적합한 완충제으로 평형시킨다.

피브리노겐-함유 부하 용액은, 적합한 경우, NaCl을 첨가하고 pH, 및 150 또는 300 OD_280-320/겔의 ml의 단백질의 양(표 2 참고)에 상당하는 용액의 용량을 비제한 적하 속도로 조절함으로써 상기 완충 조건에 근접된다. 컬럼을 각각의 경우에 1ml의 적합한 완충제으로 세척한다. 세척액을 개별적 병류와 합치고, 50mM NaCl, 20mM 시트르산삼나트륨, 0.05% NaN₃, pH 7.4에 대해 4℃에서 밤새 투석시킨다. 저장은 30℃에서 다양한 길이의 저장 시간(0 내지 2개월)동안 일어난다.

SEC-HPLC를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석한다.

또한, 플라스미노겐, XI 인자 및 XII 인자의 양은 ELISA 측정법에 의해 측정한다. 샌드위치 ELISA에서, 플라스미노겐은 처음에 미량적정판 위에 포획 항체로서 고정된 래비트 폴리클로날 항체(IgG 제제; 다데 베링(Dade Behring))에 결합된다. 검출은 동일한 폴리클로날 항체 제제이지만, 페록시다제로 표지된 것을 사용하여 일어난다. F XII는 제조업자의 정보에 따라서 F XII ELISA 키트(제조원: 네덜란드의 코르디아 라이프 사이언시즈(Kordia Life Sciences))를 사용하여 측정한다. 마찬가지로, F XI는 제조업자의 정보에 따라서 F XI ELISA 키트(제조원: 네덜란드의 코르디아 라이프 사이언시즈)를 사용하여 정량화한다.

고갈 인자(DF)는 출발 물질에서 OD_280-320에 대해 측정된 단백질(예: 플라스미노겐, F XI 또는 F XII)의 양 및 개별적 음성 크로마토그래피 후에 피브리노겐-함유 용액 중의 OD_280-320에 대해 측정된 단백질의 양의 비이다.

결과는 표 2에 나타나 있다.

표 2로부터 명백한 바와 같이, 다른 시험된 블루 염료 겔의 용도는 또한 분해 단편의 발생 감소에, 즉 피브리노겐의 증가된 안정성의 달성에 적합하다. 동시에 예로서 플라스미노겐, F XII 및 F XI가 - 또한 상이한 정도로 - 사용된 음성 크로마토그래피를 통해 분리 파라미터를 적당하게 선택하여 고갈될 수 있음이 입증된다.

기대되는 바와 같이, 양이온 교환제(프락토겔 EMD SO₃ ^- 650)의 효율은 이동 상(완충제 조성물)의 의존성을 나타낸다. 플라스미노겐 및 F XII의 양호한 고갈은, 이동 상의 pH가 약 6.5 내지 7.5인 경우에 입증될 수 있다. 분리물의 pH가 상승되는 경우, 액체 상태로 저장시에 피브리노겐의 안정성은 감소하지만, 출발 물질에 대해서보다 여전히 명백하게 우수하다. 한편, 피브리노겐과 관능성 그룹의 상호작용이 증가하고 컬럼 물질에 일부 흡착되기 때문에 피브리노겐의 수율은 낮은 pH 값에서 감소하므로, 이동 상에 대한 양이온 교환제 프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(M)의 경우에 최상의 조건은 약 7.0의 pH 범위에서이다. 염 농도의 동시 증가는 피브리노겐의 수율을 증가시키지만, 동시에 안정성은 약간 감소된다. 따라서, 프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(M)의 경우에, 염 농도는 바람직하게는 약 50mM NaCl의 영역에서 유지되며, 예를 들어, 겔의 ml당 부하된 양은 증가되어 수율을 개선시킨다. 유사하게 다른 양이온 교환제에 대한 이동 상의 최적 조성을 시험할 수도 있다.

소수성 겔은 또한, 이동 상, 특히 완충제의 염 농도에 대한 의존성을 나타낸다. 페닐 세파로스 HP를 사용하여, 예를 들어, 플라스미노겐의 고갈 및 피브리노겐의 증가된 안정성을, 피브리노겐의 우수한 수율과 함께, 넓은 범위의 염화나트륨 상에서 달성할 수 있다. 선택된 조건은 모두 출발 물질과 비교하여 증가된 안정성을 유도하여, 원칙적으로 다수의 조건을 유리하게 사용할 수 있다. 다른 소수성 겔 및/또는 다른 완충 조건은 유사한 방식으로 최적화될 수 있다.

또한 표로부터, 본 실시예에서 상이한 겔이 상이한 정도의 플라스미노겐, F XII 및 F XI 고갈에 기여함은 명백하다. F XII의 특히 유효한 고갈은, 예를 들어, 블루 염료 겔 블루 하이퍼 D 및 블루 트리스아크릴 플러스 LS, 블루 세파로스 6FF 또는 양이온 교환제(예: 프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(M))를 통해 달성할 수 있다.

실시예 3

본 실시예에서, 추가 염료, 양이온 교환제 및 소수성 겔, 및 음성 크로마토그래피에 대한 조건을 시험한다.

출발 물질은 실시예 2에 기술된 바와 동일한 정제 도식에 의해 수득된다. 컬럼은 실시예 2에 이미 기술된 바와 같이, 아래에 상술된 개별적 완충제를 사용하여 평형화시킨다.

출발 물질을 적합한 완충제에 대해 투석시킨다. 크로마토그래피 컬럼은 각각의 경우에 150 또는 300 OD_280-320(15ml 또는 30ml와 동일)/겔의 ml로 비제한 적하 속도로 부하된다. 컬럼 병류의 처음 0.5ml를 폐기한다. 컬럼을 1ml의 개별적 완충제으로 세척한다. 세척액을 개별적 병류와 합치고, 50mM NaCl, 20mM 시트르산삼나트륨, 0.05% NaN₃ pH 7.4에 대해 4℃에서 밤새 투석시킨다. 저장은 30℃에서 2개월의 저장 시간동안 일어난다.

SEC-HPLC를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하고, 플라스미노겐, F XII 및 F XI에 대한 고갈 인자(DE)는 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정한다.

표 3a 및 3b는 다른 시험된 겔 및 조건이 또한 분해 단편의 출현을 감소시키기에 적합함을 나타낸다. 부하된 양(컬럼 부하량)의 증가는 개선된 수율을 유도한다.

실시예 4

실시예 1 내지 3에서 적합한 것으로 판명된 특정 겔 물질을 대량으로 유용성에 대해 시험한다. 약 500ml의 겔 용적을 갖는 크로마토그래피 컬럼을 여기에 사용하고, 피브리노겐-함유 용액을 컬럼을 통해 도입한다.

피브리노겐-함유 용액은 동결침전물을 EP 제0 103 196호에 따라 저온멸균된 피브리노겐 용액까지 후처리하여 수득한다.

저온멸균된 피브리노겐 용액을 희석 용액의 용량과 3회 혼합한다(물 중의 3.5g/l NaCl; 5.88g/l 시트르산삼나트륨 이수화물, pH 7.5). 희석 용액의 1l당 90g의 글리신을 첨가한다. 수득된 침전을 원심분리 또는 여과에 의해 제거하고, 폐기한다.

상등액은 임의로, 고체 L-Lys x HCl 또는 EACA를 첨가함으로써 200mM L-Lys x HCl 또는 EACA로 만든다. 추가로, 75g의 글리신을 1l당 첨가한다. 피브리노겐-풍부 침전은 원심분리에 의해 수득하고, 추가로 가공할 때까지 -25℃에서 저장한다.

미량의 플라스미노겐을 추가로 정제 및 고갈시키기 위해서, 피브리노겐-풍부 침전을, 바람직하게는 완충제(20mM 시트르산삼나트륨, 50mM NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)에 대해 투석시킨 후에 용해시키고, 리간드로서 L-리실 라디칼을 갖는 매트릭스가 있는 크로마토그래피 컬럼 위에 도입한다. 병류는 후속 단계에 추가로 사용한다.

피브리노겐의 안정성에 영향을 주는 추가 오염물질을 제거하기 위해서, 피브리노겐-함유 용액을 각종 제2 크로마토그래피 컬럼 위에, 적합한 경우, 완충제 조성물을 바꾸기 전에 도입한다.

A: 피브리노겐-함유 용액은 블루 염료 겔을 함유하고 리간드로서 유도체화된 안트라퀴논 염료(예: 블루 아가로스; 프로메틱)를 포함하는 매트릭스를 갖는 컬럼(φ 6cm, 용적 약 735ml) 위에 직접 도입하고, 병류를 수집한다. 컬럼을 1 컬럼 용량(CV)의 완충제(20mM 시트르산삼나트륨, 50mM NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)로 세척한다.

B: 피브리노겐-함유 용액은 0.1M HCl을 첨가하여 pH 6.7로 조절하고, 리간드로서 SO₃ ^- 그룹을 갖는 매트릭스(프락토겔 EMD SO₃ ^- 650(M))가 있는 컬럼(φ 6cm, 용적 약 500ml 또는 φ 6cm, 용적 약 147ml) 위에 도입한다. 병류를 수집한다. 컬럼을 1 CV의 완충제(20mM 시트르산삼나트륨, 50mM NaCl, pH 6.5, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)로 세척한다.

C: 피브리노겐-함유 용액은 결정성 NaCl을 첨가하여 1M NaCl의 최종 농도로 조절하고, 리간드로서 페닐 그룹을 갖는 소수성 매트릭스(페닐-세파로스 HP)가 있는 컬럼(φ 6cm, 용적 약 500ml) 위에 도입하고, 병류를 수집한다. 컬럼을 1CV의 완충제(20mM 시트르산삼나트륨, 1M NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)로 세척한다.

D: 피브리노겐-함유 용액은 결정성 NaCl을 첨가하여 1M NaCl의 최종 농도로 조절하고, 리간드로서 부틸 그룹을 갖는 소수성 매트릭스(마크로 프렙 3급-부틸 HIC 수지)가 있는 컬럼(φ 6cm, 용적 약 500ml) 위에 도입하고, 병류를 수집한다. 컬럼을 1CV의 완충제(20mM 시트르산삼나트륨 이수화물, 1M NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)로 세척한다.

피브리노겐 제제는 피브리노겐-함유 병류를 개별적 세척액과 합치고, 처음에 적합한 한외여과 방법에 의해, 용도에 따라 OD_280-320nm = 약 2 내지 200, 바람직하게는 약 20 내지 160의 단백질 농도로 만들고, 계속해서 다음 제형화 성분을 함유하는 용액에 대해 투석시킨다: NaCl, Na₃ 시트레이트 x 2H₂O, L-Arg x HCl, 임의로 CaCl₂.

최종 농축 및 멸균 여과에 의해 피브리노겐 제제가 생성되고, 이를 30℃에서 1개월 동안 저장 후에 피브리노겐 분해 단편의 함량에 대해 SEC-HPLC(실시예 1 참고)에 의해 시험한다(표 4 참고).

결과는 음성 크로마토그래피의 사용을 통한 대규모인 경우에도 1개월 동안 가속된 저장 후에 생성된 분해 단편의 차이(δ(≤피크 4))를 2% 이하로 감소시킬 수 있으며, 따라서 30℃에서 저장시에 용액 중의 피브리노겐의 안정성이 뚜렷하게 증가됨을 나타낸다.

실시예 5

본 실시예에서, 염료 겔 및 소수성 겔을 사용하는 배치식의 두가지 음흡착이 병행된다.

피브리노겐-함유 용액은 EP 제0 103 196호에 기술된 바와 같이, 출발 물질로서 동결침전물을 수산화알루미늄(Al(OH)₃)으로 2회 흡착시켜 수득한다.

오염 단백질(예: 특히, 피브리노겐-분해 단백질)은 추가 흡착을 배치식으로 수행하여 감소/제거한다. 여기에 사용된 겔 물질은 리간드로서 유도체화된 안트라퀴논 염료를 갖는 블루 세파로스 6FF였다. 0.5g의 필터-습윤 겔을 피브리노겐-함유 용액 10g당 첨가한다. (후속 교반 시간: 90분). 다음에, 염료 겔은 원심분리로 제거한다(25℃에서 20분 및 1500g).

피브리노겐-함유 상등액을 추가 음흡착에 적용한다. 페닐 세파로스 HP를 여기에 사용한다. 겔 물질은 마찬가지로 피브리노겐-함유 용액 10g당 0.5g의 비로 사용한다. (후속 교반 시간: 90분). 흡착 후에, 결합된 오염 단백질을 갖는 겔 물질은 원심분리로 제거한다.

후속 저온멸균 및 글리신 침전은 EP 제0 103 196호에 따라서 수행하되, 단 200mM Lys의 존재하에 침전이 일어난다.

추가 정제 및 플라스미노겐 제거 후에, 피브리노겐-풍부 침전을 처음에 적합한 수성 용매에 용해시키고, 여과시키고, 바람직하게는 완충제(20mM 시트르산삼나트륨 이수화물, 50mM NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)에 대해 투석시키고 광 밀도를 약 10으로 조절한 후, 리간드로서 L-리실 라디칼을 갖는 겔 물질이 있는 크로마토그래피 컬럼 위에 도입한다.

피브리노겐 제제는 피브리노겐-함유 용액을 처음에 적합한 한외여과 방법에 의해, 용도에 따라서, OD_280-320nm = 약 2 내지 200, 바람직하게는 약 20 내지 160의 단백질 농도로 만들고, 계속해서 실시예 4에 언급된 제형화 성분을 함유하는 용액에 대해 투석시킴으로써 제조한다.

멸균 여과에 의해 피브리노겐 제제가 생성되며, 이를 실시예 1에 따라서 SEC-HPLC를 사용하여 안정성에 대해 시험한다. 이에 의해, 피크 4 및 더 작은 피크를 기준으로 하여 측정된 분해 단편 비율이 1.0% 미만으로 나타나며, 이는 30℃에서 1개월 동안 저장 후에 및 제로 값의 삭제 후에 상응하는 대조군 후처리에 의한 경우보다 덜 뚜렷하다.

본 실시예로, 배치식의 음흡착을 또한 사용하여 용액 중의 피브리노겐의 최대 안정성을 수득할 수 있음을 제시할 수 있다. 추가로, 다수의 음흡착을 합칠 수 있음이 나타난다. 또한, 음흡착 및/또는 음성 크로마토그래피를 사용하는 공정 단계는 피브리노겐을 정제시키는 방법에서 여러 지점에서 합리적으로 통합시킬 수 있음이 명백하다. 따라서, 본 실시예에서, 앞의 실시예와 반대로, 음흡착을 정제 방법의 아주 초기에, 수산화알루미늄 처리 직후에 사용한다. 저온멸균, 글리신을 사용하는 침전 및 리신-세파로스에 의한 추가 플라스미노겐의 제거는 이후에만 일어난다.

실시예 6

본 실시예는 피브리노겐-분해 단백질이 적합한 기공 크기의 선택을 통한 한외여과를 사용하여 고갈될 수 있는 정도를 조사한다.

피브리노겐-함유 용액은 실시예 1 이하에 따라서 진행하고 저온멸균된 침전의 제조를 포함함으로써 수득된다.

피브리노겐-분해 단백질의 추가 정제 및 고갈을 위해서, 피브리노겐-풍부 침전을 먼저 적합한 수성 용매에 용해시키고, 300 kDa의 컷오프를 갖는 한외여과 막을 사용하여, 완충제(20mM 시트르산삼나트륨 이수화물, 50mM NaCl, pH 7.4, 임의로 방부제로서 0.05% NaN₃ 함유)에 대해 집중 투석여과에 적용한다.

플라스미노겐은 리간드로서 L-리실 라디칼을 갖는 겔 물질이 있는 크로마토그래피 컬럼 위에 용액을 도입하여 제거한다.

피브리노겐 제제는 피브리노겐-함유 용액을 처음에 적합한 한외여과 방법 및 막(컷오프 = 300kDa)에 의해, 용도에 따라서, OD_280-320nm = 약 2 내지 200, 바람직하게는 약 20 내지 160의 단백질 농도로 만들고, 계속해서 적합한 제형화 성분을 함유하는 용액에 대해 투석시킴으로써 제조한다.

최종 농축 및 멸균 여과에 의해 피브리노겐 제제가 생성되며, 이를 저장 개시 전에 및 30℃에서 1개월 동안 저장 후에 SEC-HPLC(실시예 1 참고)를 사용하여 피브리노겐 분해 단편의 함량에 대해 시험한다. 이에 의해, 제로 값을 삭제한 후에, 통상적인 한외여과를 사용하는 대조군과 비교하여 분해 단편의 감소된 비율이 나타난다.

따라서, 추가 피브리노겐-분해 단백질이 고갈되고, 더욱 안정한 피브리노겐 농축물이 300 kDa의 컷오프로 한외여과에 의해 제조될 수 있음을 제시할 수 있다.

실시예 7

피브리노겐 침전은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, Lys-세파로스 상의 음성 크로마토그래피에 의해 추가로 정제시킨다. 피브리노겐 용액 1l당 염화나트륨 1mol로 만든 후, 후자를 부틸-세파로스로 충전된 크로마토그래피 컬럼에 넣고, 완충제으로 세척한다. 컬럼의 병류를 농축시키고, 투석시키고, t-PA, 플라스미노겐 및 F XI의 함량에 대해 시험한다. 비교용 후처리를 대조군으로서 수행하고, 여기서, 부틸-세파로스 상의 음성 크로마토그래피는 수행하지 않는다. 결과로서, 추가의 HIC는 t-PA, 플라스미노겐 및 F XI의 농도를 뚜렷하게 감소시키고, 30℃에서 저장 후에 안정성이 증가됨을 제시할 수 있다(HIC를 수행하는 경우, 30℃에서 1개월 후에 피브리노겐 단편의 비율은 약 20% 적다).

실시예 8

피브리노겐 침전을 제조하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 Lys-세파로스 상에서 음성 크로마토그래피에 의해 정제시킨다. 추가 정제는 염료 컬럼, HIC 및/또는 양이온 교환제에 의해 이행된다. 피브리노겐 용액은 투석여과 및 한외여과에 의해 다음 제형화 완충제로 옮기고, 멸균 여과 후에, 30℃에서 가속된 저장에 적용한다.

열거된 제형의 안정성은 매우 우수하며, 단편 형성은 매우 적은 정도로만 관찰된다{2% 미만의 단편(δ(≤피크 4))이 30℃에서 1개월 저장 동안에 생성된다}. 당해 용액은 액체 상태로 저장될 수 있고 둘 이상의 성분으로 이루어진 피브린 아교의 성분으로 사용하기에 적합하다.

본 발명에 의해, 놀랍게도, 경제적으로 공업적 규모로 수행할 수도 있고 용액 중의 안정성이 상당히 증가된 피브리노겐을 우수한 수율로 제공할 수 있는, 피브리노겐의 정제 방법이 제공된다.

Claims (26)

1. 하나 이상의 오염 단백질이 양이온 교환제, 소수성 겔, 염료 겔 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로 선택된 것을 사용하는 하나 이상의 음성 크로마토그래피, 하나 이상의 음흡착 또는 이들 둘 다에 의해 고갈되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는, 피브리노겐-함유 용액의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 설포메틸 그룹(S 타입), 설포프로필 그룹(SP 타입), 카복시메틸 그룹(CM 타입) 또는 다른 적합한 음전하 관능성 그룹이 양이온 교환제의 관능성 그룹으로서 사용되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 소수성 겔이 관능성 그룹으로서 알킬 그룹을 포함하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 소수성 겔이 관능성 그룹으로서 페닐 그룹 또는 유도체화된 페닐 그룹을 포함하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 소수성 겔이 관능성 그룹으로서 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 옥틸 그룹을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 블루 염료 겔이 염료 겔로서 사용되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 레드 또는 그린 염료 겔이 염료 겔로서 사용되는 방법.
8. 제1항, 제6항 및 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 염료 겔이 블루 하이퍼 D, 미메틱 블루 아가로스, 미메틱 블루 SA P6XL, 미메틱 블루 1 P6XL, 블루 트리스아크릴 플러스 LS, 블루 유니플로우, 블루 세파로스 6FF, 블루 세파로스 CL 6B, 레드 세파로스 CL 6B, 프락토겔 TSK AF 그린, 매트렉스 겔 그린 A 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 음성 크로마토그래피, 음흡착 또는 이들 둘 다가 pH 5.5 내지 8에서 수행되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 음성 크로마토그래피의 병류 중 또는 음흡착의 상등액 중의 피브리노겐의 수율이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 음흡착 또는 음성 크로마토그래피를 포함하는 공정 단계가 피브리노겐에 대한 플라스미노겐의 결합을 약화시키는 물질의 존재하에 수행되는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈액, 트랜스제닉 동물로부터의 우유 또는 발효 상등액 또는 이로부터 생성된 분획으로부터 수득된 혼합물이 출발 물질로서 사용되는 방법.
13. 제12항에 있어서, 사람 혈장, 혈장 분획 또는 동결침전물이 출발 물질로서 사용되는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 침전되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 글리신 또는 다른 아미노산에 의한 하나 이상의 침전을 포함하는 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 관능성 그룹으로서 리신 또는 리신 동족체를 갖는 겔 물질 상에서 플라스미노겐이 제거되는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 감염성 입자의 고갈, 제거 또는 이들 둘 다를 위한 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈장 분획의 제조, 수산화알루미늄에의 흡착, 바이러스와 같은 감염성 입자의 불활성화, 침전, 추가 정제 및/또는 불활성화 단계, 음성 크로마토그래피 및/또는 음흡착, 한외여과 및 멸균 여과와 같은 공정 단계가 병행되는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에서 청구된 바와 같이 제조된 피브리노겐 제제.
20. 제19항에 있어서, F XI 함량이 1ng 이하/OD_280-320, 바람직하게는 0.2ng 이하/OD_280-320인 피브리노겐 제제.
21. 제19항에 있어서, F XII 함량이 20ng 이하/OD_280-320, 바람직하게는 10ng 이하/OD_280-320인 피브리노겐 제제.
22. 제19항에 있어서, t-PA 함량이 0.02ng 이하/OD_280-320, 바람직하게는 0.01ng 이하/OD_280-320인 피브리노겐 제제.
23. 제19항에 있어서, 30℃에서 1개월 동안 액체 상태로 저장 후의 저분자량 피브리노겐 분해 단편의 비율이 3% 미만인 피브리노겐 제제.
24. 피브린 아교를 제조하기 위한, 제19항에서 청구된 피브리노겐 제제의 용도.
25. 피브린 매트릭스를 제조하기 위한, 제19항에서 청구된 피브리노겐 제제의 용도.
26. 제19항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 제형화 성분 NaCl, Na₃ 시트레이트, Arg 또는 Arg x HCl 및 CaCl₂ 또는 이들의 혼합물을, 아미노산 및 아미노 그룹-함유 방향족 화합물과 같은 다른 제형화 성분과 함께 포함하는 피브리노겐 제제.

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