KR20060006846A - 발효에 의한 티아민 생산 - Google Patents

발효에 의한 티아민 생산 Download PDF

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마르쿠스 귄터 고에세
존 비 퍼킨스
기슬라인 쉰스
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 티아민 생성물을 과생산하여 배지로 방출하게 하는 돌연변이를 함유하는 미생물을 이용하여 티아민 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 미생물의 생물학적으로 순수한 배양물 및 돌연변이를 함유하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한, 임상 시료에서 병원성 미생물을 검출하는 방법, 항생제를 확인하기 위한 분석법, 및 이런 분석법에 의해 확인되는 항생제에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 티아민 생산{THIAMIN PRODUCTION BY FERMENTATION}
본 발명은 티아민 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 티아민 생성물을 과생산하여 배지로 방출하게 하는 돌연변이를 함유하는 미생물을 이용하여 티아민 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 미생물의 생물학적으로 순수한 배지 및 돌연변이를 함유하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또한 제공된다. 또한, 임상 시료에서 병원성 미생물을 검출하는 방법, 항생제를 확인하기 위한 분석법, 및 이런 분석법에 의해 확인되는 항생제에 관한 것이다.
또한 비타민 B1으로도 알려져 있는 티아민은 비타민의 수용성 B 복합체의 일원이고, 포유동물에게는 영양학적으로 필요하다. 티아민의 파이로포스페이트 형태는 생체 내에서 많은 탄화수소 및 아미노산 대사 경로, 예를 들면 피루베이트 디하이드로게나제, 피루베이트 옥시다제 또는 트랜스케톨라제에 의한 이화 반응들에서 조효소로서 작용한다. 다른 비타민(예를 들면 라이보플라빈 및 바이오틴) 생합성 경로와는 달리, 티아민은 드 노보(de novo) 경로의 일부가 아니라, 실제로 샐비지 (salvage) 경로의 일부이다.
티아민 생합성에서의 대부분의 효소 단계 및 중간체는 이. 콜라이(E. Coli)에서 연구되어 왔고, 다소 덜하게는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 리조븀(Rhizobium)에서 연구되어 왔다(리뷰에 대해서는 브라운(Brown) 및 윌리암슨(Williamson)의 문헌[(1987), pp. 528-532, In F.C Neidhardt 등(편집) Escherichia Coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C]; 와이트(White) 및 스펜서(Spenser)의 문헌[(1996), pp. 680-686, In F.C Neidhardt 등(편집) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, vol. 2. American Society for Microbiology, Washington, D.C.]; 베글리(Begley) 등의 문헌[(1999), Arch. Microbiol. 171: 293-300]). 티아민 경로에서의 단계를 코딩하는 이. 콜라이 유전자는 염색체에서 4곳의 별개의 부위에 위치하고 있다: 90"의 thiCEFSGH 오페론; 46"에서의 ThiMD 오페론, 개별적인 thiJ 및 thiL 유전자는 9.5" 근처에 모여있고, thiK는 25"에 있다. 이들 모든 유전자는 클로닝되었고 서열 확인되었으며, 이들 유전자에 의해 코딩되는 많은 효소는 이. 콜라이에서 과다생산되었고, 이들의 효소 활성이 측정되었다.
피리미딘 잔기인 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘 포스페이트(HMP-P)는 5-아미노이미다졸 라이보타이드(AIR)에서 유래되었고, 드 노보 퓨린 생합성 경로에서의 중간체이다. 그램-음성 박테리아에서, AIR의 HMP-P로의 전환은 thiC 유전자 생성물에 의해 촉매된다. 그런 다음 HMP-P가 ThiD 키나제에 의해 HMP-PP로 인산화된후 티아졸 유니트와 커플링된다.
티아졸 잔기인 5-(2-하이드록시에틸)-4-메틸티아졸 포스페이트(HET-P)는 L-타이로신 및 1-데옥시-D-자이룰로즈 포스페이트(DXP)로부터 유래되고; 황 원자는 아마도 L-시스테인으로부터 유래된다. 이 반응은 최소한 5개의 유전자, thiF, thiS, thiG, thiH 및 thiI의 발현을 필요로 한다.
HMP-PP와 HET-P의 커플링은 thiE에 의해 코딩되는 티아민 포스페이트 파이로포스포릴라제에 의해 촉매되어 티아민 모노포스페이트(TMP)를 생성한다. 그런 다음, TMP는 thiL이 코딩하는 티아민 모노포스페이트 키나제의 활성에 의해 인산화되어 티아민 파이로포스페이트(TPP)를 형성한다. 티아민이 드 노보 경로의 일부가 아니기 때문에, 이. 콜라이는 외래 티아민을 TMP로 전환시키기 위해 thiK에 의해 코딩되는, 샐비지 효소인 티아민 키나제를 필요로 한다.
비. 섭틸리스(B. subtilis)에서의 티아민 합성은 이. 콜라이에서 발견되는 것과 동일한 효소 및 중간체를 이용하는 것으로 보인다(예를 들면 퍼킨스(Perkins) 및 페로(Pero)의 문헌[2001, pp. 271-286, In Sonenshein 등(편집), Bacillus subtilis and its relatives: from genes to cells, American Society for Microbiology, Washinton, D.C.]). 그러나, 중요한 차이점이 있다. 전통적인 유전자의 이름이 이. 콜라이와 비. 섭틸리스에서 서로 다르다. 먼저, 이. 콜라이에서의 HMP 생합성 효소 ThiC, 티아민-포스페이트 파이로포스파타제 ThiE 및 하이드록시에틸티아졸 키나제 ThiM가 비. 섭틸리스에서는 각각 ThiA, ThiC 및 ThiK로 불린다. 두 번째로, 공지된 비. 섭틸리스 티아민 생합성 유전자는 3개의 덩어리로서 서로 다르게 조직된다: thiA 유전자좌는 thiA 유전자로 구성되고, thiB 유전자좌는 유전자 thiOSFGD1으로 구성되고, thiC 유전자좌는 thiK 및 thiC 유전자로 구성된다. 세 번째로, 티아졸 생합성에서 하나 이상의 효소 단계가 서로 상이하다. 비. 섭틸리스 게놈은 thiH 오르토로그(ortholog)를 함유하지 않는다. 대신 thiO(thiB 유전자좌에서의 yjbR)가 티아졸 생합성에 관여하는 옥시다제 활성을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 유전자는 이. 콜라이 게놈에는 존재하지 않고, ThiH와 아미노산 동종성을 보이지도 않는다. 이는 리조븀 에틀리(Thizobium etli)의 thi 유전자와 연관된 유전자중 하나(thiO)와 유사하다. 네 번째로, 이. 콜라이 thiD의 2가지 오르토로그가 비. 섭틸리스에서 yjbV(thiD1) 및 ywdB(thiD2)로서 발견되었고, 이는 생합성 및 샐비지 HMP 키나제를 코딩할 수 있다. 최종적으로, thiC 유전자좌는 미지의 유전자 ywbI을 함유하고, 이는 전사 조절자의 lysR 패밀리와 강한 유사성을 나타낸다.
본 발명은 티아민 생산의 규제를 폐지하여 티아민 생성물이 세포로부터 유리되게 하는 돌연변이를 포함하는 바실라세아에(Bacillaceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 및 브레비박테리아세아에(Brevibacteriaceae)로 구성된 군에서 선택된 미생물을 제공한다.
"티아민 생성물"은 단독의, 또는 임의의 조합된 티아민, 티아민 모노포스페이트(TMP) 및/또는 티아민 파이로포스페이트(TPP)를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 미생물은 상기 미생물의 "생물학적으로 순수한 배양균", 즉, 천연 상태에서 일반적으로 미생물과 연관되어 있는 성분, 세포 등과 분리되어 있는 미생물을 의미한다.
부다페스트 협약의 규정에 따라, 다음의 미생물들은 각각 2003년 5월 12일자로 미국 버지니아주 20108 매나사스 피. 오. 박스 1549의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC) 및 2004년 4월 5일자로 독일 데-38124 브라운쉬베그 마쉐로데르 베그 1베 소재의 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; DSMZ)에 하기 개시된 바와 같은 수탁번호로 기탁되었다: 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) TH95(ATCC PTA-5221), 바실러스 섭틸리스 TH101(ATCC PTA-5222), 바실러스 섭틸리스 TH115(ATCC PTA-5223), 바실러스 섭틸리스 TH116(ATCC PTA-5224), 바실러스 섭틸리스 TH404(DSM 16333) 및 바실러스 섭틸리스 TH405(DSM 16334).
본원에서 "돌연변이"는 개질과 상호교환되어 사용되고, 야생형 미생물과 비교하였을 때 미생물의 표현형을 변화시키는, 예를 들면 임의의 기작에 의해 세포 내부 또는 세포 외부에서 티아민 또는 티아민 생성물이 증가되거나 감소되는 것을 가능하게 하는, 미생물, 예를 들면 박테리아의 야생형 DNA 서열을 변화시키는 것을 의미한다. 돌연변이는 하나이상의 프레임 쉬프트(frame shift), 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하고, 넌센스 돌연변이(앰버(UAG), 오커(T/UAA) 및 오팔(T/UGA))을 포함하는 다양한 방식으로 야기될 수 있다. 결실은 단일한 뉴클레오타이드의 결실이거나, 전제 유전자의 결실을 포함하는 더 많은 뉴클레오타이드의 결실일 수 있다.
"아미노산 치환"은 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체함을 의미한다. 이런 치환은 치환된 아미노산이 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 경우 그 성질이 보존적이다. 보존적 치환의 예는 류신의 아이소류신 또는 발린으로의 치환, 아스파테이트의 글루타메이트로의 치환 또는 트레오닌의 세린으로의 치환을 포함한다. 본 발명의 범위에서 비-보존적 치환은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산을 방향족 측쇄를 갖는 것으로 치환하는 것, 예를 들면 류신의 페닐알라닌으로의 치환을 포함한다.
아미노산의 "삽입" 또는 "결실"은 아미노산 서열의 변화를 의미한다. 이들은 전형적으로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위에 포함된다. 특정한 아미노산 서열에서 허용되는 변이는 재조합 DNA 기법을 이용하여 서열에서 뉴클레오타이드를 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환함으로써 또는 합성된 펩타이드를 생산함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
"규제 철폐"는 효소/단백질의 레벨 또는 활성이 변화되거나 개질되어, 이로 인해 티아민 생성물의 생산이 증가되거나 또는 예를 들면 분비, 유출 등에 의해 세포 외부로 티아민 생성물이 방출되는(이로 한정되지는 않는다) 등, 생합성 경로의 효소/단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 변화 또는 개질함을 의미한다. 유전자 발현의 변화 또는 개질은 유전자 그 자체의 DNA 서열, 또는 비-단백질을 코딩하는 DNA 영역을 포함하는 유전자 외부 영역의 DNA 서열을 변화시킴으로서 발생할 수 있다. "규제 철폐"는 또한 티아민 생산이 증가하거나, 티아민 생성물이 분비되도록, 세포의 생합성 유전자의 발현을 변화시키는 대사산물의 세포 내 수준의 임의의 혼란을 의미한다.
한 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 미생물에서 티아민 생산을 규제 철폐시키는 돌연변이가 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 이런 돌연변이는 tx1과 조합된 △thiL, tx26과 조합된 △thiL, tx26과 조합된 tx1 및 tx1과 tx26 둘모두와 조합된 △thiL을 포함한다. △thiL, tx1 및 tx26의 세가지 돌연변이를 모두 포함하는 미생물이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 미생물은 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 코리네박테리움 및 브레비박테리움으로 구성된 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물은 바실러스 속에서 선택되고, 가장 바람직하게는 이는 바실러스 섭틸리스 세포이다.
한 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 돌연변이를 함유하는 미생물은 비. 섭틸리스 TH95이다.
한 양태에서, 본 발명은 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하고, thiA 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 제공한다. 바람직한 미생물은 비. 섭틸리스 TH116이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하고, thiKC 오페론으로부터 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 제공한다. 바람직한 미생물은 비. 섭틸리스 TH115이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하고, tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 제공한다. 바람직한 미생물은 비. 섭틸리스 TH404이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하고, (a) tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 카세트, 및 (b) thiA 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 제공한다. 바람직한 미생물은 비. 섭틸리스 TH405이다.
본 발명에서 "DNA 카세트"는 한정된 제한효소 부위에서 벡터로 삽입될 수 있는 발현 생성물을 코딩하는 DNA의 분획 또는 DNA 코딩 서열을 의미한다. 카세트 제한효소 부위는 카세트가 적절한 판독 프레임으로 삽입되는 것을 보증하도록 디자인된다. 일반적으로 외부 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한효소 부위에 삽입된 후, 전달성 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 벡터에 의해 전달된다. 또한 선형화된 벡터 DNA의 끝부분에 결합된 토포아이소머라제를 이용하여 제한 효소 없이 DNA 단편을 벡터 DNA에 삽입할 수 있고, 이는 PCR-제조된 DNA 단편의 직접 클로닝에 특히 유용하다. 삽입되거나 첨가된 DNA를 갖는 DNA의 단편 또는 서열, 예를 들면 발현 벡터는 또한 "DNA 구축물"로 불릴 수 있다. 흔한 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 쉽게 추가의(외부) DNA를 수용할 수 있고, 적합한 숙주 세포로 쉽게 도입될 수 있는, 일반적으로 박테리아 기원의 이중 나선 DNA라는 자급자족형 분자이다. 플라스미드는 종종 코딩 DNA와 프로모터 DNA를 함유하고, 외부 DNA를 삽입하는데 적합한 하나 이상의 제한효소 부위를 갖는다. "코딩 DNA"는 특정한 단백질 또는 효소의 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열이다. DNA 카세트는, 특정한 뉴클레오타이드 서열에 추가하여, 특정한 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절하기 위한 인핸서 및 프로모터를 포함하는 추가의 전사 조절 인자를 함유한다. "프로모터 DNA"는 코딩 DNA의 발현을 개시하고, 조절하거나 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA와 코딩 DNA는 동일한 유전자에서 나오거나 다른 유전자에서 나올 수 있고, 동일하거나 상이한 미생물에서 나올 수 있다. 플라스미드 및 진균 벡터를 포함하는 다수의 벡터가 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 복제 및/또는 발현을 위해 개시되어 왔다. 비-한정적인 예는 본원에 개시되거나 인용되거나 당 분야의 숙련된 이들에게 달리 공지된 방법을 이용하는, pKK 플라스미드(클로네텍(Clonetech)), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(위스콘신주 매디슨 소재의 노바젠 인코포레이티드(Novagen, Inc.)), pRSET 또는 pREP 플라스미드(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 또는 pMAL 플라스미드(매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), pCR2.1Topo(캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐), pXLTopo(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐) 및 많은 적절한 숙주 세포뿐만 아니라 실시예에 구체적으로 개시된 것들을 포함한다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서의 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들면 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
DNA 카세트는 코딩 DNA의 하나 이상의 카피, 예를 들면 서열의 1 내지 50개의 카피, 바람직하게는 1 내지 25개의 카피, 예를 들면 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개 및 1 내지 20개의 카피를 포함할 수 있다. 서열은 예를 들면 직렬로, 즉, 헤드-투-테일(head-to-tail) 배열을 포함하는 임의의 순서로 배열될 수 있다.
"유효하게 제어되는"은 코딩 DNA의 전사가 예를 들면 프로모터 또는 전사 인핸서에 의해 제어되거나 매개됨을 의미한다. 이런 프로모터 또는 전사 인핸서는 코딩 DNA에 인접하거나, 코딩 DNA의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다.
"강한 구성적 프로모터"는 천연 숙주 세포에 비해 높은 빈도로 mRNA가 개시되게 하는 것이다. 강한 구성적 프로모터는 잘 알려져 있고, 숙주 세포에서 제어되는 특정한 서열에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 그램 양성 미생물에서 나온 이런 강한 구성적 프로모터의 예는 SP01-26, SP01-15, veg, pyc(파이루베이트 카복실라제 프로모터) 및 amyE를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 그램 음성 미생물에서 나오는 프로모터의 예는 tac, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, γ-P R 및 γ-P L 을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하고, (a) 비. 섭틸리스의 퓨린 오페론의 발현을 규제 철폐하는 제 1 돌연변이, 및 (b) 5-아미노이미다졸 라이보타이드(AIR)의 카복시아미노이미다졸 라이보타이드(CAIR)으로의 전환을 차단하는 제 2 돌연변이를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 제 1 돌연변이는 pur 오페론의 리더(leader) 영역 내부의 돌연변이를 포함하고, 제 2 돌연변이는 포스포라이보실아미노이미다졸 카복실라제 I을 코딩하는 purE 유전자 내부의 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 미생물은 비. 섭틸리스 TH101이다.
용어 "전환을 차단하다"는 AIR이 CAIR로 전환되는 세포 기작을 방해하는 돌연변이를 의미한다. 본 발명에서 AIR의 CAIR로의 전환은 바람직하게는 완전히 차단되지만, 75% 이상, 예를 들면 85 내지 90% 이상의 전환의 차단 또한 허용가능하다.
한 양태에서, 본 발명은 티아민 생성물을 생산하는 방법이다. 이 방법은 티아민 생성물이 과생산되어 배지로 방출되게 하는, △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이를 함유하는, 상기 정의된 바와 같은 미생물을 적합한 배지중에서 배양함을 포함한다.
"과생산"은 본 발명의 미생물 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 미생물을 실시예에 개시된 바와 같은 임의의 방법에 의해 측정하였을 때, 천연 미생물이 생산하는 것보다 과량으로 하나 이상의 티아민 생성물을 생성하도록 조작하는 것을 의미한다. 이런 티아민 생성물의 상당한 양이 예를 들면 분비 또는 유출에 의해 배양 배지로 방출된다. 본원에서 사용되는 "상당한 양"이란 세포에 의해 생산되는 티아민 생성물의 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 예를 들면 90 내지 95%가 배지로 분비됨을 의미한다.
"티아민 생성물"과 연관하여 사용되는 경우 "회수"는 티아민 생성물을 배지로부터 분리시키고/시키거나 회수된 티아민 생성물을 순수하거나 얼마간 순수한 형태로 단리함을 포함한다. 티아민 생성물을 예를 들면 발효 배양액으로부터 회수하는 통상적인 방법을 본원 발명에서 이용할 수 있다. 회수는 또한 HPLC를 이용함으로써 티아민 생성물을 단리함을 의미할 수 있다.
한 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 방법은 티아민 전구체의 존재하에서 상기 미생물을 배양함을 추가로 포함한다. 바람직한 전구체는 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘(HMP), 5-(2-하이드록시에틸)-4-메틸티아졸(HET) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
상기 정의된 바와 같은 티아민 생성물을 제조하는 방법에서 상기 미생물이 상기 개시된 바와 같은 비. 섭틸리스의 퓨린 오페론의 발현을 규제철폐하는 돌연변이를 추가로 포함한다면, 본 발명의 다른 양태는 티아민 전구체 및 퓨린 공급원의 존재하에서 미생물을 배양하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 양태에서, 티아민 전구체는 HET이고, 퓨린 공급원은 잔틴이다.
다른 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 방법은 HET 경로의 전구체의 존재하에서 상기 미생물을 배양함을 추가로 포함한다. "HET 경로의 전구체"는 5-(2-하이드록시에틸)-4-메틸티아졸(HET)을 제조하는데 이용되는 탄소-함유 화합물을 의미한다. 이런 전구체는 바람직하게는 글리신, 시스테인, 아이소루신, 트레오닌 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 방법은 HPM 경로의 전구체 또는 HMP 유도체의 존재하에서 상기 미생물을 배양함을 추가로 포함한다. "HMP 경로의 전구체"는 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘(HMP)를 제조하는데 사용되는 탄소-함유 화합물을 의미한다. 이런 전구체의 비-한정적인 예는 5-아미노이미다졸 라이보타이드(AIR)를 포함한다. "HMP의 유도체"는 4-아미노-2-메틸-5-피리미딘메탄아민(그레웨 다이아민(Grewe Diamine))과 동일한 방식으로 작용하는 HMP의 임의의 화학적으로 개질된 변형체를 의미한다.
따라서, 본 발명은 (a) 티아민 생성물을 배지로 과생성시키는 돌연변이를 함유하고 있는, 바실라세아에, 락토바실라세아에, 스트렙토코카세아에, 코리네박테리아세아에 및 브레비박테리아세아에로 구성된 군에서 선택된 미생물을 적합한 배지에서 배양하는 단계, 및 (b) 티아민 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 티아민 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 △thiL, tx1 및 tx26를 포함하는 돌연변이를 함유하는 상기 개시된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 thiA 유전자 생성물을 코딩하는 하나 이상의 카피의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이고, 이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 조절된다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 비. 섭틸리스의 퓨린 오페론의 발현을 규제철폐하는 돌연변이, 및 5-아미노이미다졸 라이보타이드(AIR)의 카복시아미노이미다졸 라이보타이드(CAIR)로의 전환을 차단하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 thiKC 오페론으로부터 유전자 생성물 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하고, 이 폴리뉴클레오타이드 서열이 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어되는, 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하고, 이 폴리뉴클레오타이드 서열이 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어되는, 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 미생물이 (a) tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트, 및 (b) thiA 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)의 하나 이상의 카피를 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 tx1 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 이런 돌연변이는 티아민의 생산이 증가되는 재조합 미생물, 예를 들면 티아민 생산을 규제철폐하여 티아민 생성물이 배양 배지로 배출되게 하는 돌연변이를 함유하는, 바실라세아에, 락토바실라세아에, 스트렙토코카세아에, 코리네박테리아세아에 및 브레비박테리아세아에로 구성된 군에서 선택되는, 미생물의 구축에 유용하다. 아미노산 잔기 116에서 류신을 페닐알라닌으로 치환시키는 돌연변이가 바람직하다(야생형 YloS 서열 식별 번호:32와 비교하였을 때 위치 116에서 Leu가 Phe로 치환된 아미노산 서열의 카피의 경우 서열 번호 31 참고).
본원에서 사용되는 "단리된" 폴리뉴클레오타이드(예를 들면 RNA, DNA 또는 혼합된 중합체) 또는 폴리펩타이드는 그의 천연 상태에서 동반되는 성분으로부터 실질적으로 분리되어 있음을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드의 경우, "단리된"은 예를 들면 라이보솜, 폴리머라제, 많은 다른 게놈 서열 및 단백질과 같은 천연 서열에 자연적으로 수반되는 다른 세포 성분으로부터 분리되어 있음을 의미한다. 용어는 천연적으로 발생하는 상황에서 회수된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드의 경우, 용어 "단리된"은 천연 상태에서 수반되는 성분들로부터 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 시료의 약 60 내지 75% 이상이 단일 폴리펩타이드 서열을 나타낼 때 단량체 단백질이 단리된다. 단리된 단백질은 전형적으로 단백질 시료의 약 60 내지 90% w/w, 보다 일반적으로는 약 95%를 구성할 것이고, 바람직하게는 약 99% 이상의 순도일 것이다. 단백질 순도 또는 동종성은 당 분야에 공지된 다수의 수단, 예를 들면 단백질 시료의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 그런 다음 겔을 염색시켜 단일 폴리펩타이드 밴드가 보이게 하는 등과 같은 당 분야에 잘 공지된 다수의 수단에 의해 나타날 수 있다. 일부 목적을 위해서, HPLC 또는 당 분야에 잘 공지된 다른 수단을 이용하여 더 높은 해상도의 순도가 제공될 수 있다.
한 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 30 또는 엄격한 조건하에서 서열번호 30에 하이브리드를 형성하고, 미생물에 존재하는 경우 티아민 생산의 규제를 철폐시키는 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
"엄격한 조건"하에서 본원에서 확인된 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리드를 형성하고, 동일한 기능을 갖는, 즉, 적절한 세포에 도입되었을 때 티아민 생산의 규제를 철폐하는 핵산은 본 발명의 범위이내이다. "엄격한 조건"은 당분야, 예를 들면 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 1989] 및 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 오수벨(Ausubel) 등 편집](이들은 둘 모두 참고로 본원에 인용되어 있다)에 공지되어 있다. 엄격한 조건은 서열에 의존하고, 서로 다른 상황에서 서로 상이할 것이다. 더 긴 서열은 특히 더 높은 온도에서 하이브리드를 형성한다. 핵산의 하이브리드 형성에 대한 광범위한 설명이 티즈센(Tijssen)의 문헌[Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)]에서 발견된다. 일반적으로 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정한 서열에 대한 열 용융점(Tm) 보다 약 5 내지 10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도에서) 목표물에 상보적인 프로브의 50%가 평형상태인 목표 서열에 하이브리드를 형성하는 온도이다(목표 서열이 과량으로 존재하는 경우 Tm에서 프로브의 50%가 평형상태에서 차지된다). 엄격한 조건은, pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들면 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(50 뉴클레오타이드 이상)의 경우 약 60℃ 이상인 경우일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 불안정화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 이 개시를 위해, 이런 하이브리드 형성에 적합한 "엄격한 조건"은 37℃에서 40% 포름마이드, 1M NaCl, 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 완충액중에서, 약 50℃ 이상, 일반적으로 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도에서 20분동안의 0.2XSSC에서의 1회 이상의 세척, 또는 이의 등가의 조건을 포함하는 것들이다. 양성 하이브리드 형성은 바탕값 수준의 2배 이상이다. 당 분야의 숙련자들은 유사한 엄격성 조건을 제공하기 위해 다른 하이브리드 형성 및 세척 조건이 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
문구 "핵산 서열"은 5'에서 3' 쪽으로 읽히는 데옥시라이보뉴클레오타이드 또는 라이보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중 나선 중합체를 의미한다. 이는 염색체 DNA, 자가-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체 및 주로 구조적 역할을 수행하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 자연적으로 발생되는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 동족체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 지시된 서열 뿐만 아니라, 이의 보존적으로 개질된 변형물(예를 들면 디제너레이트(degenerate) 코돈 치환) 및 상보적인 서열을 명확하게 포함한다. 구체적으로, 디제너레이트 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다(바트저(Batzer) 등의 문헌[Nucleic Acid Res. 19: 5081(1991); 오츠카(Ohtsuka) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 260: 2605-2608(1985)]; 캐솔(Cassol) 등의 문헌[1992]; 로솔리니(Rossolini) 등의 문헌[Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)] 참고).
다른 양태에서, 본 발명은 2개의 연쇄되지 않은 돌연변이, 즉 제 1 돌연변이 tx26-1과 제 2 돌연변이 tx26-2를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 여기서 티아민 제조 미생물에서 두가지 돌연변이 모두의 존재로 인해 티아민 생산이 규제철폐된다. 제 1 돌연변이, tx26-1은 △yufR::Tn917(BGSC#1A642)에 대해 70% 연쇄를 나타내고, 제 2 돌연변이, tx26-2는 ΩmotA::Tn917(BGSC#1A631)에 대해 59% 연쇄를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 △yufR::Tn917(tx26-1)에 대해 70% 연쇄를 나타내는 제 1 돌연변이, 및 ΩmotA::Tn917(tx26-2)에 대해 59% 연쇄를 갖는 제 2 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이고, 여기서, 티아민-생산 미생물에서 돌연변이 둘 모두의 존재로 인해 티아민 생산이 규제철폐된다.
바람직하게는, tx26-1 돌연변이는 서열 번호 33인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 33과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, tx26-2 돌연변이와 조합되어 미생물에 존재하는 경우 티아민 생산의 규제철폐를 야기한다.
바람직하게는, tx26-2 돌연변이는 서열 번호 36인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 36과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, tx26-1 돌연변이와 조합되어 미생물에 존재하는 경우 티아민 생산의 규제철폐를 야기한다.
또한 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 카세트, 즉 (a) 제 1 돌연변이 tx26-1 및 제 2 돌연변이 tx26-2를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 (b) tx1 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 카세트, 및 이런 DNA 카세트를 함유하는 미생물이 본 발명에 의해 제공된다.
추가의 양태는 환자에서 나온 임상 시료에서 병원성 미생물을 검출하는 방법이다. 이 방법은 그램-양성(그램+) 미생물이 시료에 존재하는지를 측정하는 방법, 미생물이 yloS 오르토로그를 함유하는지를 측정하는 방법 및 미생물이 thiL 오르토로그를 함유하는지를 측정하는 방법을 포함하며, 여기서 그램+ 미생물에서 yloS 오르토로그의 존재 및 thiL 오르토로그의 부재는 미생물이 병원성임을 나타낸다.
"임상 시료"는 환자(이는 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 가축이다)로부터 얻은 임의의 분석가능한 시료를 의미한다. 분석가능한 시료는 혈액, 뇨, 변, 타액, 조직, 또는, 존재하는 경우, 본원에 개시된 바와 같이 미생물이 동종되고 특징화될 수 있는 다른 생물학적 공급원으로부터 선택될 수 있다.
상기 정의된 바와 같이 환자로부터의 임상 시료에서 검출되는 미생물은 바람직하게는 리스테리아(Listeria), 스태필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 퍼프링겐즈(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)이다.
yloS 오르토로그만을 함유하고 thiL 오르토로그를 함유하지 않는 많은 그램+ 박테리아가 병원균으로 공지되어 있기 때문에, YloS 단백질은 항균 화합물을 확인하기 위한 귀중한 대상이다. 따라서, 본 발명은 또한, 조절자, 즉, YloS에 결합하거나, 또는 예를 들면 yloS 발현 또는 YLoS 활성에 자극 또는 억제 효과를 갖는 후보자, 시험 화합물 또는 약물(예를 들면 펩타이드, 펩타이드 유사체, 작은 분자 또는 다른 약물)을 확인하기 위한 스크리닝 분석법(또는 방법)을 제공한다.
한 양태에서, (a) YloS 단백질을 포함하는 분석 조성물과 시험 화합물을 접촉시키는 단계 및 (b) 시험 화합물이 YloS 단백질 활성을 억제하는 지를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 화합물은 YloS 단백질 활성의 활성을 억제하는 화합물의 능력에 근거하여 항생제로서 확인되는, 항생제를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 바람직하게는, 분석법은 정제된 YloS 단백질, 부분적으로 정제된 YloS 단백질, YloS 단백질을 생성하는 세포로부터의 조질 세포 추출물, 또는 리스테리아, 스태필로코커스, 클로스트리듐, 엔테로코커스 및 스트렙토코커스로 구성된 군에서 선택되는 병원성 미생물로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 YloS 단백질을 포함한다. 이런 병원성 미생물은 리스테리아 모노사이토게네스, 스태필로코커스 오레우스, 스태필로코커스 에피더미디스, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 퍼프링겐즈, 엔테로코커스 종, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오게네스 및 스트렙토코커스 뉴모니아에를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
항생제를 위한 분석법을 말할 때 "분석 조성물"은 이런 분석을 수행하는데 요구되는 조합된 성분을 의미한다. 이런 분석 조성물은 최소한 YloS 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분 및 시험 화합물, 즉, 시험되는 펩타이드, 펩타이드 유사체, 작은 분자 또는 다른 약물을 필요로 한다.
본원에서 이용되는 "YloS 활성"은 YloS 단백질, 즉 yloS 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 임의의 검출가능하거나 측정가능한 활성을 의미한다. YloS 활성은 다음중 하나이다: (1) YloS 생합성 경로에서 하나 이상의 단계의 조절; (2) YloS 생합성의 촉진; 또는 (3) YloS 돌연변이의 보완. 항생제를 확인하기위한 분석에서, 시험 화합물이 YloS 단백질 번역 또는 yloS 전사를 감소시키거나 또는 YloS 활성을 손실시키는 경우, 시험 화합물이 "YloS 단백질 활성을 억제한다".
본 발명의 시험 화합물은 당 분야에 공지된 화학적 화합물 라이브러리 방법에서의 임의의 다양한 접근법을 이용하여 수득될 수 있고, 이는 천연 화합물 라이브러리, 생물학적 라이브러리, 공간적으로 접근가능한 평행 고체 상 또는 액체 상 라이브러리; 디컨볼류션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1비드 1화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법을 포함한다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리로 제한되고, 다른 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용된다(람(Lam, K.S.)의 문헌[(1997), Anticancer Drug Des. 12:145] 참고).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당 분야에서 발견될 수 있고, 예를 들면 다음과 같다: 드 위트(De Witt) 등의 문헌[(1993) PNAS 90: 6909]; 에르브(Erb) 등의 문헌[(1994) PNAS 91: 11422]; 쥬커만(Zuckermann) 등의 문헌[(1994) J. Med. Chem. 37: 2678]; 초(Cho) 등의 문헌[(1993) Science 261: 1303]; 캐렐(Carrelle) 등의 문헌[(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; 캐렐 등의 문헌[(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 및 갤롭(Gallop) 등의 문헌[(1994) J. Med. Chem. 37: 1233]에서 발견될 수 있다. 화합물의 라이브러리는 용액중에서, 비드 상에, 칩 상에, 박테리아에, 포자중에(미국 특허 제 5,233,409 호), 플라스미드 또는 파지 상에서 존재할 수 있다.
한 양태에서, 분석은 YloS 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분을 발현하는 재조합 미생물을 시험 화합물과 접촉시키고, 시험 화합물이 YloS 활성을 조절하는 능력을 측정하는, 미생물에 근거한 분석법이다. 시험 화합물이 YloS 활성을 조절하는 능력을 측정하는 것은 예를 들면 성장, 세포내 YloS 농도 또는 분비된 YloS 농도(YloS를 억제하는 화합물은 시험 미생물중의 YloS 단백질을 축적시킬 것이기 때문에)를 모니터링함으로써 달성될 수 있다. YloS 활성의 조절이 예를 들면 라벨링된 기질이 중간체 또는 생성물로 전환되는 것을 검출함으로써 측정될 수 있도록 YloS 기질은 방사성동위원소, 효소 라벨 또는 다른 용해성 또는 불용성 신호 생성 잔기로 라벨링될 수 있다. 예를 들면, YloS 기질은 직접 또는 간접적으로 32P, 14C 또는 3H로 라벨링될 수 있고, 방사성동위원소는 섬광계수에 의해 방사성 방출을 직접 계수함으로써 검출된다. 다르게는, YloS 기질을 가용성 또는 불용성 신호 생성 잔기로 직접 또는 간접 라벨링시킨 후, 비색, 효소, 또는 형광 분석법에 의해 신호를 검출할 수 있다. 화합물이 YloS 활성을 조절하는 능력을 측정하는 것은, 다르게는, (검출가능한 마커, 예를 들면 루시퍼라제를 코딩하는 핵산에 유효하게 연결된 yloS-반응성 조절 인자를 포함하는) 리포터 유전자의 유도를 검출하거나, CoA-조절되는 세포 반응을 검출함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 스크리닝 분석법은 YloS 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 생체 외에서 시험 화합물과 직접 접촉시키고, 시험 화합물이 YloS 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하거나, 이의 활성을 조절하는 능력을 측정하는, 세포가 없는 분석법이다. 하나의 이런 양태에서, 분석법은 YloS 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 공지된 기질과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하는 단계, 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 YloS 단백질이 기질에 미치는 효소 활성을 시험 화합물이 조절하는 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 공지된 기질은 YloS 단백질이다. 문구 "YloS 유사체"는 YloS와 동일하거나 유사한 방식으로 작용하는 YloS 단백질과 구조적으로 유사한 화합물을 의미한다. 예시적인 유사체는 라벨링된 YloS 단백질 및/또는 다른 검출가능한 YloS 단백질 유도체를 포함한다. 용어 YloS 유사체는 또한 YloS 단백질과 밀접하게 연관되거나 이로부터 유래되는 화합물, 예를 들면 YloS 기질로서 작용할 수 있는 구조적으로 연관된 화합물을 포함한다.
스크리닝 분석은 미생물, 단백질 및/또는 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 이런 용기의 예는 마이크로타이터 플레이트, 시험관 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 본 발명의 분석 방법의 한가지 이상의 양태에서는, 분석의 자동화를 도모할 뿐만 아니라, 생성물, 리간드 및/또는 기질을 용이하게 분리하기 위해서, YloS 단백질, YloS 기질, 기질 유사체 또는 Ylo 단백질을 발현하는 재조합 미생물중 하나를 부동화시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/YloS 융합 단백질을 글루타티온 세파로즈 비드(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니) 또는 글루타티온 유도화된 마이크로타이터 플레이트 상에 흡착시킬 수 있다. 매트릭스 상에 단백질을 부동화시키기 위한 다른 기법(예를 들면 바이오틴-공액화 및 스트렙타비딘 부동화 또는 항체 공액화) 또한 본 발명의 스크리닝 분석에 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인되는 신규한 약물을 포함한다. 따라서, 적절한 동물 모델에서 본원에 개시된 바와 같이 확인되는 약물을 추가로 이용하는 것은 본 발명의 범위 이내이다. 예를 들면 본원에 개시된 바와 같이 확인된 YloS 조절 약물(예를 들면 항-살균 화합물)을 감염성 동물 모델에서 이용하여, 이런 약물을 이용한 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 측정하고/하거나 병원성 미생물에 의해 야기되거나 유도된 특정한 질병 상태를 치료할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 신규한 약물은 항생제이다.
YloS 조절자는 추가로 본 발명의 YloS 단백질중 임의의 하나의 결정 구조에 근거하여 디자인될 수 있다. 특히, 많은 그램+ 병원성 박테리아에서의 YloS의 발견에 적어도 부분적으로 근거하여, 예를 들면 본원에 개시된 바와 같은 재조합 기법을 이용하여 상당한 양의 YloS 단백질을 생성하고, 단백질을 정제하고 결정화하고, 단백질에 X-선 결정학 방법을 적용하고, 측정된 결정 구조에 근거하여 조절자(예를 들면 활성 부위 조절자, 예를 들면 경쟁성 분자, 활성 부위 억제제 등)를 디자인하고, 본원에 개시된 분석법중 임의의 하나에 따라 디자인된 조절자를 시험할 수 있다.
본 발명의 가장 중요한 결과중 일부를 다음과 같은 도면에서 요약한다.
도 1은 클로람페니콜-내성 유전자를 갖는 플라스미드 pTH43(A)과 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pTH47(B)에 함유된 P 26 thiA 발현 카세트의 구조를 나타낸다.
도 2는 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pTH48에 함유된 P 26 thiKC 발현 카세트의 구조를 나타낸다.
도 3은 비. 섭틸리스 thiB 오페론을 과발현시키는, 균주 TH404를 구성하는데 이용되는 2단계 과정을 나타낸다. 제 1 단계에서, thiB 프로모터 영역을 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(cat) 카세트로 치환함으로써 티아민-영양 요구성 균주를 구축하였다. 그런 다음, thiB 오페론 앞에 박테리오파지의 강한 구성적 P26 프로모터가 통합된 균주를 선택함으로써 독립영양성을 회복시켰다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 예시할 뿐 어떤 방식으로든 한정하고자 하 지 않는다.
실시예 1: 일반적인 방법론
균주
본 발명의 바실러스 섭틸리스 균주는 균주 PY79(독립영양성 SPβc; 미국 오하이오주 43210 콜럼버스 소재 더 오하이오대학교 바실러스 유전자 보관소(BGSC)의 카탈로그 번호 1A747) 및 1012(leuA8metB5; 사이토(Saito) 등의 문헌[(1979) Mol. Gen. Genet. 170:117-122])으로부터 유래된다. 네오마이신-저항 유전자(neo) 카세트 및 테트라사이클린-저항 유전자(tet) 카세트는 각각 플라스미드 pBEST504(카탈로그 번호 ECE47, BGSC) 및 pDG1514(카탈로그 번호 ECE100, BGSC)으로부터 수득된다.
배지
비. 섭틸리스용 표준 최소 배지(MM)는 1X 스피지젠(Spizizen) 염, 0.04% 나트륨 글루타메이트 및 0.5% 글루코즈를 함유한다. 표준 고형 완전 배지는 트립톤 블러드 아가(Tryptone Blood Agar) 배양액(TBAB, 딥코(Difco))이다. 표준 액체 완전 배지는 빌 인퓨전-이스트 익스트랙트(Veal Infusion-Yeast Extract) 배양액(VY)이다. 액체 시험관 배양액에서의 티아민 생산을 시험하기 위해, 티아민이 없는 배지(딥코)를 이용한다. 페드-배치 발효의 경우, VF 배지를 이용한다. 이들 배지의 조성은 하기 개시된 바와 같거나, 전술된 표준 제형이다(하우드(Harwod) 및 아키볼드(Archibald)의 문헌[(1990) pp. 1-26 및 545-552(부록 I), 커팅과 하우드 편집, Molecular biological methods for Bacillus. John Wiley and Sons, New York] 참조).
TBAB 배지: 33g 딥코 트립톤 블러드 아가 배양액, 약 1 L의 물. 오토클레이브.
VY 배지: 25 g 딥코 빌 인퓨젼 배양액, 5 g 딥코 이스트 익스트랙트, 약 1 L의 물. 오토클레이브.
최소 배지 (MM): 100 ml 10X 스피지젠 염; 10 ml 50% 글루코즈; 1 ml 40% 나트륨 글루타메이트, 약 1 L의 물.
10X 스피지젠 염: 140g K2HP04; 20g (NH4)2SO4; 60g KH2PO4; 10g Na3(시트레이트)·2H20; MgSO4·7H20; 약 1L의 물.
티아민 분석 배지: 85g 딥코 티아민 분석 배지, 약 1L의 물. 오토클레이브 (Difco Manual[(1998) pp. 499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA]).
흔적 요소 용액: 1.4g MnSO4·H2O; 0.4g CoCl2-6H20; 0.15g (NH4)6Mo7O24·4H2O; 0.1g AlCl3·6H2O; 0.075g CuCl2·2H2O; 약 200ml의 물. 여과-살균.
Fe-용액: 0.21g FeS04·7H20; 약 10ml의 물. 여과-살균.
CaCl2-용액: 15.6g CaCl2·2H20; 약 500ml의 물. 여과-살균.
Mg/Zn-용액: 100g MgS04·7H20; 0.4g ZnSO4·7H2O; 약 200ml의 물. 여과-살균.
VF 발효 배지: 0.75g 나트륨 글루타메이트; 4.71g KH2PO4; 4.71g K2HP04; 8.23g Na2HP04·12H20; 0.23g NH4Cl; 1.41g (NH4)2SO4; 11.77g 이스트 추출물(메르크); 0.2ml 바실돈 소포제; 약 1L의 물. 제자리에서 멸균.
· 발효기에 따로 첨가: 27.3g/L의 최종 농도로 글루코스·H2O.
· 발효기에 따로 첨가(최종 농도): 2ml/L의 흔적 요소 용액; 2ml/L의 CaCl2-용액; 2ml/L의 Mg/Zn 용액; 2ml/L Fe-용액.
· 공급 연구를 위한 배치의 개질은 하기 실시예에서 구체적으로 제시될 것이다. 필요에 따라 글루코즈를 공급한다. 공급 용액은 하기 조성으로 보고된 바와 같은 광물 또는 식품 영양분을 함유할 수 있다.
NB(영양 배양액)를 이용한 페드-배치 방식을 위한 발효 공급 용액: 최종 농도(오토클레이브 후): 660g/L 글루코즈·H20; 2g/L MgSO4·7H20; 14.6 mg/L MnSO4·H2O; 4 mg/L ZnS04·H20; 47.8 g/L 영양 배양액(딥코, 1g/ml 용액중에 따로따로 오토클레이브).
HMP를 이용한 페드-배치 방식을 위한 발효 공급 용액: 최종 농도(오토클레이브 후): 660g/L 글루코즈·H20; 2g/L MgSO4·7H20; 14.6 mg/L MnSO4·H2O; 4 mg/L ZnS04·H20. HMP를 0.54g/L 또는 2.7g/L으로 첨가(물/농축 HCl중에 HMP를 용해시킴; 여과-멸균).
HET를 이용한 페드-배치 방식을 위한 발효 공급 용액: 최종 농도(오토클레이 브 후): 660g/L 글루코즈·H20; 2g/L MgSO4·7H20; 14.6 mg/L MnSO4·H2O; 4 mg/L ZnS04·H20. HET를 0.54g/L 또는 2.7g/L으로 첨가(물중에 HET를 용해시킴; 여과-멸균).
HMT 및 HET를 이용한 페드-배치 방식을 위한 발효 공급 용액: 최종 농도(오토클레이브 후): 660g/L 글루코즈·H20; 2g/L MgSO4·7H20; 14.6 mg/L MnSO4·H2O; 4 mg/L ZnS04·H20. HMP를 0.54g/L 또는 2.7g/L으로 첨가(물/농축 HCl중에 HMP를 용해시킴; 여과-멸균). HET를 0.54g/L 또는 2.7g/L으로 첨가(물중에 HET를 용해시킴; 여과-멸균).
티아민 분석
생물학적 분석: 공지된 방법을 이용하여 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래된 지시제를 이용하여 총 티아민 화합물을 분석하였다([Difco Manual (1998) pp. 499-501, Difco Laboratories, Maryland, USA]). 균주 DM456(thiD906::MudJ)는 최소 배지중의 티아민, TMP 및 TPP에 상응하고, 균주 DM1864(thiL934::TnlOd)는 TPP에만 반응한다(웹(Webb) 및 다운스(Downs)의 문헌[(1997) J. Biol. Chem. 272: 15702-15707]; 피터슨(Peterson) 및 다운스(Downs)의 문헌[(1997) J. Bacteriol. 179: 4894-4900]). 공지된 양의 티아민, TMP 및 TPP에 대한 DM456의 반응은 0.0256 내지 100㎍/리터의 범위로 유사하다. 또한, DM456은 DM1854보다 TPP에 더욱 민감한 것으로 발견되었다. 비. 섭틸리스 배양물을 분석하기 위해서, 희석액을 제조하기 전에 상층액을 여과 멸균하였다. 세포를 프렌치 프 레스로 부수고 10,000g에서 10분동안 원심분리하여 수득된 여과-살균된 세포 추출물의 희석액으로부터 세포내 티아민 수준을 측정하였다. 지시자 균주를 티아민 분석 배지(TAM)에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 혼탁도를 600nm에서 판독하고 표준 용액의 범위와 비교하였다.
HPLC/티오크롬: 전술된 변형된 티오크롬-HPLC 분석 방법을 이용하여 개별적인 티아민 화합물, 티아민, TMP 및 TPP를 측정하였다(치에(Chie) 등의 문헌[(1999) Biochemistry 38: 6460-6470]). 간략하게, 100㎕의 배양 상층액 또는 세포내 추출물을 200㎕의 4M 칼륨 아세테이트에 첨가하였다. 그런 다음 7M NaOH중의 신선한 3.8mM 칼륨 페리시아나이드 100㎕를 첨가함으로써 시료를 산화시켰다. 혼합물을 격렬하게 혼합한 후, 포화 KH2PO4중의 신선한 0.06% H2O2 100㎕를 첨가함으로써 급냉시켰다. 시료를 HPLC 바이얼로 옮기고 슈펠코실(Supelcosil) LC-18-T 컬럼(15cm X 4.6 mm, 3㎛) (슈펠코 - 참고 번호 58970-U)에 주입하였다. 40% 0.1M K2HPO4(pH 6.6) 및 4mM 테트라부틸 암모늄 하이드로겐 설페이트의 존재하에서 10%-35% 메탄올(H20 50%-25%) 구배에 의해 용출시켰다. 365nm에서 여기시킨후 444nm에서 형광을 측정한다. 컬럼으로부터의 용출물의 연대기적 순서는 티아민, TMP 및 TPP이다. 이 과정을 이용하여 발효 후 내부 및 외부 모두의 티아민 생산을 모니터링하는데 이용하였다.
HPLC/DAD: 발효 배양액중에서 티아민 및 중간체 HMP 및 HET를 직접적으로 측정하기 위해서, 자동온도조절장치된 오토샘플러 및 다이오드 어레이 검출기(DAD)가 장착된 아길런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템을 이용하여 페노메넥스(Phenomenex) LUNA C18 컬럼상에서 시료의 크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼의 치수는 150x4.6mm이고, 입자 크기는 5마이크론이다. 컬럼의 온도는 20℃에서 일정하게 유지되었다. 이동상은 물중의 0.4g 펜탄 설포네이트, pH 2(A)와 메탄올(B)의 혼합물이다. 20분동안 2% A(3분) 내지 20% A의 범위의 구배 용출을 적용하였다. 유속은 1ml/분이다. 검출 방법은 254nm에서의 UV 흡수이다. 방법의 선택성은 각각 100㎍/ml의 연관된 기준 화합물, 티아민, HMP 및 HET의 10㎕ 표준 용액을 주입함으로써 입증되었다. 특별한 시료 준비없이 목표 화합물은 완전하게 분리되었다.
분자 및 유전학적 기법
표준 유전 및 분자 생물학 기법은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 전술되어 있다(마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[(1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.]; 밀러(Miller)의 문헌[(1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor]). DNA 형질전환, PBS1 일반화된 형질도입 및 다른 표준 비. 섭틸리스 유전학적 기법이 또한 당 분야에 일반적으로 공지되어 있고, 전술되어 있다(커팅(Cutting) 및 혼(Horn)의 문헌[(1990) pp. 27-74, In Cutting and Harwood (ed. ) Molecular biological methods for Bacillus. John Wiley and Sons, New York]).
발효
티아민 생산 균주를 교반된 탱크 발효기, 예를 들면 작업 부피가 6 내지 12 리터인 바이오플로(BIOFLO) 4500 뉴 브룬스윅(New Brunswick) 20리터들이 용기에서 성장시켰다. 컴퓨터 제어 및 자료 수집을 NBS 바이오코맨드(NBS Biocommand) 32(미국 뉴저지주 에디슨 소재의 뉴 브룬스윅 사이언티픽 캄파니 인코포레이티드(New Brunswick Scientific Co. , Inc. ))의 상업적 소프트웨어에 의해 수행하였다.
접종물 크기는 일반적으로 용기의 초기 배지 부피의 5%이었다. 수산화 암모늄 용액(물중의 28%)을 자동적으로 첨가함으로써 반응기에서 pH를 6.8로 일정하게 유지시켰다. 발효 온도는 39℃였고, 6L/분의 일정한 공기흐름을 제공하였다. 소포제(바실돈(Basildon))를 필요에 따라 수동으로 첨가하고, 2psi의 일정한 압력을 용기에서 유지시켰다. 교반기의 자동 캐스캐이딩에 의해 15% 용존 산소(pO2)의 최소 농도를 달성하였다. 최소 교반기 속도는 400rpm으로 설정되었다.
발효는 배치 방식일 수 있지만, 바람직하게는 탄화수소-제한된, 페드-배치 방식이다. 따라서, 일반적으로 6 내지 8 시간 공정 후인 초기 글루코스가 소비된 후, (상기 개시된 바와 같은) 한정된 공급 용액이 반응기에 제공된다. 이때 압력을 8spi로 증가시키고, 공급 용액의 첨가는 70g/시간의 속도로 시작되어 8시간의 기간동안 102.5g/시간으로 선형 증가한 후, 102.5g/시간에서 일정하게 유지된다.
실시예 2: 티아민 및 티아민 화합물을 드 노보 생산하는 돌연변이 미생물의 배양
이 실시예는 티아민 화합물을 과생산하는 비. 섭틸리스 균주를 생산하는 티아민 생합성 및 규제철폐 돌연변이인 △thiL, tx1, tx26 돌연변이체 및 이의 조합의 단리를 개시한다.
야생형 및 유전자 조작된 비. 섭틸리스 균주에서 나온 티아민 생성물의 세포내 및 세포외 수준을, 37℃에서 24시간동안 30ml의 최소 배지 진탕 플라스크 배양액에서 성장한 세포로부터 결정한다. 양성 대조군으로써, 티아민 규제철폐된 이. 콜라이 PT-R1 돌연변이체 또한 시험하였다. 생분석 결과는 티아민 생성물이 초음파처리된 세포의 추출물로부터 쉽게 검출되지만, 배양 배지로부터는 거의 또는 전혀 검출되지 않음을 나타낸다(표 1). 로그 상태 또는 정지 상태 야생형 비. 섭틸리스의 티아민 생성물의 세포내 수준은 약 100 내지 200㎍/L로 계산된다. 이. 콜라이에 대해서 보고된 바와 같이, 비. 섭틸리스의 세포내 티아민 생성물은 아마도 TPP의 형태일 것이다. 티아민 생성물의 세포내 수준은 티아민 규제철폐된 이. 콜라이 PT-R1 균주에서 상당히 더 높아서 정지상 세포에서는 약 1.6mg/L에 이르렀다.
Figure 112005070344322-PCT00001
이. 콜라이 ThiL 단백질 서열을 섭틸리스의 단백질 데이터 베이스와 비교하여 단 한가지 단백질 서열에 대해서만 상당한 유사성을 검출하였다: YdiA(P(N)=8.1e-15). 이 단백질을 코딩하는 유전자인 ydiA는 975 염기쌍으로 비. 섭틸리스 염색체상의 55°에 위치하는 5-유전자 오페론의 첫 번째 유전자이다. 비-극성 삽입성 벡터인 pMUTIN2 및 4(이는 삽입 부위의 다운스트림에서 유전자의 전사를 조절하는 IPTG-유도성 Pspac 프로모터를 함유한다)를 이용하여 thiL 파괴 돌연변이를 생성한다(바그너(Vagner) 등의 문헌[(1998) Microbiology 144:3097-3104]). 뉴클레오타이드 264와 612사이의 ydiA 서열에 상응하는, 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 BsuydiA1(서열 번호 7) 및 BsuydiA2(서열 번호 8)를 이용하여, 표준 PCR 방법에 의해 348bp DNA 단편을 제조하였다. 이 단편을 pMUTIN2 벡터의 HindIII와 BamHI 부위 사이에서 클로닝하여 이. 콜라이 플라스미드 pTH1을 생성하였다. 그런 다음, 5㎍/ml 에리트로마이신에 내성인 콜로니를 선택하는 DNA 형질전환에 의해 이 플라스미드를 비. 섭틸리스 PY79의 ydiA(thiL) 유전자에 삽입하였다. 하나의 Ermr 콜로니를 회수하고, TH5(ΩthiL::pMUTIN)이라 명명하였다. IPTG의 존재 또는 부재하에서 에리트로마이신이 있는 TBAB 배지 상에서의 박테리아 성장을 비교함으로써, ydiA의 다운스트림의 하나 이상의 유전자의 발현이 세포 성장에 요구되는지를 측정하였다. ydiA(thiL)의 뉴클레오타이드 267 내지 272 사이의 내인성 rho-독립성 전사 종결 부위를 함유하거나(cat 2 ) 이 종결부위가 없는(cat 4 ) 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 카세트를 삽입함으로써, 추가의 ydiA(thiL) 파괴가 발생하는 경우 유사한 결과가 또한 수득되었다. PCR 프라이머 쌍 cat#1(서열 번호: 9) - cat#2(서열 번호: 10) 및 cat#1 - cat#4(서열 번호: 11)을 이용하여 각각 DNA 카세트 cat 2 또는 cat 4 유전자를 생성하였고, 이를 프라이머 ydiA/atp/for/bam(서열 번호: 12) - ydiA/atp/rev/sma(서열 번호: 13) 및 ydiA/ctp/for/sma/2(서열 번호: 14) - ydiA/ctp/rev/ecorI/2(서열 번호: 15)를 이용하여 생성된 ydiA(thiL) PCR DNA 단편에 결찰시켰다. 그런 다음 5㎍/ml 클로람페니콜에 내성인 콜로니에 대해 선택하는 DNA 형질변환에 의해 △thiL::cat 카세트를 균주 PY79의 염색체 ydiA(thiL) 유전자에 직접 삽입하였다. △thiL::cat 4 를 함유하는 Cmr 콜로니(TH12)만이 TBAB 배지에서 정상적으로 성장하였고, △thiL::cat 2 를 함유하는 Cmr 콜로니는 작은, 소량의 콜로니로서 성장하였다. △thiL::cat 2 및 △ydiA::cat 4 를 함유하는 균주 TH11 및 TH12를 각각 구하였다. 놀랍게도, 균주 TH5 및 TH12는 티아민 또는 TPP 영양 요구성이 아니었다. 대신 2가지 균주는 모두 티아민 영양완서성(bradytroph)이었다: 최소 배지에서 TH5 및 TH12의 콜로니 크기는 PY79 대조군 콜로니의 직경의 절반이었다. 살모넬라와 이. 콜라이의 thiL의 널(null) 돌연변이체가 엄격한 티아민 독립영양성이기 때문에, 비. 섭틸리스는 제 2의 키나제 활성이나 TMP를 TPP로 전환시킬 수 있는 다른 경로를 함유하는 것으로 보인다. 흥미롭게도, ydiA(thiL) 돌연변이체는 37℃에서 하루동안 배양한 후 최소 배지상에서 비. 섭틸리스 thiF 또는 thiG 돌연변이체(각각 TH3 및 TH4로 불리는 균주)를 교차급식할 수 있는 반면, PY79는 3일 이상이 요구된다. 이는 ydiA 돌연변이체가 티아민 생합성에 대해 부분적으로 규제철폐하여 야생형 균주보다 확산성인 티아민 생성물을 방출함을 제안한다. 생분석 결과(표 2)는 총 세포내 티아민 생산(티아민+TMP+TPP) 수준이 PY79보다 TH5 및 TH12에서 약간 더 높음(2 내지 3배)을 보여주었다. 또한 PY79에 비해 약간 더 높은 총 티아민 수준이 배양 배지에서 검출되었지만, 이는 세포내 수준보다는 상당히 낮았다. 흥미롭게도, 티아민 생성의 증가는 티아민 유사체인 피리티아민에 대한 내성을 제공하기에는 충분하지 않았다.
Figure 112005070344322-PCT00002
비. 섭틸리스의 티아민 규제철폐된 돌연변이체를 단리시키는 전략은 thiA-lacZ 융합을 함유하는 박테리아를 돌연변이시킨 후, XGAL-함유 배지상에서 TPP 또는 티아민의 존재하에서 Lac+(즉, 청색 콜로니)인 콜로니에 대해 스크리닝하는 것이었다. thiA의 5' 프로모터 영역의 417bp를 함유하는 732bp 길이의 DNA 단편을 표준 방법을 이용한 PCR에 의해 제조하고, pDG1728 벡터의 프로모터없는 lacZ 유전자(구에루트-플뢰리(Guerout-Fleury) 등의 문헌[(1996) Gene 180:57-61]))의 앞쪽에 일방향성으로 클로닝하여, 플라스미드 pTH12를 생성하였다. 이 벡터는 이소성(ectopic) 전사 lacZ 융합물을 비. 섭틸리스의 비-필수적 amyE 유전자좌에 도입하도록 디자인되었다. 제한효소 분해에 의해 플라스미드 pTH12를 선형화하고, 비. 섭틸리스 PY79로 형질전환하여 100㎍/ml 스펙티노마이신에 대해 내성인 콜로니를 선택하였다. TH21(ΩamyE::thiA-lacZ)로 명명된 하나의 생성된 콜로니는 서로 다른 영양 성장 조건 하에서 시험하였을 때 명확한 티아민 규제를 나타내었다. 1μM의 티아민을 함유하는 진탕 플라스크 배양액중에서 초기 로그상(OD600=0.8-0.9)까지 성장하였을 때, thiA-lacZ의 발현은 티아민이 없는 최소 배지에서 성장된 세포에 비해 약 80배 억제되었다. HMP(1μM) 또한 융합체의 발현을 억제하였지만 다소 덜하였다(6 내지 7배). 티아졸 및 아데노신(각각 1μM) 둘 모두 억제 활성을 나타내었다. 시간 경과 실험에서, 세포가 초기 로그상(OD600=0.8-0.9)이었을 때, thiA-lacZ의 발현이 최고였다(200 밀러(Miller) 유니트). 세포가 정지상(OD600≥1)으로 들어가면 발현이 (50 밀러 유니트로) 점진적으로 감소되었다.
또한 여러 돌연변이체에서 thiA-lacZ 융합체의 규제를 평가하였다. 포자형성-결핍성 돌연변이 균주(△spo0A::erm)에서 융합체의 발현은 규제되었지만, 티아민에 의한 억제 수준은 야생형에 비해 덜하였다. ydiA/thiL의 결실을 함유하는 균주(TH22(△thiL::cat 4 , ΩamyE::thiA-lacZ))에서는 융합체가 부분적으로 규제철폐되었다: LacZ 활성은 억제 및 억제해제 성장 조건 둘 모두에서 2 내지 3배 더 높았다.
이들 결과에 근거하여, thiA-lacZ 리포터 균주 TH22(△thiL::cat 4 )를 이용하여 억제 성장 조건 하에서 규제철폐된 돌연변이체를 스크리닝하였다. 이런 돌연변이체를 단리하기 위해 2가지 방법을 이용하였다. 첫 번째 방법에서는 1μM의 티아민 및 25㎍/ml의 XGAL을 함유하는 MM 아가 플레이트를 제조하였다. 로그 성장상 TH22 세포의 균일한 희석액을 적용한 후, 3방울의 에틸메탄 설포네이트(EMS, d=1.17g/ml 용액)을 함유하는 종이 디스크를 플레이트의 중심부에 두었다. 37℃에서 7일간의 배양 기간동안 Lac+ 콜로니가 출현하였다. 규제철폐된 돌연변이체 Tx1-Tx10을 회수하였다. 2번째 방법에서는 EMS-돌연변이된 세포의 은행을 준비하여 스크리닝하였다. 따라서 로그상 TH22 세포를 9.4mM EMS로 90분동안 처리한 후, 분획을 -90℃에서 10% 글리세롤중에 냉동시켰다. 냉동된 저장액에서 취한 세포를 VY 배지에 희석시키고, 실온에서 30분동안 배양한 후, 1μM의 티아민 및 25㎍/ml의 XGAL을 함유하는 MM 배지중에 두었다. Lac+ 콜로니의 스크리닝은 돌연변이체 Tx11 내지 Tx26을 이끌어내었다. 이들 돌연변이체는 티아민- 및 TPP- 억제 조건하에서 청색의 강도 및 출현 시간(표 3)에 근거하고, 추가의 표현형에 근거하여 3가지 군으로 분류될 수 있다. 하나의 돌연변이체(Tx1)는 강한 티아민 영양완서성으로 발견되었고, 이는 이 돌연변이체가 (1) 잔류 TMP 키나제 활성, 또는 (2) TMP를 통한 TMP에서 TPP로의 제 2의 경로에 관여하는 유전자중 하나를 불활성화시키는 것으로 제안된다. 다른 돌연변이체 Tx26은 10μM 피리티아민에 대해 내성이었다. 티아민 생성물의 합성 측면에서, 돌연변이체 Tx7(군 2)는 모 균주인 TH22(△thiL::cat 4 , ΩamyE::thiA-lacZ)에 비해 2 내지 3배 더 많은 총 티아민 생성물을 분비하지만, 티아민 생성물의 세포내 수준은 유사하였다(표 4). 돌연변이체 Tx26(1군)은 TH22 대조군 균주보다 10 내지 15배 더 많은 총 세포외 티아민 생성물을 배양 배지로 분비하였다(표 4). 분비된 티아민 생성물의 50%를 약간 넘는 양이 TPP의 형태이었다. Tx1 및 Tx23으로 대표되는 3군 돌연변이체는 티아민 또는 TPP의 존재하에서 서로 다른 Lac 발현에 근거하여 티아민-TMP-TPP 경로에 영향을 미치는 것으로 보인다.
Figure 112005070344322-PCT00003
Figure 112005070344322-PCT00004
외인성 전구체 공급 연구에서, HMP 및 HET의 총 티아민 생성물로의 전환은 또한 Tx7과 Tx26사이에서 달랐다(표 5). 각각의 균주를 37℃에서 18시간동안 지시된 양의 HET 및 HMP를 함유하는 최소 배양 배지에서 성장시켰다. 배양 배지 및 세포 추출물을 티아민 생산에 대해 분석하였다. (티아민+TMP+TPP) 및 (TPP)를 각각 에스. 티피무리움 지시자인 DM456(ΩthiD906::MudJ) 및 DM1856(ΩthiL934::Tn10)을 이용한 생물학적 분석에 의해 측정하였다. 티아민 생성물은 배지에서 검출되지 않았다. Tx7에서, 대부분의 티아민 생성물은 세포 내부에서, 주로 TPP의 형태로 발견되었다. 이와는 대조적으로, Tx26에서 총 티아민 생성물의 90%는 거의 티아민+TMP로서 배양 배지에서 발견되었다. 세포외 축적은 HMP+HET가 첨가되지 않고 성장한 Tx26보다 약 40배 더 높았다.
Figure 112005070344322-PCT00005
돌연변이 tx26, thiL 및 tx1의 조합을 함유하는 비. 섭틸리스 균주를 구축하였다. 이 균주는 통합되고 증폭된 유전자조작된 티아민 생합성 유전자를 위한 숙주로서 제공될 수 있다. 제 1 단계로서, DNA 형질전환에 의해 Tx26에서의 돌연변이를 TH12(△thiL::cat 4 )로 옮기고 10μM 피리티아민에 내성인 콜로니를 선택하였다. 티아민의 존재하에서 또한 Lac+인 하나의 Pyrr 콜로니를 회수하고 TH48으로 명명하였다. 각각의 균주를 37℃에서 미세 영양분 및 2.5% 딥코 영양 배양액(NB)이 보충된 최소 배지에서 18시간동안 성장시켰다. (티아민+TMP+TPP)에 대한 지시자 살모넬라 DM456(thiD906::MudJ) 및 (TPP)에 대한 살모넬라 DM1856(thiL934::Tn10)을 이용한 생물학적 분석에 의해 상층액을 티아민 생성에 대해 분석하였다. 최소 배지 진탕 플라스크 배양액에서 성장하는 경우, TH48은 Tx26 모체에 비해 유사한 수준의 티아민 생성물을 생성하였다(표 6). 그런 다음, cat-방해된 thiL 유전자를 인-프레인 결실에 의해 대체하였다. 표준 PCR 방법을 이용하여 thiL의 인-프레임 결실(아미노산 잔기 Gly79 및 Gly202를 제거)을 먼저 구축한 후, 이. 콜라이 플라스미드 벡터 pEpUC△1의 bamHI과 EcoRI 부위 사이에 삽입하여 pTH30을 생성하였다. pEpUC△1(S. Seror, Universite Paris-Sud, 91405 Orsay, France)는 선택가능한 에리트로마이신-저항성(erm) 카세트, 및 51℃ 이상에서 작용하지 않는 온도-민감성 복제 기원을 함유한다. TH48 세포는 에리트로마이신 저항에 대해 선택된 pTH30을 이용하여 51℃에서 형질전환되었다. 또한 Cmr인 하나의 Ermr 콜로니를 회수하여 72시간동안 항생제 선택성이 없는 상태로 28℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 그런 다음, 박테리아를 TBAB 아가 플레이트상에서 도말하고, 플레이트를 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 콜로니의 약 25%가 에리트로마이신 및 클로람페니콜 항생제 둘 모두에 대해 민감한 것으로 발견되었다. 여러 Erms Cms 콜로니로부터의 염색체 DNA를 PCR 분석하여 인-프레임 △thiL 돌연변이의 존재 및 △thiL::cat 4 돌연변이의 부재를 확인하였다. 이는 균주 TH83을 생성하였다. 그런 다음 사일런트(silent) Tn917 삽입체, ΩyloA::Tn917(tx1에 대한 60% 연쇄; 바실러스 유전자 저장소의 균주 1A633, 이는 또한 CU4153 또는 Ωzdi-82::Tn917로 불린다)에 대한 연쇄를 이용하는 표준 방법을 이용하여 PBS1 형질도입에 의해 tx1 돌연변이를 TH83으로 도입하였다. 생성된 균주는 TH95로 불렸다.
Figure 112005070344322-PCT00006
20리터들이 실험실 규모의 발효기를 이용하는 표준 페드-배치 발효에서, NB는 TH95에서의 티아민 생산을 증가시키는 것으로 발견되었다. 결과는 세포외 티아민 생성물 수준이 NB가 없는 공급물에 비해 4% NB를 함유하는 공급 배지를 이용하는 경우 약 2 내지 3배 더 높다는 것을 보여주었다. 생산은 성장 30 내지 48시간동안 6 내지 7mg/L의 최대 수준에 이르렀다. 보다 중요하게는 티오크롬/HPLC 분석으로 판단하였을 때, 세포외 티아민 생성물의 65% 이상이 티아민의 형태이고, 공급물에 NB가 없는 발효의 경우 대부분의 생성물이 TMP 및 TPP이었다. 동시에, 종자중의 NB의 양(10%)을 증가시키고, 공급물로부터 NB를 제거하여, 티아민-연관된 생성물의 생산을 24시간 배양 시간으로 지연시켰다. 더욱이, 분비된 티아민 생성물이 감소되고, 주로 TMP의 형태이다. 배치에 NB(4%)를 추가하는 것 또한 총 티아민 생산을 감소시키고, 분비 프로파일을 변화시키고, 여기서 모든 티아민 형태(THI, TMP 및 TPP)는 거의 동일한 몰 양이다.
Figure 112005070344322-PCT00007
실시예 3: HMP 및 HET를 이용한 티아민 화합물의 생산
본 실시예는 티아민 전구체 HMP 및 HET의 존재하에서 티아민-규제철폐된 균주를 성장시킴으로써 티아민 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
티아민 전구체 공동-공급물을 이용하여 균주 TH95(tx26 tx1 △thiL yloA::Tn917)를 페드-배치 조건하에서 6리터 및 1리터 규모로 발효시켰다. 0.54g/L의 하이드록시에틸티아졸(HET) 및 0.54g/L의 하이드록시메틸피리미딘(HMP)을 함유하는 공급 용액으로 인해 배양 배지에서 티아민이 상당량 축적되었다. 48시간 후에 티아민 역가는 120mg/L에 이르렀고(표 8), 이는 어느 한 전구체의 농도를 기준으로 25%의 몰 수율을 나타낸다. 거꾸로, TMP 및 TPP 역가는 매우 낮아(각각 4 및 2mg/L), 티아민과 연관하여 분비된 생성물의 총 양의 3% 미만에 해당한다. HMP 또는 HET중 어느 하나만을 공급하면 모든 티아민 생성물의 역가가 매우 낮아졌다. HMP 및 HET의 농도를 각각 또는 함께 2.7g/L로 증가시키더라도 티아민 생성물 수준이 상당히 증가하지는 않았다. 0.54g/L HET 및 0.54g/L HMP의 존재하에서 TH95의 발효를 연장시키면 티아민 역가가 우선적으로 증가되었다. 70시간 후에, 티아민(THI) 역가는 250mg/L에 도달하고, TMP 및 TPP 수준(7 및 2mg/L) 역가는 48시간 시기와 유사하였다(표 9).
Figure 112005070344322-PCT00008
Figure 112005070344322-PCT00009
실시예 4: 증가된 ThiA 합성을 이용한 티아민 생산 균주
본 실시예는 비. 섭틸리스 thiA 유전자를 과발현시켜 티아민 생성물을 과다생산하고 분비시키는데 사용할 수 있는 상기 유전자를 함유하는 DNA 카세트의 구축을 개시한다.
발현을 증가시키기 위해서, 천연 프로모터 영역이 비. 섭틸리스 박테리오파지 SPO1에서 유래된 강한 구성적 SP01-26 프로모터(P 26 으로 명명)에 의해 대체되는, 증폭가능한 유전자조작된 thiA 카세트를 구축하였다. 먼저 전체 thiA 유전자를 함유하는 1770bp 길이의 DNA 단편을 표준 방법 및 합성 올리고 DNA 프라이머 thiA/for/pXI22/NdeI(서열 번호: 1) 및 thiA/rev/pXI22/Bam(서열 번호:2)을 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. NdeI 및 BamHI으로 분해시킨후, PCR 생성물을 pXI22mod의 NdeI과 BamHI 부위 사이에 삽입시키고, 표준 방법을 이용하여 컴피튼트(competent) 이. 콜라이 세포로 형질전환시켰다. pXI22mod는 P 26 프로모터, 합성 바실러스 RBS, cryT 터미네이터, 선택가능한 앰피실린(bla) 내성 및 클로람페니콜(cat) 내성 유전자 및 RBS와 cryT 터미네이터 사이에 위치한 NdeI/BamHI 클로닝 부위(NdeI 부위는 ATG 출발 부위를 생성한다)를 함유하는 7.2kb의 이. 콜라이 플라스미드이다. 프로모터의 -35와 -10 컨센서스 영역 사이의 이. 콜라이 ColE1 레플리콘(replicon)과 bla 유전자의 위치로 인해 P 26 프로모터가 불활성화된다. 추가로, pXI22 내부의 NdeI 부위를 표준 방법에 의해 변형하여 레플리콘 영역 내부에 위치한 바람직하지 않은 NdeI 제한효소 부위를 제거시켰다. 이로 인해 플라스미드 pTH43이 생성되었다(도 1). 또한 cat 카세트를 선택가능한 테트라사이클린-내성(tet) 유전자로 대체함으로써 다른 thiA 발현 카세트를 제조하였다. 이를 위해, 플라스미드 pDG1514(BGSC, 카탈로그 번호 ECE100) 유전자로부터 tet 유전자를 함유하는 2042bp DNA 단편을 표준 방법 및 합성 올리고 DNA 프라이머 tet/for/PmeI(서열 번호: 3) 및 tet/rev/NotI(서열 번호: 4)를 이용하는 PCT에 의해 증폭시켰다. 그런 다음, 이 단편을 pTH43의 PmeI과 NotI 부위 사이에 클로닝하였다(도 1).
다음의 과제는 P 26 thiA-cat 카세트를 티아민 규제철폐된 균주로 통합하는 것이다. 먼저, 플라스미드 pTH43을 BsaI으로 분해시키고 3352bp 길이의 단편을 표준 방법을 이용하여 아가로즈 겔로부터 정제하였다. 정제된 단편을 높은 DNA 농도에서 그 자체에 결찰시키고, 표준 방법을 이용하여 TH95 컴피튼트 세포로 형질전환하였다. 5㎍/ml의 클로람페니콜을 함유한 TBAB 배지상에서 형질전환체를 선택하였다. TH116으로 명명된 하나의 Cmr 콜로니를 추가의 연구를 위해 저장해두었다. 연속적으로 더 높은 수준의 클로람페니콜에 내성인 콜로니를 선택함으로써 thiA의 발현을 증가시켰다. 특히 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 균주 TH116을 수득할 수 있었다. 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 TH116 균주의 조질 세포 추출물의 SDS-PAGE 분석은 단지 5㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 TH116에 비해 상당히 더 높은 수준의 ThiA 단백질을 나타냄을 보여주었다.
TH116 유전자조작된 균주를 이용한 티아민 생성을 HET 공동 공급(0.54g/L, w/w)를 이용한 표준 페드-배치 조건을 이용하여 20리터들이 실험실 규모의 발효기에서 시험하였다. 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 균주 TH116는 18 내지 21mg/L의 티아민을 생산하고(표 10), 이는 TH95 발효와 비교하였을 때 티아민 생산을 3배 증가시켰다(표 8). 그러나, 티아민 생산은 공급물 연구에서 관찰되는 것보다 상당히 더 낮았다(실시예 3 참조). 이 결과는 HMP의 형성이 속도 제한적임을 나타내고, 이는 불충분한 양의 추가의 효소 활성 또는 낮은 수준의 AIR 수단에 의한 것일 수 있다.
Figure 112005070344322-PCT00010
실시예 5: AIR 형성이 증가된 미생물을 이용한 티아민 화합물의 제조 방법
본 실시예는 아미노이미다졸 라이보타이드(AIR) 형성을 증가시키기 위해 퓨린 경로를 변화시킴으로써 티아민 생산을 증가시키는 실험에 대해 개시하고 있다. 이는 퓨린 오페론(purO)의 리더(leader) 영역 내부의 돌연변이를 이용하여 비. 섭틸리스 퓨린 오페론의 발현을 규제완화하는 것과 동시에 포스포라이보실아미노이미다졸 카복실라제 I을 코딩하는 purE 유전자 내부에 돌연변이를 도입함으로써 AIR의 카복시아미노이미다졸 라이보타이드(CAIR)로의 전환을 차단함으로써 달성되었다.
purO 돌연변이를 구축하기 위해서, 오페론 프로모터의 업스트림 영역을 프라이머 YebF+1(서열 번호:18) 및 YebG-1(서열 번호: 19)를 이용하는 PCR에 의해 증폭시켜 667bp 생성물을 생성하였다. 야생형 비. 섭틸리스 1012로부터 제조된 게놈 DNA를 주형으로 이용하고, PCR 반응 조건은 95℃에서 1분동안의 변형, 55℃에서 1분동안의 어닐링 및 72℃에서 1분간의 연장의 30 주기로 구성되었다. PCR 생성물을 위자드 PCR 정제 키트(프로메가(Promega))를 이용하여 정제하고, EcoRI-BamHI을 이용하여 이중으로 분해시켰다. PCR 생성물을 EcoRI-BamHI 분해된 pUC19에 클로닝하여 플라스미드 pNMR72를 생성하였다.
프라이머 PurE+3(서열 번호 20) 및 PurE-1(서열 번호: 21)을 이용하는 PCR에 의해 purE 프로모터를 증폭시켜 768bp 생성물을 수득하였다. PCR 생성물을 위자드 PCR 정제 키트(프로메타(Promega))를 이용하여 정제하고, BamHI-PstI을 이용하여 이중으로 분해시키고 BamHI-PstI 분해된 pNMR72에 클로닝하여 플라스미드 pNMR76을 생성하였다.
BamHI을 이용하여 플라스미드 pNMR76을 선형화시키고, pBEST50에서 나온 BclI-분해된 네오마이신-내성(neo) 유전자 카세트에 결찰시켜 플라스미드 pNMR79(neo 카세트가 pur 전사와 동일한 배향이다) 및 pNMR80(neo 카세트가 반대 배향이다)을 생성하였다. 2가지 플라스미드 모두 ScaI을 이용하여 선형화되었고, 컴피튼트 비. 섭틸리스 1012 세포로 형질전환되었다. 2.5㎍/ml의 최종 농도의 네오마이신을 함유하는 TBAB 플레이트 상에서 형질전환체를 선택하였다. pNMR79 형질전환에 대해 67개의 콜로니를, pNMR80 형질전환체의 경우 18개의 콜로니를 관찰하였다. 각각의 형질전환 실험에서 6개의 콜로니를 따서 PCR로 분석하였다. 2개의 클론은, 각각의 형질전환체에 대한 이중 교차로서 통합된 잘려진 pur 오페론을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 클론을 pNMR79 형질전환의 경우 BS1566 및 BS1567로서, pNMR80 형질전환의 경우 BS1568 및 BS1569로서 다시 이름지었다.
purO 결실 돌연변이를 purE6 돌연변이와 조합하기 위해서, 비. 섭틸리스 균주 1A320(purE6 trpC2; 바실러스 유전자 저장소, 미국 43210 오하이오 콜럼버스 오하이오 대학교)를 균주 BS1567의 염색체 DNA로 형질전환시켜 균주 TH94를 생성하였다. purO::neo purE6이 밀접하게 연쇄되어 있기 때문에, 표준 조건하에서 PBS1 일반화된 형질도입에 의해 2가지 돌연변이를 티아민 규제철폐된 균주 TH95에 동시에 이동시켜 균주 TH101(tx26 tx1 △thiL yloA::Tn917 △purO::neo purE)를 생성하였다. 티아민 생산을 측정하기 위해서, HET(0.54g/L)의 공동 공급을 이용하여 표준 1L 페드-배치 조건하에서 균주 TH101을 성장시켰다. 또한 각각 0.01%(w/w) 및 1%(w/w, 7.35N NaOH에 용해됨)의 잔틴을 배치 배지 및 공급 용액에 첨가하여 퓨린 요구조건을 만족시켰다. 잔틴은 임의의 퓨린 드 노보 효소를 피드백 억제하지 않았고, 고농도에서 유독하지 않다. 또한, 공급물은 NH4Cl(9.6% w/w)를 함유하고, H2SO4(10%) 및 NaOH(7.35M)를 이용하여 pH를 조절하였다. 결과는 동일한 실험 조건 하에서 TH101이 대조군인 TH95 발효에 비해 배양액중에 약 6배나 더 많은 티아민을 생성함을 나타내었다(표 11).
Figure 112005070344322-PCT00011
실시예 6: 티아민 커플링 유전자를 개선시킴으로써 티아민 화합물 생산을 증가시키는 방법
본 실시예는 비. 섭틸리스 thiC 유전자를 과발현시켜 결과적으로 티아민 생성물을 과다생산하고 분비시키는데 이용할 수 있는 상기 유전자를 함유하는 DNA 카세트의 구축을 개시한다. 이 유전자는 샐비지 효소인 HET 키나제를 코딩하는 thiK를 함유하는 오페론에 위치한다.
thiC의 발현을 증가시키기 위해서, 증폭가능한 카세트를 구축하고, 여기서 천연 프로모터 영역은 비. 섭틸리스 박테리오파지 SP01에서 유래된 강한 구성적 SP01-26 프로모터(P 26 으로 명명)로 대체되었다. 그러기 위해서, thiA 카세트를 pTH47로부터 제거하고, thiKC를 함유하는 DNA 분획으로 대체하였다.
먼저 thiKC 구조 유전자를 함유하는 1555bp 분획을 표준 방법 및 합성 올리고 DNA 프라이머 thiKC/for3/pXI22/NdeI(서열 번호:5) 및 thiCop/rev2/pXI22/SmaI(서열 번호: 6)을 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. NdeI 및 BamHI을 이용하여 분해시킨 후, PCR 생성물을 pTH43의 NdeI과 BamHI 부위 사이에 삽입시켜 플라스미드 pTH48을 생성하였다(도 2).
먼저 pTH48을 BsaI으로 분해시키고, 표준 방법을 이용하여 아가로즈 겔로부터 4078bp 단편을 정제함으로써 이 P 26 thiKC-tet 카세트를 TH95에 도입하였다. 정제된 단편을 높은 DNA 농도에서 그 자체에 결찰시키고, 표준 방법을 이용하여 TH95 컴피튼트 세포로 형질전환시켰다. 형질전환체를 20㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 TBAB 배지상에서 선택하였다. TH115로 명명된 하나의 Tetr 콜로니를 추가의 연구를 위해 저장하였다. 연속적으로 더 높은 수준의 테트라사이클린에 대해 내성인 콜로니를 수득함으로써 thiKC의 발현을 증가시켰다. 구체적으로, 45㎍/ml의 테트라사이클린에 저항성인 TH115 균주를 수득할 수 있다. 조질 세포 추출물의 SDS-PAGE 분석은 단지 20㎍/ml 테트라사이클린에 저항성인 TH115 균주에 비해 상당히 더 높은 수준의 ThiK 및 ThiC 단백질을 보여주었다.
HMP 및 HET 공동-공급(각각 0.54g/L)의 존재하에서, TH115의 2개의 페드-배치 발효로 인해 티아민 생성이 증가되었다(48시간에 210mg/L 및 78시간에 300mg/L). 기질 HMP 또는 HET에 대한 몰 수율은 48시간 및 78 시간 둘 모두에 대해 각각 45%였다. 2가지의 다른 발효로 인해 티아민 생산이 약간 감소되었다. 흥미롭게도, 더 높은 티아민 분비는 발효의 첫 번째 기간동안 발생하는 심한 성장 억제 사건과 동시에 일어나고, 이는 25g의 영양 배양액(NB) 및 1.6mg의 TPP를 6L 배양액에 첨가함으로써 극복될 수 있다. HPLC/DAD는 발효 배양액중의 티아민의 존재를 확인하였고, 다른 UV-검출성 화합물로부터 티아민을 정제하기 위해 사용할 수 있다. 흥미롭게도, HMP 또는 HET중 어느 것도 HPLC/DAD에 의해 검출되지 않았고, 이는 0.54g/L에서 공급되는 공동-공급물의 완전한 섭취를 나타낸다. 어쨌든, 이들 결과는 TH115가 외부에서 첨가되는 전구체로부터 TMP를 합성하고, TMP를 티아민으로 탈인산화시키고, 티아민을 배양 배지로 분비시키는 큰 능력을 가짐을 나타낸다. 또한, ThiC 커플링 능력은 이 공정의 속도 제한이 아닌 것으로 보인다.
실시예 7: 티아졸 생합성 효소의 발현을 개선시킴으로써 티아민 화합물 생산을 증가시키는 방법
이 실시예는 유전자 tenAI-thiOSGFD를 함유하는 비. 섭틸리스 thiB 오페론을 함유하는 DNA 카세트의 구축을 개시하고 있고, 이를 이용하여 상기 유전자를 과발현시켜 결과적으로 티아민 생성물을 과다 생산 및 분비시킬 수 있다.
먼저, tenAI-thiOSGFD 오페론 앞의 천연 프로모터 영역이 결실된 티아졸 영양요구성 균주를 생성하였다. 그러기 위해, 먼저 프로모터 영역의 각각의 측면에 위치한 2개의 DNA 단편(TenA의 다운스트림 및 YjbQ 단편의 업스트림)을 프라이머쌍 YjbQ+_BamHI(서열 번호: 22)/YjbQ-_MluI(서열번호: 23)과 TenA+_KpnI(서열 번호: 24)/TenA-_XhoI(서열 번호:25)를 이용하여 비. 섭틸리스 PY79 염색체로부터 증폭시켰다. 프라이머 TenA-cat+_KpnI(서열 번호: 26) 및 TenA-cat-_MluI(서열 번호: 27)을 이용하여 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제 카세트를 함유하는 제 3 분획을 TH11 염색체 DNA(PY79 △thiL::cat 2 )로부터 증폭시켰다. 그런 다음 pUC19에서 이들 3가지 분획을 조합하여 플라스미드 pTH401을 생성하고, 이는 PstI과 EcoRI 제한효소 부위사이에 삽입되는 'yjbQ 3' -MluI- 3' cat 5' -KpnI- 5' tenA' DNA 구축물을 함유한다. TH95중의 플라스미드 pTH401을 형질전환하고, Cm 5㎍/ml에서 선택하여 티아민- 및 티아졸-영양요구성 TH403을 생성하였다.
P 26 tenAI-thiOSGFD 카세트를 구축하기 위해서, pTH401에서의 cat 카세트를 KpnI 및 MluI을 이용하여 절단한 후, 박테리오파지 SPO1에서 유래된 P26 강한 구성적 프로모터를 함유하는 PCR 단편으로 대체시켰다. 프라이머 P26+_MluI(서열 번호: 28) 및 P26-_KpnI(서열 번호: 29)를 이용하여 이 단편을 플라스미드 pUCSPO1-26으로부터 증폭하였다. 그런 다음, TH403 백그라운드에서 독립영양성의 회복에 대해 선택함으로써 thiB 과발현 카세트를 도입하였다. P 26 tenA' 인-프레임 융합체를 만드는 결찰 혼합물을 TH403으로 형질전환시킨 후, 독립영양성 형질전환체를 최소 배지 플레이트상에서 성장하는 이들의 능력에 대해 선택하였다. 이들의 클로람페니콜 민감성 및 tenAI-thiOSGFD 오페론의 앞쪽의 P26 프로모터의 존재를 확인하였다. 생성된 균주를 TH404라 이름지었다(도 3).
TH404 유전자조작된 균주를 이용한 티아민 생산을, HMP가 함께 공급되는(0.54g/L, w/w) 표준 페드-배치 조건(출발 부피: 6L)을 이용하여 20리터들이 실험실 규모의 발효기에서 시험하였다. 균주 TH404는 315mg/L까지의 티아민을 생성하였다(표 12). 이 수치는 균주 TH95의 경우 48시간 후에 수득된 수치(110mg/L, 표 9)보다 상당히 더 높다.
Figure 112005070344322-PCT00012
실시예 8: ThiA 및 티아졸 생합성 효소 둘 모두의 발현을 개선시킴으로써 티아민 화합물 생산을 증가시키는 방법
이 실시예는 비. 섭틸리스 thiA 유전자 및 tenAI-thiOSGFD를 함유하는 비. 섭틸리스 thiB 오페론를 함유하고, 상기 유전자를 과발현시켜 결과적으로 티아민 생성물을 과다 생산 및 분비시키는데 이용되는 DNA 카세트의 조합을 개시한다.
비. 섭틸리스 P 26 tenAI-thiOSGFD 카세트(실시예 7에 개시되어 있음) 및 증폭가능한 P 26 thiA-cat 카세트(실시예 4에 개시되어 있음)를 조합시키기 위해, 균주 TH404의 컴피튼트 세포를 표준 방법을 이용하여 균주 TH116으로부터 추출한 염색체 DNA의 비-집단적 농도를 이용하여 형질변환시켰다. 형질변환체를 5㎍/ml의 클로람페니콜에 대한 내성에 대해 선택하였다. PCR 분석은 이들이 P 26 tenAI-thiOSGFD 및 P 26 thiA-cat 카세트를 함유함을 확인하였다. TH405로 명명된 하나의 Cmr 콜로니를 추가 연구를 위해 저장하였다. TH405에서 thiA의 발현은 연속적으로 더 높은 수준의 클로람페니콜에 내성인 콜로니를 수득함으로써 증가되었다. 특히, 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 균주 TH405를 수득할 수 있었다. 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 균주 TH405의 조질 추출물의 SDS-PAGE는 단지 5㎍/ml에 내성인 균주 TH405보다 상당히 더 높은 수준의 ThiA 단백질을 보여주었고, 이는 균주 TH116(실시예 4)에서 P 26 thiA-cat 카세트의 증폭 후에 수득된 수준과 동일하다.
TH405 유전자조작된 균주를 이용한 티아민 생성을 표준 페드-배치 조건(출발 부피: 6L)를 이용한 20리터 실험실 규모 발효기에서 시험하였다. 60㎍/ml의 클로람페니콜에 내성인 균주 TH405는 48시간에 34 내지 37mg/L의 티아민을 생성하였고(표 13), 이는 0.54g/L의 HMP를 공동 공급한 TH95 발효와 비교하였을 때 티아민 생산을 6배 증가시켰다(표 8). 그러나, 티아민 생산은 공동 공급 연구에서 관찰된것이나 thiB 오페론만을 과다발현하는 균주를 이용한 경우보다 상당히 더 낮다(표 12, 실시예 7). 이 결과는 실시예 4에서의 우리의 관찰, 즉, HMP의 형성이 속도 제한적이고, thiA와 thiB 오페론에 추가하여 과다발현될 필요가 있는 추정되는 분실 유전자가 thiB 오페론의 일부가 아님을 확인하였다.
Figure 112005070344322-PCT00013
실시예 9: 글리신 또는 시스테인 이용가능성을 증가시킴으로써 티아민 화합물 생산을 증가시키는 방법
본 실시예는 글리신 또는 시스테인(이들 둘 모두는 HET 경로에서의 전구체이다)의 존재하에서 티아민-규제철폐된 균주를 성장시킴으로써 티아민 생산을 증가시키는 실험을 개시하고 있다.
비. 섭틸리스 TH95(tx26 tx1 △thiL)을 이용한 티아민 생산을 HMP(0.54g/L)와 글리신을 공동 공급(2g/L)하는 표준 페드-배치 조건을 이용한 6-리터들이 실험실 규모 발효기에서 실험하였다. 티아민, TMP 및 TPP 생산은 48시간에 각각 14mg/L, 3mg/L 및 0.5mg/L에 이르렀고, 이는 단지 HMP만 공급하여 성장시킨 TH95에서의 티아민 생성물에 비해 상당히 더 높다(표 8).
다음으로, 비. 섭틸리스 TH95(tx26 tx1 △thiL)을 HMP(0.54g/L)와 시스테인을 공동 공급(0.5g/L)하는 표준 페드-배치 조건을 이용한 6-리터들이 실험실 규모 발효기에서 실험하였다; 시스테인 동화를 용이하게 하기 위해서 트레오닌(0.4g/L) 및 아이소류신(0.2g/L)를 첨가하였다. 티아민 생산은 48시간에 8mg/L에 이르고(표 14), 이는 단지 HMP만을 공급하여 성장시킨 TH95에서의 티아민 적정에 비해 실질적으로 더 높다.
티아민 생산을 증가시키는 것은 또한 글리신, 시스테인, 아이소류신 및 트레오닌의 4가지 아미노산 모두를 TH95의 발효기에 첨가함으로써 달성될 수 있다(표 14). 더욱이, 이들 아미노산의 합성에 관여하는 생합성 유전자의 발현을 증가시키거나, 또는 상기 아미노산 생합성 유전자의 발현을 증가시키도록 조절 유전자 또는 시스-작용 조절 부위에 돌연변이를 도입하거나, 또는 상기 생합성 효소의 활성을 증가시키는 돌연변이를 도입하면 티아민 생산성을 증가시킬 수 있다.
Figure 112005070344322-PCT00014
실시예 10: 전구체로서 그레웨 다이아민을 이용하여 티아민 화합물을 생산하는 방법
본 실시예는 HMP의 유도체인 4-아미노-2-메틸-5-피리미딘메탄아민(그레웨 다이아민)의 존재하에 티아민-규제철폐된 균주를 성장시킴으로써 티아민을 생산함을 입증하는 실험을 개시하고 있다.
그레웨 다이아민은 C-5 하이드록시메틸 기가 아미노메틸기로 치환된 HMP의 유도체이다. 비. 섭틸리스 TH95(tx26 tx1 △thiL)를 이용한 티아민 생산을 그레웨 다이아민과 HET를 공동 공급하는(각각 0.54g/L) 표준 페드-배치 조건을 이용하여 6리터들이 실험실 규모 발효기에서 시험하였다. 티아민 생산은 45.5시간에 53mg/L에 이르렀다(표 15). 공급 용액중의 그레웨 다이아민의 수준을 2.7g/L까지 증가시키면 46.5시간에 티아민 생산이 120mg/L까지 증가하였다(표 15). 이들 결과는 그레웨 다이아민 및 HET로부터 티아민을 생산하는 발효 공정의 개발 실행가능성을 입증한다. 더욱이, 이들 결과는 바실러스 섭틸리스가 그레웨 다이아민을 HMP 또는 티아민을 생산하는데 사용될 수 있는 구조적으로 유사한 화합물로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 효소 활성을 코딩함을 입증한다.
Figure 112005070344322-PCT00015
실시예 11: 단리된 유전자 및 돌연변이
yloS/tx1
균주 Tx1은 tx1 돌연변이(돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열의 카피에 대해서는 서열 번호 30 참고)를 갖고, 이는 TPP의 존재하에서 Lac+ 표현형에 대해 thiA-lacZ 융합체를 함유하는 박테리아를 스크리닝함으로써 단리되었다. 이 균주(△thiL::cat 4 amyE::thiA-lacZ tx1)는 강한 티아민 영양완서성을 나타내고, 이는 이 돌연변이가 잔류 TMP 키나제 활성을 불활성시키거나 또는 티아민으로부터 TPP를 형성하는 제 2 경로에 관여하는 미지의 유전자 생성물을 불활성시키는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 재구축 연구는 Tx1의 Lac+ 표현형이, HET(ΩthiF::pMUTIN) 또는 HMP-P(ΩthiA::Tn917)중 하나에 장애물을 함유하는 TH22 유도체의 분석에 의해 판단되는 바와 같이, 티아졸 또는 HMP 경로에서의 일반적인 결점으로 인한 것이 아님을 나타낸다.
tx1을 갖는 균주는 2.5% 영양 배양액(이는 임의의 유의한 양의 티아민 생성물을 함유하지 않는다)으로 보충된 최소 배지에서 성장할 수 있는 능력에 근거하여 영양완서성으로 확인되었다. 이들 배양액에서, Tx1은 대조군인 균주 TH22(ΩthiL::cat 4 amyE::thiA-lacZ)보다 약 10배 더 많은 세포외 티아민 생성물을 생산하였다. 흥미롭게도 모든 검출가능한 티아민 생성물은 티아민 또는 TPP의 형태이고, TMP는 배양 배지에서 검출되지 않았다. 유전자 연구는 Tx1의 티아민 영양완서성 표현형이 thiL::cat 4 을 요구함을 나타내었다.
표준 조건하에서의 PBS1 일반화된 형질도입을 이용한 유전자 맵핑(mapping) 연구는 tx1 돌연변이가 thiL::cat 4 또는 ΩamyE::thiA-lacZ중 하나와 연쇄되지 않음을 나타내었다. 그러나, tx1은 140°에 위치한 zdi-82::Tn917에 90%의 형질도입 연쇄를 나타내었다. 동일한 표식자에 대한 형질전환 연쇄는 8%였다. 120° 내지 140°사이에 위치한 여러 Tn917-연쇄된 돌연변이 또한 tx1에 대해 높은 형질도입 연쇄를 나타내었다. 하나의 돌연변이 urc83::Tn917(균주 1A611)은 높은(>60%) 형질도입 연쇄 및 상당한 형질전환 연쇄(10%)를 나타내었다. 우라실+시스테인 또는 우라실+메티오닌에 대한 영양요구성을 야기하는 이 삽입은 pyr 오페론과 cys 오페론 사이의 연결부이다(139°). 제 2 돌연변이, yloA::Tn917은 tx1에 유사한 연쇄를 나타내었다. ΩspoVM::Tn917 돌연변이에 대한 tx1의 훨씬 더 높은 형질도입 및 DNA 형질전환 연쇄가 관찰되었고, 이는 tx1이 spoVM에 인접한 yloS의 대립 유전자임을 제안한다. yloS 유전자는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)의 TNR3 유전자 단백질과 약한 아미노산 유사성(P=0.23)을 나타내었고, 이는 이전에 티아민 피로포스포키아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. tx1이 yloS의 대립 유전자인지를 결정하기 위해 yloS 유전자의 염기 124에서 시작하는, 안정한 448bp 길이 결실 돌연변이(△yloS::cat 4 )를 표준 방법을 이용한 PCR에 의해 구축하여 PY79로 도입하였다. ΩthiL::pMUTIN을 도입한 후 생성된 이중 돌연변이체는 원래의 Tx1 돌연변이체와 표현형이 유사하였다. 더욱이, Tx1 돌연변이체에서 yloS의 DNA 서열화는 아미노산 잔기 116에서 류신을 페닐알라닌으로 치환시키는 단일 염기 돌연변이를 드러냈다(L116>F116; 서열 번호 31 참고).
이런 결과에 근거하여, 비. 섭틸리스는 TMP로부터 TPP를 합성하는 2가지 생합성 경로를 함유한다: (1) thiL의 생성물에 의한 TMP에서 TPP로의 직접적인 효소 형질전환; 및 (2) 미지의 포스파타제에 의한 TMP에서 THI로의 효소적 형질전환, 및 yloS의 생성물에 의한 THI의 TPP로의 파이로인산화.
경로 (1)은 그램 음성 미생물(예를 들면 살모넬라 티피무리움 및 이. 콜라이)에 존재하는 것으로 나타났다. 경로 (2)는 여러 그램 양성 박테리아, 및 효모를 포함하는 다른 진핵성 미생물에만 존재한다(로렌테(Llorente) 등의 문헌[(1999) Mol. Microbiol. 32:1140-1152]). 또한, 비. 섭틸리스는 티아민을 TMP로 전환시키는 키나제 활성을 반드시 함유한다. 이 결론은 돌연변이 △yloS::cat 4 및 ΩthiA84::Tn917을 함유하는 균주 TH109가 티아민을 함유하는 최소 배지상에서 성장할 수 있음을 보여주는 유전자 연구에 근거한다.
단백질 데이터베이스 조사는 13가지 이상의 박테리아 속이 YloS와 상당한 동종성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 함유함을 나타낸다: 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 리스테리아(Listeria), 스태필로코커스(Staphylococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 메소리조븀(Mesorhizobium), 브루셀라(Brucella), 테르모토가(Thermotoga), 애그로박테리움(Agrobacterium) 및 헬리코박터(Helicobacter). 이들 미생물의 대부분은 그램 양성 박테리아이다. 비-박테리아 미생물(예를 들면 효모, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 무스 무스쿨러스(Mus musculus) 및 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum))에서의 유전자와의 더 약한 동종성 또한 검출되었다. 흥미롭게도, yloS-함유 박테리아 종의 대부분은 thiL 오르토로그 유전자를 함유하지 않고, 반대로 thiL-함유 박테리아 종의 대부분은 yloS 오르토로그를 함유하지 않는다(표 16). 이 후자의 군은 주로 그램 음성 속으로 구성되었다. 비. 섭틸리스와 유사하게, 오세아노바실러스 이헤옌시스(Oceanobacillus iheyensis)는 두 유전자를 모두 함유한다. 이들 결과는 유박테리아(eubacteria)가 티아민의 파이로인산화에 의해 또는 TMP의 인산화에 의해 TPP를 형성할 수 있는 능력에 따라 2가지 군으로 분류될 수 있음을 나타낸다. 더욱이 단지 yloS 오르토로그만을 함유하고 thiL 오르토로그는 함유하지 않는 그램 양성 박테리아의 대부분은 공지된 병원균이고, 이는 yloS 유전자가 항생제를 개발하는 목표로서 사용될 수 있음을 제안한다.
Figure 112005070344322-PCT00016
yuaJ/tx26-1
표준 조건 하에서의 PBS1 일반화된 형질도입된 실험은 Tx26 돌연변이체가 염색체의 서로 다른 영역에 위치한 2개의 돌연변이를 함유함을 나타내었다. 이들 실험에서, 먼저 염색체 근처에 위치된 표현형-침묵형 Tn917 삽입체를 함유하는 표준 야생형 비. 섭틸리스 균주상에서 파지 용리액을 제조하였다(바실러스 유전자 저정소). 이들 용리액중 2개, 지도 위치 277°에서 ΩyufR::Tn917(BGSC#1A642)를 갖는 것 및 지도 위치 122.5°에서 ΩmotA::Tn917(BGSC#1A631)을 갖는 다른 것이 Tx26 표현형을 야생형으로 회복시킬 수 있었다(1μM TPP를 함유하는 최소 배지 상에서 Lac+를 Lac-로 회복시키고, 0.1μM 피리티아민을 이용하여 피리티아민 내성을 피리티아민 민감성으로 회복시킨다). 이런 예상치못한 결과는 두가지 돌연변이가 모두 Tx26에 의해 나타나는 티아민-규제철폐된 표현형에 필요함을 나타낸다. tx26-1로 명명된 하나의 돌연변이는 ΩyufR::Tn917에 대해 70% 연쇄를 나타내고, tx26-2로 명명된 다른 돌연변이는 ΩmotA::Tn917에 대해 59% 연쇄를 나타낸다. 더욱이, 역교배 실험에서, 집합적 DNA 형질전환에 의해 Tx26의 피리티아민-내성 표식자는 민감성 비. 섭틸리스 균주로 이동될 수 있었다. 이들 피리티아민-내성 형질전환체는 또한 티아민-규제철폐되었다(1μM TPP를 함유하는 최소 배지상에서 Lac+이고, 0.1μM 피리티아민에 대해 내성임).
yufR/maeN(277.1°), yuiGH(281°), yurI(285.6°), gerAB 및 yvaC(294°)에서 서로 다른 조합의 항생 삽입체를 함유하는 공여자 균주를 이용한 3-인자 교차 실험은 티아민-규제되는 유전자인 yuaJ에 인접한 tx26-1 돌연변이를 추가로 맵핑하였고, 이는 마이크로어레이 분석에 의해 확인되었다(하기 참조). tx26-1이 yuaJ의 대립 유전자인지를 결정하기 위해, 먼저 표준 PCR 방법을 이용하여 yuaJ의 결실 돌연변이를 구축하였다. 이를 달성하기 위해, 위치 353에서 출발하는 yuaJ의 324bp 길이 내부 단편을 PCR 증폭시키고 프라이머 BsyuaJ/for/Hind3(서열 번호 16)과 BsyuaJ/rev/Bam(서열 번호 17)을 이용하여 pMUTIN2의 BamHI과 HindIII 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pTH31을 생성하였다. 예상한 바와 같이 ΩyuaJ::pMUTIN의 야생형 균주(예를 들면 PY79) 또는 thiA 돌연변이체로의 도입은 표현형이 없었다. 그러나, 여러 유전자 교배에서, ΩyuaJ::pMUTIN2의 파괴는 tx26-1와의 매우 높은(100%) 형질도입 및 형질전환 연쇄를 나타내었다. 이들 연쇄는 tx26-1을 yuaJ 내부 또는 근처에 둔다. 더욱이, ΩyuaJ::pMUTIN의 균주 TH112(tx26-1 + tx26-2△thiL)로의 형질도입 및 형질전환은 0.1μM 피리티아민에 내성인 Ermr 콜로니를 생성시켰다. 최종적으로 Tx26의 yuaJ의 DNA 서열 분석은 tx26-1(돌연변이를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 카피에 대해서는 서열 번호 33 참고)이 yuaJ의 대립 유전자임을 확인하였다. Tx26으로부터의 4개의 독립적인 PCR 단편 및 야생형 모 균주(PY79)로부터의 2개의 단편에서 나온 DNA 서열을 비교하면 아미노산 위치 35에서 글루나민 잔기를 오커(Ocher) 중단 코돈(Q35(CAA)>Stop(TAA); 야생형 YhaJ의 아미노산 서열 35와 비교하여 서열 34 참조)으로 변화시키는 단일 염기 돌연변이가 검출되었다. 단백질 데이터베이스 조사는 yuaJ가 표면 항체 단백질 유전자의 조절자 또는 티아민 퍼미아제를 코딩함을 나타내었다. 소수성 분석은 YuaJ가 6개의 막-통과 도메인을 함유함을 나타내었다. tx26-1 돌연변이의 도입은 잘려진 35아미노산 단백질을 생성할 것으로 예측되고, 이는 아마도 단백질분해될 것이다. 상기 유전 자료와 함께, 이들 결과는 yuaJ의 기능 손실이 티아민-규제철폐 표현형의 원인인 것으로 제안한다. 더욱이, 마이크로어레이 자료(하기 참고)는 yuaJ의 발현이 TPP에 의해 조절되고, 예측되는 5' 리더 영역의 검사는 콘센서스 THI 박스 조절 서열과 강한 동종성을 갖는 DNA 서열을 확인하였다.
tx26-2
Tn917 삽입체를 함유하는 균주상에서 제조된 PBS1 파지 용리액의 수집물을 이용한, 일반화된 형질도입 맵핑 연구(2-인자 교배)는 비. 섭틸리스 게놈의 122.5°에 위치한 ΩmotA::Tn917(BGSC#1A631)에 대해 tx26-2의 60% 연쇄를 나타내었다. 이 게놈 지도 위치는 유전자의 클러스터인 ykoFEDC에 상응하고, 이의 전사 수준은 티아민 규제철폐된 Tx26 균주의 마이크로어레이 연구에서 증가하는 것으로 나타났다(표 17 참조). 더욱이, 이들 유전자는 오페론으로서 조직화되고 ykoF의 업스트림의 프로모터 영역에 THI 박스 조절 요소를 함유하는 것으로 보였다. ykoF의 400bp 영역 업스트림을 포함하는 이 오페론의 DNA 서열화는 ykoD 유전자에서 Asp180(GAC)를 Asn180(AAC)로 치환시키는 단일 염기 돌연변이를 검출하였다(야생형 YkoD의 서열 번호 38의 아미노산과 비교하여 아미노산 서열에 대해서는 서열 번호 37 참고). 단백질 데이터베이스 조사는 ykoD가 HMP 수송 ATP-결합 단백질을 코딩함을 나타내었다. 이 오페론에서의 2가지의 다른 유전자인 ykoE와 C는 HMP 수송 퍼미아제를 코딩하는 것으로 예측된다. 이들 결과는 tx26-2 돌연변이가 ykoD의 대립 유전자이고 티아민의 세포 수송에 영향을 미침을 나타낸다(돌연변이를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 카피에 대해서는 서열 번호 36 참고).
마이크로어레이 프로파일링을 통해 확인되는 티아민-규제되는 유전자
마이크로어레이 프로파일링을 수행하기 위해, PY79를 티아민 파이로포스페이트가 첨가되거나 첨가되지 않은 50ml의 스피지젠 최소 배지를 함유하는 진탕 플라스크 배양액에서 성장시켰다. 하룻밤동안 배양한 배양액을 Klett = 10 유니트가 되도록 신선한 배지로 희석시키고, 지수성 성장상(Klett = 100 유니트)까지 성장시켰다. 배양물의 절반에서 나온 세포를 원심분리하여 수집하고, 전술한 바와 같이 총 RNA를 즉시 추출하였다(리(Lee) 등의 문헌[(2001) J. Bacteriol. 183:7371-7380]). 나머지 배양액을 RNA 추출전에 초기 정지상까지 성장시켰다. 초기 성장상은 글루코스 고갈후 30분인 것으로 판단되었다: 배지중의 글루코즈 함량은 표준 방법을 이용하여 글루코스 분석기 2(캘리포니아주 풀러톤 소재의 베크만(Beckman) 제품)에 의해 측정되었다. 라벨링된 cDNA 목표물의 제조, 마이크로어레이 하이브리드 형성 및 염색 과정, 및 자료 분석은 상기 리 등의 문헌에 개시되어 있다.
공지된 티아민-규제된 비. 섭틸리스 유전자 thiA 및 tenAI-thiOSGFD에 추가하여, 결과를 분석하면 또한 TPP의 부재하에 성장된 세포에서 여러 다른 유전자의 전사 수준이 3배 이상 더 높다. 이들 유전자는 표 17에 열거되어 있다. 이들 결과는 TPP의 존재하에서 최소 배지에서 성장한 티아민-규제완화된(Tx26) 균주와 야생형의 마이크로어레이 자료를 비교함으로써 확인되었다. 더욱이, 이들 유전자중 여러 개에서, 콘센서스 시스-작용성 조절 부위(thi 박스)가 5' 리더 영역 내부에서 가시화될 수 있어, TPP에 의해 조절을 확인시킨다. 개별적으로 또는 함께, 또는 공지된 생합성 유전자와 조합하여, 이들 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는 것 또한 더 높은 티아민, HMP 및/또는 티아졸 생산을 이끌어낼 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
Figure 112005070344322-PCT00017
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Thiamin production by fermentation <130> Case 21807 <150> US 60/475,323 <151> 2003-06-02 <160> 38 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 atgccatatg caaaacaatt cagtgcagc 29 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 gcatggatcc tcattattga tataaattgc ttcccg 36 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 acgtgtttaa acgcaggttg ttctcaatgt cg 32 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 acgtgcggcc gcgatcaatt ttgaactctc tcc 33 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 atgccatatg gatgcacaat cagcagc 27 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 gcatcccggg tcagtctgaa aaccttgatg gacagc 36 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 gggaagcttt gcggtacctt caaaatggac t 31 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 gggggatcca atctgccgac gcttactct 29 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 gggggtaccg aaaattggat aaagtggg 28 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 gggacgcgtt caactaacgg ggcaggtta 29 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 gggacgcgta agtacagtcg gcattatctc ata 33 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 atgcggatcc cgtccggacc gcc 23 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 13 cgatcccggg gcctcccatc gcggc 25 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 14 atgccccggg atttgcctaa gcttcatcct aac 33 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 15 cgatgaattc agcccttctg caaaacctt 29 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 16 agctaagctt ggcagccgtt attttagaca ttg 33 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 17 tgcaggatcc ataaaaactg cgctgaccac tgaa 34 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 18 gagagaattc gctgaaagga cagc 24 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 19 tctcggatcc ttagatcaat ttcccttcaa atacg 35 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 20 gagaggatcc atcgttgaca ttatcc 26 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 21 ctctctgcag ctttctaaca ctgtctg 27 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 22 atcaggatcc cgctcctgct gcttgcgctg 30 <210> 23 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 23 tatgagataa tgccgactgt acttacgcgt ccttatttgg tcaagattta tcc 53 <210> 24 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 24 cccactttat ccaattttcg ggtacctaag gaggtaactc atatgatttg tgaagttttc 60 agaa 64 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 25 ctgctcgagc cagccttctt ttcgataggc c 31 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 26 cttctgaaaa cttcacaaat catatgagtt acctccttag gtacccgaaa attggataaa 60 gtgg 64 <210> 27 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 27 ggataaatct tgaccaaata aggacgcgta agtacagtcg gcattatctc ata 53 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 28 gggttacgcg tggccgctaa ctacactaac agc 33 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 29 gggttggtac ctttaattct cgagtgttaa g 31 <210> 30 <211> 642 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> mutation <222> (346)..(346) <223> Mutation tx1 in yloS gene <400> 30 atgaaaacaa ttaatatcgt tgcgggaggc ccgaaaaatc tcattcccga tctaaccggc 60 tatacggatg aacacacgct ttggatcggt gttgacaaag gcaccgtcac tctcttagat 120 gccgggatca ttcctgttga agccttcgga gattttgaca gcataacgga gcaagaacgc 180 cggcgaatag aaaaagccgc tcccgccctt catgtgtatc aagcagaaaa agatcaaaca 240 gatttagacc tcgcccttga ttgggcgctg gaaaagcagc cggatattat tcagattttc 300 ggcattacag gcggcagagc tgatcatttt ttaggaaaca ttcagtttct gtataaaggt 360 gtaaaaacga acataaaaat taggctgata gacaaacaaa atcatattca aatgttccct 420 cctggtgaat atgatattga gaaggatgaa aataagcgat atatctcctt cataccgttt 480 tccgaagaca tacatgagct gaccctgacc ggttttaaat atcctctaaa taattgtcat 540 attacgctcg gttcaacact atgtattagt aacgaactca ttcattcacg aggtactttt 600 tcgtttgcaa aaggcatatt aataatgata agaagcacgg at 642 <210> 31 <211> 214 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 31 Met Lys Thr Ile Asn Ile Val Ala Gly Gly Pro Lys Asn Leu Ile Pro 1 5 10 15 Asp Leu Thr Gly Tyr Thr Asp Glu His Thr Leu Trp Ile Gly Val Asp 20 25 30 Lys Gly Thr Val Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Ile Pro Val Glu Ala 35 40 45 Phe Gly Asp Phe Asp Ser Ile Thr Glu Gln Glu Arg Arg Arg Ile Glu 50 55 60 Lys Ala Ala Pro Ala Leu His Val Tyr Gln Ala Glu Lys Asp Gln Thr 65 70 75 80 Asp Leu Asp Leu Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Lys Gln Pro Asp Ile 85 90 95 Ile Gln Ile Phe Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ala Asp His Phe Leu Gly 100 105 110 Asn Ile Gln Phe Leu Tyr Lys Gly Val Lys Thr Asn Ile Lys Ile Arg 115 120 125 Leu Ile Asp Lys Gln Asn His Ile Gln Met Phe Pro Pro Gly Glu Tyr 130 135 140 Asp Ile Glu Lys Asp Glu Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Phe Ile Pro Phe 145 150 155 160 Ser Glu Asp Ile His Glu Leu Thr Leu Thr Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 165 170 175 Asn Asn Cys His Ile Thr Leu Gly Ser Thr Leu Cys Ile Ser Asn Glu 180 185 190 Leu Ile His Ser Arg Gly Thr Phe Ser Phe Ala Lys Gly Ile Leu Ile 195 200 205 Met Ile Arg Ser Thr Asp 210 <210> 32 <211> 214 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 32 Met Lys Thr Ile Asn Ile Val Ala Gly Gly Pro Lys Asn Leu Ile Pro 1 5 10 15 Asp Leu Thr Gly Tyr Thr Asp Glu His Thr Leu Trp Ile Gly Val Asp 20 25 30 Lys Gly Thr Val Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Ile Pro Val Glu Ala 35 40 45 Phe Gly Asp Phe Asp Ser Ile Thr Glu Gln Glu Arg Arg Arg Ile Glu 50 55 60 Lys Ala Ala Pro Ala Leu His Val Tyr Gln Ala Glu Lys Asp Gln Thr 65 70 75 80 Asp Leu Asp Leu Ala Leu Asp Trp Ala Leu Glu Lys Gln Pro Asp Ile 85 90 95 Ile Gln Ile Phe Gly Ile Thr Gly Gly Arg Ala Asp His Phe Leu Gly 100 105 110 Asn Ile Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Val Lys Thr Asn Ile Lys Ile Arg 115 120 125 Leu Ile Asp Lys Gln Asn His Ile Gln Met Phe Pro Pro Gly Glu Tyr 130 135 140 Asp Ile Glu Lys Asp Glu Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Phe Ile Pro Phe 145 150 155 160 Ser Glu Asp Ile His Glu Leu Thr Leu Thr Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 165 170 175 Asn Asn Cys His Ile Thr Leu Gly Ser Thr Leu Cys Ile Ser Asn Glu 180 185 190 Leu Ile His Ser Arg Gly Thr Phe Ser Phe Ala Lys Gly Ile Leu Ile 195 200 205 Met Ile Arg Ser Thr Asp 210 <210> 33 <211> 576 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> mutation <222> (103)..(103) <223> Mutation tx26-1 in yuaJ <400> 33 atgaatcaat ctaagcaact ggttcgcctt attgaaattg ccattatgac agcggcagcc 60 gttattttag acattgtctc aggaatgttt cttagcatgc cttaaggagg ctcggtctcc 120 atcatgatga ttccgatctt tttaatttcg tttcgctggg gtgtcaaagc aggtcttact 180 acaggtttgt tgacaggtct agtacaaata gcaatcggaa acttgtttgc tcaacatcct 240 gtacagctat tgttagatta cattgtcgct ttcgcagcaa tcggcataag cggctgtttc 300 gcttcttctg tccgtaaagc cgctgtatca aaaacaaaag ggaaattgat tgtttcagtg 360 gtcagcgcag tttttatcgg cagtttgctg cgctatgccg cgcatgtcat ttcaggagct 420 gtgtttttcg gcagctttgc tccaaaagga acaccggtat ggatttattc tttaacttat 480 aatgcgactt acatggttcc ttcattcatt atttgtgcaa ttgtcctatg tttattattt 540 atgacagcac cccgtctgct taaaagtgac aaagcg 576 <210> 34 <211> 34 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 34 Met Asn Gln Ser Lys Gln Leu Val Arg Leu Ile Glu Ile Ala Ile Met 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ala Val Ile Leu Asp Ile Val Ser Gly Met Phe Leu Ser 20 25 30 Met Pro <210> 35 <211> 192 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 35 Met Asn Gln Ser Lys Gln Leu Val Arg Leu Ile Glu Ile Ala Ile Met 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ala Val Ile Leu Asp Ile Val Ser Gly Met Phe Leu Ser 20 25 30 Met Pro Gln Gly Gly Ser Val Ser Ile Met Met Ile Pro Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Ser Phe Arg Trp Gly Val Lys Ala Gly Leu Thr Thr Gly Leu Leu 50 55 60 Thr Gly Leu Val Gln Ile Ala Ile Gly Asn Leu Phe Ala Gln His Pro 65 70 75 80 Val Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Ile Val Ala Phe Ala Ala Ile Gly Ile 85 90 95 Ser Gly Cys Phe Ala Ser Ser Val Arg Lys Ala Ala Val Ser Lys Thr 100 105 110 Lys Gly Lys Leu Ile Val Ser Val Val Ser Ala Val Phe Ile Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Arg Tyr Ala Ala His Val Ile Ser Gly Ala Val Phe Phe Gly 130 135 140 Ser Phe Ala Pro Lys Gly Thr Pro Val Trp Ile Tyr Ser Leu Thr Tyr 145 150 155 160 Asn Ala Thr Tyr Met Val Pro Ser Phe Ile Ile Cys Ala Ile Val Leu 165 170 175 Cys Leu Leu Phe Met Thr Ala Pro Arg Leu Leu Lys Ser Asp Lys Ala 180 185 190 <210> 36 <211> 1470 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> mutation <222> (538)..(538) <223> Mutation tx26-2 in ykoD <400> 36 atgcaagcct ttgatgagct tctgacggtt gagcagctca gcttctctta tgaagaagac 60 gagaaaccgg tttttcaaga catttcgttt gagcttcaaa aaggagaatg tgttttatta 120 ttaggaccga gcggatgcgg taaaagctcg ctcgcccttt gtttaaacgg tctatatccg 180 gaggcttgcg acggcattca gtccggacat gtatttctat ttcaaaagcc ggtcacagat 240 gctgaaacct ccgaaacgat tactcagcat gccggggtcg tttttcagga tcctgatcag 300 cagttctgca tgctgacggt ggaggacgaa atagcgttcg ggctggaaaa tctgcaaatt 360 ccaaaagaag aaatgacaga gaaaatcaac gccgtattag gaaaattacg cattacccat 420 ttaaaagaaa aaatgatctc aaccctttca ggaggacaaa agcagaaagt ggctctcgcc 480 tgtattttgg cgatggagcc tgagcttatt attttagatg agccgacctc tcttttaaac 540 cctttctcag ctcgggagtt cgttcatctg atgaaggatc ttcagcggga aaaaggtttc 600 agcctcctcg tcattgagca ccagcttgat gaatgggcgc cttggattga gagaacgatc 660 gtactcgaca aatcaggcaa aaaggcactg gatggcctga cgaaaaatct atttcagcat 720 gaagcggaga cactaaagaa attgggcatc gcaattccaa aggtctgtca tctgcaggaa 780 aagctgagta tgccgtttac tttatcaaaa gagatgctgt tcaaagagcc tattcctgcc 840 gggcatgtca aaaagaagaa agccccttct ggggagagtg tgcttgaagt cagcagcctt 900 tcgttcgcga gaggacagca ggcgattttc aaagacatca gcttttcgtt gcgcgaaggc 960 tctttaacgg cgcttgtcgg tccgaacgga actggaaaat cgacgctcct atcagttctg 1020 gccagtctca tgaaaccgca aagcggcaaa atccttctct atgatcagcc gctgcagaaa 1080 tataaagaaa aagaattgcg taaacggatg ggatttgttt ttcaaaaccc tgagcatcaa 1140 ttcgtcaccg atacggtgta tgacgagctt ctgttcggcc agaaagcaaa tgctgaaact 1200 gagaaaaaag cgcaacacct gctgcagcgt tttggtcttg cgcatttggc tgatcatcat 1260 ccgtttgcga tcagccaagg gcaaaaacgg cgactgagcg tagctactat gctcatgcat 1320 gacgtaaagg ttttattatt agacgaacca acctttggcc aggatgcccg cacggcggct 1380 gaatgcatgg aaatgattca acgtatcaag gcagagggaa ctgctgtcct tatgattaca 1440 caaggatatg gagcaagtct cttcgtatgc 1470 <210> 37 <211> 490 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 37 Met Gln Ala Phe Asp Glu Leu Leu Thr Val Glu Gln Leu Ser Phe Ser 1 5 10 15 Tyr Glu Glu Asp Glu Lys Pro Val Phe Gln Asp Ile Ser Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Lys Gly Glu Cys Val Leu Leu Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys 35 40 45 Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Cys Asp 50 55 60 Gly Ile Gln Ser Gly His Val Phe Leu Phe Gln Lys Pro Val Thr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Thr Ser Glu Thr Ile Thr Gln His Ala Gly Val Val Phe Gln 85 90 95 Asp Pro Asp Gln Gln Phe Cys Met Leu Thr Val Glu Asp Glu Ile Ala 100 105 110 Phe Gly Leu Glu Asn Leu Gln Ile Pro Lys Glu Glu Met Thr Glu Lys 115 120 125 Ile Asn Ala Val Leu Gly Lys Leu Arg Ile Thr His Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Met Ile Ser Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Lys Val Ala Leu Ala 145 150 155 160 Cys Ile Leu Ala Met Glu Pro Glu Leu Ile Ile Leu Asp Glu Pro Thr 165 170 175 Ser Leu Leu Asn Pro Phe Ser Ala Arg Glu Phe Val His Leu Met Lys 180 185 190 Asp Leu Gln Arg Glu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Val Ile Glu His Gln 195 200 205 Leu Asp Glu Trp Ala Pro Trp Ile Glu Arg Thr Ile Val Leu Asp Lys 210 215 220 Ser Gly Lys Lys Ala Leu Asp Gly Leu Thr Lys Asn Leu Phe Gln His 225 230 235 240 Glu Ala Glu Thr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ala Ile Pro Lys Val Cys 245 250 255 His Leu Gln Glu Lys Leu Ser Met Pro Phe Thr Leu Ser Lys Glu Met 260 265 270 Leu Phe Lys Glu Pro Ile Pro Ala Gly His Val Lys Lys Lys Lys Ala 275 280 285 Pro Ser Gly Glu Ser Val Leu Glu Val Ser Ser Leu Ser Phe Ala Arg 290 295 300 Gly Gln Gln Ala Ile Phe Lys Asp Ile Ser Phe Ser Leu Arg Glu Gly 305 310 315 320 Ser Leu Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Thr Gly Lys Ser Thr Leu 325 330 335 Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Met Lys Pro Gln Ser Gly Lys Ile Leu 340 345 350 Leu Tyr Asp Gln Pro Leu Gln Lys Tyr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Lys 355 360 365 Arg Met Gly Phe Val Phe Gln Asn Pro Glu His Gln Phe Val Thr Asp 370 375 380 Thr Val Tyr Asp Glu Leu Leu Phe Gly Gln Lys Ala Asn Ala Glu Thr 385 390 395 400 Glu Lys Lys Ala Gln His Leu Leu Gln Arg Phe Gly Leu Ala His Leu 405 410 415 Ala Asp His His Pro Phe Ala Ile Ser Gln Gly Gln Lys Arg Arg Leu 420 425 430 Ser Val Ala Thr Met Leu Met His Asp Val Lys Val Leu Leu Leu Asp 435 440 445 Glu Pro Thr Phe Gly Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ala Glu Cys Met Glu 450 455 460 Met Ile Gln Arg Ile Lys Ala Glu Gly Thr Ala Val Leu Met Ile Thr 465 470 475 480 Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Leu Phe Val Cys 485 490 <210> 38 <211> 490 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 38 Met Gln Ala Phe Asp Glu Leu Leu Thr Val Glu Gln Leu Ser Phe Ser 1 5 10 15 Tyr Glu Glu Asp Glu Lys Pro Val Phe Gln Asp Ile Ser Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Lys Gly Glu Cys Val Leu Leu Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys 35 40 45 Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Cys Asp 50 55 60 Gly Ile Gln Ser Gly His Val Phe Leu Phe Gln Lys Pro Val Thr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Thr Ser Glu Thr Ile Thr Gln His Ala Gly Val Val Phe Gln 85 90 95 Asp Pro Asp Gln Gln Phe Cys Met Leu Thr Val Glu Asp Glu Ile Ala 100 105 110 Phe Gly Leu Glu Asn Leu Gln Ile Pro Lys Glu Glu Met Thr Glu Lys 115 120 125 Ile Asn Ala Val Leu Gly Lys Leu Arg Ile Thr His Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Met Ile Ser Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Lys Val Ala Leu Ala 145 150 155 160 Cys Ile Leu Ala Met Glu Pro Glu Leu Ile Ile Leu Asp Glu Pro Thr 165 170 175 Ser Leu Leu Asp Pro Phe Ser Ala Arg Glu Phe Val His Leu Met Lys 180 185 190 Asp Leu Gln Arg Glu Lys Gly Phe Ser Leu Leu Val Ile Glu His Gln 195 200 205 Leu Asp Glu Trp Ala Pro Trp Ile Glu Arg Thr Ile Val Leu Asp Lys 210 215 220 Ser Gly Lys Lys Ala Leu Asp Gly Leu Thr Lys Asn Leu Phe Gln His 225 230 235 240 Glu Ala Glu Thr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ala Ile Pro Lys Val Cys 245 250 255 His Leu Gln Glu Lys Leu Ser Met Pro Phe Thr Leu Ser Lys Glu Met 260 265 270 Leu Phe Lys Glu Pro Ile Pro Ala Gly His Val Lys Lys Lys Lys Ala 275 280 285 Pro Ser Gly Glu Ser Val Leu Glu Val Ser Ser Leu Ser Phe Ala Arg 290 295 300 Gly Gln Gln Ala Ile Phe Lys Asp Ile Ser Phe Ser Leu Arg Glu Gly 305 310 315 320 Ser Leu Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Thr Gly Lys Ser Thr Leu 325 330 335 Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Met Lys Pro Gln Ser Gly Lys Ile Leu 340 345 350 Leu Tyr Asp Gln Pro Leu Gln Lys Tyr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Lys 355 360 365 Arg Met Gly Phe Val Phe Gln Asn Pro Glu His Gln Phe Val Thr Asp 370 375 380 Thr Val Tyr Asp Glu Leu Leu Phe Gly Gln Lys Ala Asn Ala Glu Thr 385 390 395 400 Glu Lys Lys Ala Gln His Leu Leu Gln Arg Phe Gly Leu Ala His Leu 405 410 415 Ala Asp His His Pro Phe Ala Ile Ser Gln Gly Gln Lys Arg Arg Leu 420 425 430 Ser Val Ala Thr Met Leu Met His Asp Val Lys Val Leu Leu Leu Asp 435 440 445 Glu Pro Thr Phe Gly Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ala Glu Cys Met Glu 450 455 460 Met Ile Gln Arg Ile Lys Ala Glu Gly Thr Ala Val Leu Met Ile Thr 465 470 475 480 Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Leu Phe Val Cys 485 490

Claims (31)

  1. 바실라세아에(Bacillaceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 및 브레비박테리아세아에(Brevibacteriaceae)로 구성된 군에서 선택되고, 티아민 생산을 규제철폐하여 티아민 생성물이 배양 배지로 방출되게 하는 돌연변이를 함유하는 미생물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    돌연변이가 △thiL, tx1, tx26 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 미생물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 코리네박테리움 및 브레비박테리움으로 구성된 군에서 선택되는 미생물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 세포인 미생물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    비. 섭틸리스(B. Subtilis) TH95(ATCC PTA-5221)인 미생물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    (a) thiA 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피가 DNA 카세트에 함유되어 있다);
    (b) thiKC 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 카피가 DNA 카세트에 함유되어 있다); 및
    (c) tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는 미생물.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    (a) tenAl-thiOSGFD 오페론의 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 카세트, 및 (b) thiA 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(이 폴리뉴클레오타이드 서열은 강한 구성적 프로모터에 의해 유효하게 제어된다)을 함유하는 DNA 카세트를 추가로 포함하는 미생물.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    비. 섭틸리스 TH116(ATCC PTA-5224), TH115(ATCC PTA-5223), TH404(DSM 16333) 및 TH405(DSM 16334)로 구성된 군에서 선택된 미생물.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    비. 섭틸리스의 퓨린 오페론의 발현을 규제철폐하는 제 1 돌연변이 및 5-아미노이미다졸 라이보타이드(AIR)의 카복시아미노이미다졸 라이보타이드(CAIR)로의 전환을 차단하는 제 2 돌연변이를 추가로 포함하는 미생물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 1 돌연변이가 pur 오페론의 리더(leader) 영역 내부의 돌연변이를 포함하고, 제 2 돌연변이가 포스포라이보실아미노이미다졸 카복실라제 I을 코딩하는 purE 유전자 내부의 돌연변이를 포함하는 미생물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    비. 섭틸리스 TH101(ATCC PTA-5222)인 미생물.
  12. (a) 티아민 생성물을 배지로 과다생산하는 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항의 미생물을 적합한 배지중에서 배양시키는 단계; 및
    (b) 티아민 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 티아민 생성물을 생산하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    (a) 티아민 전구체,
    (b) 티아민 전구체 및 퓨린 공급원,
    (c) HET 경로의 전구체,
    (d) HMP 경로의 전구체 및
    (e) HMP의 유도체로 구성된 군에서 선택된 성분의 존재하에서 미생물을 배양함을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    티아민 전구체가 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘(HMP), 5-(2-하이드록시에틸)-4-메틸티아졸(HET) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    티아민 전구체가 HET이고, 퓨린 공급원이 잔틴인 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    HET 경로의 전구체가 글리신, 시스테인, 아이소류신, 트레오닌 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    HMP의 유도체가 4-아미노-2-메틸-5-피리미딘메탄아민(그레웨(Grewe) 다이아민)인 방법.
  18. tx1 돌연변이를 함유하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  19. 제 18 항에 있어서,
    돌연변이로 인해 아미노산 잔기 116에서 류신이 페닐알라닌으로 치환되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    서열이 서열 번호 31이거나, 또는 엄격한 존재하에서 서열 번호 31에 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 미생물에 존재하는 경우 티아민 생산을 규제철폐하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  21. △yufR::Tn917에 대해 70% 연쇄를 나타내는 제 1 돌연변이(tx26-1), 및 ΩmotA::Tn917에 대해 59% 연쇄를 나타내는 제 2 돌연변이(tx26-2)를 포함하고, 돌연변이 둘 모두의 존재로 인해 티아민-생산 미생물에서 티아민 생산이 규제철폐되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  22. 제 21 항에 있어서,
    tx26-1 돌연변이가 서열 번호 33인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에 서 서열 번호 33과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, tx26-2 돌연변이가 서열 번호 36인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 36과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 미생물에 존재하는 경우 티아민 생산의 규제철폐를 야기하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 카세트.
  24. 제 23 항의 DNA 카세트를 함유하는 미생물.
  25. (a) 그램 양성 미생물이 시료에 존재하는지를 측정하는 단계,
    (b) 미생물이 yloS 오르토로그(ortholog)를 함유하는지를 측정하는 단계 및
    (c) 미생물이 thiL 오르토고르를 함유하는지를 측정하는 단계를 포함하며,
    그램 양성 미생물에 yloS 오르토로그가 존재하고 thiL 오르토로그가 부재하는 것이 미생물이 병원성임을 나타내는, 임상 시료에서 병원성 미생물을 검출하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    미생물이 리스테리아(Listeria), 스태필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    미생물이 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 퍼프링겐즈(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  28. (a) YloS 단백질을 포함하는 분석 조성물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 시험 화합물이 YloS 단백질 활성을 억제하는지를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 YloS 단백질의 활성을 억제하는 화합물의 능력에 근거하여 화합물을 항생제로서 확인하는, 항생제 확인용 분석법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    분석 조성물에 포함된 YloS 단백질이 정제된 YloS 단백질, 부분적으로 정제된 YloS 단백질, 및 YloS 단백질을 생산하는 세포로부터의 조질 세포 추출물로 구성된 군에서 선택되는 분석법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    YloS 단백질이 리스테리아, 스태필로코커스, 클로스트리듐, 엔테로코커스 및 스트렙토코커스로 구성된 군에서 선택되는 병원성 미생물로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 분석법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    미생물이 리스테리아 모노사이토게네스, 스태필로코커스 오레우스, 스태필로코커스 에피더미디스, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 퍼프링겐즈, 엔테로코커스 종, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오게네스 및 스트렙토코커스 뉴모니아에로 구성된 군에서 선택되는 분석법.
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