KR20060005958A

KR20060005958A - 탁수스 식물로부터 파클리탁셀 제조방법

Info

Publication number: KR20060005958A
Application number: KR1020040056725A
Authority: KR
Inventors: 가베타부르노; 지니장프랑코
Original assignee: 인데나 에스피아
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2004-07-21
Publication date: 2006-01-18
Also published as: DE602004008903T2; NO20070192L; EP1616868A1; IL180643A0; JP4890455B2; HK1101822A1; AU2005261970B2; DE602004008903D1; CA2573601A1; CA2573601C; ATE372993T1; EP1616868B1; ES2293129T3; AU2005261970A1; WO2006005429A1; PL1616868T3; RU2007101233A; DK1616868T3; SI1616868T1; CN100546986C

Abstract

본 발명은 파클리탁셀을 함유한 식물로부터 파클리탁셀을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 식물재료는 파클리탁셀을 함유하는 식물로부터 먼저 얻어진다. 다음 파클리탁셀을 식물재료로부터 추출한다. 이어서 파클리탁셀을 함유한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 컬럼클로마토그래피 분리단계의 일련의 공정을 사용하여 파클리탁셀 추출물로부터 파클리탁셀을 분리한다. 최종 클로마토그래피 단계에서 얻은 분획물중 파클리탁셀을 결정화시킨다. 이와같은 방법을 사용하여 고순도의 파클리탁셀을 함유하는 식물로부터 효과적으로 얻을 수 있다.

파클리탁셀(paclitaxel), 탁수스식물(Taxus plants)

Description

탁수스 식물로부터 파클리탁셀 제조방법{Methods for obtaining paclitaxel from Taxus plants}

도 1은 본 발명의 발명의 태양을 도시한 흐름도이다.

[기술분야]

본 발명은 일반적으로 파클리탁셀(paclitaxel)을 함유한 식물로부터 파클리탁셀을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 주목과(Taxaceae)에 속하는 식물로부터 파클리탁셀을 추출하는 방법에 관한 것으로, 탁수스 메디아(Taxus media)와 같은 탁수스종(genus Taxus)식물을 포함하며, 컬럼클로마토그래피단계를 거쳐 파클리탁셀을 결정화시키는 일련의 공정을 포함한다.

[배경기술]

파클리탁셀(paclitaxel)은 탁수스 브레비포리아(Taxus brevifolia)(pacific yew)나무의 수피(bark)로 부터 유도된 최초의 항암 작용을 갖는 화합물이다. 1960년경 국립암연구소(National Cancer Institute)는 항암(anti-cancer) 또는 항종양(anti-neoplastic)효능을 나타내는 식물추출물에 대한 연구를 개시한바 있다.

탁수스 브레비포리아(Taxus brevifolia)로 부터 유도된 수피(bark)의 조 추출물(Crude extracts)이 여러종양을 억제한다는 사실이 발견되었다. 1971년경 파크리탁셀이 엠.씨.와니등(M.C.Wani et al.)(J. Am. Chem. Soc. 93, 2325(1971))에 의하여 분리되었고 기술된바 있으며, 이때 화학방법 및 X-선 크리스탈로그래픽 분석(X-ray crystallographic analysis)을 사용하여 파클리탁셀의 구조를 구명한바 있다. 1979년 쉬프(Schiff)와 공동연구자들은 파클리탁셀의 신규의 작용기전을 밝혀내었다. 이 기전에는 마이크로튜블(microtubules)에 결합기전과 해중합반응(depolymerization)이 정상적으로 일어날 조건하에서 그들의 해중합반응을 방지하는 기전을 포함한다. 파클리탁셀은 흔히 난소(ovarian), 유방(breast)및 비소세포폐암(non-small cell lung cancers)에 사용된다.

비록 파클리탁셀이 패시픽유(태평양주목, Pacific yew)(T. brevifolia)의 수피로부터 추출된 최초 천연산물이지만 탁수스 카나덴시스(Taxus canadensis), 탁수스 윤나넨시스(Taxus yunnanensis)를 포함한 주목과 식물(Taxaceae family)의 다른식물에서도 또한 발견된바 있다.

파클리탁셀은 또한 유럽산유(European yew)(T. baccata)를 포함한 다른 유종 (yew species)의 땅위부분(epigeal parts)와 뿌리에도 존재하며, 아시안 유(Asian yews)(T. wallichiana 및 T. chinensis)는 파클리탁셀과 동족체를 침엽(needles)에 함유하기도 하며, 장식용으로 배양되기도 한다.

다음과 같은 탁수스 배양주(Taxus cultivars)에서도 파클리탁셀이 발견된 바 있다 : T.x media " 헨리 ( Henryi )", T.x media " 루난 ( Runyan )", T. cuspidata , T.x media "할로란(Halloran)", T.x media "하트필드(Hatfield)", T.x media" 힉시(Hicksii)", T.x media "타운토니(Tauntonii)", T.x media "다크 그린 스프레더(Dark Green Spreader)", T.x media "와디(Wardii)", T.x media "브라우니(Brownii)", T.x media "덴시호르미스(Densiformis)", T.x media "나이그라(Nigra)", T.x cuspidata "브레비포리아(Brevifolia)", 및 T. cuspidata "스프레더 (Spreader)".

이들 종 모두에는 매우 제한된 량으로 파클리탁셀을 포함하고 있다.

예를들면, 탁수스 브레비포리아(T. brevifolia)와 탁수스 윤나넨시스(T. yunnanensis)의 수피에는 약 0.02 %의 파크리탁셀을 포함하며, 탁수스 메디아 힉시(T. media Hicksii)관목의 침엽(needles)에는 약 0.005 % 내지 약 0.1 % 의 파클리탁셀을 포함하고 있다.

따라서, 식물재료로부터 고순도의 파클리탁셀을 추출하는 효과적인 방법의 개발에 큰 관심을 두게 되었다.

본 발명은 클로마토그래피를 사용하여 식물재료로부터 고순도의 파클리탁셀을 추출한 다음 파클리탁셀을 결정화하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 파클리탁셀을 함유하는 식물로부터 고순도의 파클리탁셀을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 방법은 파클리탁셀의 안정성을 보장할 수 있는 이점을 갖으며, 파클리탁셀의 내용량과는 관계없는 자주적으로, 여러 탁수스 배양주 또는 그의 부속부분을 사용하고, 그리고 바이오매스(biomass)에서 존재하는 파클리탁셀을 최대한 회수하는 것이다. 본 발명에 기재된 방법은 기존의 종래 방법들보다 여러 이로운점이 있다.

예를들면, 파클리탁셀은 7번위치에서의 에피머화반응(epimerization), 10번위치에서의 탈아세틸화반응(deacetylation)및 13번위치에서 측쇄체인의 분리(detachment)와 같은 여러 분해반응(degradation reactions)이 일어날 수 있다고 알려져 있다. 이들 분해반응은 분리된 파클리탁셀의 품질과 수율에 악영향을 미치며, 가열온도가 오르고, 특히 알콜성용매를 과량으로 매질중에 포함시켜야 한다. 본 발명에 기재된 방법에서는 알콜을 제한적인 량과 희석된 조건에서 사용하고 있으며, 일반적으로 추출공정동안 가열을 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 파클리탁셀의 안정성을 증가시킬수 있다.

나아가, 본 발명의 방법은 출발재료로서 식물부분(plant parts)의 여러 형태를 사용할 수 있다. 특히 본 발명에서 사용되는 출발재료는 파클리탁셀을 함유한 식물의 잎(leaves), 줄기(stems), 가지(brandes), 수피(bark), 뿌리(roots) 단독 또는 그들의 혼합물이 해당된다. 출발재료는 식물부분의 비율, 탁수스 배양주의 성질 및 파크리탁셀의 내용량과 관계없이 선택될수 있다. 본 발명의 방법은 파클리탁셀을 고 품질과 항량으로 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

뿐만 아니라 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 방법은 식물재료로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하는 것으로 구성된다. 파클리탁셀은 컬럼 클로마토그래피시스템(column chromatography systems)을 사용하여 파클리탁셀 추출물을 분리하고, 여기서 각 컬럼 클로마토그래피 시스템은 고정상과 용리용매로 구성되며, 다음 최종 클로마토그래피 단계에서 얻어진 적어도 하나 이상의 분획물중에 포함된 파클리탁셀을 결정화 시키는 것이다. 몇몇 태양에서, 파클리탁셀은 최종 클로마토그래피 단계에서 얻어 진 모든 분획물로부터 결정화 시킨다. 얻어진 파클리탁셀결정을 건조시킨다. 위에 기재된 바와같이 몇몇 바이오매스(biomasses)가 출발식물재료로 사용될 수 있다. 만약 탁수스 메디아 전체식물을 바이오매스(biomass)로 사용된다면 식물재료는 전형적으로 약 40 내지 약 60 중량 %(w/w)의 땅위부분과 약 60 내지 약 40 중량%(w/w)의 뿌리로 구성된다. 부가적으로 고정상과 용리용매는 상이한 시스템간에 다를수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 파클리탁셀은 식물재료로부터 파클리탁셀 추출물을 얻기위해 추출한다. 파클리탁셀은 물과 유기용매의 조합물과 같은 용매를 사용하여 식물재료로 부터 추출될수 있다. 컬럼클로마토그래피 시스템은 각 클로마토그래피를 통한 분리후 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻음으로써 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하는데 사용되며, 그리고 임의로, 용리용매를 제거하기 위해 압력을 감압시켜 적어도 하나이상의 분획물을 처리하는 것이다.

하나이상의 분획물을 각 분리후 수집할때에는 파클리탁셀을 함유한 적어도 여러 분획물을 조합물로 용리용매를 제거하기전 혼합할 수 있다. 부가적으로, 결정화는 24시간 이상 행하며 실온에서 행한다. 추가로 본 발명은 식물재료를 약 40 내지 약 60 체적(v/v)퍼센트의 아세톤으로 구성된 수용성용액으로 실온에서 추출하여 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 파클리탁셀을 추출하는 방법을 제공한다.

하나의 태양으로, 본 발명의 방법은 식물재료로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하고 다음 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획 물을 얻기위하여 제1고정상과 제1용리용매로 구성된 제1컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하는 공정으로 구성된다. 다음 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제2고정상과 제2용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시킨다. 그후 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제3고정상과 제3용리용매로 구성된 제3컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나 이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시킨다. 추가로, 적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고, 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제4공정상과 제4용리용매로 구성된 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시킨다. 다음 파클리탁셀결정을 얻기위하여 결정화용매를 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 결정화 시킨다.

또 다른 태양으로, 본 발명의 방법은 식물재료로부터 파클리탁셀을 추출하므로서 파클리탁셀추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

다음 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제1고정상과 제1용리용매로 구성된 제1컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하고, 제1잔사를 형성시키기 위하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 제1용리용매를 제거한다. 다음 제1잔사로부터 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제2고정상과 제2용리용매로 구 성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀을 제1잔사로부터 분리하고, 다음 제2잔사를 형성하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 제2용리 용매를 제거한다. 계속하여, 제2잔사로부터 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제3고정상과 제3용리용매로 구성된 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀을 제2잔사로부터 분리하고, 다음 제3잔사를 형성하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 제3용리용매를 제거한다. 다음 제3잔사로부터 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 제4고정상과 제4용리용매로 구성된 제4컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀을 제3잔사로부터 분리시키고, 다음 제4잔사를 형성하기 위하여 제3잔사로부터 제4용리용매를 제거시킨다. 다음 파클리탁셀을 제4잔사에 결정화용매를 사용하여 결정화시켜 파크리탁셀 결정을 얻는다.

또 다른 태양으로, 본 발명의 방법은 약 40 내지 약 60 v/v % 의 아세톤으로 구성된 수용성 용매로 실온에서 식물재료(plant material)를 추출하여 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 식물재료 추출물을 제조하고, 다음 식물재료 추출물로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀 추출물을 제조하는 것으로 구성된다. 다음 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 디클로로메탄 단독 또는 디클로로 메탄과 메탄올의 혼합물로 구성된 용리 용매로 구성된 제1클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리한다.

다음 적어도 하나이상의 분획물을 디클로로메탄 및/또는 메탄올을 제거하기 위하여 감압한다. 다음 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상인 중성 알루미나와 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고 아세톤을 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압한다. 그런다음 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤 혼합물로 구성된 용리용매로 구성된 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 n-헥산과 아세톤을 제거하기 위하여 적어도 하나 이상의 분획물을 감압시킨다. 더 나아가 적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸 아세테이트로 구성된 용리용매로 구성된 제4컬럼클로마토그래피시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 t-부틸아세테이트를 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압처리한다. 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화제로 사이클로헥산과 아세톤혼합물을 사용하여 24시간동안 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻는다.

다음 파클리탁셀결정을 진공하 48시간동안 건조시킨다.

또 다른 태양으로, 본 발명의 방법은 실온에서 약 40 내지 약 60 v/v %의 아세톤으로 구성된 수용성용매로 식물재료를 추출하여 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 식물재료추출물을 제조하고, 식물재료 추출물로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

다음 파클리탁셀을 함유한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 디클로로메탄 및 메탄올로 구성된 용리용매로 구성된 제1클로마토그래피시스템을 사용하여 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 잔사를 얻기위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다음 아세톤-잔사 조성물을 얻기 위하여 잔사를 아세톤중에 용해시킨다. 계속하여, 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 중성 알루미나와 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 아세톤-잔사 조성물로부터 파클리탁셀을 분리시킨다. 아세톤을 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압처리한다. 다음 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성된 제3컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고, n-헥산과 아세톤을 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다. 다음 적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나 이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸아세테이트로 구성된 용리용매로 구성된 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 t-부틸아세테이트를 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다.

다음 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화 용매로 사이클로헥산과 아세톤 혼합물을 사용하여 24시간동안 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻는다. 파클리탁셀결정을 진공하 48시간동안 건조시킨다.

다음 파클리탁셀을 함유한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 중성 알루미나와 디클로로메탄 및 메탄올로 구성된 용리용매로 구성된 제1클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀 추출물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 디클로로메탄과 메탄올을 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다. 계속하여, 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 디클로로메탄과 메탄올로 구성된 용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로 부터 파클리탁셀을 분리시키고, 잔사를 얻기위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압처리한다음 아세톤중에 잔사를 용해시켜 아세톤-잔사 조성물을 얻는다. 그 다음 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성된 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 아세톤-잔사 조성물로부터 파클리탁셀을 분리하고, n-헥산과 아세톤의 혼합물을 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다. 다음 적어도 세팔로 만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나 이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸아세테이트로 구성된 용리용매로 구성된 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리시키고, 다음 t-부틸아세테이트를 제거하기 위하여 적어도 하나이상의 분획물을 감압시킨다.

그 다음 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화 용매로 사이클로헥산과 아세톤 혼합물을 사용하여 24시간동안 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻는다. 파클리탁셀결정을 진공하 48시간동안 건조시킨다.

본 발명의 방법은 파클리탁셀을 함유한 식물로부터 파클리탁셀을 획득하는 방법을 포함한다. 도 1은 본 발명의 방법의 태양을 도시한 흐름도이다. 단계 A는 파클리탁셀을 함유한 식물 재료에서 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀 추출물을 제조하는 것을 포함한다. 다음 파클리탁셀은 컬럼 클로마토그래피 분리 시스템을 사용하는 단계 B - E에서 파클리탁셀 추출물에서 다른 성분으로부터 분리된다.(ⅰ)로 표시된 각각 단계는, 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나 이상의 분획물을 얻기 위하여 고정 상과 용리 용매로 구성된 컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하는 파클리탁셀 추출물 또는 클로마토그래피 분획물로부터 파클리탁셀의 분리 공정을 포함한다. (ⅱ)로 표시된 각각 단계는 이전의 클로마토그래피 단계에서 획득된 적어도 하나 이상의 분획물로부터 용리 용매를 제거하는 공정을 포함한다. 바람직한 태양에서, 적어도 하나 이상의 분획물은 용리 용매를 제거하기 위해 감압처리 한다. 도 1에서 표지 (a)와 (b)는 변경된 분리 경로를 가리킨다. 예를 들어, 만약 (a) 경로가 각각 분리 단계 다음에 이루어지면, 용리 용매는 파클리탁셀의 적어도 하나 이상의 분획물로부터 제거되지 않을 것이다. 예를 들어, 만약 (b)의 경로가 각각 분리 단계 다음에 이루어지면, 용리 용매는 파클리탁셀의 적어도 하나 이상의 분획물로부터 제거될 것이다. 다른 태양에서, (a) 경로는 분리 단계의 어느 다음에 올 수 있으며, (b)의 경로는 다른 분리 단계의 다음에 올 수 있다. 예를 들어, 단계 B에서 (b) 경로는 단계 B에서 획득된 분획물에서 용리 용매가 제거되기 위해서 취할 수 있는데 반해, 단계 C에서, (a) 경로는 단계 C의 용리 용매의 제거 없이, 단계 D에서 분획물을 직접 분리시키기 위해 취해진다. 단계 F는 마지막 클로마토그래피 단계에서 획득된 적어도 하나 이상의 분획물을 결정화하는 것을 수반한다. 특수한 태양에서, 단계 E(ⅱ)에서 획득된 적어도 하나 이상의 분획물은 단계 F에서 결정화된다. 도 1에서 단지 네 개의 클로마토그래피 단계를 보여주지만, 결정화 전에 추가의 클로마토그래피 단계가 있을 수 있다. 결정화 단계는 건조 단계가 뒤따를 수 있다.

식물 재료

본 발명의 단계 A에서 사용하기 위한 출발 재료는 파클리탁셀을 함유한 식물 재료이다. 적합한 식물 재료는 주목과(Taxaceae family)의 식물 부분, 예를 들어 탁수스(Taxus)식물에서 획득 할 수 있다. 되도록이면, 식물 재료는 탁수스 메디아(Taxus media)에서 조제된다. 탁수스 메디아(Taxus media)의 적합한 변종은 T.x meda "Hill," T.x media " 헨리 ( Henryi )", T.x media " 루난 ( Runyan )", T. cuspidata, T.x media " 할로란 ( Halloran )", T.x media "하트필드(Hatfield)", T.x media" 힉시 ( Hicksii )", T.x media " 타운토니 ( Tauntonii )", T.x media " 다크 그린 스프레더(Dark Green Spreader)", T.x media "와디(Wardii)", T.x media "브라우니(Brownii)", T.x media "덴시호르미스(Densiformis)", T.x media "나이그라(Nigra)", T.x cuspidata "브레비포리아(Brevifolia)", 및 T.x cuspidata "스프레더 (Spreader)"를 포함한다. 게다가, 식물 재료는 신선하거나 건조된 뿌리, 잎, 가지, 씨, 나무껍질(수피), 줄기 또는 그것들의 혼합물과 같은, 탁수스(Taxus) 식물의 다양한 부분으로부터 제조될 수 있다. 되도록이면, 식물 재료는 약 40에서 약 60 w/w 퍼센트의 땅위 부분(aerial parts)과 약 60에서 약 40 w/w 퍼센트의 뿌리로 제조된다. 식물 재료는 예를 들어, 추출, 분쇄 또는 절단한 파클리탁셀-포함하는 식물 부분으로부터 획득된다. 특별한 태양에서, 추출되기 위한 식물 재료는 예를 들어, 10 mm 직경 망이 설비된 블레이드 제분 줄을 사용하여 가루로 만들 수 있다. 한 태양에서, 식물 재료는 적어도 하나 이상의 용매를 사용하여 추출된다. 적합한 용매는 예를 들어, 물 중에서 아세톤과 같은, 수성 유기용매와 같은 수성 용매를 포함한다. 되도록이면, 약 40에서 60 부피 퍼센트의 아세톤과 약 60에서 40 부피 퍼센트의 물의 혼합물이 사용된다. 수성 아세톤은 파클리탁셀의 분해를 막을 수 있다. 되도록이면, 추출은 실온에서 수행한다. 실온에서 추출은 파클리탁셀의 분해를 막을 수 있다.

파클리탁셀과 코지너 ( Cogeners )의 추출

예를 들어, 단계 B의 첫 번째 클로마토그래피 단계 이전에, 파클리탁셀의 추출물이 단계 A와 같이 제조되었다. 한 태양에서, 파클리탁셀 추출물은 용매로 식물 재료에서 파클리탁셀을 추출하는 것에 의해 제조되었다. 특별한 태양에서, 파클리탁셀 추출물은 식물 재료의 수성 아세톤 추출물을 처리하여 제조되었다. 적합한 추출 용매는 에틸 아세테이트 같은 지방족 에스테르, 또는 클로로포름 또는 디클로로메탄과 같은 염소 처리된 용매가 제한 없이 포함된다. 바람직한 추출 용매는 디클로로메탄이다. 특별한 태양에서, 파클리탁셀이 상기 용매 중 하나로 추출되기 전에, 수성 아세톤 추출물을 아세톤을 제거하기 위해 진공상태 하에서 농축시킨다. 농축물은 용매에 희석될 수 있다. 이 희석용매에는 메틸 알코올 또는 에틸 또는 프로필 알코올과 같은 다른 수용성(hydrosoluble) 알코올 용매가 포함될 수 있다. 다음 파클리탁셀은 디클로로메탄과 위에 설명된 다른 추출물 용매와 같은 추출용매를 사용하여 희석된 농축물에서 추출된다.

한 태양에서, 파클리탁셀 추출물은 용매를 제거하기 위하여, 진공상태 하에서 농축시켰다. 농축된 파클리탁셀 추출물은 파클리탁셀과 그의 코지너(cogeners), 엽록소, 지질, 리그난(lignans), 플라보노이드, 페놀 그리고 다양한 극성 불순물을 함유한다. 코지너(Cogeners)에는 예를 들어, 세팔로만닌(cephalomannine), N-데벤조일-N-헥사노일-파클리탁셀(N-debenzoyl-N-hexanoyl-paclitaxel), N-데벤조일-N-헥사노일-N-메틸-파클리탁셀(N-debenzoyl-N-hexanoyl-N-mehtyl-paclitaxel), N-데벤조일-N-페닐아세틸-파클리탁셀(N-debebzoyl-N-phenylacetyl-paclitaxel), N-데벤 조일-N-신나모일-파클리탁셀(N-debenzoyl-N-cinnamoyl-paclitaxel), 그리고 2-데벤조일-2-티그로일-파클리탁셀(2-debenzoyl-2-tigloyl-paclitaxel)을 포함한다. 각각 이들은 각각의 7-에피(7-epi), 10-데아세틸(10-deacetyl) 그리고 7-0-자이로실(7-0-xylosyl) 유도체 형태로 존재할 수 있다. 파클리탁셀의 상응하는 후자의 유도체가 역시 존재한다. 이들 비-파클리탁셀 성분들 또는 불순물은 아래에 설명되는 것처럼 클로마토그래피 기술을 사용하여 제거될 수 있다.

클로마토그래피 에 의한 파클리탁셀의 정제

단계 B - E와 같이 도 1에 제시된 최소한 4개의 컬럼 클로마토그래피 단계를 적용하여 파클리탁셀 추출물에서 파클리탁셀을 분리시킨다. 단계 B(ⅰ) - E(ⅰ) 각각은 고정 상(stationary phase)과 용리 용매로 구성된 클로마토그래피 시스템의 사용을 포함한다. 각각의 시스템은 다른 고정 상과 용리 용매를 갖는 같은 장치일 수 있다. 적합한 고정 상은 중성 알루미나와 실리카-겔을 제한 없이 포함한다. 가능한 용리 용매는 아세톤, 디클로로메탄, 메탄올, n-헥산, t-부틸 아세테이트, 클로로포름, 그리고 에틸 아세테이트를 제한 없이 포함한다.

각각의 클로마토그래피 단계는 파클리탁셀을 함유한 적어도 하나 이상의 분획물을 획득하기 위해 고정 상과 용리 용매로 구성된 컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 적어도 하나 이상의 분획물은 클로마토그래피 단계에서 획득된 다수의 분획물의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 분획물은 클로마토그래피 단계에서 획득될 수 있다. 다음 이들 분획물을 조합하고, 다음 클로마토그래피 단계를 조합된 분획물에 대해 수행되었다.

한 태양에서, 용리 용매는 적어도 하나 이상의 분획물에서 제거된다. 적어도 하나 이상의 분획물은 용리 용매를 제거하기 위해 단계 B(ⅱ) - E(ⅱ)에서 감압 시킬 수 있다. 용매의 제거는 적어도 하나 이상의 분획물에서 반드시 모든 용매를 제거하는 것이고, 용매의 일부분을 포함할 수 있다.

한 태양에서, 첫 번째 클로마토그래피 단계인, 단계 B(ⅰ)은, 일반적으로 파클리탁셀로부터 지질(fats), 엽록소(chlorophylls), 낮은 분자량을 갖는 페놀(phenolics)과 매우 극성 불순물을 분리할 수 있다. 두 번째 클로마토그래피 단계인, 단계 C(ⅰ)은, 일반적으로 파클리탁셀로부터 추가의 불순물, 특히 플라보노이드(flavonoids)와 리그난(lignans)를 분리할 수 있다. 세 번째 클로마토그래피 단계인, 단계 D(ⅰ) 은 , 일반적으로 파클리탁셀로부터 다른 탁산류(taxanes)를 분리할 수 있다. 그런 탁산류(taxanes)에는 위에서 언급된 탄산 유도체(taxane derivatives), 특히, 세팔로만닌(cephalomannine)과 위에서 언급된 것과 같은, 다른 탄산류(taxanes) 보다 작은 양을 포함한다. 네 번째 클로마토그래피 단계인, 단계 E(ⅰ)는, 파클리탁셀로부터 코지너 세팔로만닌(cogener cephalomannine)을 분리한다. 세팔로만닌(cephalomannine)를 제거하기 위한 적합한 고정 상은 실리카 겔을 포함한다. 유용한 용리 용매의 예는 t-부틸 아세테이트, i-부틸 아세테이트, n-부틸 포메이트, i-부틸 포메이트, t-부틸 포메이트, 그리고 s-부틸 포메이트를 포함한다. 미국 특허번호 제6,333,419호를 참고하고, 여기의 내용은 그대로 참고로 적용될 수 있다.

한 태양에서, 첫 번째 컬럼 클로마토그래피 시스템은 실리카 겔로 구성된 고정 상과 메틸렌 클로라이드와 다음에 99 : 1 또는 98 : 2 v/v 비율의 메틸렌 클로라이드-메탄올의 혼합물로 구성된 용리 용매로 구성된다. 다른 태양에서, 두 번째 컬럼 클로마토그래피 시스템은 중성 알루미나로 구성된 고정 상과 포함하고 아세톤으로 구성된 용리 용매로 구성된다. 다시 또 다른 태양에서, 세 번째 컬럼 클로마토그래피 시스템은 실리카 겔로 구성된 고정 상과, 4 : 1의 비율로 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리 용매로 구성된다. 다른 태양에서, 네 번째 컬럼 클로마토그래피는 시스템은 실리카 겔로 구성된 고정 상과 t-부틸 아세테이트로 구성된 용리 용매로 구성된다.

임의로, 다른 순서로 불순물을 제거하는 것 역시 가능하다. 예를 들어 알루미나와 페놀의 제거는 고정 상으로 실리카 겔을 사용하여 엽록소와 지질의 제거 전에 수행될 수 있다.

파클리탁셀의 결정화

마지막 클로마토그래피 단계에 따라, 파클리탁셀을 함유한 적어도 하나 이상의 분획물을 파클리탁셀 결정체를 얻기 위해 결정화하는 용매를 사용하는 단계 F에서 결정화시키는 단계에서 얻었다. 적합한 결정화 용매는 시클로헥산(cyclohexane), 아세톤, n-헥산, i-헥산, n-헵탄, t-부틸 아세테이트와 그들의 혼합물을 포함한다. 바람직하기로는, 1 : 1의 비율로 시클로헥산과 아세톤의 혼합물이 사용된다. 한 태양에서, 결정화는 실온에서 일어난다. 일반적으로, 결정화는 24 시간 이상 기간 동안 일어난다. 그러나, 결정화는 다른 시간 동안 역시 일어날 수 있다. 결정화 다음에는, 파클리탁셀 결정체를 예를 들어, 약 50℃에서 약 60 ℃사이의 온도에서 진공상태 하에서 건조시킨다. 되도록이면 약 48 시간동안 건조시킨다.

실시예 1

약 500 kg의 뿌리와 약 500 kg의 잎과 잔가지들로 구성된 탁수스 메디아 힉시(T. media Hichsii)로 부터 획득된 건조되고 가루화한 식물 재료 1 톤(ton)을 실온에서 50 % 수성 아세톤 15.000 L로 추출하였다. 추출물은 약 300 L로 진공상태 하에서 농축시켰다. 그때, 150 L의 메탄올을 첨가시키고, 디클로로메탄(dichloromethane) 200 L 로 5가지 추출물을 제조하였다. 모은 유기층을 연성 잔존물(잔사)이 될 때까지 진공상태 하에서 농축시키고, 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 실리카 겔 180 kg으로 컬럼 클로마토그래피(column chromatograph) 시켰다. 디클로로메탄 약 2.700 L는 컬럼을 통해 용리시키고, 경사시켰다.

다음 파클리탁셀(Paclitaxel)을 디클로로메탄-메탄올 99 : 1 (v/v)의 혼합물로 용리시켰다. 용액을 연성 잔존물을 얻기 위해 진공상태 하에서 증발시켰다. 잔존물은 중성 알루미나(alumina) 30 kg을 포함한 컬럼을 통해 통과시켜 아세톤-잔존물(잔사)을 획득하기 위해 아세톤 8 L에 용해시키고, 같은 용매로 용리시켰다. 파클리탁셀을 포함하는 분획물을 모으고, 진공상태 하에서 8 L로 농축시켰다.

다음 아세톤 용액을 n-헥산-아세톤 4 : 1의 혼합물로 포장된 실리카 겔 180 kg을 포함하는 컬럼에 채웠다. 이 용출제에서 용리는 세팔로만닌(cephalomannine)을 제외한, 대부분의 다른 탁산류(taxanes)가 없는 파클리탁셀을 제공했다. 파클리탁셀을 포함한 분획물을 모으고, 진공상태에서 5 L로 농축시켰다.

다음 용액은 이 용매에서 용리하는, t-부틸 아세테이트로 포장된 실리카 겔 180 kg으로 클로마토그래피 하였다. 파클리탁셀을 함유한 분획물을 모으고, 연성 잔존물이 획득될 때 까지 진공상태 하에서 증발시켰다. 나아가 t-부틸 아세데이트로 컬럼의 용리는 최소한 세팔로만닌(cephalomannine)를 제거했다. 파클리탁셀을 포함한 연성 잔존물(약 300 g)을 아세톤 2 L에 용해시키고, 시클로헥산(cyclohexane) 1.2 L에 희석시킨 다음, 결정화하기 위해 남겨뒀다. 여과 후 50 ℃에서 48 시간 동안의 건조하여, 99 % 보다 큰 순도를 갖는 파클리탁셀 255 g을 얻었다.

실시예 2

약 40 kg의 뿌리와 약 60 kg의 잎과 잔가지로 구성된 탁수스 메디아(Taxus media)의 어두운 녹색 스프레더(dark green spreader)전체 식물로부터 얻은 건조하고 가루로 만든 식물 재료 100 킬로그램을 실온에서 50 % 수성 아세톤 1,500 L로 추출하였다. 추출물을 진공상태 하에서 30 L로 농축하였다. 다음, 메탄올 15 L을 첨가시키고, 디클로로메탄 20 L로 5가지 추출물로 실행하였다. 디클로로메탄 추출물을 모으고, 진공상태 하에서 15 L로 농축시켰다.

메탄올(150 ml)는 첨가시키고, 용액을 디클로로메탄-메탄올 99 : 1 v/v로 용 리하는 중성 알루미나(alumina) 13 kg을 포함하는 컬럼을 통해 통과시켰다. 파클리탁셀을 함유한 분획물을 수집하고, 진공상태 하에서 5 L로 농축시켰다.

농축된 용액을 실리카 겔 9 kg을 포함하는 컬럼 상에 채웠고, 디클로로메탄-메탄올 99 : 1 v/v로 용리시켰다. 극성 불순물의 용리 후, 파클리탁셀을 함유한 분획물 220 L를 수집하여, 모으고, 연성 잔존물(잔사)(190 g)을 획득하기 위해 진공상태 하에서 증발시켰다.

잔존물(잔사)을 아세톤-잔존물(잔사)을 형성하기 위해 아세톤 400 ml에 용해시키고, n-헥산-아세톤 4 : 1로 용리하는 실리카 겔 9 kg으로 컬럼 클로마토그래피 하였다. 파클리탁셀을 포함하는 분획물을 수집하고, 실시예 2에서 설명된 것처럼, t-부틸 아세테이트로 용리하는 실리카 겔로 컬럼 클로마토그래피하여 다시 정제하였다. 시클로헥산-아세톤 1 : 1로 혼합물을 결정화한 후 55 ℃에서 건조시켜, 99 % 보다 더 큰 순도를 갖는 파클리탁셀 18.5 g을 얻었다.

본 발명에 따르면, 파클리탁셀을 고품질과 항량으로 효과적으로 제조할 수 있으며, 또한 고수율로 얻을 수 있는 특장점이 있다.

Claims

하기 공정으로 구성된 파클리탁셀을 함유하는 식물로부터 파클리탁셀을 제조하는 방법.

(하기)

(a) 식물재료로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하고;

(b) 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제1고정상과 제1용리용매로 구성된 제1컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(c) 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제2고정상과 제2용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 단계(b)에서 얻은 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(d) 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제3고정상과 제3용리용매로 구성된 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 단계(c)에서 얻은 적어도 하나이상의 분획물로 부터 파클리탁셀을 분리하며;

(e) 적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 제4고정상과 제4용리용매로 구성된 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하여 단계(d)에서 얻은 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고; 그리고

(f)결정화용매를 사용하여 단계(e)에서 얻은 적어도 하나이상의 분획물중에 포함된 파클리탁셀을 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻는 단계로 구성된 공정이다.
제1항에 있어서, 단계(f)에서 얻은 파클리탁셀결정을 추가로 건조시키는 방법.
제1항에 있어서, 식물재료는 식물부분( plant parts)으로부터 얻어지는 방법.
제3항에 있어서, 식물재료추출물은 약 40 내지 약 60 w/w %의 땅위부분과 약 60 내지 약 40 w/w %의 뿌리로 구성된 식물재료를 추출하여 제조되는 방법.
제1항에 있어서, 식물재료는 탁수스 메디아(Taxus media), T.x media "헨리(Henryi)", T.x media "루난(Runyan)", T. cuspidata, T.x media "할로란 (Halloran)", T.x media "하트필드(Hatfield)", T.x media" 힉시 ( Hicksii )", T.x media " 타운토니 ( Tauntonii )", T.x media " 다크 그린 스프레더 (Dark Green Spreader)", T.x media " 와디 ( Wardii )", T.x media " 브라우니 ( Brownii )", T.x media " 덴시호르미스 ( Densiformis )", T.x media " 나이그라 ( Nigra )", T.x cuspidata "브레비포리아(Brevifolia)", 및 T. cuspidata " 스프레더 (Spreader)" 로 부터 얻어진 식물재료인 방법.
제1항에 있어서, 제2 고정상은 중성알루미나로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 제1, 제3, 또는 제4고정상은 실리카겔로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 제1, 제2 또는 제3 용리용매는 아세톤, 디클로로메탄, 메탄올, n-헥산, t-부틸아세테이트, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 제1용리용매는 디클로로메탄과 메탄올로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 제2용리용매는 아세톤으로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 제3용리용매는 n-헥산 및 아세톤으로 구성되는 방법
제1항에 있어서, 제4용리용매는 t-부틸아세테이트, i-부틸아세테이트, n-부틸 포메이트, i-부틸포메이트, t-부틸포메이트, 또는 s-부틸포메이트로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 결정화용매는 시클로헥산 및 아세톤으로 구성되는 방법.
하기 공정으로 구성된 파클리탁셀을 함유하는 식물로부터 파클리탁셀을 제조 하는 방법.

(하기)

(a) 식물재료로 부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하고;

(b) 하기공정으로 구성된 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i) 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제1고정상과 제1용리용매로 구성된 제1컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고,

(ii) 단계(b)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 제1잔사를 얻기 위하여 제1용리용매를 제거하며;

(c) 하기 공정으로 구성된 단계(b)(ii)에서 얻어진 제1잔사로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i) 제1잔사로 부터 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 제2고정상과 제2용리용매로 구성된 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고,

(ii)단계 (c)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 제2잔사를 얻기위하여 제2용리용매를 제거하며;

(d) 하기공정으로 구성된 단계 (c)(ii)에서 얻어진 제2잔사로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i) 제2잔사로부터 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 제3고정상과 제3용리용매로 구성된 제3컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고,

(ii) 단계(d)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 제3잔사를 얻기위하여 제3용리용매를 제거하며;

(e) 하기 공정으로 구성된 단계(d)(ii)에서 얻어진 제3잔사로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i) 제3잔사로부터 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 제4고정상과 제4용리용매로 구성된 제4컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고,

(ii)단계(e)(i)에서 얻어진 제3잔사로부터 제4잔사를 얻기위하여 제4용리용매를 제거하며;

(f) 결정화용매를 사용하여 단계(e)(ii)에서 얻어진 제4잔사로부터 파클리탁셀을 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻는 공정으로 구성된다.
제14항에 있어서, 단계(e)에서 적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제3잔사로부터 제거하는 방법.
제14항에 있어서, 제1용리용매는 단계(b)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 제거하는 방법.
제14항에 있어서, 제2용리용매는 단계(c)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 제거하는 방법.
제14항에 있어서, 제3용리용매는 단계(d)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 제거하는 방법.
제14항에 있어서, 제4용리용매는 단계(e)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 제거하는 방법.
제14항에 있어서, 추가로 단계(f)에서 얻어진 파클리탁셀을 건조하는 방법.
제20항에 있어서, 파클리탁셀결정은 진공하 건조시키는 방법.
제14항에 있어서, 파클리탁셀은 식물재료로부터 제1수성 용매를 사용하여 추출하는 방법.
제22항에 있어서, 제1수성용매는 물과 아세톤으로 구성된 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)는 실온에서 수행되는 방법.
제14항에 있어서, 단계(b)(i)에서 얻어진 하나이상의 분획물과 적어도 분획물 다수를 단계(b)(ii)에서 제1용리용매를 제거하기전 조합시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계(c)(i)에서 얻어진 하나이상의 분획물과 적어도 분획물 다수를 단계(c)(ii)에서 제2용리용매를 제거하기전 조합시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계(d)(i)에서 얻어진 하나이상의 분획물과 적어도 분획물 다수를 단계(d)(ii)에서 제3용리용매를 제거하기전 조합시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계(e)(i)에서 얻어진 하나 이상의 분획물과 적어도 분획물 다수를 단계(e)(ii)에서 제4용리용매를 제거하기전 조합시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계(f)의 결정화를 24시간 기간 넘게 시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계(f)의 결정화를 실온에서 시키는 방법.
제14항에 있어서, 식물재료는 식물부분(plant parts)에서 얻는 방법
제31항에 있어서, 식물재료추출물은 약 40 내지 약 60 w/w%의 땅위부분과 약 60 내지 약 40 w/w%의 뿌리로 구성된 식물부분으로부터 얻은 식물재료를 추출하여 얻는 방법.
제14항에 있어서, 식물재료는 탁수스 메디아(Taxus media), T.x media "헨리(Henryi)", T.x media "루난(Runyan)", T. cuspidata, T.x media "할로란 (Halloran)", T.x media "하트필드(Hatfield)", T.x media" 힉시 ( Hicksii )", T.x media " 타운토니 ( Tauntonii )", T.x media " 다크 그린 스프레더 (Dark Green Spreader)", T.x media " 와디 ( Wardii )", T.x media " 브라우니 ( Brownii )", T.x media " 덴시호르미스 ( Densiformis )", T.x media " 나이그라 ( Nigra )", T.x cuspidata "브레비포리아(Brevifolia)", 및 T. cuspidata " 스프레더 (Spreader)" 로 부터 얻어진 식물재료로 구성된 방법.
제14항에 있어서, 제2고정상은 중성 알루미나로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제1, 제3, 또는 제4고정상은 실리카겔로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제1, 제2 또는 제3 용리용매는 아세톤, 디클로로메탄, 메탄올, n-헥산, t-부틸아세테이트, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제1용리용매는 디클로로메탄과 메탄올로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제1용리용매는 아세톤으로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제3용리용매는 n-헥산, 및 아세톤으로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 제4용리용매는 t-부틸아세테이트, i-부틸아세테이트, n-부틸포메이트, i-부틸포메이트, t-부틸포메이트, 또는 s-부틸포메이트로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 결정화용매는 시클로헥산과 아세톤으로 구성되는 방법.
하기공정으로 구성된 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 파클리탁셀을 제조하는 방법.

(하기)

(a)식물재료를 실온에서 약 40 내지 약 60 v/v%의 아세톤으로 구성된 수성용매로 추출하여 탁수스 메디아(Taxus media)로부터 식물재료추출물을 제조하고;

(b) 단계(a)에서 얻은 식물재료추출물로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하며;

(c) 하기 고정으로 구성된 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 디클로로메탄 단독 또는 디클로로메탄과 메탄올 혼합물로 구성된 용리용매로 구성되는 제1클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계(c)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 디클로로메탄과/또는 메탄올을 제거하며;

(d)하기 고정으로 구성돤 단계(c)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 중성아루미나와 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성되는 제2 컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계(d)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 아세톤을 을 제거하며;

(e)하기공정으로 구성된 단계(d)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나 이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성되는 제3컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계(e)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 n-헥산과 아세톤을 제거하며;

(f)하기 공정으로 구성된 단계(e)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i)적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함한 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸아세테이트로 구성된 용리용매로 구성되는 제4컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계 (f)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 t-부틸아세테이트를 제거하며;

(g)단계(f)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화제로 시클로헥산과 아세톤의 혼합물을 사용하여 24시간 이상 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻고; 그리고

(h)단계(g)에서 얻은 파클리탁셀 결정을 진공하 48시간 건조시키는 공정으로 구성된다.
제42항에 있어서, 단계(b)의 파클리탁셀추출물의 제조공정에 하기와 같은 공정이 추가되는 방법.

(하기)

(a)아세톤을 제거하기 위하여 식물재료 추출물을 감압하 농축시켜 농축물(concentrate)을 얻고;

(b)농축물을 메틸알콜로 희석시키며;

(c)농축물을 디클로로메탄으로 추출하여 디클로로메탄추출물을 얻은후; 그리고

(d)디클로로메탄추출물을 감압하 농축시켜 파클리탁셀 추출물을 제조하는 공정으로 구성된다.
하기 공정으로 구성된 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 파클리탁셀을 제 조하는 공정.

(하기)

(a)식물재료를 실온에서 약 40 내지 약 60 v/v% 의 아세톤으로 구성된 수성용매로 추출하여 탁수스메디아(Taxus media)로 부터 식물재료 추출물을 제조하고;

(b)단계(a)에서 얻은 식물재료추출물로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀추출물을 제조하며;

(c)하기 공정으로 구성된 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기위하여 고정상으로 실라카겔과 디클로로메탄과 메탄올로 구성된 제1클로마토그래피 시스템을 사용하고,

(ii)단계(c)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 잔사를 얻은후, 그리고

(iii)단계(c)(ii)에서 얻어진 잔사를 아세톤에서 용해시켜 아세톤-잔사 조성물을 얻으며;

(d)하기 공정으로 구성된 단계(c)(iii)에서 얻어진 아세톤-잔사 조성물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 중성 알루미나와 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성되는 제2컬럼 클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계 (d)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 아세톤을 제거하며;

(e)하기 공정으로 구성된 단계(d)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성되는 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계 (e)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 n-헥산과 아세톤을 제거하며;

(f)하기공정으로 구성된 단계(e)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸아세테이트로 구성된 용리용매로 구성되는 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고 그리고,

(ii)단계 (f)(i)에 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 t-부틸아세테이트를 제거하며;

(g)단계(f)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화제로 시클로헥산과 아세톤의 혼합물을 사용하여 24시간이상 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻고; 그리고

(h)단계(g)에서 얻은 파클리탁셀결정을 진공하 48시간 건조시키는 공정으로 구성된다.
제44항에 있어서, 탁수스 메디아(Taxus media)는 탁수스 메디아힉시(Taxus media Hicksii)인 방법.
하기 공정으로 구성된 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 파클리탁셀을 제조하는 공정.

(하기)

(a)식물재료를 실온에서 약 40 내지 약 60 v/v%의 아세톤으로 구성된 수성용매로 추출하여 탁수스 메디아(Taxus media)로 부터 식물재료 추출물을 제조하고;

(b)단계(a)에서 얻은 식물재료 추출물로부터 파클리탁셀을 추출하여 파클리탁셀 추출물을 제조하며;

(c)하기공정으로 구성된 파클리탁셀추출물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 중성알루미나와 디클로로메탄과 메탄올로 구성된 용리용매로 구성되는 제1클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계(c)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 디클로로메탄과 메탄올을 제거하며;

(d)하기공정으로 구성된 단계(c)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나 이상의 분획물을 얻기위하여 고정상 으로 실리카겔과 디클로로메탄과 메탄올로 구성된 용리용매로 구성되는 제2컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고,

(ii)단계(d)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 잔사를 얻은후, 그리고

(iii)단계(d)(ii)에서 얻어진 잔사를 아세톤에 용해시켜 아세톤-잔사 조성물을 제조하고;

(e)하기공정으로 구성된 단계(d)(iii)에서 얻어진 아세톤-잔사 조성물로부터 파클리탁셀을 분리하고;

(i)파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 n-헥산과 아세톤으로 구성된 용리용매로 구성되는 제3컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계(e)(i)에서 얻이진 적어도 하나이상의 분획물을 결합시켜 n-헥산과 아세톤의 혼합물을 제거하며;

(f)하기 공정으로 구성된 단계(e)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물로부터 파클리탁셀을 분리하며;

(i)적어도 세팔로만닌(cephalomannine)을 제거하고 파클리탁셀을 포함하는 적어도 하나이상의 분획물을 얻기 위하여 고정상으로 실리카겔과 t-부틸아세테이트로 구성된 용리용매로 구성되는 제4컬럼클로마토그래피 시스템을 사용하고, 그리고

(ii)단계 (f)(i)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 감압시켜 t-부틸아세테이트를 제거하며;

(g)단계(f)(ii)에서 얻어진 적어도 하나이상의 분획물을 실온에서 결정화제로 시클로헥산과 아세톤의 혼합물을 사용하여 24시간 이상 결정화시켜 파클리탁셀결정을 얻고; 그리고

(h)단계(g)에서 얻은 파클리탁셀결정을 진공하 48시간 건조시키는 공정으로 구성된다.
제46항에 있어서, 탁수스 메디아(Taxus media)는 탁수스 메디아 "다크그린 스프레더"(Taxus media "dark green spreader")인 방법.