KR20050122373A

KR20050122373A - 단삼 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 ｂ를함유하는 나트륨 채널 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20050122373A
Application number: KR1020040047466A
Authority: KR
Inventors: 호원경; 이석호; 김영섭; 유시용; 최연희; 오현철
Original assignee: 대한민국(서울대학교 총장)
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2005-12-29

Abstract

본 발명은 단삼 (Salvia miltiorrhiza)의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B (dimethyl lithospermate B, dmLSB)를 유효성분으로 하는 나트륨 채널 (sodium channel) 촉진용 조성물에 관한 것으로, 단삼의 뿌리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 디메틸 리소스퍼메이트 B는 나트륨 채널에 선택적으로 작용하여 나트륨 전류의 비활성화를 지연시키고 활동전압기간을 연장시키는 반면, 조기-후 탈분극 (early-after depolarization, EAD)을 유발하지 않아 부정맥을 야기하지 않으므로, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단삼 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 Ｂ를 함유하는 나트륨 채널 촉진용 조성물{COMPOSITION COMPRISING A ROOT EXTRACT OF SALVIA MILTIORRHIZA OR DIMETHYL LITHOSPERMATE B AS A SODIUM CHANNEL AGONIST}

본 발명은 단삼 (Salvia miltiorrhiza)의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B (dimethyl lithospermate B, dmLSB)를 유효성분으로 하는 나트륨 채널 촉진제 (sodium channel agonist) 조성물에 관한 것이다.

막전압-의존성 전압-개폐 나트륨 채널 (voltage-gated sodium channel, VGSC)은 흥분성 세포에서 활동전압 상승 (upstroke)의 원인이 되는 주요 결정인자로, VGSC의 개폐는 세포 내 다양한 신호 전달기작과 약물에 의해 조절된다. 이 VGSC에 변이가 생기면 심부정맥과 간질 등이 유발되는데, 대표적으로 Long QT-3과 부르가다 (Brugada) 증후군은 각각 VGSC의 작용획득 (gain-of-function)과 작용소실 (loss-of-function)로 인해 유발되는 것으로 알려져 있다 (Grant AO, et al., J. Clin. Invest. 110(8), 1201-1209, 2002; Veldkamp MW, et al., Circ. Res. 86, e91-e97, 2000)

VGSC를 표적으로 하는 약물들은 국소마취제, 근이완제, 항 부정맥제, 항 간질제 등으로 임상에서 널리 사용되고 있는데, 이들은 주로 나트륨 채널 촉진제이다. 최근에는, 인공적으로 합성된 나트륨 채널 촉진제가 충혈성 심장마비 환자에 있어서 심장수축을 개선시킬 수 있는 새로운 약리학적 대응방안으로 제시되고 있다 (Muller-Ehmsen J, et al., J. Cardio. Pharma. 31, 684-689, 1998). 이러한 약물들은 나트륨 전류 (I_Na)의 비활성화 시기를 늦추어 활동전압기간 (action potential duration, APD)을 연장시킨다. 이로 인해 나트륨 유입과 세포내 나트륨 적재량이 증가하여 심실근 세포 내 Na⁺/Ca²⁺ 교환 활성에 의한 근수축 조절이 항진되는 것이다.

한편, 부르가다 증후군은 심장의 나트륨 채널인 Na_V1.5를 암호화하는 유전자인 SCN5A상의 변이로 인해 유발되는 유전질환으로, Na_V1.5의 거의 모든 부분에서 복수의 변이가 밝혀져 있다. 다수의 부르가다 증후군 변이는 나트륨 채널의 개폐 작용을 변화시켜 나트륨 채널의 가용성을 저하시키는 것으로 보고되었는데, 늦은 비활성화 단계로부터의 나트륨 채널의 더딘 회복은 부르가다 증후군에서 발견되는 주요 기능장애의 원인이 된다 (Wang DW, et al., Circ. Res. 87, e37-e43, 2000). 그러나, 아직까지는 부르가다 증후군의 치료를 위한 효과적인 약물이 개발되지 않은 상태이고, 이러한 연구의 일환으로 나트륨 채널 증대로 인한 활동전압기간을 증가시킬 수 있는 나트륨 채널 촉진제의 치료적 가능성이 모색되고 있다.

그러나, 기존에 합성된 나트륨 채널 촉진제는 부정맥 유발 가능성으로 인해 임상치료에 적용하기가 부적절하였다. 대부분의 나트륨 채널 촉진제는 나트륨 전류 비활성화를 지연시켜 지속성 나트륨 전류 (persistent Na⁺ current)를 발생시킴으로써 (Yuill KH, et al., Br. J. Pharmacol. 130, 1753-1766, 2000) 조기 후-탈분극 (early after-depolarization, EAD)을 유발하여 부정맥을 야기하게 되는 문제점이 있다 (Ruegg PC & Nuesch E, Br. J. Clin. Pharmacol. 24, 453-458, 1995).

이에 본 발명자들은 천연물로부터 분리·정제되어 독성을 나타내지 않고 부정맥을 유발하지 않으면서 나트륨 채널 촉진제로 사용될 수 있는 화합물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 단삼의 뿌리 추출물에서 분리·정제된 디메틸 리소스퍼메이트 B가 나트륨 채널에 선택적으로 작용하여 나트륨 전류의 비활성화를 지연시키고 활동전압기간을 연장시키는 반면, 조기 후-탈분극에 의한 부정맥을 유발하지 않아 나트륨 채널 촉진제로서 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

디메틸 리소스퍼메이트 B는 리소스퍼메이트 B의 디메틸에스테르 형태이며, 리소스퍼메이트 B는 카페인산 사분자체 (tetramer)로 단삼 (Salvia miltiorrhiza)의 뿌리에서 추출된다. 리소스퍼메이트 B는 NG-모노메틸-L-아르기닌 (L-NMMA)에 의해 저해되는 내피-의존성 혈관확장을 유발하며 (Kamata K, et al., Gen. Pharmacol. 24, 977-81, 1993), 칼슘의 이동 (mobilization)을 저하시킴으로써 동맥 절편의 노르에피네프린-유발성 수축을 저해하는 것으로 보고되었다 (Nagai M, et al., Biol. Pharm. Bull. 19, 228-232, 1996). 리소스퍼메이트 B는 토끼의 허혈-재관주 모형에서 유발된 심장근 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고되었으나 (Fung KP, et al., Life Sci. 53(12), PL189-93, 1993), 리소스퍼메이트 B뿐만 아니라 이의 디메틸에스테르 형태가 심장의 전기적 활동에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 나트륨 채널 촉진제를 포함하는 강심제, 항 부정맥제 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디메틸 리소스퍼메이트 B를 포함하고 나트륨 채널에 선택적으로 작용하여 활성화시키는 단삼의 뿌리 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단삼의 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 나트륨 채널 촉진제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 나트륨 채널 촉진제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 단삼의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B를 유효성분으로 함유하는 강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방 및 치료제 조성물을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 단삼의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B를 포함하는 강심제 효과 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방 및 치료를 통한 건강 증진용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 나트륨 채널에 선택적으로 작용하여 나트륨 전류의 비활성화를 지연시키고 활동전압기간을 연장시키는 반면, 조기 후-탈분극에 의한 부정맥을 유발하지 않아 나트륨 채널 촉진제로 유용하게 사용될 수 있는 단삼의 뿌리 추출물 또는 이로부터 분리·정제된 하기 화학식 1의 디메틸 리소스퍼메이트 B를 제공한다.

<화학식 1>

본 발명에 따른 단삼의 뿌리 추출물은 단삼의 뿌리 또는 이의 건조물을 유기용매로 추출함으로써 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 단삼의 뿌리 추출물은

1) 건조시킨 단삼 뿌리를 저급알콜로 추출한 후 여과 및 농축하여 저급알콜 추출물을 얻는 단계; 및

2) 상기 저급알콜 추출물을 증류수에 현탁한 후 유기용매로 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

단계 1)에서는, 건조된 단삼 뿌리 1 ㎏에 약 1 내지 50 ℓ, 바람직하게는 약 5 내지 10 ℓ의 저급알콜을 가하고 20 내지 60℃, 상온에서 약 5 내지 15일, 바람직하게는 약 7 내지 10일 동안 침출시켜 추출한다. 상기 단계에서 사용 가능한 저급알콜로는 메탄올 또는 메탄올 수용액, 에탄올 또는 에탄올 수용액, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올 및 이들의 혼합물 등이 있으며, 메탄올 및 50 내지 90％ 메탄올 수용액이 가장 바람직하다. 이로부터 얻은 추출물을 여과하여 불순물을 제거한 후 감압 조건, 바람직하게는 1 내지 2 psi 압력하에서 농축하여 저급알콜 추출물을 얻는다.

단계 2)에서는 저급알콜 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 상기 현탁액에 약 1 내지 5배, 바람직하게는 1.5 내지 3배 부피의 극성 또는 비극성 유기용매를 가하여 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 분획하여 수득할 수 있다. 또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다. 상기 단계에서 사용가능한 유기용매로는 에틸아세테이트 (EtOAc), 에테르 또는 부탄올 등이 있으며, 에틸아세테이트가 가장 바람직하다.

또한, 디메틸 리소스퍼메이트 B는 단삼의 뿌리 추출물로부터 분리·정제하거나 이와 동시에 분리·정제된 리소스퍼메이트 B를 메틸화시켜 제조할 수 있고, 화학적으로 합성할 수도 있다.

구체적으로, 디메틸 리소스퍼메이트 B는 상기와 같이 제조된 단삼 뿌리의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 분리·정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, 역상실리카겔 컬럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 물과, 메틸렌클로라이드, 헥산, 에틸아세테이트, 저급알콜 등과 같은 유기용매를 사용할 수 있다.

아울러, 디메틸 리소스퍼메이트 B는 상기 방법에 의해 컬럼 크로마토그래피에서 추가적으로 용출되는 리소스퍼메이트 B를 촉매를 이용하여 메틸화시켜 디메틸 리소스퍼메이트 B로 전환시키는 방법에 의해 제조될 수도 있다. 이때, 촉매로는 p-톨루엔설폰산, 염산, 또는 황산 등이 사용될 수 있다.

디메틸 리소스퍼메이트 B 및 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물의 나트륨 채널 촉진제로서의 효과를 입증하기 위하여 마우스 심실근 세포를 분리한 후 막전압 고정법을 사용하여 단삼의 뿌리 추출물 및 디메틸 리소스퍼메이트 B의 전기 생리학적 효과를 조사하였다. 그 결과, 단삼의 뿌리 추출물 및 디메틸 리소스퍼메이트 B는 심실근 세포의 활동전압기간을 연장시켰는데, 이러한 효과는 나트륨 전류의 비활성화 지연으로 인한 것으로 칼륨이나 칼슘 전류에는 별 영향을 나타내지 않고 나트륨 전류에만 선택적으로 작용하였다. 디메틸 리소스퍼메이트 B에 의한 활동전압기간의 연장은 조기 후-탈분극 (early-after depolarization, EAD)을 유발하지 않아 부정맥을 일으킬 위험이 없으며, 지속성 나트륨 전류도 발생시키지 않아 나트륨 채널 촉진제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

기존에 나트륨 채널 촉진제로 사용되어 온 베라트리딘, 바트라코톡신, 아코니틴, 피레스로이드 등은 지용성 식물염기들 (lipid-soluble alkaloids)로 활성화의 막전압 의존성을 저분극 쪽으로 이동시켜 비활성화를 저해 또는 완전 억제함으로써 안정막 전압에서의 나트륨 채널이 지속적으로 활성화되게 한다 (Caterall WA, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20, 15-43. 1980; Narahashi, 1996; Wang DW, et al., Circ. Res. 87, e37-e43, 2003). 그러나, 이들은 심장의 나트륨 전류의 활성영역 (window region: 활성화와 비활성화 곡선이 겹치는 영역의 전압)을 증가시키고 활성화와 비활성화 곡선 모두를 좌편으로 이동시켜 활성영역이 음전압 방향으로 이동하게 된다 (Spencer CI, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 298, 1067-1082, 2001). 이러한 변화가 심장 심실근 세포에서의 연장된 고원기 (plateau phase)에서 EAD 발생에 관여하게 된다. 그러나, 본 발명의 디메틸 리소스퍼메이트 B는 나트륨 전류의 활성화 곡선을 양전압 방향으로 이동시키나, 평형-상태 비활성화 곡선에는 영향을 주지 않으면서 나트륨 전류의 비활성화 동역학을 늦추는 반면, 지속성 나트륨 전류를 유발시키지 않는다. 이러한 특성들이 본 발명의 디메틸 리소스퍼메이트 B가 기존에 나트륨 채널 촉진제로 알려진 지용성 식물염기들과는 달리 EAD를 유발하지 않으면서 활동전압기간을 연장시키는 것으로 판단된다.

상기와 같은 특성을 나타내는 본 발명의 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물은 지속성 나트륨 전류를 발생시키지 않으면서 나트륨 전류에만 선택적으로 작용하여 비활성화를 지연시키고 부정맥 유발 가능성이 적으므로 나트륨 채널 촉진제로서 강심제 또는 항 부정맥제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물은 나트륨 채널 증대로 인한 활동전압기간을 연장시켜 나트륨 채널의 기능 저하로 인한 부르가다 증후군의 치료제로서의 효과도 기대할 수 있다.

따라서, 강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 증후군의 예방 및 치료제로 사용가능한 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 통상적인 의약조성물의 형태로 제조되어 경구, 피하, 근육내, 정맥내, 십이지장내, 비내, 안막, 설하, 피부투과 및 직장경로 등의 다양한 경로를 통해 동물에 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 디메틸 리소스퍼메이트 B는 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들면 정제, 캡슐제, 산제, 과립, 트로치, 설하정, 카시에, 엘키실, 유탁액, 용액, 시럽, 현탁액, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐제, 및 무균 포장 분말 등의 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 유당, 포도당, 자당, 솔비톨, 만니톨, 옥수수전분, 결정 셀룰로스, 아라비아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 규산칼슘, 황산칼슘, 미결정 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 고무, 젤라틴, 시럽, 메틸셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 안식향산 나트륨, 메틸하이드록시 안식향산 에스테르, 프로필하이드록시 안식향산 에스테르, 탈크, 스테아린산 마그네슘, 불활성 폴리머류, 물 또는 광유, 주사용으로 허용가능한 땅콩유 (또는 낙화생유), 또 글리셀라이드와 같은 좌제기제 등이 있다.

고체 또는 액체 조성물 중 어느 것이나 상기와 같은 충전제, 결합제, 활택제, 습윤제, 붕괴제, 유탁 및 현탁제, 보존제, 감미제 또는 방향제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또 환자에게 투약 후에 활성성분이 급속히, 지속적으로 또는 지연적으로 방출되도록 처방할 수 있다.

경구투여의 경우에 리소스퍼메이트 B는 담체 및 희석제와 혼합되어 정제, 캡슐제 등의 형태로 제조된다. 비경구 투여의 경우에 활성성분은 10％ 포도당 수용액, 등장식염수, 무균수 또는 유사한 액체로 용해하여 정맥내에 점적 또는 주사에 의해서 또는 근육내 주사에 의해서 투여 되도록 바이알 또는 앰플로 밀폐된다. 바람직하기로는, 용해 보조제나 국소마취제, 보존제, 완충제 등을 용매 중에 포함할 수 있다. 안정성을 증가시키기 위해서 본 발명의 조성물을 바이알이나 앰플에 주입한 후에 동결건조할 수도 있다.

본 발명의 단삼 뿌리 추출물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 화학식 1의 디메틸 리소스퍼메이트 B의 통상적인 1일 투여량은 0.01 내지 1 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 단삼의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B는 나트륨 채널 촉진제로서 강심제 효과 또는 부르가다 증후군의 예방 및 치료를 통한 건강증진의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 건강식품의 경우 전체 식품 중량의 0.1 내지 50 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 1 중량％로 가할 수 있으며, 건강음료의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.1 내지 50 g, 바람직하게는 0.1 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 또한, 디메틸 리소스퍼메이트 B는 일반적으로 건강식품의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량％로 가할 수 있으며, 건강음료의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.01 내지 5 g, 바람직하게는 0.01 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강음료 조성물은 필수성분으로서 상기 단삼의 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 [예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]), 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 음료에는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 함유될 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 심실근 세포의 분리

성별에 관계없이 6∼7주령의 스프라그-다우리 (Spraque-Dawley) 랫트로부터 심실근 세포를 분리하였다. 랫트를 팬토바비톤 나트륨 (200 ㎎/㎏)으로 마취시킨 후 심장을 적출하여 랑겐도르프 (Langendorff) 관류 기구에 건 후, 37℃로 5분간 변형된 타이로드 (Tyrode) 용액 (143 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨, 5 mM HEPES, 0.5 mM 염화마그네슘, 0.5 mM 인산나트륨, 1.8 mM 염화칼슘 및 10 mM 포도당, 수산화나트륨을 이용해 pH 7.4로 적정)을 흘려주었다. 그 후 칼슘 미포함 타이로드 용액을 5분간 흘려준 다음, 콜라게나아제 (Collagenase, 0.5 ㎎/㎖, TypeII, Worthington사)를 용해시킨 타이로드 (칼슘 미포함) 용액을 다시 30분간 흘려주었다. 마지막으로, 5분간 고 칼륨 저 염소 KB 용액 (70 mM 글루타민산칼륨, 55 mM 염화칼륨, 10 mM HEPES, 3 mM 염화마그네슘, 20 mM 타우린, 20 mM 인산칼륨 및 0.5 mM 칼륨-EGTA, 수산화칼륨을 이용해 pH 7.3으로 적정)을 흘려주었다. 이와 같이 처리된 심장의 좌심실 부분을 절단하여 동일한 KB 용액속에서 포셉으로 살살 흔들어 준 후 분리된 심실근 세포들을 사용 전까지 5℃ KB 용액에 보관하였다.

<실험예 2> 전기생화학적 기록

패치 피펫 (실험용액을 채웠을 때 1∼2 MΩ)은 경질유리 미세관 (Harvard Apparatus Ltd.사)으로 뽑아내었다. 단일 심실근 세포에서 막전류나 막전압을 기록하기 위하여 통상적인 전-세포 막 고정법 (whole-cell patch clamp technique)을 사용하였다. 막전류 측정을 위한 고정법에서는 짧은 상-역치 전류 자극으로 활동전압을 유발시켰다. 막전압 측정을 위한 고정법에서는 실험 기간동안 접근저항 (access resistance)을 관찰하여 접근저항이 6 MΩ 이하일 때의 자료만 유효 처리하였다. 막전압 고정 증폭기 (Biologic RK 300)에서 나온 여파된 신호 (10 KHz)를 아날로그/디지털 변환기 (AD/DA converter, PCI-MIO-16E-4, National Instrument사)로 보내어 20 KHz로 디지털화 하였으며, 이후의 분석을 위해 PC에 저장하였다. 관류용액의 유속은 0.5∼1 ㎖/분이었고 모든 전기생리학적 실험은 상온 (20∼25℃)에서 수행하였다.

<실시예 1> 단삼 뿌리 추출물로부터 디메틸 리소스퍼메이트 B (dmLSB)의 분리 및 정제

건조시킨 단삼 뿌리 6 ㎏을 60 ℓ의 100％ 메탄올에 담가 7일간 상온에 방치한 후 이를 여과하여 얻은 추출액을 1 내지 2 psi 하에서 농축시켜 어두운 빛깔의 끈적한 메탄올 추출물 470 g을 제조하였다. 이것을 증류수 2.5 ℓ에 현탁한 후 n-헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용해 순차적으로 추출하여 각각을 분획하였다. 이때, 현탁액과 유기용매의 부피비는 각각 1:2였다. 이로부터 N-헥산 분획 69 g, 에틸아세테이트 분획 52 g, 부탄올 분획 69 g 및 수용성 잔사를 얻었고, 이들 중 에틸아세테이트 분획에서 랫트 심실근 세포의 활동전압기간을 연장시키는 효과가 나타남을 확인하였다 (도 1a). 또한, 각 분획별로 나트륨 전류의 비활성화를 지연시키는 효과를 확인한 결과, 에틸아세테이트 분획에서 그 효과가 가장 현저함을 확인하였다 (도 1b). 상기에서 활동전압기간 연장효과와 나트륨 전류의 비활성화 지연효과가 확인된 에틸아세테이트 분획 26 g을 이용하여 옥타데실 실리카겔 (octadecyl silica gel) 컬럼 (Φ6.0×60 ㎝) 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼을 단계적인 층 분리법을 이용해 300 ㎖의 수용성 메탄올 (0∼100％)로 용출하여 네 개의 분획을 분리하였다; Fr. 1 (3.2 g), Fr. 2 (13.0 g), Fr. 3 (2.4 g), Fr. 4 (7.0 g). 이들 분획 중 Fr. 2에서 나트륨 전류의 비활성화 지연효과가 가장 뛰어남을 확인하였고, Fr. 2를 CH₂Cl₂에 용해시킨 20％ 메탄올을 사용한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 걸어 추가적으로 정제하여 110 ㎎의 dmLSB와 2.4 g의 LSB를 최종적으로 분리하였다. dmLSB와 LSB에서 각각 나트륨 전류의 비활성화 지연효과를 관찰한 결과, dmLSB는 뚜렷한 효과를 보인 반변, LSB는 효과가 미미하여 dmLSB가 주요 활성을 나타내는 성분임을 확인하였다 (도 2). 분리된 LSB는 100％ 메탄올에서 p-톨루엔설폰산을 촉매로 사용하여 메틸화시켜 dmLSB로 전환시켰다.

상기와 같이 단삼의 뿌리 추출물에서 분리·정제된 dmLSB의 화학구조를 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR로 하기와 같이 분석하여 기존에 보고된 결과와 동일함을 확인한 후 (Tanaka T, et al., Chem. Pharm. Bull. 37, 340-344, 1989), 50％ 에탄올에 10 mM 농도로 용해시켜 저장용액을 만들어 -20℃에 보관하였다. 시간의 경과에 따라 dmLSB의 효과가 감소하므로, 저장용액은 만든 후 48시간 이내에 사용하였다.

¹H-NMR (300 MHz, 아세톤-d₆)

δ: 7.58 (1H,d,J=15.9Hz,H-7), 7.17 (1H,d,J=8.5Hz,H-6), 6.79 (1H,d,J=8.5Hz,H-5), 6.18-6.69 (9H,m), 6.21 (1H,d,J=15.9Hz,H-8), 5.70 (1H,d,J=4.2Hz,H-7''), 5.06(2H,m,H-8',8'''), 4.37(1H,d,J=4. 2Hz,H-8''), 3.50 (6H,d,J=3Hz,-OCH₃)

¹³C-NMR (125MHz, 아세톤-d₆)

δ:170.3,170.0,169.3,165.8,147.6,145.3,145.1,,144.8,144.7,143.9,143.7,142.4,132.2,127.6,127.3,125.1,123.4,120.7(*2),117.4,117.1,116.3,116.2,115.3,115.2,115.1,115.0,112.3, 86.5,74.2,73.2(*2),55.7,51.6,51.4,36.6,36.2(*2)

<실시예 2> dmLSB가 랫트 심실근 세포의 활동전압에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 단삼의 뿌리 추출물로부터 분리·정제된 dmLSB가 랫트의 심실근 세포에서 전기적 활동에 미치는 영향을 조사하기 위해, 실험예 1과 같이 준비된 랫트 심실근 세포에 dmLSB를 처리하였을 때 활동전압의 변화를 관찰하였다.

먼저, 랫트 심실근 세포에 70-90 pA의 탈분극 전류자극 (5 ms 지속)을 매 500 ms마다 주어 활동전압 (AP)을 유발시켰으며, 실험예 2와 같은 방법에 따라 전-세포 막 고정법에 의한 막전류를 측정하였다. 활동전압기간에 대한 dmLSB의 영향은 90％ 재분극이 될 때까지 걸린 활동전압기간을 나타내는 APD₉₀으로 정량화하였다. 매 12초마다 선별된 5개의 연속적인 AP를 평균하여 얻은 APD₉₀에 있어서의 변화에 대한 시간-프로파일을 전-세포 기록 시간의 함수로서 도 3a에 나타내었다. dmLSB를 4, 10 또는 20 μM의 다양한 농도로 처리한 후 대조군과 dmLSB 처리군에서의 대표적인 활동전압들을 기록한 것이 도 3b이다.

도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, dmLSB는 초반의 빠른 재분극 시기를 저해하여 고원기 (plateau)를 연장시켰다. 피레스로이드 (Spencer CI, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 298, 1067-1082, 2001)와 같은 지용성 나트륨 채널 촉진제와는 달리, 고원기에서의 이차 상승 막전압 편향 (조기 후-탈분극, EAD)은 관찰되지 않았다. dmLSB를 처리하는 동안 휴지 막전압 (resting membrane potential, RMP)이나 활동전압의 과도 전압 (overshoot potential)에는 변화가 없었다 (도 3a에서, RMP은 ---으로, 과도 전압은 ……으로 나타내었다). 휴지 막전압과 과도 전압의 평균값은 각각 -68.46±2.6 mV (n=7)와 53.53±8.8 mV (n=7)이었다.

APD₉₀과 dmLSB 농도와의 관계를 조사하기 위하여, 여러 농도의 dmLSB에서 측정한 평형상태의 APD₉₀을 7개 세포로부터 수집하여 도 3c에 나타내었다. dmLSB에 의한 활동전압기간의 증가는 20 μM에서 최대였다. 20 μM 이상에서는 활동전압기간이 더 이상 증가하지 않았고, 오히려 조금 감소하였다. 100 μM까지 dmLSB의 농도를 높여도 EAD는 유발되지 않았다. 대조군과 20 μM dmLSB 처리군에서의 APD₉₀ 평균값은 각각 58.8±12.1 ms와 202.3±9.5 ms로서, 이는 dmLSB가 활동전압기간을 현저히 증가시킴을 나타내는 것이다 (단측 t-검정; n=7, p<0.05).

<실시예 3> dmLSB가 심실근 세포의 이온 전류에 미치는 영향

dmLSB에 의해 활동전압기간의 변화가 일어나는 기작을 조사하기 위해, 실험예 2의 전-세포 막전압 고정법을 사용하여 랫트의 심실근 세포의 이온 전류에 대한 dmLSB의 효과를 연구하였다. 막전류는 K⁺-풍부 (140 mM) 피펫용액을 사용하는 패치 피펫을 이용하여 전-세포 막전압 고정법으로 기록하였다. 상기 K⁺-풍부 피펫용액은 90 mM 아스파르트산칼륨, 30 mM 염화칼륨, 2 mM 염화마그네슘, 5 mM 마그네슘-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM 칼륨-EGTA, 5 mM 디트리스-크레아틴인산 및 2.5 mM Na₂-크레아틴인산을 포함한다.

도 4a는 대조군과 10 μM dmLSB 처리군에서 단계적 전압 (-120 mV∼+80 mV)을 주었을 때 -80 mV의 고정전압 (Vh)에서 일련의 1초간 탈분극 자극에 대한 전류 반응을 측정한 것이고, 도 4b는 20 ms (왼쪽)와 950 ms (오른쪽)의 단계 자극에서 전류 크기의 막전압-의존성을 나타낸 것이다. 저분극 자극 (hyperpolarization pulse)은 큰 내향 전류를 유발하였는데, 이는 전형적인 내향 정류 칼륨 전류 (inward rectifier K⁺ current)를 나타내는 것이다. 탈분극 자극은 복잡한 전류반응을 유발하였는데, 각각은 빠른 내향 Na⁺ 전류 (I_Na), L-형 Ca²⁺ 전류 (I_Ca,L), 그리고 일시적/지연성 외향 K+ 전류로 이루어진 것으로 추정된다. 직각 (square) 자극을 준 후 950 ms 시점에서 측정된 전류의 평형-상태의 진폭 (I₉₅₀ ms)은 10 μM dmLSB 처리군에서 별다른 변화가 없었는데, 이는 내향 정류 칼륨 전류나 지연성 정류 칼륨 전류 모두가 dmLSB에 의해 영향을 받지 않음을 나타내는 것이다 (도 4b, 오른쪽). 그러나, dmLSB 처리군에서 20 ms에서 측정된 초기 진폭 (I₂₀ ms)은 대조군과 차이를 보였으며, 전류-전압 관계 (I-V relationship)는 dmLSB에 의해 내향 쪽으로 편향되었다. 이러한 편향은 -20 mV에서 +20 mV 범위의 전압 사이에서 두드러져서, dmLSB 처리군에서 전류-전압 관계가 종모양을 형성하게 하였다 (도 4b, 왼쪽). dmLSB 처리군에서 전류-전압 관계의 편향은 dmLSB가 일시적 외향 전류를 감소시키거나 급속 내향 전류를 증가시킴을 나타내는 것이다. 그러나, 이러한 종모양의 전류-전압 관계는 칼슘 또는 나트륨 채널과 같은 내향 전류가 개입되었음을 보다 더욱 암시하는 것이다.

<실시예 4> dmLSB가 급속 내향성 나트륨 전류에 미치는 영향

dmLSB가 내향 전류에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 10 mM EGTA를 포함하는 Cs⁺-풍부 피펫용액을 이용하였다. Cs⁺-풍부 피펫용액은 90 mM 세슘-아스파르트산, 20 mM 염화세슘, 2 mM 염화마그네슘, 5 mM 마그네슘-ATP, 10 mM HEPES, 2.5 mM Na₂-크레아틴인산, 10 mM 테트라에틸염화암모늄 (TEA-Cl) 및 5 mM 세슘-EGTA를 포함하며 수산화세슘을 이용해 pH를 7.3으로 맞추었다. 상기와 같은 조성의 Cs⁺-풍부 피펫용액을 표준 타이로드 (NT) 용액과 병합하여 사용하였으며, -80 mV에서 막전압을 고정하면 칼륨 전류로 인해 내향 전류가 발생하는데, 이를 방지하기 위해 NT 용액에 들어 있는 염화칼륨을 동일한 농도의 염화세슘으로 치환하였다. L-형 칼슘 전류 (I_Ca,L)와 나트륨 전류 (I_Na)를 구분하기 위해, 이-단계 탈분극 자극법 (two-step pulse protocol)을 사용하였다.

-80 mV의 고정전압에서, 심실근 세포를 -35 mV로 50 ms동안 탈분극시켜 I_Na를 비활성화시킨 후, 다양한 탈분극 자극을 주어 I_Ca,L을 기록하였다. 대조군에서 겹쳐진 전류기록을 보면, 시험자극에서 I_Ca,L의 보다 느린 활성화와 비활성화에 이어 -35 mV에서 I_Na의 빠른 활성화와 비활성화가 관찰되었다 (도 5a 및 5b). I_Na의 최대 진폭이 dmLSB에 의해 변화가 없다 하더라고 비활성화 단계가 현저하게 연장됨이 관찰되었다. 반면, I_Ca,L는 dmLSB (10 μM) 처리에 의해 거의 영향을 받지 않았다.

또한, I_Ca,L에 대한 dmLSB의 영향을 100 μM의 테트로도톡신 (tetrodotoxin, TTX)으로 I_Na를 억제시킨 상태에서 조사하였다. 탈분극 시험자극 (-60 mV∼+50 mV)을 -65 mV의 고정전압에서 200 ms동안 주어 I_Ca,L을 활성화시켰다. 도 5c는 TTX 존재하에서 dmLSB (10 μM) 처리 전 (왼쪽)과 후 (오른쪽)의 대표적인 전류 기록을 나타낸 것으로, 이로부터 I_Ca,L의 최대 진폭의 전류-전압 곡선을 얻었다. 대조군과 dmLSB 처리군간의 전류-전압 곡선에는 별다른 차이가 없었다 (도 5d). 이러한 결과는 dmLSB가 I_Ca,L에는 거의 영향을 미치지 않지만, TTX-민감성 나트륨 전류에는 선택적으로 작용하여 영향을 준다는 것을 강하게 암시하는 것이다.

<실시예 5> dmLSB가 저농도 나트륨 조건의 나트륨 전류에 미치는 영향

막전압 회피 문제를 방지하고, 나트륨 전류에 대한 dmLSB의 효과를 정량적으로 분석하기 위해, I_Na를 저농도 세포 밖 [Na⁺] (10 mM) 조건에서 기록하였다. 전-세포 막전압 고정법으로 기록하는 동안 평형-상태 비활성화가 자발적으로 일어난 경우에도 비활성화가 충분히 회복되는 전압으로부터 I_Na를 활성화시키기 위하여, 500 ms동안 전자극을 -120 mV까지 준 후 탈분극 시험자극을 주었다. I_Ca,L의 오염을 제거하고 순수한 I_Na만을 분리하기 위해, 동일한 시험자극을 주되 -40 mV의 고정전압 (Vh)에서 얻은 전류 반응은 I_Ca,L이라고 간주하여 -120 mV의 고정전압에서 얻은 전류 반응으로부터 제하였다.

도 6a는 -120 mV의 고정전압에서 10 mV 간격의 단계 시험자극 (-80 mV∼+10 mV)을 주었을 때, 대조군 (왼쪽)과 10 μM dmLSB 처리군 (오른쪽)에서 기록된 나트륨 전류를 나타낸 것이다. 비교를 위해, dmLSB 처리 전/후에 기록된 한 쌍의 I_Na를 다양한 시험전압 (V_T)에서 겹쳐서 도 6b에 나타내었다.

도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이, I_Na에 대한 dmLSB의 가장 두드러진 효과는 비활성화 동역학을 지연시키는 것으로, 이는 -20 mV에서 얻은 겹쳐진 전류기록에서 잘 나타나 있다 (도 6b, 오른쪽). 빠른 비활성화의 초반 단계는 dmLSB에 의해 영향을 받지 않았지만, 후반 단계는 dmLSB에 의해 선택적으로 느려졌다. 비활성화가 느리게 진행되었다 하더라도, 지속성 내향 전류를 유발하지 않으면서 50 ms이내에 완료되었는데 (삽입도; 동일한 기록을 확대한 것), 이러한 결과는 dmLSB가 지속성 나트륨 전류를 증가시키지는 않지만, 빠른 나트륨 전류의 비활성화 과정을 지연시킴을 나타내는 것이다.

도 6c는 I_Na의 최대 진폭의 전압 의존성을 전류-전압 관계로 더욱 분석하기 위하여 dmLSB 처리 전 (○)과 후 (●)에 I_Na 최대 측정치를 나타낸 전류-전압 관계도를 나타낸 것이다. I_Na의 진폭은 dmLSB에 의해 약간 감소하였고, 역류 전압 (reverse potential, E_rev)은 나트륨의 평형 전압 예상치 (+20 mV)에 근접하였다. I_Na의 최대 진폭은 -20 mV 이하 저분극 범위에서 dmLSB에 의해 약간 줄어든 반면, 나트륨 채널이 충분히 활성화된 탈분극 범위에서는 비슷하였다. 따라서, 전류 진폭을 기전력 (electromotive force, V-E_rev)으로 나눈 활성화 곡선은 dmLSB 처리군에서 -5 mV 오른쪽으로 이동하였다 (도 6c, 오른쪽). 최대 활성화 절반치 (half-maximal activation)의 평균값은 dmLSB 처리군에서 -37.28±0.8 (n=4)이었는데, 이는 대조군에 비해 (42.35±1.1; 단측 t-검정, p<0.05, n=4) 현저하게 탈분극되었음을 나타내는 것이다.

비활성화 동역학에 대한 dmLSB의 영향을 좀더 알아보기 위해, I_Na의 쇠퇴기 (decay phase)를 지수 함수로 보정하였다 (fitting). 시험 전압이 -60, -50, -40 mV일 때 대조군에서는 단일 지수함수로도 I_Na의 쇠퇴기를 보정하기에 충분하였다 (도 6b의 점선). 그러나, dmLSB 처리군에서는 쇠퇴기가 단일-지수함수로부터 상당히 벗어나서 느린 요소 (slow component)가 관찰되었다. 그 차이는 V_T가 탈분극 될수록 더욱 뚜렷해졌다. 쇠퇴기를 이중-지수함수로 보정하면 느린 요소의 진폭 (A_S)이 -20 mV에서 최대 I_Na의 22.1±1.02％ (n=4)로 측정되었고, 이는 V_T가 탈분극 될수록 증가하였다 (도 6e). 반면, dmLSB 처리군에서 빠른 요소의 시간상수 (τ_f)는 대조군의 단일-지수 시간상수와 비슷하였다 (도 6d). 이러한 결과들은 dmLSB가 I_Na의 정상적인 빠른 비활성화를 희생시켜 비활성화의 느린 요소를 유발시킴을 타나내는 것이다.

<실시예 6> dmLSB가 나트륨 전류의 평형-상태 비활성화에 미치는 영향

dmLSB가 I_Na의 평형-상태 비활성화에 미치는 영향을 도 7c에 나타낸 바와 같은 자극 계획안을 이용해 조사하였다. 먼저, 다양한 전압 (-120∼-30 mV, 15 mV 간격)을 500 ms동안 전-전압을 준 후, 50 ms 동안 시험전압 -20 mV를 주었다. 시험전압 (-20 mV)에서의 전류 반응을 겹쳐서 도 7a에 나타내었다. dmLSB 처리군에서 I_Na의 느린 비활성화는 dmLSB가 약리학적 효과를 발휘하였음을 나타내는 것이다 (도 7a, 오른쪽). 도 7b는 I_Na의 최대 진폭을 전-자극 전압에 대하여 플롯팅한 것으로, 1-(1/(1+exp((V_1/2-V_m)/k)))에 따라 작성하였다. V_1/2과 k는 대조군에서 각각 -63.9와 8.20이고, dmLSB 처리군에서는 -64.3과 8.89였다. 평형-상태 비활성화에는 dmLSB 처리 전/후에 별다른 차이를 나타내지 않았는데, 이러한 결과는 dmLSB가 I_Na의 평형-상태 비활성화에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 것이다. 반 비활성화 전압 (voltage for half inactivation)은 대조군에서 -64.3±4.3 mV, dmLSB 처리군에서 -64.5±4.45 mV (n=5)였다.

<실시예 7> 투여량-반응 (dose-response) 관계

I_Na에 대한 dmLSB의 효과는 대조군과 dmLSB 처리군에서 -20 mV로 탈분극시켜 생긴 I_Na의 차이로 나타낼 수 있다. dmLSB는 I_Na에서 비활성화의 느린 단계에 선택적으로 영향을 미치기 때문에, 이러한 전류의 차이는 dmLSB에 의해 유도된 느린 비활성화 I_Na (I_slow)를 나타낸다. 도 8a는 다양한 dmLSB 농도에서의 I_slow 진폭에 있어서의 시간에 따른 변화를 나타낸 것이다. -120 mV와 -40 mV의 전자극으로부터 -20 mV로 이중-단계 자극을 매 10초마다 반복하여 I_Na를 측정하였다. dmLSB에 의해 유도된 I_slow는 대조군의 I_Na를 dmLSB 처리시 I_Na로부터 제함으로써 계산하였다. dmLSB-유도 I_slow는 약 2.8 ms에서 최대 진폭을 나타내었고, 그 이후에 서서히 쇠퇴하였다.

각 농도별 약물의 최대 효과는 투여 후 약 150초 후에 나타났다. 고농도일수록 약효가 유실되는데 보다 긴 시간이 소요되었지만, dmLSB의 효과는 가역적이었다. 비슷한 실험을 반복한 결과, 투여량-반응 관계를 얻었다. I_Na에 대한 dmLSB의 효과를 정량하기 위해, 최대 I_Na에 대한 I_slow의 상대적인 진폭을 Hill 방정식을 이용하여 dmLSB 농도에 대해 플롯팅하였다 (도 8b). 그 결과, 절반 최대 유효농도 (half-maximum effective concentration, ED₅₀)는 21.1 μM, Hill 계수는 1.02였다.

<실시예 8> dmLSB의 세포내 투여가 나트륨 전류 비활성화에 미치는 영향

dmLSB는 지용성이기 때문에, 세포막을 침투해 들어가서 세포내 수용체 또는 나트륨 채널 단백질 자체에 결합할 가능성이 있다. dmLSB가 세포막 표면 수용체 부위, 세포내 부위 또는 양쪽 모두를 거쳐서 그 효과를 나타내는지 여부가 명확하지 않으므로, 이러한 가능성을 조사하기 위해 심실근 세포에 20 μM dmLSB를 포함하는 패치 피펫용액을 세포내 관류시킨 후 상기 패치 피펫용액이 확산되어 유입되는 동안 I_Na를 관찰하였다. 이때, 관류시키는 동안 직렬저항 (R_s)은 7 MΩ 이하로 유지시켰다. 전-세포 고정이 이루어지자 마자, -20 mV의 시험전압에서 I_Na가 기록되었고, 이를 그 이후의 I_Na 기록에서 제하였다. 제외된 전류의 진폭을 전-세포 기록 시간 (WCR time)의 함수로서 플롯팅하였다 (도 9a). 세포내 dmLSB는 I_Na에 아무런 영향을 나타내지 않았는데 (n=4), 이는 dmLSB의 결합 부위가 심실근 세포의 표면에 존재함을 나타내는 것이다. dmLSB가 세포밖에서 투여될 때까지, I_Na의 비활성화 동역학에는 변화가 없었다 (도 9b). 전-세포 고정 후 약 13분이 경과하였을 때 5 μM의 dmLSB를 동일한 세포에 적용한 결과, dmLSB 효과를 나타내는 I_slow가 관찰되었다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

다음의 성분들을 혼합하여 경질 젤라틴 캅셀에 충진함으로써 캅셀제를 제조하였다:

양 (㎎/캅셀)

활성성분 20

(단삼 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B)

건조 전분 160

마그네슘 스테아레이트 20

총 200 ㎎

<제제예 2> 단삼 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B를 포함하는 식품의 제조

실시예 1에서 제조한 본 발명의 단삼 뿌리 추출물 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B를 포함하는 식품들을 하기와 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

밀가루에 0.5 중량％의 단삼 뿌리 추출물 또는 0.05 중량％의 디메틸 리소스퍼메이트 B를 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 국수 등을 제조하여 건강 증진용 식품을 수득하였다.

<2-2> 유제품 (dairy products)의 제조

우유에 1 중량％의 단삼 뿌리 추출물 또는 0.1 중량％의 디메틸 리소스퍼메이트 B를 첨가하고 이 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다. 그러나, 단삼 뿌리 추출물을 치즈 제조시에는 응고된 우유 단백질에, 요구르트 제조시에는 발효 후에 수득된 응고된 우유 단백질에 첨가하였다.

<2-3> 쥬스의 제조

단삼 뿌리 추출물 1 내지 5 g 또는 디메틸 리소스퍼메이트 B 0.1 내지 0.5 g을 토마토 또는 사과 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 쥬스를 수득하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 이를 포함하는 단삼의 뿌리 추출물은 나트륨 채널에 선택적으로 작용하여 나트륨 전류의 비활성화를 지연시키고 활동전압기간을 연장시키는 반면, 조기-후 탈분극을 유발하지 않아 부정맥을 야기하지 않는 신규한 나트륨 채널 촉진제로서, 강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 증후군의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 각각 단삼 추출물의 유기용매 분획들이 마우스 심실근 세포의 활동전압 (1a)과 나트륨 전류의 비활성화 (1b)에 미치는 영향을 조사한 결과이다.

도 2는 디메틸 리소스퍼메이트 B (dimethyl lithospermate B, dmLSB)와 리소스퍼메이트 B (LSB)가 나트륨 전류의 비활성화에 미치는 영향을 조사한 결과이다.

도 3a 내지 3c는 디메틸 리소스퍼메이트 B (dimethyl lithospermate B, dmLSB)가 마우스 심실근 세포의 활동전압에 미치는 영향을 조사한 결과로, 3a는 활동전압기간에 대한 dmLSB의 영향을 나타낸 것이고, 3b는 dmLSB의 농도 변화에 따른 활동전압의 변화를 나타낸 것이고, 3c는 다양한 농도의 dmLSB에서 측정한 평형상태의 ADP₉₀을 나타낸 것이다.

a: 대조군, b: 4 μM dmLSB,

c: 10 μM dmLSB, d: 20 μM, dmLSB,

e: dmLSB 유실, △: 각 활동전압을 기록한 시간

도 4a 및 4b는 dmLSB가 마우스 심실근 세포의 이온 전류에 미치는 영향을 조사한 결과로, 4a는 고정전압 -80 mV에서 단계적으로 전압자극 (-120 mV∼+80 mV)을 주었을 때 대조군과 10 μM dmLSB 처리군에서의 전류반응을 나타낸 것이고, 4b는 단계 자극이 20 ms (왼쪽)와 950 ms (오른쪽)일 때 대조군과 dmLSB 처리군에서의 전류 크기의 막전압-의존성을 나타낸 것이다.

도 5a 내지 5d는 dmLSB가 급속 내향 전류에 미치는 영향을 조사한 결과로, 5a는 각각 10 μM dmLSB를 투여하기 전과 후에 이단계 탈분극 자극에 대한 전류반응을 나타낸 것이고, 5b는 두 번째 단계 탈분극 자극에 의해 유발된 전류의 최대 진폭의 전압-의존성을 나타낸 것이고, 5c는 100 μM 테트로도톡신 (tetrodotoxin, TTX) 존재 하에서 각각 10 μM dmLSB를 투여하기 전과 후에 고정전압 탈분극 자극에 대한 전류반응을 나타낸 것이고, 5d는 dmLSB 투여 전 (○)과 후 (●)의 전류-전압 관계를 겹쳐서 표시한 것이다.

도 6a 내지 6e는 dmLSB가 저농도 나트륨 조건에서 나트륨 전류 (I_Na)에 미치는 영향을 조사한 것으로, 6a는 고정전압 -120 mV로부터 10 mV 간격의 단계적 시험자극 (-80 mV∼+10 mV)을 주었을 때 대조군과 10 μM dmLSB 처리군에서 기록된 전-세포 (whole-cell) 나트륨 전류를 나타낸 것이고, 6b는 동일한 시험전압에서 대조군과 dmLSB 처리군의 나트륨 전류를 겹쳐서 그린 것이고, 6c는 대조군과 dmLSB 처리군에서 나트륨 전류의 정점 측정치를 나타낸 전류-전압 관계도를 나타낸 것이고, 6d는 비활성화 단계를 단일 또는 이중-지수함수로 맞추었을 때 측정한 시간 상수를 나타낸 것이고, 6e는 dmLSB가 유발한 느린 요소의 상대적인 크기를 시험 전압과의 관계로 나타낸 것이다.

도 7a 및 7b는 dmLSB가 나트륨 전류의 평형-상태 비활성화에 미치는 영향을 조사한 결과로, 7a는 대조군과 10 μM dmLSB 처리군에서 다양한 전-자극 전압을 200 ms동안 준 후 -20 mV로 단계 자극하였을 때 생긴 나트륨 전류를 나타낸 것이고, 7b는 dmLSB 투여 전 (○)과 후 (●)에 나트륨 채널의 유용성 (availability)과 전-자극 전압과의 관계를 나타낸 것이다.

도 8a 내지 8c는 dmLSB의 투여량-반응 관계를 조사한 결과로, 8a는 다양한 dmLSB 농도에서 시간에 따른 느리게 비활성화하는 I_Na (I_slow)의 변화를 나타낸 것이고, 8b는 각각 대조군과 dmLSB 투여군에서 I_Na (회색)와 I_slow (검정색)를 겹쳐 나타낸 것이고, 8c는 dmLSB가 유발한 느린 요소의 정점 나트륨 전류에 대한 상대적인 크기를 dmLSB 농도와의 관계로 나타낸 것이다.

도 9a 및 9b는 세포내 투여시 dmLSB가 나트륨 전류의 비활성화에 미치는 영향을 조사한 결과로, 9a는 전-세포에 -80 mV의 고정전압에서 시험자극 -20 mV을 주어 나트륨 전류를 유발시킨 후 5 μM dmLSB를 투여하여 발생한 I_slow(I_Na,_dmLSB - I_Na,_control)의 최대 진폭을 시간에 따라 나타낸 것이고, 9b는 동일한 세포에서 dmLSB 투여 전, 투여 후 및 유실된 후에 기록한 전류를 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 디메틸 리소스퍼메이트 B를 포함하고, 나트륨 채널 촉진 효과를 나타내는 단삼의 뿌리 추출물:

<화학식 1>
제 1항에 있어서,

단삼의 뿌리 추출물이

1) 건조시킨 단삼 뿌리를 저급알콜로 추출한 후 여과 및 농축하여 저급알콜 추출물을 얻는 단계; 및

2) 상기 저급알콜 추출물을 증류수에 현탁한 후 유기용매로 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 추출물.
제 2항에 있어서,

단계 1)에서 건조된 단삼 뿌리 1 ㎏에 약 5 내지 10 ℓ의 저급알콜을 가하고 상온에서 약 약 7 내지 10일 동안 침출시켜 추출하는 것을 특징으로 하는 추출물.
제 2항에 있어서,

저급알콜이 메탄올 또는 메탄올 수용액, 에탄올 또는 에탄올 수용액, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물.
제 2항에 있어서,

단계 2)에서 저급알콜 추출물을 증류수에 현탁한 후, 상기 현탁액에 1.5 내지 3배 부피의 유기용매를 가하여 분획하는 것을 특징으로 하는 추출물.
제 5항에 있어서,

유기용매가 에틸아세테이트 (EtOAc), 에테르 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물.
제 1항의 단삼의 뿌리 추출물 또는 하기 화학식 1의 디메틸 리소스퍼메이트 B 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 나트륨 채널 촉진용 조성물:

<화학식 1>
제 7항에 있어서,

상기 디메틸 리소스퍼메이트 B가 단삼의 뿌리 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 분리·정제되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서,

상기 디메틸 리소스퍼메이트 B가 리소스퍼메이트 B를 촉매를 이용하여 메틸화시켜 디메틸 리소스퍼메이트 B로 전환시키는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9항에 있어서,

상기 촉매가 p-톨루엔설폰산, 염산 및 황산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서,

강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방 및 치료제로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항의 단삼의 뿌리 추출물 또는 하기 화학식 1의 디메틸 리소스퍼메이트 B를 유효성분으로 포함하는, 강심제, 항부정맥제 또는 부르가다 (Brugada) 증후군의 예방효과를 나타내는 건강 증진용 식품:

<화학식 1>
제 12항에 있어서,

단삼 뿌리의 유기용매 추출물을 전체 식품 중량의 0.1 내지 50 중량％로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강 증진용 식품.
제 12항에 있어서,

디메틸 리소스퍼메이트 B를 전체 식품 중량의 0.01 내지 5 중량％로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강 증진용 식품.
제 12항에 있어서,

음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강 증진용 식품.