CN113423408A

CN113423408A - 包含适配体作为有效成分的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物

Info

Publication number: CN113423408A
Application number: CN201980073606.9A
Authority: CN
Inventors: 孙寅植
Original assignee: Nasmos
Current assignee: Nasmos; Nexmos Co Ltd
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-09-21
Also published as: JP2022513033A; US20220002729A1; KR20210060638A; EP3881849A1; EP3881849A4; JP7199534B2; WO2020101181A1

Abstract

本发明涉及用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其包含维生素C和与上述维生素C结合的适配体的复合物作为有效成分，本发明的组合物在帕金森病实验模型中表现出改善及治疗的效果，从而具有可用作包含其的用于具有神经退行性疾病的患者的药品及保健功能食品等的效果。

Description

包含适配体作为有效成分的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物

技术领域

本发明涉及包含与维生素C结合的适配体作为有效成分的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物。

背景技术

神经退行性疾病是与老化相关的疾病，其与特定神经细胞集团的逐渐丧失及蛋白质凝集相关联地定义，考虑到临床上表现的主要症状和被侵犯的脑部位，将其分为阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等。这些疾病的共同特征是难以根治并且病因不明，但神经细胞的功能障碍或凋亡可能引起的氧化应激影响病因。大脑对氧化应激尤为脆弱。大脑是为保持多种功能而需要很高的金属离子浓度的器官，由于其缺乏能够处理氧化应激的能力，并且几乎没有再生能力，因此凋亡的细胞无法恢复。

因此，对能够阻止因氧化应激导致的神经细胞凋亡引起神经退行性疾病的新型治疗剂的开发的必要性日益增加。

现有专利文献

韩国公开专利公报第10-2013-0139771号

发明内容

技术问题

本发明鉴于上述必要性而提出，本发明的目的在于，提供具有治疗及预防神经退行性疾病的效果的新型组合物。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其包含与维生素C结合的适配体作为有效成分。

在本发明的一实例中，优选地，上述组合物还包含维生素C，但不限于此。

在本发明的再一实例中，优选地，上述适配体由序列编号1表示的碱基序列形成，但能够通过对上述碱基序列进行一个以上的取代、缺失、移位及附加等来实现本发明效果的所有适配体序列也包括在本发明的范围内。

在本发明的另一实例中，优选地，上述维生素C与适配体的混合比的范围为10∶1至500∶1的重量比，更优选为20∶1至50∶1，但不限于此。

在本发明的一实例中，优选地，上述组合物具有神经细胞保护效果，但不限于此。

在本发明中，上述神经退行性疾病包括脑卒中、中风、痴呆、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿病(Huntington’sdisease)、多发性硬化症以及肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)等，神经退行性疾病是指由于在脑神经系统的信息传达中非常重要的脑神经细胞的凋亡、脑神经细胞与脑神经细胞之间传达信息的突触的形成或功能上的问题、脑神经的电活动性的异常症状或减少引起的疾病。

本发明的一实施例中，优选地，上述神经退行性疾病为帕金森病，但不限于此。

本发明的药学组合物的给药途径包括口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠管、局部、舌下或直肠，但不限于此。口服或非口服给药为优选。在本申请中使用的术语“非口服”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑液囊内、胸骨内、硬膜内、病灶内以及头盖骨内的注射或注入技术。本发明的药学组合物还能够以用于直肠给药的栓剂的形式给药。

本发明的药学组合物能够以任何口服可接受的剂型口服给药，包括胶囊、片剂及水性悬浮液及溶液，但不限于此。在口服用片剂的情况下，包含作为通常可接受的载体的乳糖及玉米淀粉。还可以添加硬脂酸镁之类的典型的润滑剂。在以胶囊型口服给药的情况下，可以包含乳糖或干燥的玉米淀粉作为有用的稀释剂。当以水性悬浮液口服给药时，活性成分可以与乳化剂及悬浮化剂配合。可以根据需要添加甜味剂和/或风味剂和/或着色剂。

本发明的药学组合物可根据诸多因素有多种变化，包括所使用的本发明化合物的活性、年龄、体重、通常的健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物配合及所要预防或治疗的疾病的严重程度。本发明的药学组合物能够以丸剂、糖衣片、胶囊、液剂、凝胶、糖浆、浆液、悬浮剂来剂型化。

在本发明中，上述药学组合物可以通过与选自由钙通道阻滞剂、抗氧化剂、谷氨酸拮抗剂、抗凝剂、抗高血压剂、抗血栓剂、抗组胺剂、消炎镇痛剂、抗癌剂及抗生素组成的组中的一种以上的药剂一同制剂化或联合使用。

并且，本发明涉及食品或食品添加剂，其包含具有预防及改善神经退行性疾病的效果的Aptamin C或其药学上可接受的盐作为有效成分。

本发明的功能食品能够以各种方式使用在用于炎症预防的药剂、食品及饮料等。本发明的功能食品包括例如各种食品类、糖果、巧克力、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、保健辅助食品类等，能够以粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料等形式使用。

作为有效成分包含于本发明的功能食品的Aptamin C具有突出的氧化应激抑制活性，对于本发明所书技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，在用于食品的情况下，会表现出突出的功效。

包含本发明的化合物的组合物可以根据通常的方法分别剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形式来使用，作为可以包含在其中的载体、赋形剂及稀释剂，可以例举出乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、硬脂酸镁及矿物油。当制剂化时使用通常使用的填充剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、等稀释剂或赋形剂来配制。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，上述固体制剂通过在上述化合物中混合至少一种赋形剂，即面粉、淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等中的至少一种来配制。并且，除简单的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁、滑石粉之类的润滑剂。用于口服的液体制剂有悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除广泛用作稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包括多种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非口服给药的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、油剂、冻结干燥剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮剂可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油、油酸乙酯之类的可注射酯类等。栓剂的材料可使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可豆脂、月桂酯、甘油明胶等。

本发明的化合物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形式、给药途径及期间而不同，但可以由本发明所属技术领域的普通技术人员进行适当的选择。但是，为了优选的效果，化合物以1天0.0001mg/kg至1g/kg的量给药，优选地，以1天0.001mg/kg至0.1g/kg的量给药。可以一天给药一次，也可以一天分为数次给药。上述给药量不在任何层面限制本发明的范围。

并且，本发明提供用于预防及改善神经退行性疾病的保健功能食品，其包含Aptamin C或其药学上可接受的盐作为有效成分。

包含本发明的化合物的保健功能食品能够以各种方式使用在用于预防及改善神经退行性疾病的药剂、食品及饮料等。能够添加本发明的化合物的食品形式包括糖果类的各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂或者保健辅助食品类食品等。

本发明的化合物能够以预防及改善神经退行性疾病为目的被添加到食品或饮料中。在此情况下，作为食品或饮料中的上述化合物的量，通过能够以食品总重量的0.01重量百分比至15重量百分比添加本发明的保健食品组合物，以100ml的饮料为基准，可以添加0.02g至10g，优选0.3g至1g的保健饮料组合物。

本发明的保健饮料组合物除了以指示的比例包含上述本发明的Aptamin C作为必要成分以外，对液体成分没有特别的限制，像普通饮料一样，还可以包含多种香味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。上述天然碳水化合物的例包括例如葡萄糖、果糖之类的单糖，例如麦芽糖、蔗糖之类的二糖，例如糊精、环糊精之类的常见的糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇之类的糖醇。作为上述之外的调味剂，还可以有利地使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊化合物(例如甜叶菊甙A、甘草酸等))以及合成香味剂(糖精、阿巴斯甜等)。上述天然碳水化合物的比例通常为每100ml的本发明的组合物包含约1g至20g，优选地，可以包含约5g至12g。

除上述以外，本发明组合物还可以包含多种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。

此外，本发明的组合物还可以包含用于制备天然果汁及果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。上述成分能够以单独或组合的方式使用。上述添加剂的比例不是很重要，但可以在每100重量份的本发明的组合物中的0重量份至20重量份的范围内选择。

相对于本发明的组合物的总重量，本发明的组合物能够以0.01％至99％的重量包含上述化合物。但本发明的组合物不限于此，可根据患者的状态、疾病的种类以及病程而改变。

包含本发明的化合物的组合物还可以包含制备药学组合物时通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。

发明的效果

通过本发明可知，本发明的包含维生素C和与上述维生素C结合的适配体的复合物作为有效成分的组合物表现出神经保护效果，因此可以有效地用作神经退行性疾病的预防或治疗剂。

附图说明

图1-图3为示意性地示出基于抗坏血酸的指数富集的配体系统进化技术(SELEX)的图，图1示出维生素C具有作为被还原形式的L-抗坏血酸(L-ASCORBIC ACID)和作为被氧化形式的L-去氢抗坏血酸(L-dehydroascorbic acid)(DHA)，图2示出L-抗坏血酸快速被氧化为L-去氢抗坏血酸，从而失去抗氧化能力，示出通过基于L-抗坏血酸的指数富集的配体系统进化技术发掘出作为防止L-抗坏血酸的氧化的适配体的AptaminC3T31，图3为示出抗坏血酸与AptaminC3T31结合的图，将抗坏血酸与AptaminC3T31结合的复合物称为NXP031。

图4-图5为示出抑制抗坏血酸氧化的基于荧光的微孔板法的图，图4为利用与L-去氢抗坏血酸结合来表现出荧光的邻苯二胺(OPDA)的实验结果，在使用过氧化氢处理抗坏血酸来使抗坏血酸氧化的条件下，放入AptaminC3T31来防止氧化。图5为在相同的条件下将AptaminC3T31+抗坏血酸与抗坏血酸放置8周后，利用二氯酚靛酚(DCPIP)对剩余的抗坏血酸的抗氧化能力进行比较的图。AptaminC3T31+抗坏血酸在8周后仍保持50％左右的抗氧化能力。

图6-图7为示出结合于抗坏血酸的本发明适配体的等温滴定量热(ITC，Isothermal Titration Calorimetry)特性的图，图6示出在抗坏血酸的各滴定中产生的热量的原始数据(raw data)，图7示出在对滴定剂(titrant)的稀释热量进行校正后，每次滴定的合并热量。本发明的适配体与抗坏血酸之间的结合亲和度为0.9μM。

图8-图14为示出NXP031对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)-诱导的PD小鼠模型的神经保护效果的图，在向成年C57BL/6小鼠腹腔内给药20mg/kg的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(4次，间隔2小时)之前，向腹腔内注射NXP031(4mg的AptaminC3T31/kg以及200mg的抗坏血酸/kg体重)或生理盐水。

图8为概述全部实验过程的图，通过向成年C57BL/6小鼠腹腔内给药20mg/kg的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(4次，间隔2小时)来诱导多巴胺神经细胞的破坏后，向腹腔内注射NXP031(4mg的AptaminC3T31/kg以及200mg的抗坏血酸/kg体重)来确认NXP031的神经保护效果，在第4天(Day4)进行行为学实验(爬杆试验(Pole test)、疲劳转棒实验(Rotarod test))，在第5天(Day5)将其安乐死(Sacrifice)后对中脑多巴胺神经细胞进行染色(Staining)并分析。

图9为示出各组之间的体重没有显著差异的图。

图10及图11为分别示出最后1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶给药3天后进行的爬杆试验及疲劳转棒实验的结果的图，通过爬杆试验的结果可知，比起分别单独使用维生素C(Vitamin C)、AptaminC3T31进行处理的实验组，使用NXP031进行处理的实验组的效果更为突出，与未使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶进行处理的空白组(Sham)相比，其恢复程度没有显著差异，统计学显著性以标记(^*P＜0.02vs空白组(sham)；^#P＜0.05vs对照组(Vehicle))来表示。通过疲劳转棒实验的结果可知，比起分别单独使用维生素C(VitaminC)、AptaminC3T31进行处理的实验组，使用NXP031进行处理的实验组的效果更为突出，统计学显著性以标记(^*P＜0.02vs空白组(sham)；^#P＜0.05vs对照组(Vehicle))来表示。

图12为使用通过抗酪氨酸羟化酶(anti-TH)抗体的免疫组织化学染色确认纹状体(striatum)及黑质(substantia nigra)的多巴胺神经元的结果，通过立体分析来计数TH-阳性的神经元的数量。数据以至少3次独立实验的平均数±平均数的抽样误差(S.E.M.)来表示，统计学上显著差异以标记(^*P＜0.02vs对照组(Control)；^#，§P＜0.05vsMPTP)来表示。

图13为纹状体光密度(Striatal optical density)的测定结果，只有NXP031组比vehicle组显著增加。

图14为在黑质(SN)中示出TH-阳性的多巴胺神经元的数量，在黑质中计数(count)总TH-阳性细胞(Total TH-positive cell)时，可知NXP031保护了1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶对TH阳性细胞(TH positive cell)的大部分破坏。

在本附图中，将与维生素C(抗坏血酸(Ascorbic acid))结合的适配体命名为Aptamin C，尤其以AptaminC3T31来表示在实施例中使用的Aptamin C，以NXP031命名本发明的AptaminC3T31和维生素C复合物。

具体实施方式

以下，通过非限制性的实施例更为详细地说明本发明。但下述实施例仅用于例示本发明，而不应解释为本发明的范围受下述实施例的限制。

实施例1：脱氧核糖核酸适配体(DNA aptamer)的选择及序列分析

抗坏血酸的指数富集的配体系统进化技术(Ascorbic acid SELEX)：

使用由～10¹⁵的独特寡核苷酸组成的脱氧核糖核酸文库(DNA library)(BasePairBiotechnologies公司)对抗坏血酸进行9轮的指数富集的配体系统进化技术。使用的缓冲液的组合如下：50mM的乙酸钠(Sodium Acetate)(pH 5.5)(Sigma公司)、1mM的氯化镁(MgCl₂)(Sigma公司)、0.05％的吐温20(Tween 20)(Sigma公司)、1％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司)以及1mM的谷胱甘肽(glutathione)(Sigma公司)。通过减少适配体与靶标的结合时间，变更缓冲液的组合，并在自由分子的溶出中通过减少靶标浓度来变更指数富集的配体系统进化技术的严格性。为了在富集的(enriched)的文库中去除与氧化形式的抗坏血酸结合的适配体，执行对L-去氢抗坏血酸的阴性选择(图2)。

对通过指数富集的配体系统进化技术方法产生的富集的文库进行生物信息分析来获得候选适配体，从前20名中筛选它们在氧化中保护AA的能力。序列编号1的适配体表现出最佳效果。

实施例2：对抗坏血酸氧化产物的荧光分析

通过变形Vislisel等(Vislisel，J.M.，Schafer，F.Q.and Buettner，G.R.(2007)Analytical biochemistry，365，31-39)中记载的抗坏血酸的氧化方法来检测氧化产物去氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid，DHA)(L-去氢抗坏血酸)并进行逆向测定。

概括如下：在添加25μM的过氧化氢(H₂O₂)(Sigma公司)之前，在4×的浓度下，使用AA培养基(10.3μM)在常温下培养适配体30分钟。在添加邻苯二胺染色剂(OPDA dye)(Sigma公司)之前，加入氧化剂样品后在常温下培养10分钟。使用连续光谱酶标仪

读取器在激发：345nm；发射：425nm的条件下从添加染料(954.6μM)样品之后到对照组收敛时为止以每隔60秒读取一次的方式读取45分钟。为了确认筛选的数据表现出AA保护，不受氧化产物(L-去氢抗坏血酸)或分析染料(邻苯二胺)的干涉，使用在AA的位置中培养并选择的适配体对L-去氢抗坏血酸(10.3μM)(Sigma公司)反复进行荧光分析。所有分析在如下条件下进行：50mM的乙酸钠(Sigma公司)、1％的牛血清白蛋白(Sigma公司)、0.05％的吐温20(Sigma公司)、1mM的氯化镁(Sigma)、pH校正为5.5。所有荧光粉细都在黑色的384孔培养板(greinerbio-one公司)进行。每个样品反复进行3次(图4)。

实施例3：适配体增加维生素C的储存性

将本发明Aptamin C在常温下保持8周后，使用二氯酚靛酚(DCPIP，2，6-二氯苯酚吲哚酚)测定抗坏血酸的还原力。从图5可知，本发明的Aptamin C抑制抗坏血酸的氧化并保持还原力，相比于抗坏血酸单独存在的对照组，增加4倍以上的储存寿命。

实施例4：对AA的适配体滴定

为了确定最佳适配体(A)的有效浓度，将其对AA(10.3μM)进行滴定。相对于AA的适配体的相对浓度分别为10×、5×、2×、1×、0.5×、0.25×以及0.1×。在添加10.3μM的硫酸铜(CuSO₄)之前，将所有适配体/AA混合物在常温下培养30分钟，在添加954.6μM的邻苯二胺之前再培养样品10分钟。在激发(ex)：345nm；发射(em)：425nm的条件下读取培养板45分钟，每60秒收集一次数据。每个样品反复进行3次。

从图7可知，本发明的适配体与抗坏血酸之间的结合亲和度为0.9μM。

实施例5：Aptamin C和维生素C复合物对MPP⁺-诱导的细胞毒性的效果

使用具有被记载的浓度的MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶鎓(1-methyl-4-phenylpyridinium))处理SH-SY5Y细胞(人类神经母细胞瘤)后测定细胞存活率，使用NXP031(本发明的适配体和维生素C复合物)预处理上述细胞1小时后，使用5mM的MPP⁺暴露24小时后测定细胞存活率。通过MTT分析测定上述细胞的存活率。

实施例6：对使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的帕金森病小鼠模型的效果

1-1.帕金森病小鼠模型

以20mg/kg的量使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶在一天内每隔2小时向体重为25g以上的8周龄的C57BL/6小鼠(mouse)的腹腔内连续注射共4次来急性地诱导帕金森病。

1-2.组合物的制备及给药

在蒸馏水中混合200mg/kg的维生素C、4mg/kg的与上述上述维生素C结合的适配体(GTGGA GGCGG TGGCC AGTCT CGCGG TGGCG GC；序列编号1)来制备组合物。在向通过上述方法诱导帕金森病的小鼠最后给药1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶1小时后，将上述组合物稀释为维生素C的最终给药浓度为200mg/Kg、Aptamin C的最终给药浓度4mg/Kg后，通过腹腔或口服向小鼠给药50μl。维生素C和Aptamin C的单独给药以与在上述组合物中相同的浓度，通过腹腔或口服给药50μl。组合物、维生素C及Aptamin C的给药以一天一次的频次连续给药4天。

1-3.神经行为学评价

为了评价通过上述方法给药1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶及组合物后诱导的神经行为学影响，在通过上述方法诱导帕金森病4周后，执行爬杆试验和疲劳转棒实验。

利用55cm高的杆进行爬杆试验。将小鼠置于杆顶，测定小鼠下降到底部的时间。

疲劳转棒实验是将小鼠放置于转棒后，启动转棒使其速度从2.5rpm开始逐渐提高至25rpm后(高速为3.5rpm～35rpm)，当转棒转动时，测定从开始到小鼠失去平衡掉落地面为止的时间(秒)。

1-4.脑组织的免疫组织学染色

为了清除通过上述方法获得的脑组织切片中的内源性过氧化物酶的活性，使用1％的过氧化氢处理15分钟。然后，加入稀释为适当浓度的酪氨酸羟化酶抗体后在4℃的温度下染色一晚。通过清洗去除未结合的一次抗体后，使用生物素化(biotinylated)的第二抗体在常温下染色90分钟。通过清洗去除未结合的第二抗体后，在常温下使用ABC溶液染色1小时。使用3，3-二氨基联苯胺(3，3-diaminobenzidine)进行显色反应后通过显微镜进行观察。

从图10～图14可知，通过上述实验确认，在使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导帕金森病的小鼠模型的试验中，通过本发明组合物(维生素C及Aptamin C)的处置，显著减少行为学上的运动能力的缺失。并且，通过对从给予试样的小鼠中获得脑组织切片中的酪氨酸羟化酶进行免疫组织学染色来确认组织内多巴胺神经细胞的结果，确认在组合物给药组中，多巴胺神经细胞的凋亡显著减少。

Claims

1.一种用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，包含与维生素C结合的适配体作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，上述组合物还包含维生素C。

3.根据权利要求1所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，上述适配体由序列编号1表示的碱基序列形成。

4.根据权利要求2所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，上述维生素C与适配体的混合比的范围为10t1至500t1的重量比。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，上述组合物具有神经细胞保护效果。

6.根据权利要求1或2所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，上述神经退行性疾病选自由脑卒中、中风、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症以及肌萎缩侧索硬化症组成的组中。

7.根据权利要求6所述的用于治疗及预防神经退行性疾病的组合物，其特征在于，上述神经退行性疾病为帕金森病。