KR20240102901A - 해방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
해방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 해방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 해방풍 추출물이 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며, 산화적 스트레스로부터 근육세포를 보호하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 근손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에서는 해방풍 추출물이 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며, 산화적 스트레스로부터 근육세포를 보호하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 근손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 해방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
우리의 신체에는 약 460개의 근육이 있으며, 근육은 우리 몸의 자세 및 균형을 유지하거나 이동 등 신체 기능에 중요한 역할을 하고 있다. 또한, 근육은 체중의 45 ~ 55%를 차지하는 가장 큰 장기이며 에너지 대사 및 열 생성에서도 중요한 역할은 담당한다. 여러 가지 원인으로 인해 이들 근육량이 감소하게 되면, 신체활동을 위한 근력이 약화되는 것을 기본으로, 근골격계 퇴화의 악순환 고리가 시작된다. 보행 속도의 감소 및 악력의 약화 등이 근육량 감소의 주된 증상이자 지표가 되며, 이는 추가적으로 낙상, 골절, 관절의 손상, 대사장애 및 심혈관 질환 등으로 이어질 수 있다.
근손상 또는 근육 소실(Decreased muscle mass)은 신체의 노화에 따라 자연스럽게 발생할 수 있고, 근육의 미사용이나 운동량 부족 등이 원인이 되어 나타나거나 다른 병적 상태(악액질, 패혈증, 기아, 항암치료, 스트레스 호르몬에의 과도한 노출)가 원인이 되어 2차적으로 발생할 수도 있다. 이는 제1형 및 제2형 근섬유(muscle fibers)의 반-동화(Anti-anabolic)작용 및 이화(Catabolic)작용으로 인한 근육세포 위축으로 일괄할 수 있다.
근위축(Muscle atrophy)이란 근육량의 점진적 감소에 의하여 발생하는 것으로, 근육의 약화 및 퇴행을 일컫는다 (Iain W McKinnell and Michael A Rudnicki, Cell, 119(7): 907-910, 2004). 근위축은 근육사용의 감소, 신경손상, 장기적인 요양, 산화적 스트레스, 만성 염증 및 유전적 요인 등에 의해 촉진되며 근육 기능과 운동 능력을 약화시킨다 (Claire E. Lee et. al., Clinical Nutrition, 26(5): 524-534, 2007). 근기능을 결정짓는 가장 중요한 요소는 근육량이며, 이는 단백질 합성과 분해의 균형에 의해 유지된다. 근위축증은 단백질 분해가 합성보다 더 일어날 때 발생한다(G.A. Nader et. al., The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 37(10): 1985-1996, 2005). 전사 인자인 FoxO(forhead box)가 세포질에서 핵 내로 이동하면 단백질 분해에 관여하는 E3 유비퀴틴 리가아제인 아트로긴-1(atrogin-1)과 MuRF-1의 발현을 증가시키는데, 이 경우 근육 내의 단백질 분해가 촉진되어 근육량이 줄어들게 된다. 즉, 단백질 분해가 합성보다 더 일어나게 되는 것으로 근육량 감소에 따른 근육의 약화 및 퇴행을 일으키게 된다. 또한, 근위축은 산화적인 환경의 근육에서 전자이동과 산소흐름이 갑자기 많아질 때 활성산소 (ROS)에 의하여 발생하기도 하는데, 심한 운동을 하면 활성산소 생산의 증가로 인해 근육 손상이 유도된다,
근위축은 크레아틴 키나아제(Creatine kinase: CK), 근전도검사, 근육생검, 분자생물학적 유전자검사, 세포유전학적 검사 등을 통해 진단이 이루어지며, 현재까지의 근위축에 대한 주된 치료방법은 물리치료와, 합병증 및 기형, 기능 장애 예방을 위한 작업치료, 호흡치료의 병행, 그리고 추가적으로 대증요법(symptomatic treatment)과 지지요법(supportive therapy)을 시도하는 것이 유일한 대응방법이다.
한편, 해방풍(Glehnia Littoralis)은 산형과(Umbelliferae)에 속하는 갯방풍(Glehnia)속의 다년생 식물로, 한국, 중국, 일본에 분포하며 한방에서 발한제, 해열제, 진통제, 거담제로 사용되어 왔다 (Yuan, Z., et. al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 50(1):73-77, 2002).
해방풍은 퀘르세틴(quercetin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 루틴(rutin), 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페산(caffeic acid)과 같은 항산화 성분을 가지고 있으며, 최근 연구에서는 해방풍이 일과성 뇌허혈증(transient global cerebral ischemia)에 대해 치료효능을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 해방풍은 성체 생쥐의 해마에서 세포 증식, 신경아세포 분화 및 신경 성숙을 촉진한다고 최근 보고되었으나(Park, J.H., et. al., Chinese Medical Journal, 131(06):689-695, 2018), 해방풍의 근육 손상, 특히 근위축 예방 또는 치료 효과는 연구된 바 없다.
이에, 본 발명에서는 근육 손상의 예방 또는 치료 효능이 있는 천연소재를 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 해방풍 추출물이 근위축을 유발하는 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)인 FoxO3a, atrogin1/MAFbx 및 Murf1의 과발현을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 산화적 손상으로부터 근육세포를 보호하는 효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 근손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 물 또는 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 20 ~ 60%(v/v) 에탄올, 더 바람직하게는 25 ~ 45%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며, 산화 스트레스로부터 근육세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 근손상 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근육감소증(sacopenia), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육 손상 및 근육 퇴화로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 근육 손상은 운동-유발성 근육 손상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 근육 손상은 근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion) 및 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서는 해방풍 추출물이 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며, 산화적 스트레스로부터 근육세포를 보호하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 근손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 덱사메타손 처리에 의해 근위축이 유발된 C2C12 근육세포에 해방풍 추출물을 처리하였을 때, 근위축 관련 단백질인 MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx의 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다. 도면에서 W는 물 추출물, 30E는 30%(v/v) 에탄올 추출물, 50E는 50%(v/v) 에탄올 추출물을 의미한다.
도 2는 덱사메타손 처리에 의해 근위축이 유발된 C2C12 근육세포에 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 관련 단백질인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 덱사메타손 처리에 의해 근위축이 유발된 C2C12 근육세포에 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 관련 유전자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 C2C12 근육세포에서 과산화수소로 유발된 산화 스트레스에 대한 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물의 세포 보호 효과를 확인한 데이터이다.
도 5는 C2C12 근육세포에서 과산화수소로 유발된 산화 스트레스에 대한 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물의 세포주기 조절 효과를 확인한 데이터이다. 도 5A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 세포주기를 분석한 데이터이며, 도 5B는 Sub-G1 단계의 세포 백분율을 나타낸 데이터이다.
도 6은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에의한 과산화수소 유발 세포사멸 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 6A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 세포 사멸정도를 유세포 분석으로 확인한 데이터이며, 도 6B는 세포 사멸 정도를 백분율로 나타낸 데이터이다.
도 7은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 과산화수소 유발 활성산소종 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 7A는 (a) 대조군, (b) H2O2(300 uM) 처리군, (c) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 ROS 생성 정도를 유세포 분석으로 확인한 데이터이며, 도 7B는 세포 내 ROS 생산 비율을 백분율로 나타낸 데이터이다.
도 8은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 과산화수소 처리로 유발된 미토콘드리아 막 전위(Membrane potential) 손실 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 8A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 막전위 변화를 로다민(rhodamine) 123 어세이로 측정한 데이터이며, 도 8B는 로다민 형광 정도를 백분율로 나타낸 데이터이다.
도 2는 덱사메타손 처리에 의해 근위축이 유발된 C2C12 근육세포에 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 관련 단백질인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 덱사메타손 처리에 의해 근위축이 유발된 C2C12 근육세포에 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 관련 유전자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 C2C12 근육세포에서 과산화수소로 유발된 산화 스트레스에 대한 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물의 세포 보호 효과를 확인한 데이터이다.
도 5는 C2C12 근육세포에서 과산화수소로 유발된 산화 스트레스에 대한 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물의 세포주기 조절 효과를 확인한 데이터이다. 도 5A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 세포주기를 분석한 데이터이며, 도 5B는 Sub-G1 단계의 세포 백분율을 나타낸 데이터이다.
도 6은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에의한 과산화수소 유발 세포사멸 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 6A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 세포 사멸정도를 유세포 분석으로 확인한 데이터이며, 도 6B는 세포 사멸 정도를 백분율로 나타낸 데이터이다.
도 7은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 과산화수소 유발 활성산소종 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 7A는 (a) 대조군, (b) H2O2(300 uM) 처리군, (c) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(300 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 ROS 생성 정도를 유세포 분석으로 확인한 데이터이며, 도 7B는 세포 내 ROS 생산 비율을 백분율로 나타낸 데이터이다.
도 8은 C2C12 근육세포에서 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 과산화수소 처리로 유발된 미토콘드리아 막 전위(Membrane potential) 손실 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 8A는 (a) 대조군, (b) H2O2(150 uM) 처리군, (c) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군, (d) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군, (e) H2O2(150 uM) + 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군, (f) 해방풍 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖ 처리군의 막전위 변화를 로다민(rhodamine) 123 어세이로 측정한 데이터이며, 도 8B는 로다민 형광 정도를 백분율로 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서, 해방풍(Glehnia Littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일관점에서, 해방풍(Glehnia Littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 물 또는 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 20 ~ 60%(v/v) 에탄올, 더 바람직하게는 25 ~ 45%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
또한, 상기 해방풍 추출물은 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물일 수 있다.
구체적으로 상기 분획물들은 해방풍 에탄올 추출물에 헥산 용매를 첨가한 다음, 헥산 분획물 및 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계; 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 클로로포름 분획물 및 수상을 수득하는 단계; 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물 및 수상을 수득하는 단계; 및 상기 수상에 부탄올 용매를 첨가한 다음, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 수득하는 단계로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 전체 조성물에 10 ~ 1000 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 50 ~ 800 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 근육 단백질 분해에 관여하는 MuRF1 및 atrogin1/MAFbx 발현을 억제할 수 있다.
근위축은 유비퀴틴-프로테아좀(ubiquitin-proteasome) 경로의 활성화를 통한 근육 단백질의 분해에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 유비퀴틴-활성화효소(ubiquitin-activating enzymes; E1), 유비퀴틴-결합효소(ubiquitin-conjugating enzymes; E2) 및 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligases; E3)라는 효소들이 매개하여 표적 단백질과 유비퀴틴의 공유결합을 유발시킴으로써 단백질 분해 개시를 유도한다.
특히 심장 및 골격근에서 특이적으로 발현되는 F-box type E3 리가아제인 MAFbx/atrogin-1 및 Ring Finger 유형의 E3 리가아제인 MuRF1은 근위축을 유발하는 다양한 조건에서 증가하여, 세포주기 억제 및 근육 특이적인 유전자 발현의 활성화를 통한 근육 분화(myogenic differentiation)에 관여하는 근육-특이적 전사인자(muscle-specific transcription factor)인 미오게닌(myogenin)과 MyoD의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명에서는 덱사메타손(dexamethasone)이 유발하는 근위축 현상이 근육-특이적 유비퀴틴 리가아제(muscle-specific ubiquitin ligase) 및 근육-특이적 전사 효소(muscle-specific transcription factor)의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 분화가 유발된 C2C12 근육세포에 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하여 근위축 유발 및 관련 인자들의 단백질 발현 변화를 조사한 결과, 해방풍 물 추출물, 30%(v/v) 에탄올 추출물을 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, C2C12 근관세포에서 덱사메타손(dexamethasone)으로 인해 유발된 MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx 단백질 증가를 모두 억제한 것을 확인하였다.
반면, 같은 농도로 해방풍 50%(v/v) 에탄올 추출물을 처리하였을 때는 MuRF-1의 단백질 증가만 억제한 것으로 나타났다. 특히 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 처리하였을 때 MuRF1 및 atrogin-1/MAFbx 단백질 증가를 억제하는 효능이 가장 우수하였다 (도 1).
또한, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖로 처리한 결과에서도 덱사메타손(dexamethasone)으로 인해 유발된 FoxO3a, MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현 증가를 모두 억제하는 것을 확인하였다 (도 2 및 도 3).
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 산화 스트레스로부터 근육세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, C2C12 근육세포에 과산화수소로 산화 스트레스를 유발하였을 때, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의해 근육세포의 사멸이 억제되고, 세포 주기가 조절되며, 세포 내 ROS 생성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 4 내지 도 8).
즉, 본 발명의 해방풍 추출물은 근손상으로 인해 증가된 FoxO3a, MuRF-1, atrogin-1/MAFbx 단백질 및 유전자 발현을 억제하여 근손상을 억제하는 것을 확인하였으며, 과산화수소로 유도한 산화적 손상에 대하여 해방풍 추출물이 ROS 저해를 통해 세포를 보호하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 해방풍 추출물을 근손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 효과적으로 활용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 근손상 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근육감소증(sacopenia), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육 손상 및 근육 퇴화로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 근육 손상은 운동-유발성 근육 손상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 근육 손상은 근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion) 및 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1 ~ 10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 건강기능식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01 ~ 0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
해방풍 추출물 제조
해방풍은 울진(한국)에서 구매하였으며, 해방풍 추출물은 열수 추출물, 30% 에탄올 추출물 및 50% 에탄올 추출물로 준비하였다.
구체적으로, 열수 추출물은 해방풍을 씻어 건조한 후 분쇄하여 사용하였으며, 건조된 해방풍 50g에 물 1 ℓ를 넣고 100℃에서 2시간 동안 추출하였다.
에탄올 추출물은 30%(v/v) 에탄올 또는 50%(v/v) 에탄올을 첨가하고 초음파로 각각 1시간씩 2회 추출하였다.
그 다음, 열수 추출물 및 에탄올 추출물은 각각 여과지(Whatman No.41, Whatman International Limited, 영국)로 여과하고 회전식 진공 증발기(N-1000, EYELA Co., 일본)를 사용하여 농축한 다음, 진공 동결 건조기(일신연구소, 양주, 한국)를 사용하여 동결건조하여 해방풍 추출물을 제조하였다.
해방풍 추출물에 의한 근위축 유발 단백질 발현 억제 효능 확인
일반적으로 노화, 영양부족 및 다양한 만성질환에 의하여 유발되는 근위축은 근육 단백질 합성 억제 및 분해 증가를 통하여 근섬유 및 근육의 밀도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 근위축과 관련된 실험을 위해 C2C12 근육세포에서 근관세포로의 분화유도하고, 분화가 유발된 C2C12 근육세포에 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하여 근위축 유발 및 관련 단백질들의 발현 변화를 조사하였다.
실험에 사용된 세포주인 C2C12 근육세포(myoblast)는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)에서 구입하여 사용하였다. C2C12 근육세포는 10% FBS 및 100 unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium DMEM; ThermoFisher Scientific, 미국) 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. C2C12 근육세포를 근관세포(myotube)로 분화시키기 위하여 2% HS(horse serum)와 100 unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 분화 배지를 사용하였으며 6일간 분화 유도하였다.
분화가 유발된 C2C12 근육세포에 덱사메타손(dexamethasone; Tokyo Chemical Industry Co, 일본)을 100 uM 농도로 처리하여 근위축을 유발한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 해방풍 물 추출물, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물, 및 해방풍 50%(v/v) 에탄올을 각각 200 ㎍/㎖ 처리하였다.
그 다음, 당업계에 공지된 방법으로 세포로 부터 단백질을 분리한 다음, 웨스턴 블랏을 통해 MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx 단백질 발현양상을 관찰하였다.
단백질 분석을 위해 1차 항체로 항-MAFbx/atrogin-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc, 미국), 및 항-MuRF1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc, 미국)를 사용하였고, 2차 항체로 고트-항-마우스 IgG-HRP(goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase; Santa Cruz Biotechnology, Inc, 미국)을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 근육-특이적 유비퀴틴 리가아제(muscle-specific ubiquitin ligase)인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF-1의 발현 변화를 확인한 결과, 근위축을 유발하지 않았을 경우에는 발현이 되지 않았지만 덱사메타손 처리에 의한 근위축이 유발되는 조건에서 발현이 증가되었다.
해방풍 물 추출물, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 각각 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, C2C12 근육세포에서 덱사메타손으로 인해 유발된 MuRF1 및 atrogin-1/MAFbx 단백질은 모두 발현이 억제되는 것으로 나타났다. 반면, 해방풍 50%(v/v) 에탄올 추출물을 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때는 MuRF1의 단백질만 발현이 억제되는 것으로 확인되었다.
특히, 해방풍 30% 에탄올 추출물을 처리하였을 때 MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx 단백질 증가를 억제하는 효능이 가장 우수하였다.
통계 분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 statistical Analysis System ver. 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 분석하였다.
해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 근위축 유발 단백질 발현 억제 효능 확인
3-1: 단백질 발현 정도 확인
본 발명에서는 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 유발 단백질 발현 정도를 확인하였다.
상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 해방풍 30%(v/v)에탄올 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 그 다음, 당업계에 공지된 방법으로 세포로부터 단백질을 분리한 다음, 웨스턴블랏을 통해 p-FoxO3a, MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx의 단백질 발현정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 로 처리한 결과에서도 덱사메타손으로 인해 증가된 근위축관련 인자인 p-FoxO3a, MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx의 단백질 발현 증가를 모두 억제하는 것을 확인하였다.
3-2: mRNA 발현 정도 확인
본 발명에서는 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 근위축 유발 단백질의 mRNA 발현 정도를 분석하였다.
상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 그 다음, 당업계에 공지된 방법으로 세포로부터 total RNA를 분리한 다음, RT-PCT을 통해 FoxO3a, MuRF-1 및 atrogin-1/MAFbx의 mRNA 발현정도를 관찰하였다.
gene | Primer sequence | PCR 산물크기 |
서열번호 | |
FoxO3a |
정방향 | 5'-GAGAGCCCATACTTGCTTATCC-3' | 421bp | 서열번호 1 |
역방향 | 5'-CTGGTGCCTGAAACCTAACA-3' | 서열번호 2 | ||
MuRF-1 |
정방향 | 5'-GAGTGGGTTTGGAGACAAAGA-3' | 598bp | 서열번호 3 |
역방향 | 5'-CCAGCATGGAGATGCAGTTA-3' | 서열번호 4 | ||
Atrogin-1/MAFbx | 정방향 | 5'-CACCTTGTGGACGTGTGTAA-3' | 574bp | 서열번호 5 |
역방향 | 5'-GGGCAAGAAAGAGGATGGATAG-3' | 서열번호 6 | ||
GAPDH | 정방향 | 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' | 472bp | 서열번호 7 |
역방향 | 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' | 서열번호 8 |
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 단백질 발현 결과와 마찬가지로 덱사메타손 단독 처리군에 비해 해방풍 추출물 농도 의존적으로 근위축관련 유전자 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
해방풍 30%(v/v) 에탄올 추출물에 의한 산화스트레스에 대한 산화적 손상 보호 효과 확인
해방풍 추출물의 세포 독성 및 세포 보호 효과를 확인하기 위해 C2C12 세포주를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 해방풍 30% 에탄올 추출물만을 100 ~ 1000 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 모든 농도에서 세포 생존율이 95% 이상이었으며 이는 시료 자체의 독성이 없는 것으로 판단하였다.
이후, 해방풍 30% 에탄올 추출물이 H2O2로 유도한 산화스트레스에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다. 해방풍 추출물의 C2C12 근육세포의 산화적 손상 보호효과는 MTT 방법을 이용하여 측정하였다.
분화되지 않은 C2C12 세포를 48-웰 플레이트에 1.0×104 개/웰의 농도로 분주하였다. 24시간 배양 후 해방풍 30% 에탄올 추출물을 농도별로(100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖)로 한시간 동안 전처리하였다. 그 다음, H2O2의 농도가 150 μM이 되도록 처리하고 24시간 후에 산화적 스트레스를 유발을 확인하였다. 그 후 5 ㎎/㎖의 MTT 시약을 각 웰에 20 ㎕ 씩 분주하고 2시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 DMSO 200 ㎕으로 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켰다. 이 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고 무처리군의 세포생존율을 100%로 계산하여 세포의 생존율을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, C2C12 근육세포에 H2O2(150 μM)를 처리한 경우 세포 생존율이 약 65% 수준으로 감소한 반면, 해방풍 30% 에탄올 추출물을 처리하였 때 H2O2 처리군에 비해 800 ㎍/㎖까지 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다.
상기 결과를 통해 해방풍 30% 에탄올 추출물이 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 대해 세포보호 효과를 보이는 것으로 판단하였으며, 이후 실험은 해방풍 30%에탄올 추출물의 농도를 100, 200, 400 ㎍/㎖로 하여 진행하였다.
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로 유도된 C2C12 근육세포 손상에서 해방풍 추출물이 세포주기에 미치는 영향 (세포 주기 분석)
C2C12 세포의 세포주기에 미치는 영향에 대한 분석은 프로피듐 요오드화물(propidium iodide; PI)로 DNA를 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 형광의 세기를 측정하였다. C2C12 세포에 해방풍 추출물을 1시간 전처리한 다음, 150 μM이 되도록 H2O2를 처리하고 24시간 후에 세포를 모아 원심분리한 후, 트윈 20(tween 20)이 포함된 에탄올로 세포를 1일 동안 고정하였다. PBS로 세척된 세포에 PI 용액(0.1% Triton X-100, PI 20 ㎍/㎖, RNase 200 ㎍/㎖) 500 ㎕를 첨가하고 30분간 반응시킨 후 유세포분석기를 이용하여 세포주기를 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 세포의 사멸을 의미하는 sub-G1기는 무처리군에서 4.41%로 나타났으며, H2O2 처리군은 12.20%로 증가하였다. 반면, 해방풍 30% 에탄올 추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 각각 1시간 동안 전처리한 경우, sub-G1기는 각각 6.01%, 3.70%, 및 5.68%로 나타났다.
또한, H2O2를 처리하지 않고 해방풍 30% 에탄올 추출물만 400 ㎍/㎖의 농도로 처리한군의 sub-G1기는 3.37%를 나타내었다. 이러한 결과는 산화스트레스에 의해 증가된 sub-G1기가 해방풍 30% 에탄올 추출물을 처리하였을 때 유의적으로 억제되는 것을 의미한다.
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로 유도된 C2C12 근육세포 손상에서 해방풍 추출물이 세포사에 미치는 영향 (Apoptosis 유발의 정량적 분석)
C2C12 세포에서 H2O2 처리에 의한 세포사멸(apoptosis) 유발 및 해방풍 추출물에 의한 세포사멸(apoptosis)의 억제 효과를 정량적으로 분석하기 위하여 준비된 세포들을 모은 다음 13,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
다시 PBS를 이용하여 2회 이상 세척하고 1X 바인딩(binding) 버퍼 100 ㎕에 부유시킨 다음 아넥신-V-플루오레세인 이소티오시아네이트(annexin V-fluorescein isothiocyanate; FITC) 및 프로피듐 요오드화물(propidium iodide; PI)을 처리하여 암실에서 15분 동안 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 바인딩 버퍼 400 ㎕를 추가한 후 유세포분석기를 이용하여 세포사멸이 유발된 세포(V+/PI)를 형광반응에 따라 정량적으로 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 아넥신 V-FITC/PI 염색을 이용하여 분석을 실시한 결과, H2O2 처리를 하고 24시간 동안 배양된 C2C12 세포에서는 약 25.41%에 해당되는 세포에서 세포사멸(V+/PI, V+/PI+)이 유발된 것으로 나타났다.
해방풍 30% 에탄올 추출물 단독 처리군에서는 대조군의 수준(9.92%)과 유사하였고(10.17%), 해방풍추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 각각 1시간 동안 전처리한 경우, 세포사멸 유발 빈도는 각각 12.68%, 11.54%, 및 12.53%로 나타났다. 이러한 결과는 해방풍 30% 에탄올 추출물이 산화적 스트레스에 의한 C2C12 세포의 세포사멸(apoptosis)을 효율적으로 억제하였음을 의미한다.
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로 유도된 C2C12 근육세포 손상에서 해방풍 추출물이 세포내 ROS 생성에 미치는 영향 (세포내 ROS 생성량 측정)
C2C12 세포의 세포사멸 유발 억제 효과가 ROS 생성의 억제에 의한 것인지 확인하였다.
먼저, 세포 내 ROS 생성 변화를 확인하기 위하여 C2C12 세포에 해방풍 추출물을 1시간 전처리한 후 H2O2(300 μM)를 2시간 처리하여 세포내 ROS를 유도하였다.
형광 프로브(Fluorescent probe)인 10 μM의 DCF-DA(2',7'-di-chlorodihydrofluorescein diacetate; Molecular Probes, 네덜란드) 용액으로 30분간 염색하였다. 반응이 끝난 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 단일세포로 분리하였다. 이렇게 준비된 세포를 유세포분석기로 측정하여 ROS 값의 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, C2C12 세포에 H2O2 처리 시 ROS 생성량이 34.15%로, 무처리군의 ROS 생성량이 5.64%인 것에 비해 약 7배가량 증가한 것으로 나타났다. 반면, 해방풍 추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 각각 1시간 동안 전처리한 경우, ROS 생성량은 각각 35.54%, 20.80%, 및 11.27%로 농도의존적으로 감소하였다. 따라서 해방풍 추출물 처리로 인해 H2O2로 유도된 C2C12 세포 내 ROS를 효과적으로 억제함을 확인하였으며, 이를 통하여 해방풍 추출물은 산화적 스트레스로부터 근육세포를 보호할 것으로 판단된다.
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로 유도된 C2C12 근육세포 손상에서 해방풍 추출물이 세포내 미토콘드리아 손상에 미치는 영향 (미토콘드리아 멤브레인 포텐셜 변화량 분석)
산화 스트레스에 의한 과도한 ROS 생성은 세포내 미토콘드리아 멤브레인 포텐셜 수준을 저하시켜 세포 기능을 방해하는 것으로 알려져 있다. 미토콘드리아의 막전위(Membrane potential) 변화를 조사하기 위하여 로다민(rhodamine 123) 염색을 수행하였다. C2C12 세포에 해방풍추출물을 1시간동안 전처리 한 후 H2O2를 처리하여 24시간 더 배양하였다. 로다민 123을 처리하고 30분간 세포 배양기에서 반응시킨 후 세포를 회수하여 차가운 PBS로 2회 세척하고 PBS를 추가한 후 유세포분석기를 이용하여 형광의 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군(13%)에 비해 H2O2를 처리한 세포에서는 미토콘드리아 멤브레인 포텐셜이 감소된 세포들이 증가하였다 (33.58%). 그러나, 해방풍 추출물을 전처리한 군에서는 미토콘드리아 멤브레인의 포텐셜이 H2O2 처리군에 비해 감소가 현저히 낮은 것으로 나타났다. 이는 해방풍 추출물이 C2C12 세포의 과도한 ROS로 인한 미토콘드리아 멤브레인 포텐셜 손실이 회복되는 것으로 판단된다.
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Claims (10)
- 해방풍(Glehnia Littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 물 또는 에탄올을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하며, 에탄올은 20%(v/v) ~ 60%(v/v) 에탄올인 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며,
산화 스트레스로 부터 근육세포를 보호하는 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 근손상 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근육감소증(sacopenia), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육손상 및 근육 퇴화로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 근육 손상은 운동-유발성 근육 손상으로,
근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion) 및 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 해방풍(Glehnia Littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 물 또는 에탄올을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하며, 에탄올은 20%(v/v) ~ 60%(v/v) 에탄올인 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 근위축 관련 인자인 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1/MAFbx의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하며,
산화 스트레스로 부터 근육세포를 보호하는 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 경직성 척추 증후군(rigid spinsesyndrome), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 근감소증(sarcopenia) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 근손상 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 근육 손상은 운동-유발성 근육 손상으로,
근육 좌상(muscle strain), 근육 파열(muscle rupture), 근육 열상(muscle tearing), 타박상(contusion), 염좌(distortion) 및 회전근개 증후근(roator cuff syndrome) 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 근육질환 또는 근육 손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
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