KR20050120784A

KR20050120784A - 알부민 제제의 제조 방법

Info

Publication number: KR20050120784A
Application number: KR1020057019064A
Authority: KR
Inventors: 리키이치 다카와; 요시히로 하야세; 고타 마에무라; 히사시 다니가와
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2003-04-09
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2005-12-23
Also published as: ES2543978T3; KR101146946B1; US8258264B2; EP1614424B1; AU2004228847A1; CA2524246C; CA2524246A1; WO2004089402A1; EP1614424A4; US20060281903A1; AU2004228847B2; EP1614424A1; JPWO2004089402A1

Abstract

감염성 바이러스의 오염 가능성은 감소되고 고도의 안정성 및 안전성을 갖는 알부민 제제를 산업적 규모로 효율적으로 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 바람직하게 공극 크기가 10 내지 20 nm인 바이러스-제거막를 사용하여 혈청 알부민-포함 용액을 여과하는 단계를 포함한다. 특히, 바이러스의 불활성화를 위해 가열처리하기 전 여과를 수행한다. 더욱 바람직한 일면으로 혈청 알부민-포함 용액을 상기 여과 단계 전에 음이온 교환체 및/또는 프리필터로 처리한다.

Description

알부민 제제의 제조 방법{PROCESS FOR PREPARING ALBUMIN PREPARATIONS}

본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 혈장 분획 제제중 하나인 혈청 알부민 제제 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 바이러스-제거막을 사용하여 여과하는 단계를 포함하는 혈청 알부민 제제 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법을 통해 감염성 바이러스에 의한 오염 가능성은 줄이면서 고도로 안정하게 혈청 알부민 제제를 효율적으로 제조할 수 있다.

혈청 알부민은 분자량이 약 6.6 x 10⁴Da인 단백질로서 585개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고 타원형이다. 이는 전체 단백질중 약 60%를 차지하고 있고, 혈장에 가장 풍부하게 존재하며 간에서 합성된다. 이는 혈장 콜라겐의 삼투압 유지, 독물 중화 및 산-염기 평형 유지에 관여한다. 또한, 비-특이적 결합을 통해 다수의 약물 또는 화학 물질을 운반하는 역할을 한다.

상기 알부민은 화상, 콩팥증후군에 의해 유발된 알부민 상실 및 알부민 합성능 저하에 따른 저알부민혈증, 출혈쇼크 등의 치료에 사용하기 위한 알부민 제제로 제제화된다. 혈장 단백질 분획(PPF)을 포함하는 알부민 제제는 단백질을 4.4 내지 25%의 고 수준으로 포함하고, 그중 알부민이 80% 이상, 또는 96% 이상을 차지하는 단백질 제제이다. 제제 1개당 그의 용량은 또한 20 내지 250 mL으로 대량이다. 따라서, 알부민 제제를 생산하기 위해서는 대량 및 대용량의 단백질을 처리하여야 한다.

한편, 단백질, 특히 생체로부터 유래된 단백질, 더욱 특히 혈액으로부터 유래된 단백질은 AIDS 바이러스, 다양한 간염 바이러스, 및 인간 파르보바이러스 B19와 같은 다양한 바이러스에 의해 오염될 수 있다는 것을 부인할 수 없다. 따라서, 출발 물질로서 이 단백질을 사용하여 약제를 생산하는 경우 바이러스를 충분하게 제거하거나 불활성화시키는 단계를 필수적으로 도입하여야 할 것이다.

혈액으로부터 유래된 제제, 즉 혈액 제제의 오염 가능성은 부인할 수 없고, 바이러스 불활성화를 위해 가열 처리를 통상 사용하였다. 다르게는 바이러스를 불활성화시키기 위하여 특수한 용매 및 세정제가 사용되는 용매-세정제(SD)법을 사용할 수 있다(참조 Japanese Patent Publication No. 051116/1985). 바이러스는 또한 친화크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거할 수 있다(참조 Developments in Biological Standardization, Vol., 81, 199-209 (1993)). 그러나, 이런 모든 방법은 장단점 모두를 갖고, 각개 접근법은 단독으로는 바이러스를 완전하게 불활성화시키거나 완전하게 제거할 수 없을 것이다. 따라서, 다수의 접근법은 병용하여 효율적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 표적인 알부민 제제는 액상 가열(60℃에서 10시간동안) 및 알코올 분류에 의해 바이러스의 불활성화/제거에 적용시켰고, 50여년동안 임상적으로 사용하여 그의 안전성을 입증하여 왔다. 그러나, 안전성을 추가로 개선시키는 것과 관련하여 예를 들면, 상기 공정을 통해서도 불활성화되거나/제거되지 않는 바이러스와 같은 병원체 또는 아직 발견된 바 없었던 바이러스와 같은 공지되지 않는 병원체를 불활성화/제거하기 위한 수단으로서 바이러스-제거막에 의한 여과를 사용하여 이들 병원체를 제거하는 방법이 연구중에 있다. 그러나, 상업적으로 볼 때 알부민 제제를 생산하기 위하여 바이러스-제거막에 의한 여과법이 실제로 도입된 바는 없다.

발명의 개시

(본 발명에 의해 해결하고자 하는 기술적 문제)

바이러스-제거막에 의한 여과법은 제제를 생산할 때 막의 공극 크기보다 큰 바이러스와 같은 병원체를 의료제로부터 제거하기 위한 것이다. 그러나, 막을 사용하여 단백질성 용액으로부터 바이러스와 같은 병원체를 제거하는 것과 함께 충족시켜야 할 주요 문제는 막이 막힘(clog)으로써 여과하기 어렵거나 여과를 할 수 없다는 점이다. 바이러스-제거막의 공극의 크기는 제조사 또는 막 규격에 따라 달라질 수 있고, 그 범위는 10 내지 70nm이다. 한편, 여과시 바이러스-제거막의 공극을 통해 빠져나가는 단백질의 분자량은 10 내지 약 1000 kDa으로 이는 바이러스-제거막의 것과 거의 동일한 크기이다. 바이러스-제거막의 공극의 크기가 작을수록 더욱 작은 바이러스가 포획되고 제거될 수 있기 때문에 더욱 우수한 효과를 기대할 수 있을 것이다. 그러나, 바이러스-제거막의 공극을 통과하는 단백질의 크기에 따라 단백질 및 바이러스는 서로로부터 분리되지 못할 수 있다. 따라서, 바이러스-제거막을 사용하여 단백질성 용액을 여과하기 위하여 사용하는 막의 공극 크기도 선별하여야 하고, 동시에 막을 통과시키는 단백질의 크기도 고려되어야 한다. 또한, 사용하기 위하여 적절한 공극 크기를 갖는 바이러스-제거막을 선별한 경우에도 단백질성 용액중 존재할 수 있는 미량의 응집체 또는 오염 단백질은 막의 공극을 통과하지 못하고 공극을 채움으로써 막을 막거나 여과를 방해할 수 있다. 특히, 공극의 크기가 작은, 즉, 10 내지 20nm인 바이러스-제거막을 사용하여 여과하는 경우, 막을 통과할 수 있는 단백질의 크기는 극도로 작기 때문에 여액내 포함된 단백질의 종류 및 양에 따라 막이 막히지 않도록 하는 것이 과제가 된다.

또한, 알부민 제제를 생산하기 위해 처리하여야 하는 단백질의 양은 다른 혈장 제제보다 현저하게 많다. 따라서, 바이러스-제거막을 사용하는 여과법을 도입하기 위해서는 어떤 생산 고정 단계에서 여과를 수행할 수 있는지, 또는 어떤 조성 또는 특성을 갖는 알부민 수용액을 여과할 수 있는지를 고려하여야 한다. 또한, 여과법을 도입하기 위해서는 바이러스-제거막의 가격, 여과 면적 및 수량 또한 고려하여야 한다. 그러므로, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 공정을 도입하기 위해서는 가능한 적은 수량의 고가의 바이러스-제거막을 사용할 수 있는 조건을 찾아내는 것이 산업상 적용을 위해서는 필수적이다.

(문제를 해결하기 위한 방법)

본 발명의 목적은 감염성 바이러스의 오염 가능성을 줄이면서 고도로 안전하게 제제를 효율적으로 생산하는 것이다. 현재까지 시도된 바 없었던 산업적 실생산 규모로 알부민 제제를 생산하는 공정에 화학 용액중 바이러스와 같은 병원체를 제거하기 위하여 사용되어 왔던 바이러스-제거막을 사용하는 여과법을 적용함에 있어 본 발명자들은 우수한 여과 특성을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

현재까지, 알부민 제제를 생산함에 있어 바이러스-제거막을 사용하는 여과법에 대한 우수한 여과 조건이 제시된 바 없었기 때문에 본 발명자들은 상기 기술된 문제들을 해결하기 위하여 열심히 연구하였다. 결과, 본 발명자들은 막을 사용하여 알부민-포함 수용액을 여과하기 전에, 그의 크기가 바이러스-제거막의 공극 크기보다 크고, 이로써 막을 막히게 하는 오염 단백질을 제거하거나 감소시켜 효율적으로 여과할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

또한, 본 발명자들은 알부민 생산 공정에서 바이러스를 불활성화시키기 위하여 열-안정화제의 존재하에 10시간 이상동안 60℃에서 액체 생태로 가열 처리하기 전에 바이러스-제거막을 사용하여 알부민-포함 수용액을 여과하므로써 우수한 여과 특성을 얻을 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

(선행 기술보다 더욱 유효한 효과)

본 발명에 따른 바이러스-제거막을 사용한 여과에서 가열 처리전의 알부민-오염 용액은 우수한 여과 특성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 바람직한 일면으로, 용액의 화학적 조건을 조작하지 않고도 음이온 교환체를 사용하는 사전처리 및/또는 사전여과를 통해 필터 면적당 여과 용량을 증가시키는 효과를 얻을 수 있다는 것을 확인하게 되었다. 따라서, 면적이 작은 필터를 사용하여 대량의 알부민 용액을 여과시킬 수 있는 능력을 통해 바이러스-제거막을 사용하는 여과법을 산업적 규모의 알부민 제제 생산 공정에 도입시킬 수 있다.

통상의 알코올 분류법 및 가열 처리를 통해 바이러스를 제거/불활성화하는 것 외에도 본 발명의 제조 방법에 따른 신규한 방법인 바이러스-제거막에 의한 여과법도 가능할 것이다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 알부민 제제는 안전성면에 있어 더욱 탁월하다.

현재까지, 알부민 제제를 생산함에 있어 바이러스-제거막을 사용하는 여과법에 대한 우수한 여과 조건이 제시된 바 없었기 때문에 본 발명이 알부민 제제 생산 공정에 바이러스-제거막을 사용하는 여과법을 도입하는 것에 대하여 개시하는 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 따른 알부민 제제 제조 방법내로 도입되는, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 공정에서 여과 특성을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 알부민 제제 제조 방법내로 도입되는, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 공정에서 다양한 사전처리를 포함하는 여과 특성(여과량에 대한 효과)을 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 알부민 제제 제조 방법내로 도입되는, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 공정에서 다양한 타입의 사전여과에 대한 여과량에 대한 효과를 포함한다.

본 발명을 수행하는 최선 모드

알부민 용액은 오염 단백질로서 합토글로빈, 트랜스페린 및 헤모펙신과 같은 다른 단백질 및 그 자체로서의 알부민 응집체를 포함한다. 알부민 제제를 생산하기 위해 액상 가열처리할 때 열-안정화제를 사용할 경우에도 열에 의한 단백질 변성은 피할 수 없고, 따라서 열처리후에는 액상내 미량의 응집체가 형성되어 있음이 관찰된다. 또한, 알부민 그 자체는 소듐 N-아세틸트립토판 또는 소듐 카프릴레이트와 같은 안정화제와의 상호작용을 통해 그의 3차 구조로 변형될 수 있다고 가정할 수 있다. 이는 막을 막히게 할 수 있다고 판단된다. 그러나, 열처리에 기인하여 알부민 때문에 바이러스-제거막에 의한 여과가 난해했다는 보고는 없었다.

바람직한 일면으로, 바이러스-제거막에 의한 여과법을 수행하기 전에 알부민 용액을 음이온 교환체 처리 및/또는 사전여과(제거 크기: 35 내지 200 nm)에 의해 사전처리하여 오염 단백질을 제거하거나 감소시킴으로써 바이러스-제거막을 사용하여 여과할 때 막힘(clogging)을 저해하고, 유속을 현저히 감속시키지 않고도 공극 크기가 작은(10 내지 20nm) 바이러스-제거막을 사용하여 알부민 용액을 여과할 수 있기 때문에 결과적으로는 바이러스-제거막의 수량을 감소시키고 알부민 제제의 생산에 있어 적절하게 산업적으로 적용시킬 수 있다.

본 발명에 따른 알부민 제제의 활성 성분으로서 알부민의 근원은 포유동물, 예로서, 인간, 소 또는 래빗 또는 유전공학 기술을 사용하는 배양 세포와 같은 것을 포함하는 어느 것일 수 있다. 이들 중, 인간으로부터 유래된 알부민을 실제로 가장 많이 사용할 수 있고, 예로서, Cohn 방법인 에탄올 분류법으로부터의 Fraction V를 포함할 수 있다.

본 발명의 알부민 제제를 제조하는 방법은 오염 바이러스를 제거할 수 있도록 하기 위하여 바이러스-제거막을 사용하여 상기 기술된 바와 같은 알부민-포함 수용액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 바이러스를 불활성화하기 위한 가열처리 전 본 발명의 여과 단계를 수행하여 우수한 여과 특성을 얻을 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 바와 같은 바이러스-제거막은 바람직하게 10 내지 20 nm의 공극 크기를 가질 수 있다. 이 조건을 만족시키는 모든 바이러스-제거막을 사용할 수 있다. 바람직한 바이러스-제거막은 상업적으로 이용가능한 것을 포함할 수 있고, 예로서, Planova 15N (Asahi Kasei Corporation), Ultipor VF-DV20 (Pall Corporation), Viresolve (Millipore Corporation) 등을 포함할 수 있다.

또한, 알부민-포함 수용액을 음이온 교환체를 사용하는 하전-기초 분리 및 제거 및/또는 프리필터(제거 크기:35 내지 200nm)을 사용하는 크기-기초 분리 및 제거에 의해 사전처리하여 막힘을 유발하는 오염 단백질을 제거한 후 바이러스-제거막에 의해 여과하므로써 본 발명의 방법 효과를 추가로 증진시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 일면으로, 바이러스-제거막에 의한 여과 단계 이전에 사전처리를 수행할 수 있고, 이는 음이온 교환체를 사용하는 사전처리, 또는 사전여과에 의한 사전처리 및 그의 병용법을 포함할 수 있다. 각각의 사전처리가 단독으로도 적절한 효과를 제공할 수 있지만, 그의 병용법으로 더욱 증가된 효과를 얻을 수 있다. 특히, 각 사전처리는 하기와 같이 수행될 수 있다.

(1) 음이온 교환체를 사용하는 사전처리

pH, 전기전도 및 단백질 농도가 조절된 알부민-포함 용액을 적절한 완충액으로 평형화된 음이온 교환체에 적용시켜 상기 음이온 교환체에 흡착되도록 하여 용액중 포함된 오염 단백질이 제거될 수 있도록 한다. 사용되는 음이온 교환체는 음이온 교환 그룹을 포함하는 불용성 캐링러일 수 있고, 이는 DEAE-Sepharose (Amersham Pharmacia), Q-Sepharose (Amersham Pharmacia), DEAE-TOYOPEARL (Tosoh Corporation), QAE- TOYOPEARL (Tosoh Corporation) 등을 포함한다. 바람직한 음이온 교환체는 강 음이온 교환체, 예로서, Q-Sepharose 및 QAE-TOYOPEARL이다.

(2) 사전여과에 의한 사전처리

pH 및 단백질 농도가 조절된 알부민-포함 용액을 프리필터(제거 크기: 30 내지 200nm)에 통과시켜 막힘을 유발할 수 있는, 그의 입자 크기가 35 내지 200nm보다 큰 단백질을 프리필터로 포획하여 제거할 수 있다. 사용되는 프리필터는 카트리지 필터 (Sartorius, Sartopore 2, 0.1μm), 중공사 필터 (Asahi Kasei Corporation, Microza, 0.1μm), 다공성 막 중공사 (Asahi Kasei Corporation, Planova, 35 nm) 등를 포함한다. 바람직한 프리필터는 Sartopore 2 및 Planova 35 nm을 포함한다.

본 발명에 따라, 예를 들면 하기 기술하는 바와 같이 알부민 제제를 제조할 수 있다.

(1) 알부민-포함 수용액 제조

Cohn 방법의 에탄올 분류법으로부터 유래된 Fraction V 페이스트에 페이스트 중량의 2배 이상의 양으로 주사용수(The Japanese Pharmacopoeia)를 가하고 혼합물을 교반시켜 용해시킨다. 혼합물을 한외여과시켜 알코올을 제거하고 pH를 4 내지 5 (바람직하게 4.4 내지 4.6), EC를 5 mS/cm 미만 (바람직하게 1.5 mS/cm 미만), 및 단백질 농도를 5 내지 15 w/v% (바람직하게 8 내지 12 w/v%)로 조절한다.

(2) 이온 교환체를 사용하는 사전처리

단계 (1)에서 제조된 알부민-포함 수용액을 pH 4 내지 5 (바람직하게 4.4 to 4.6) 및 EC 5 mS/cm 미만 (바람직하게 1.5 mS/cm 미만)의 아세테이트 완충액으로 평형화된 음이온 교환체 [예: DEAE-Sepharose (Amersham Pharmacia), Q-Sepharose (Amersham Pharmacia), DEAE-TOYOPEARL (Tosoh Corporation), QAE-TOYOPEARL (Tosoh Corporation)]에 적용시켜 용출액을 회수한다.

(3) 필터를 사용하는 사전처리

단백질 농도가 5 내지 15 w/v% (바람직하게 6 내지 10 w/v%) 및 pH가 6 내지 7.5 (바람직하게 6.6 내지 7.2)로 조절된 단계 (2)에서 제조된 알부민-포함 수용액을 제거 크기가 35 내지 200nm인 필터를 통해 여과시켜 여액을 회수한다.

(4) 본 발명에 따른 처리: 바이러스-제거막 통과

단백질 농도가 5 내지 15 w/v% (바람직하게 6 내지 10 w/v%) 및 pH가 6 내지 7.5 (바람직하게 6.6 내지 7.2)로 조절된 알부민-포함 수용액를 Planova 15N (Asahi Kasei Corporation)에 통과시켜 여액을 회수한다.

(5) 벌크 용액 제조

단계 (4)에서 회수한 용액의 단백질 농도를 5 내지 30 w/v% (통상 5 또는 20 내지 25 w/v%)로 조절한다. 단백질을 농축시켜야 할 경우, 한외여과를 사용한다. 0.08 mmol/g 단백질로 소듐 N-아세틸트립토판 및 소듐 카프릴레이트를 용액에 가한다. 용액의 pH를 6.9±0.5로 조절하고 공극 크기가 0.22μm 미만인 필터 막을 통해 여과하여 최종 벌크 용액을 제조한다.

(6) 가열처리 및 필링(filling)

최종 벌크 용액을 10시간 이상동안 60.0 ± 0.5℃에서 가열하고 소정량의 각 부분을 비알에 무균적으로 필링하고 밀봉한다.

본 발명을 하기 제조예 및 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명하지만 이로 제한하고자 하는 것은 아니다.

제조예

(알부민 제제 제조)

(1) 알부민-포함 수용액 제조

Cohn 방법의 에탄올 분류법으로부터 유래된 Fraction V 페이스트에 페이스트 중량의 2배 이상의 양으로 주사용수(The Japanese Pharmacopoeia)를 가하고 혼합물을 교반시켜 용해시켰다. 혼합물을 한외여과시켜 알코올을 제거하고 pH를 4.54, EC를 1.5 mS/cm 미만, 및 단백질 농도를 12w/v%로 조절하였다.

(2) 이온 교환체를 사용하는 사전처리

단계 (1)에서 제조된 알부민-포함 수용액을 pH 4.51 및 EC 5 mS/cm 미만의 아세테이트 완충액으로 평형화된 음이온 교환체 [Q-Sepharose (Amersham Pharmacia)에 적용시켜 용출액을 회수하였다.

(3) 필터를 사용하는 사전처리

단백질 농도가 8 w/v% 및 pH가 6.98로 조절된 단계 (2)에서 제조된 알부민-포함 수용액을 제거 크기가 100m인 필터를 통해 여과시켜 여액을 회수하였다.

(4) 본 발명에 따른 처리: 바이러스-제거막 통과

단백질 농도가 8 w/v% 및 pH가 6.98로 조절된 알부민-포함 수용액를 Planova 15N (Asahi Kasei Corporation)에 통과시켜 여액을 회수하였다.

(5) 벌크 용액 제조

단계 (4)에서 회수한 용액의 단백질 농도를 25w/v%로 조절하였다. 단백질을 농축시켜야 할 경우, 한외여과를 사용하였다. 0.08 mmol/g 단백질로 소듐 N-아세틸트립토판 및 소듐 카프릴레이트를 용액에 가하였다. 용액의 pH를 6.9±0.5로 조절하고 공극 크기가 0.22μm 미만인 필터 막을 통해 여과하여 최종 벌크 용액을 제조하였다.

(6) 가열처리 및 필링

최종 벌크 용액을 10시간 이상동안 60.0 ± 0.5℃에서 가열하고 소정량의 각 부분을 비알에 무균적으로 필링하고 밀봉하였다.

실시예 1

(본 발명의 바람직한 여과 특성 확인)

알부민 제제 생산 공정에서 본 발명의 효과를 확인하기 위하여 각 단계의 알부민-포함 수용액를 하기와 같이 비교하였다. 여과 특성은 하기 3가지 조건에 대하여 비교하였다: (i) 가열처리전 단계 (1) 내지 (3)을 통해 수득한 알부민-포함 수용액의 단백질 농도를 8 w/v% 및 pH를 4 내지 9로 조절한 후 일정한 압력하에 바이러스-제거막으로 여과시킴; 및 비교를 위한 (ii) 가열처리전 단계 (1) 내지 (3)을 통해 수득한 알부민-포함 수용액을 농축시켜 다시 단백질 농도를 8 w/v% 및 pH를 7로 다시 조절된 최종 벌크 용액의 제조 단계를 수행한 후 일정한 압력하에 바이러스-제거막으로 여과시킴; 및 (iii) 가열처리전 단계 (1) 내지 (3)을 통해 수득한 알부민-포함 수용액을 농축시켜 다시 단백질 농도를 8 w/v% 및 pH를 7로 다시 조절된 최종 벌크 용액의 제조 단계 및 가열처리를 수행한 후 일정한 압력하에 바이러스-제거막으로 여과시킴.

결과를 도 1에 나타낸다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 가열처리전의 알부민 용액은 가열처리후의 알부민 용액보다 더욱 우수한 여과 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 특히, 가열처리전의 알부민 용액은 가열처리후의 알부민 용액보다 약 50배 이상의 알부민을 여과할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 2

(본 발명의 사전처리 효과에 대한 확인)

음이온 교환체 및/또는 사전여과에 의한 사전처리에 대한 효과를 확인하기 위하여 제조 단계(1)에서 수득한 알부민-포함 수용액을 (1) 음이온 교환체 [Q-Sepharose (Amersham Pharmacia)]로 처리만 하거나, (2) 사전여과 [카트리지 필터 (Sartorius, Sartopore 2, 0.1μm)]로 처리만 하거나, (3) 음이온 교환체 [Q-Sepharose (Amersham Pharmacia)] 및 사전여과 [카트리지 필터 (Sartorius, Sartopore 2, 0.1μm)]로 병용 처리하거나, (4) 대조군으로서 사전처리 않음으로써, 본 발명에 따라 사전처리시켰다. 각 알부민-포함 수용액을 주사용수(The Japanese Pharmacopoeia)를 사용하여 단백질 농도를 8 w/v%로, 1 w/v%의 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.98로 조절하고 0.5 kgf/cm²의 일정한 압력하에 바이러스-제거막(Asahi Kasei Corporation, Planova 15N)으로 여과시켰다. 각 여과의 유량을 막 면적당 알부민 용액의 용량으로 나타낸 도 2에 결과를 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 사전처리된 알부민 용액은 사전처리되지 않은 알부민 용액보다 더욱 다량의 증가량을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 특히, 음이온 교환체 처리 및 사전여과를 사용하여 병용 사전처리된 알부민 용액은 사전처리되지 않은 알부민 용액보다 약 2배 이상의 알부민을 여과할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

(다양한 타입의 프리필터에 의한 여과량에 대한 효과 확인)

다양한 타입의 프리필터에 의한 여과량에 대한 효과를 확인하기 위하여 제조 단계(2)에서 수득한 알부민-포함 수용액을 (1) a 카트리지 필터 (Sartorius, Sartopore 2, 0.1μm), (2) 중공사 필터 (Asahi Kasei Corporation, Microza, 0.1μm), 또는 (3) 다공막 중공사 (Asahi Kasei Corporation, Planova, 35 nm)를 사용하거나, (4) 대조군으로서 사전처리 않음으로써 본 발명에 따라 사전여과시켰다. 각 알부민-포함 수용액을 주사용수(The Japanese Pharmacopoeia)를 사용하여 단백질 농도를 8 w/v%로, 1 w/v%의 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.98로 조절하고 0.5 kgf/cm²의 일정한 압력하에 바이러스-제거막(Asahi Kasei Corporation, Planova 15N)으로 여과시켰다. 각 여과의 유량을 막 면적당 알부민 용액의 중량으로 나타낸 도 3에 결과를 나타낸다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 어느 타입의 프리필터와 함께 음이온 교환체로 병용처리한 경우 막 면적당 여과량을 증가시키는 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 카트리지 필터 (Sartorius, Sartopore 2, 0.1μm) 및 다공막 중공사 (Asahi Kasei Corporation, Planova, 35 nm)는 막 면적당 여과량을 현저히 증가시키는 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

(바이러스 제거에 대한 효과 확인)

바이러스 제거에 대한 본 발명의 효과를 확인하기 위하여 바이러스-제거막을 사용하여 여과하기 전에 단계 (1) 내지 (3) 후 수득한 49 용량의 알부민-포함 수용액에 (i) 1 용량의 슈도레이비스바이러스 (PRV), (ii) 1 용량의 소 바이러스 설사 바이러스 (BVDV), (iii) 1 용량의 마우스 뇌심근염바이러스(EMCV), 또는 (iv) 1 용량의 돼지 파르보바이러스 (PPV)를 가하였다. 이들 4개의 바이러스를 포함하는 혼합물 각각을 바이러스-제거막 (Planova 15N, Asahi Kasei Corporation)을 통해 여과하고 여과 전후로 바이러스 감염가를 측정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 바이러스-제거막을 사용하는 여과에 대한 우수한 효과가 시험된 모든 바이러스에서 밝혀졌다.

표 1: 바이러스-제거막을 사용하는 여과에 의한 바이러스 제거에 대한 효과

	바이러스 제거 효과
(i) PRV	≥5.0
(ii) BVDV	≥5.1
(iii) EMCV	≥4.9
(iv) PPV	4.1

수치: 바이러스 감염가(logTCID₅₀/ml)

Claims

바이러스-제거막을 사용하는 여과 단계를 포함하는 알부민 제제의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 액상 가열처리 단계 전에 알부민-포함 용액을 바이러스-제거막을 사용하는 여과 단계에 적용시키는 알부민 제제의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 단계에 사용되는 바이러스-제거막의 공극 크기가 10 내지 20 nm인 알부민 제제의 제조 방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 단계 전에 알부민-포함 용액을 음이온 교환체 및/또는 프리필터(prefilter)로 처리하는 것을 포함하는 알부민 제제의 제조 방법.
제 4항에 있어서, 처리에 사용되는 프리필터의 공극 크기가 35 내지 200 nm인 알부민 제제의 제조 방법.
바이러스-제거막을 사용하는 알부민-포함 용액 여과 단계 전에 알부민-포함 용액을 음이온 교환체 및/또는 프리필터로 처리하는 것을 포함하는, 바이러스-제거막을 사용하는 여과 단계 전에 알부민-포함 용액을 사전처리하는 방법.
제 6항에 있어서, 처리에 사용되는 프리필터의 공극 크기가 35 내지 200 nm인 알부민-포함 용액을 사전처리하는 방법.