KR20050104567A - 트라이테르페노이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를포함하는 피부 노화 방지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 화학식 1의 트라이테르페노이드 화합물 또는 이의 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 노화 방지를 위한 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

Description

트라이테르페노이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 노화 방지용 조성물{Triterpenoid compound, preparation method thereof and composition for preventing skin aging comprising the same}

본 발명은 신규한 트라이테르페노이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 노화 방지를 위한 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부의 자극으로부터 신체를 보호하고 신체를 주위의 변화에 순응시키는 역할을 한다. 피부의 주요기능에는 보호, 체온 조절, 감각, 분비, 배설, 비타민 D 합성, 표정, 재생 및 면역작용 등이 있다.

노화란 단순하게 젊음과 성숙도가 약해져 간다는 의미이기보다는 외부로부터의 악영향이나 질병 등으로 신체의 외부적인 자극에 의하여 피해를 받았을 때, 그에 대응하는 기관이나 조직의 기능이 저하되는 것이다. 피부, 근육, 뼈, 폐, 혈관 등에 분포하는 콜라겐(교원질)과 엘라스틴(탄력소)도 새로운 합성이 감소되고 이미 생성된 물질들마저 제 기능을 못하게 된다. 이때 피부의 탄력성이 없어지고 주름이 지는 현상은 우리가 현실적으로 가장 빨리 느낄 수 있는 것이 피부의 변화이다. 그러나 많은 연구와 의견이 있음에도 불구하고 아직까지 노화에 대한 정확한 원인은 규명되지 않고 있다.

피부 노화는 나이에 의한 내적 노화(자연 노화)와 자외선에 의한 외적 노화(광노화)로 구분된다. 그러나 세월에 따른 노화는 매우 미미하며 대부분 자외선 등의 환경적 요인에 의하여 촉진된다. 자외선이 우리들 삶에 있어서 필수적인 것이나 장시간 노출시 곧바로 피부에 큰 영향을 미치지 않는다 해도 누적되어 쌓이면 시간이 지남에 따라 조기에 피부 노화가 촉진된다. 피부가 노화되면 변화가 오는 것은 당연하다. 피부 구석구석 늘어지고 처지며 잘 찢어지고 부서진다. 머리카락은 점점 빠져가고 상처는 빨리 낫지 않으며 땀의 분비가 줄어 피부가 건조하게 되며, 이처럼 피부 노화의 주된 원인은 세월이 아니라 햇빛 때문이며 그중에서도 자외선에 의해 유발되는 광노화의 조절 기작은 많이 연구되어 왔다.

메트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP)-1은 피부의 콜라겐 관련 인자로써 프로콜라겐을 분해시킨다. 즉, 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1의 발현이 많아지면 프로콜라겐의 분해도 많아지므로 피부에 콜라겐의 양도 줄어들게 되므로 탄력적인 피부는 그 탄력성을 잃고 노화의 과정을 거치게 된다. 콜라겐의 분해는 광노화를 유발하는 주된 요소이다. 특히, 탄력물질의 축적은 주위 콜라겐 다발의 동시 파괴에 의해 유발되는 현상이며, 그 증거로 광노화에서 세포외기질 분해를 담당하는 메트릭스 메탈로프로테이나아제의 존재로 알 수 있다. 메트릭스 메탈로프로테이나아제는 최소 14개 이상의 서로 다른 종류를 가진 분해효소로 구성되어 있다. 이런 단백분해효소 대부분은 천연의 콜라겐, 변형된 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 다양한 프로테오글리칸, 파이브로 넥틴 및 그 외 다른 진피 성분들을 분해할 수 있다. 진피에 존재하는 세포는 섬유아세포가 주종을 이루는데 이들은 세포외기질인 콜라겐 섬유와 엘라스틴 섬유 등 여러 다양한 기질을 만드는 역할을 한다. 섬유아세포에 자외선을 조사한 경우 단백분해 효소의 발현이 증가하는 것이 보고되었다. 결국 사람 피부에 자외선을 조사한 경우 메트릭스 메탈로프로테이나아제의 활성이 증가하며, 증가된 효소 활성은 주로 타입 I 프로콜라겐의 콜라겐을 분해한다. 동시에 자외선 조사는 특정 MMP 저해제(Tissue inhibitor of MMP, TIMP)의 합성도 유도하는 것으로 알려져 있다. 광노화 피부에서 분해효소와 분해효소 저해제와의 정확한 균형이 있음에도 불구하고 자외선 조사 후 과다한 분해 환경을 만들게 되어 피부 콜라겐의 손실이 초래된다. 그러므로 외부로부터의 자극에 대비한 예방으로 자외선 차단 및 피부 노화방지를 위한 예방용품 즉, 기능성 화장품 등의 개발이 필수 불가결하게 되었다.

국내의 화장품 총 매출 규모는 약 3조원으로서, 지금까지 자외선 차단에 따른 피부 노화방지를 위한 미백 활성성분별로는 천연식물 추출물이 44%, 신규 화합물이 25%, 기존 미백성분으로 알려진 비타민 C 유도체 등 그 밖의 물질이 31%로 나타났다. 특히 닥나무, 반하, 단풍잎, 상황버섯, 율피, 녹두, 황금, 오미자, 창이자, 인삼알카로이드, 아세로라, 콩과 식물 등의 천연식물을 통한 새로운 자외선 차단에 의한 피부 노화방지 물질의 탐색은 국내업체가 특히 주력하는 분야이다.

상기한 바와 같이, 자외선 차단에 따른 피부 노화방지를 겸한 복합적인 기능성 화장품의 원료개발에 있어 천연식물에 대한 연구는 우리 전통의학에 기반을 둔 원료 개발과 우리 나라 소비자들의 식물성 화장품에 대한 선호도가 높다는 점이 잘 맞아 현재 국내 화장품 개발의 주력분야가 되고 있다.

이에 본 발명자들은 식물에서 자외선 차단효과를 가지는 주요성분을 분리·정제하여, 자외선 차단에 의하여 피부 노화방지를 위한 활성성분을 찾던 중, 때죽나무의 메탄올 추출물로부터 일련의 용매추출법에 의하여 얻은 유기용매 가용분획물 중에서 메틸렌 클로라이드 가용 분획물인 트라이테르페노이드 화합물이 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1) 합성억제를 통한 교원질 합성증가와 자외선에 의한 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1) 증가 억제를 통한 교원질 감소억제를 통해 궁극적으로는 자외선 차단에 의한 피부의 노화방지 효과를 가질 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 노화 방지 효과가 있는 신규한 트라이테르페노이드 화합물 또는 이의 영을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 때죽나무로부터 트라이테르페노이드 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 트라이테르페노이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 트라이테르페노이드 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:

트라이테르페노이드(또는 트라이테르펜)은 탄소수 30개로 되는 테르펜의 총칭이며, 여러 종류의 식물중에 유이체 또는 배당체로서 널리 존재하며 동물에도 그 존개가 알려져 있다. 생합성의 견지에서는 이소프렌 단위 6개로 구성되는 전구물질에서 유래한다고 한다. 탄소수가 30개 보다 많거나 적을 수 있으며, 고도로 산소화된 유도체도 천연적으로 존재한다. 트라이테르펜 유도체는 다양한 생물학적 활성을 지니며, 예를 들어 한국 특허 공개번호 제2003-0042123호는 티아렐릭산, 란디아닌 및 올레아놀릭산이 세포 사멸 유도작용을 한다고 기술하고 있고, 일본 특허 공개공보 제02-073012호는 브리오놀릭산이 소염 작용이 있다고 기술하고 있으며, 그 외에도 항종양 활성, 간질환 치료 활성, ACAT(acyl-CoA cholesteryl acyltransferases) 억제 활성, 항-아테롬경화 활성, 발모 활성, 항균 활성, 천신, 고혈압 등의 치료/예방제 등 다양한 활성을 갖는다고 보고되었다.

본 발명의 신규한 화학식 1의 트라이테르페노이드 화합물은 교원질의 합성을 증가시키고 교원질의 감소를 억제한다. 구체적으로, 본 발명자는 본 발명의 화합물이 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 합성을 억제하여 교원질의 합성을 증가시키며, 자외선에 의한 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 증가를 억제시켜 교원질의 감소를 억제한다는 것을 입증하였다(표 2, 3 및 4).

본원에서 사용된 용어 "화학식 1의 화합물의 염"이란 약리학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 염을 의미하며, 약학적으로나 생리학적으로 허용되는 무기 및 유기산 및 염기로부터 유도된 것을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리금속, 예를 들어 나트륨, 알칼리토금속, 예를 들어 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 트라이테르페노이드를 화학적으로 유도체화하여 수득하거나 이를 포함하고 있는 천연 공급원으로부터 추출하여 수득할 수 있다.

본 발명자는 한국의 자생식물인 때죽나무(Styrax japonica S. et Z.)로부터 통상적인 방법으로 추출하고(도 1 참조), 이를 일련의 크로마토그래프를 통해 화학식 1의 화합물을 분리하였다.

하나의 구체적 예시로서, 때죽나무를 알콜로 추출하고 이어서 메틸렌클로라이드로 추출한 후, 이 추추물을 크로마토그래피하여 분리하였다. 바람직하게는 메틸렌클로라이드 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 다시 일련의 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피(예: Toyopearl HW-40 크로마토그래피), 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피(예: 세파덱스 LH-29 컬럼 크로마토그래피) 및 소수성 역상 크로마토그래피(예: RP-18 박층 크로마토그래피, RP-18 고성능 박층 크로마토그래피)하여 순수하게 분리하였다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 때죽나무를 알콜로 추출하는 단계; 알콜 추출물을 메틸렌클로라이드로 추출하는 단계; 메틸렌클로라이드 추추물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 단계; 겔 여과 크로마토그래피하는 단계; 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 단계; 겔 여과 크로마토그래피; 및 소수성 역상 크로마토그래피하는 단계를 포함하여, 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 분리하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 제1 단계의 추출에 사용되는 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등, 바람직하게는 메탄올이 사용될 수 있다. 상기 분리 방법에서 메틸렌클로라이드 추출물은 실리카겔 컬럼에 로딩한 후 극성 용매와 비극성 용매의 혼합 용매, 바람직하게는 에틸아세테이트, 이소프로판올 및 물의 혼합 용매를 용출제로 사용하여 용출시킨다. 또한, 첫 번째 겔 여과 크로마토그래피는 Toyoperl HW-40 등을 이용한 크로마토그래피가 이용될 수 있으며, 두 번째 겔 여과 크로마토그래피는 세파덱스 LH-20 등을 이용한 크로마토그패피가 이용될 수 있다. 이러한 겔 여과 크로마토그래피의 수지는 통상 메탄올을 용매로 사용할 수 있으나, 클로로포름, 클로로포름-메탄올, 에탄올, 아세톤 등을 사용할 수 있다. 소수성 역상 크로마토그래피는 RP-18 TLC(박층 크로마토그래피)가 바람직하게 이용될 수 있다.

따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 분리 방법은 때죽나무를 메탄올로 추출하는 단계; 메탄올 추출물을 메틸렌클로라이드로 추출하는 단계; 메틸렌클로라이드 추추물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 단계; Toyopearl HW-40을 이용한 겔 여과 크로마토그래피하는 단계; 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 단계; 세파덱스 LH-29 컬럼을 이용한 겔 여과 크로마토그래피하는 단계; 및 RP-18을 이용한 소수성 역상 박층 크로마토그래피하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용하는 때죽나무(Styrax japonica S. et Z.)는 한국에서 자생하는 식물로서, 때죽나무속(Sytracaceae)에 속하며, 산과 들의 낮은 지대에서 자란다. 낙엽소교목으로 높이는 10m 내외이다. 가지에 성모(星毛)가 있으나 없어지고 표피가 벗겨지면서 다갈색으로 된다. 잎은 어긋나고 달걀 모양 또는 긴 타원형이며, 가장자리는 밋밋하거나 톱니가 약간 있다. 꽃은 단성화이고 종 모양으로 생겼다. 5 내지 6월에 지름 1.5 내지 3.5cm의 흰색 꽃이 잎겨드랑이에서 총상꽃차례[總狀花序]로 2 내지 5개씩 밑을 향해 달린다. 꽃부리는 5갈래로 깊게 갈라지며 수술은 10개이고 수술대의 아래쪽에는 흰색 털이 있다. 열매는 삭과로 길이 1.2 내지 1.4cm의 달걀형의 공 모양으로 9월에 익고 껍질이 터져서 종자가 나온다. 과피(果皮)는 물고기를 잡는 데 사용하고, 종자는 새가 먹으며, 목걸이 등을 만들기도 하고 목재(木材)는 기구재, 가공재 등으로 쓰인다. 한국(중부 이남 - 제주도, 덕유산, 팔공산) ·일본 ·필리핀 ·중국 등지에서 분포한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 상기한 바와 같이 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 합성 억제를 통해 교원질의 합성을 증가시키며, 자외선에 의한 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 증가 억제를 통해 교원질의 감소를 억제하므로 피부 노화 방지에 유효하게 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 피부 노화 방지를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 교원질의 합성 또는 이의 감소의 억제가 필요한 모든 적용에 사용될 수 있으며, 하나의 예시로서 피부 노화 방지를 위한 화장품 조성물에 유효 성분으로서 포함될 수 있으며, 또 다른 예시로서 기호 식품과 기타 특수형태의 식품이나 노화 등의 질병 예방과 관련된 기능성을 지닌 식품의 원료로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물이 화장품 조성물에 포함되는 경우, 이는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 1 % 의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 화장품 조성물의 경우 그 제형에 있어서 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 젤, 팩, 에센스, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 크림, 패취, 에어로졸, 스프레이, 파우더, 아이새도 및 바디클렌져 등으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 추가의 성분으로서, 특히 제한되지 않지만 ，수렴제，살균·항균제，자외선 흡수제，보습제，세포 활성제，소염·항 알레르기제，항산화·활성 산소 제거제，유지류，왁스류，탄화수소류，지방산류，알코올류，에스테르류，계면활성제，항료 등을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분은 ，상기한 메틸렌클로라이드 추출물 또는 화학식 1의 화합물과 함께 상승적으로 작용하여 기대 이상이 우수한 사용 효과를 나타낼 수 있다．

상기 수렴제로서는, 예를 들면, 구연산 또는 그 염류，주석산 또는 그 염류，유산 또는 그 염류，염화알루미늄，황산알루미늄·칼륨，아란토인쿠롤히도로키시알미니움，아란토인지히도로키시알미니움，팔라듐 페놀 술폰산아연，황산아연 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 살균·항균제로서는, 예를 들면，안식향산，안식향산 나트륨，팔라듐옥시안식향산에스테르，염화 디스테아릴 메틸 암모늄，염화벤제토니움，염산클로르헥시딘，살리실산，살리실산나트륨，솔빈산，레졸신，팔라듐클로로페놀，페녹시에틸알콜，멘톨，키토산，키토산 분해물，알로에 엑기스 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 자외선 흡수제로서는, 예를 들면，β-이소프로필 푸라논 유도체，우로카닌산，우로카닌산에틸，오키시벤존，오키시벤존슬혼산，테트라히드록시벤조페논，디히드록시디메톡시벤조페논，디히드록시벤조페논，산화 티탄，β-카로틴，γ-오리자놀코메누카에키스，알로에 엑기스，자작나무 엑기스 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 보습제로서는, 예를 들면，세린，글리신，트레오닌，알라닌，콜라겐，가수 분해 콜라겐，케라틴，에라스친，로열 젤리，콘드로이친 황산 헤파린，스핀고인지방질，스핀고당지질，리놀레산 또는 그 에스테르，다가 불포화 지방산 또는 그 에스테르류，펙틴，비피더스균 발효물，유산 발효물，효모 추출물，밀 배아유，쌀 배아유，호호바유 등을 들수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 세포 활성제로서는, 예를 들면，리보플라빈 또는 그 유도체，니코틴산 또는 그 유도체，판토텐산 또는 그 유도체，당근 엑기스，샐비어 엑기스，마늘 엑기스 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 소염·항 알레르기제로서는, 예를 들면，아미노카프로산，인도메타신，염화리소자임，에스트라디올，에티닐에스트라디올，푸로게스테론 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기항 산화·활성 산소 소거제로서는, 예를 들면，디부틸 히드록시 톨루엔，샐비어 엑기스，은행나무 잎 엑기스，월계수 엑기스 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 유지류로서는, 예를 들면，콩기름，옥수수 기름，올리브유，동백나무 기름，아몬드 기름，히마시 기름，땅콩 유，카카오 기름，팜 핵유，호호바유 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 왁스 류로서는, 예를 들면 꿀 왁스，사라시 꿀 왁스，고래 왁스，라놀린류 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 탄화수소류로서는, 예를 들면，유동 파라핀，와셀린，스쿠알렌，폴리에틸렌 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 지방산류로서는, 예를 들면，스테아린 산，리놀레산，라우린산，미리스틴산，파르미틴산，헤베닌 산，라놀린 산，올레인산，이소스테아린 산 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 알코올류로서는, 예를 들면，라우릴 알코올，세틸 알코올，스테아릴 알코올，라놀린 알코올，헥사 데실 알코올，소르비톨，프로필렌 글리콜，１，３－부틸렌 글리콜，에틸렌 글리콜 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 에스테르류로서는, 예를 들면，올레인산데실，스테아린산부틸，미리스틴산 미리스틸，라우린산 헥실，파르미틴산 이소프로필，미리스틴산 이소프로필，미리스틴산 옥틸 도데실，스테아린산글리세린，트리미리스틴산 글리세린 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 계면활성제로서는, 비이온성 계면활성제，음이온(anion)성 계면활성제，양이온성 계면활성제，양성 계면활성제 등을 사용할 수 있다. 또한, 대두 레시틴，노른자위 레시틴，사포닌，올리고 배당체，인지방질계 계면활성제，아실펩티드계 계면활성제，폴리옥시 에틸렌폴리옥시 프로필렌글리콜，폴리옥시 에틸렌 폴리옥시 프로필렌 세틸 에테르，폴리옥시 에틸렌 폴리옥시 프로필렌 브틸 에테르 등의 계면활성제를 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

상기 항료로서는, 예를 들면，멘톨，스페어민트 기름，페퍼민트 기름，유칼리 기름 등을 들 수 있고，이러한 １종을 단독으로 또는 ２종 이상을 조합하여 사용할 수 있다．

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

때죽나무(Styrax japonica)로부터 섬유아세포 재생능과 자외선 차단에 의한 피부의 노화방지 물질의 분리 때죽나무는 식물 분류학적으로 동정한 후 사용하였다. 그늘에서 건조한 때죽나무 654g을 잘게 썰어 메탄올로 80℃에서 4시간씩 3회 추출하였다. 그런 다음 상기 메탄올 추출물을 감압 농축하고 이 농축물 120.31g을 물에 녹인 후, 메틸렌 클로라이드를 추출용매로 선택하여 혼합한 후에 3회 추출하였다. 이를 수집하여 메틸렌 클로라이드 가용분획(13.98g)으로 하고 남은 잔사를 다시 에틸 아세테이트, 부탄올 등의 추출용매로 3회 추출하여 이들을 모아 각각 에틸 아세테이트(12.15g), 부탄올 가용분획(75.88g)으로 하였다. 그리고 남은 잔사를 물분획(2.90g)으로 얻었다.

상기와 같이 추출한 때죽나무의 각 유기용매에 대한 4개의 가용분획물 중에서 메틸렌 클로라이드 가용분획물(12.15g)이 자외선 차단 활성을 나타내었다.

따라서, 상기 메틸렌 클로라이드 가용분획물 중에서 4.0g을 취하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 실시하였다. 이 때 사용한 컬럼 용출액은 에틸 아세테이트, 이소 프로판올 및 물의 혼합비율이 각각 20%, 1%, 0.5%의 부피비율로 만든 혼합용매를 사용하여 7개의 소분획으로 나누었다.

7개의 소분획 중에서, 네번째의 소분획을 Toyopearl HW-40 크로마토그라피, 실리카겔 컬럼 크로마토그라피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피, RP-18 박층 크로마토그라피를 실시하여 화합물을 5mg 수득하였다.

[실시예 2] 때죽나무로부터 분리된 화합물의 구조결정

상기 실시예 1에서 얻은 화합물의 최종 분획물들을 메탄올에 용해시켜 자외선(UV) 분광기로 측정하였고, 화합물의 최종 분획물들을 KBr과 혼합하여 적외선(IR) 분광기로 측정하였다. 또한 25℃에서 메탄올 용액을 사용하여 선광도 [α]_D를 측정하였고, 500 ㎒(¹H)와 125 ㎒(¹³C)의 핵자기공명 스펙트럼을 측정하였으며, 각 피크의 화학 시프트(chemical shift)는 내부 표준물질인 트리메틸실란에 대한 상대값으로 나타내었다.

n-헥산으로부터의 백색 결정

m.p. 243-244℃

EI-MS m/z (rel.int.%): 484 (5), 466 (5), 234 (23), 203 (100)

¹H-NMR(CDCl₃, 500 MHz): 5.19 (1H, t, J=3.5 Hz, H-12), 4.51 (1H, dd, J =9.0,

8.0 Hz, H-3), 3.55 and 3.22 (each 1H, d, J=11.0 Hz, H-28), 2.05 (3H, s, OCO-CH3), 1.16 (3H, s, H-27), 0.96 and 0.94 (each 3H, s, H-29, 30), 0.89, 0.88 and 0.86 (12H, s, H-23, 24, 25, 26)

¹³C-NMR(CDCl₃, 125 MHz): 171.01 (OCOCH3), 144.21 (C-13), 122.27 (C-12),

80.90 (C-3), 69.70 (C-28), 55.24 (C-5), 47.49 (C-9), 46.41 (C-19), 42.33 (C-18), 41.71 (C-14), 38.26 (C-17), 37.70 (C-1), 36.83 and 36.81 (C-8, 10), 34.08 (C-21), 33.17 (C-29), 32.50 (C-7), 31.02 (C-20), 30.94 (C-22), 28.01 (C-23), 25.88 (C-27), 25.52 (C-15), 23.57, 23.54 and 23.52 (C-2, 11, 30), 21.99 (C-16), 21.29 (C-25), 18.23 (C-6), 16.72 (C-24), 16.67 (C-26), 15.56 (OCOCH3).

화합물은 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 트라이테르페노이드 골격을 가지고 있음을 알 수 있었다. ¹H-NMR 스펙트럼으로부터 δ 7.05, 6.82, 6.70, 6.65, 6.61, 6.60에서 3, 4 위치가 치환된 2개의 방향족환의 피크와 락톤 메틸렌 피크, 벤질 메틸렌 그룹의 특징적인 피크로부터 부티로락톤 타입의 트라이테르페노이드을 알 수가 있었다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 1개의 카르보닐 탄소와 3개의 메톡시 탄소가 있음을 알 수 있었다. 또한 장범위(long-range) ¹³C-¹H COSY에서 나타난 각각의 교차피크로 결합위치를 결정할 수 있었다.

한편, 화합물은 참고문헌 및 스펙트럼과의 비교분석을 한 결과, 화합물은 에르트로디알-3-아세테이트(erythrodiol-3-acetate)로 그 구조를 결정하였다.

[실시예 3] 때죽나무로부터 분리된 화합물의 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1) 합성억제와 교원질 합성증가

상기 실시예 1에서 추출한 화합물의 인체유래 섬유아세포에서 자외선 차단효과를 측정하였다 상기 화합물의 자외선 차단 및 노화방지 효과에 대한 유의성은 다음과 같은 과정을 통하여 결정하였다.

시험관상에서 인체 유래의 섬유아세포에 대한 각 화합물의 세포독성을 조사한 결과 시험농도에서는 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 이에 성인으로부터 얻은 피부세포를 배양하여 얻은 섬유아세포 배양액에 MMP-1 단백질, 즉 타입 I 프로콜라겐의 발현에 대한 각 화합물의 효과를 관찰하고자 하였다. 인체유래의 섬유아세포를 10마이크로몰씩 48, 72, 96시간 동안 처리하였고, 타입 I 프로콜라겐의 발현수준과 MMP-1의 발현정도를 특수 단백 검출 검사 분석(Western blot analysis)으로 측정하였다.

그 결과, 상기 본 화합물이 MMP-1을 유의성 있게 일관적으로 감소시켰고(표 1 참조) 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다(표 2 참조). 따라서, 상기 화합물이 자외선 차단에 의한 노화방지 효과가 있음을 알 수 있었다.

MMP-1 단백질 발현도

처리 농도(μM)	발현효과(%)
0	100
0.1	76.2 ± 13
1	67.5 ± 9
10	60.3 ± 12

타입 I 프로콜라겐 단백질 발현도

처리 농도(μM)	발현효과(%)
0	100
0.1	156.1 ± 11
1	192.4 ± 15
10	512.7 ± 18

또한 표 1 및 표 2의 결과에 따라서 인체유래의 섬유아세포에 UV를 조사하므로써 MMP-1 단백질의 발현정도를 동일 비처리군인 대조군(UV조사 안 한 것)과 화합물을 0.1, 1, 10μM의 농도로 처리한 다음 UV를 조사한 후 MMP-1의 발현량을 측정하였으며, 그 결과를 표 3, 도 2 에 나타내었다.

UV 조사에 의한 MMP-1 단백질의 발현도

처리 농도(μM)	발현효과(%)
0(-UV)	100
0(+UV)	459.9
0.1(+UV)	318.2
1(+UV)	332.2
10(+UV)	118.6

상기의 결과로, 본 발명에 의한 화합물이 자외선 조사로 증가하는 MMP-1 단백질의 발현을 억제함을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 교원질 합성증가와 교원질 감소억제를 통해 궁극적으로는 피부의 노화 방지 효과를 가질 수 있으며, 이들 활성과 관련된 기능성 화장품 및 기능성 식품의 원료로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 화합물을 때죽나무로부터 분리해내는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 2는 화합물의 자외선 노출에 의한 메트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 발현도이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염.

   화학식 1
2. 1) 때죽나무를 알콜로 추출하는 단계;

   2) 알콜 추출물을 메틸렌클로라이드로 추출하는 단계; 및

   3) 메틸렌클로라이드 추추물을 크로마토그래피하는 단계를 포함하여, 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 분리하는 방법.

   화학식 1
3. 제 1항의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 피부 노화 방지를 위한 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 교원질 합성 증가 또는 교원질 감소 억제를 위한 조성물.
5. 제 1항의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 화장품 조성물.