KR20050095608A

KR20050095608A - 어피니티 트랩 리액터, 및 그것을 이용한 앤지오스타틴과같은 단편의 사람 혈장으로부터의 일단계 정제 프로세스

Info

Publication number: KR20050095608A
Application number: KR1020057012889A
Authority: KR
Inventors: 게이지 하스미; 고스케 시미즈
Original assignee: 가부시키가이샤 티티시
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2003-01-17
Publication date: 2005-09-29

Abstract

본 발명은 지지체에 결합된 효소와 기질 간 반응이 사용된 효소와 기질의 종류에 따른 사용의 제약 없이 효과적으로 진행되도록 하는 어피너티 트랩 리액터를 제공한다. 본 발명은 효소 및 결합된 효소의 기질과 특이적으로 반응하는 분자를 갖는 지지체를 포함하는 어피너티 트랩 리액터; 및 플라스미노겐을 함유하는 생물학적 샘플을 바실로라이신 MA 및 라이신이 결합된 지지체를 포함하는 어피너티 트랩 리액터에 적용시키고, 칼슘 이온이 없는 조건 하에서 이소프로필 알코올의 존재하에서 0℃ 내지 50℃에서 반응시킴으로써, BL-앤지오스타틴을 얻는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내에 함유된 플라즈미노겐으로부터 단일 공정으로 BL-앤지오스타틴을 얻는 방법을 제공한다.

Description

어피니티 트랩 리액터, 및 그것을 이용한 앤지오스타틴과 같은 단편의 사람 혈장으로부터의 일단계 정제 프로세스 {AFFINITY TRAP REACTOR AND SINGLE-STEP PROCESS FOR PURIFYING ANGIOSTATIN-LIKE FRAGMENT FROM HUMAN PLASMA USING THE SAME}

본 발명은 프로테아제 등의 효소를 고정화한 어피니티 트랩 리액터에 관한 것이다.

혈관이 생성되는 것을 저해하는 물질은 암의 증식, 침윤, 전이를 억제하기 때문에, 항종양제로서 사용하는 용도가 기대되고 있고, 이러한 물질의 하나로서 앤지오스타틴이 알려져 있다. 앤지오스타틴은 혈액 중에 존재하는 선용인자인 플라스미노겐을 분해하여 얻을 수 있는 분자량 약 4O,000의 단백질이며, 동물 실험에서는 암에 대하여 극적인 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다(M.S.오렐리(M. S. O'Reilly) 외, 「셀」(Cel1), (미국), 1994년 10월 21일, 제79권, 제2호, p315-328 1 참조). 앤지오스타틴의 생산에는 (1) 플라스미노겐을 엘라스타제라고 하는 프로테아제로 가수분해하고 (M.S.오렐리(M. S. O'Reilly) 외, 「네이쳐 약품」(Nature Medicine), (미국), 1996년, 제2권, P689-692 참조), (2) 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에 직접 생산시키는(B. K. Sim 외 , 「캔서·리서치」(Cancer Research), (미국), 1997년, 제57권, p1329-1334 참조) 2 종류의 방법이 이용되고 있다. 이(1) 방법으로는 엘라스타제의 기질 특이성이 낮기 때문에, 부생성물이 많이 생겨 플라스미노겐으로부터 앤지오스타틴을 선택적으로 생성시키기가 곤란하다. 또한 얻을 수 있는 앤지오스타틴의 활성이 낮은 등의 결점이 있다. (2) 방법으로는 대장균에 의하여 생산되는 앤지오스타틴의 정제가 곤란하고, 비용도 든다. 또한, 용해성이 낮은 것도 문제가 있다. 이 때문에, 앤지오스타틴을 간편한 방법으로 고순도로 얻는 수단의 개발이 요구되고 있었다. 최근, Bacillus megaterium A9542 주가 생산하는 프로테아제인 바실로라이신 MA가, 플라스미노겐을 특이적으로 절단하여 신생 혈관 억제 작용을 가지는 앤지오스타틴 단편(주로 Glu¹-Ser⁴⁴¹, 이하, BL―앤지오스타틴이라 기재한다)와 혈전 용해 활성을 가지는 미니 플라스미노겐과 같은 단편(주로 Va1⁴⁴²-Asn⁷⁹¹)을 생성하는 것이 인정되었다(일본공개특허공보 2002-272453호 참조). 또한, 이 효소 바실로라이신 MA는 매우 안정적이므로, 담체에 고정하여 각종 용도로 이용할 수 있다. 이에 이러한 바실로라이신 MA의 특성을 이용하여, 바실로라이신 MA와 기질 플라스미노겐과의 반응과 그 결과 얻을 수 있는 생성물 BL 앤지오스타틴의 정제까지의 공정을 일단계로 행하고 고순도의 BL-앤지오스타틴을 얻는 방법, 및 그것을 행하기 위한 장치의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 각종 용도로 이용하는 프로테아제 등의 각종 효소를 반응에 이용하기 위하여 담체에 고정한 효소 고정화 리액터가 종래 제안되어 있다. 그러나, 프로테아제에 대하여는 고정된 프로테아제가 자기 소화에 의한 분해로 실활되기 쉽다. 또 프로테아제 등의 효소의 기질이 고분자인 경우, 공간적인 제한에 의하여 담체에 결합된 효소와 기질의 반응이 효율적으로 신속하게 진행되기 어렵다. 이러한 이유에서, 효소 고정화 리액터에 대하여서는 이용하는 효소와 기질의 종류에 따라서는 그 용도가 제한되어, 각종 효소 및 기질에 대하여 넓게 이용할 수 있는 효소 고정화 리액터의 개발이 기대되고 있었다.

본 발명자는 상기와 같은 결점이 없는 효소 고정화 리액터를 개발하는 동시에, 상기 바실로라이신 MA의 특성을 이용한 BL-앤지오스타틴의 생산 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 한 결과, 바실로라이신 MA 등의 효소, 및 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 모두 담체에 결합시키고 어피니티 트랩 리액터로 함으로써, 상기와 같은 결점이 없는 리액터를 얻을 수 있는 동시에, 효소로서 바실로라이신 MA를 고정하고, 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 Lys를 고정한 어피니티 트랩 리액터를 이용함으로써, 혈액 등의 생체 시료에 포함되는 플라스미노겐으로부터 BL―앤지오스타틴을 고효율로 그리고 신속하게 분해 정제하는 방법이 얻어지는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

도1은 플라스미노겐을 바실로라이신에 의하여 분해시킴으로써 얻어진 BL-앤지오스타틴의 전기영동도이다.

본 발명을 실시하게 위한 최선의 실시 형태

본 발명의 어피니티 트랩 리액터

본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 효소, 및 상기 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 결합, 고정시킨 담체로 이루어진다. 효소와 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자 모두를 담체에 결합시킴으로써, 효소의 기질이 상기 분자를 매개하여 담체에 트랩되어 결합된 결과, 입체적인 장해를 적게 받고, 기질과 효소가 국소적으로 농축되는 환경이 형성되기 때문에, 안정적이고 고효율로 신속하게 효소와 기질과의 반응이 진행된다.

본 발명의 어피니티 트랩 리액터에 고정되는 효소로서는 담체에 공유 결합에 의하여 고정할 수 있는 효소이면, 필요에 따라서 각종 효소를 이용할 수 있다.

프로테아제, 당질 분해 효소, 및 지방질 분해 효소 등을 포함한 가수분해 효소, 산화 환원 효소, 전이 효소, 제거 부가 효소, 이성화 효소, 합성 효소 등, 각종 효소를 이용할 수 있다.

또한 담체에 결합시키는 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자란, 저분자 리간드나 항원 항체 반응 등에 의하여, 효소 기질과 특이적이고 가역적으로 결합하는 분자이며, 담체와 결합할 수 있는 분자라면, 필요에 따라서 임의의 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, 효소의 기질, 및 목적으로 하는 반응 생성물에는 특이적으로 결합하지만, 부생성물에는 결합하지 않는 분자를 선택하여 결합시킴으로써, 효소 반응 후, 부생성물은 어피니티 트랩 리액터로부터 용이하게 제거되고, 목적 생성물만을 고순도로 회수할 수 있다. 이하에, 효소, 기질, 그것과 특이적으로 결합하는 분자의 예를 이하에 나타낸다.

효소	기질	기질과 특이적으로 결합하는 분자
바실로라이신 MA	플라스미노겐	라이신
바실로라이신 MA	프로트롬빈	히루딘, 항트롬빈 항체
트립신	프리프로인슐린	항인슐린항체, Fab 플라그먼트

상기에 나타낸 바와 같이, 담체에 결합시키는 효소가 Bacillus megaterium 4952 주가 생산하는 효소인 바실로라이신 MA인 경우, 이러한 분자로서는 라이신(Lys)을 바람직하게 이용할 수 있다. 이 경우, 라이신은 기질인 플라스미노겐 및 목적으로 하는 분해 생성물인 BL-앤지오스타틴과는 특이적으로 결합하지만, 부생성물인 미니플라스미노겐과는 결합하지 않는다. 이 때문에, 효소 반응 후, 부생성물은 담체에 결합되지 않고 어피니티 트랩 리액터로부터 제거되기 때문에, 목적 생성물만을 선택적으로 회수할 수 있다.

본 발명의 어피니티 트랩 리액터에 사용할 수 있는 담체로서는 어피니티 크로마토그라피에 있어서 통상 사용되고 있는 담체라면, 고정화하는 효소나, 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 종류, 성질에 따라, 당업자라면 적당히 선택, 사용할 수 있다. 이러한 담체로서는 예를 들면, 다공성 실리카 비즈 담체; 셀렉스(Cellex) AE, 셀렉스 CM, 셀렉스 PAB 등의 셀룰로오스계 담체(모두 셀바사(Selva) 제품); 세파로스(Sepharose) 2B, 세파로스 4B, 세파로스 6B 등의 아가로스계 담체(모두 팔마시아사 제품); 세파덱스(Sephadex), CM 세파덱스 등의 가교 덱스트란계 담체(모두 팔마시아사); 크로마겔 P, 엔자픽스 P-HZ, 엔자픽스 P-SH, 엔자픽스 P-AB 등의 가교 폴리 아크릴 아미드계 담체(모두 와코 퓨어 케미컬 인더스트리스사 제품) 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 안정성, 기계적 성질이 우수하고 리간드의 고정 가능화량이 많고, 비특정적 흡착성이 낮은 등의 이유에서, 비즈상의 담체인 세파로스 2B, 세파로스 4B, 세파로스 6B 등의 아가로스계 담체를 바람직하게 사용할 수 있다. 아가로스 겔을 사용하는 경우는 할로겐화시안(브롬화시안, 요오드화시안, 염화 시안 등)에 의하여 미리 활성화해 두는 것이 바람직하다.

또한, 상기 효소는 담체와 직접 결합되어 있어도 무방하나, 필요에 따라서, 스페이서기를 사이에 두고 결합되어 있어도 된다. 예를 들면, 담체와 효소를 직접적인 화학 결합으로 커플링시킬 수 없는 경우, 효소가 비교적 작은 분자이며 효소와 기질과의 결합을 완전하게 결합시키기 곤란한 등의 경우에, 스페이서기를 이용할 수 있다. 이러한 스페이서기는 당업자가 결합시키는 효소의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 한편, 바실로라이신 MA를 담체에 결합시키는 경우에는 스페이서는 특별히 사용하지 않아도, 이것을 담체에 용이하게 결합시킬 수 있다.

이하에, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터에 매우 적합하게 사용할 수 있는 담체, 효소, 그 기질, 기질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자 및 이용할 수 있는 스페이서기의 예를 들었으나, 본 발명의 어피니티 트랩 리액트는 이들에 한정되는 것은 아니다.

담체	효소	기질	기질과 특이적으로 결합하는 분자	스페이서
아가로스 겔	바실로라이신 MA	플라스미노겐	라이신	없음
아가로스 겔	바실로라이신 MA	프로트롬빈	히루딘항트롬빈 항체	없음
아가로스 겔	트립신	프리프로인슐린	항인슐린 항체Fab 플라그먼트	없음

본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 작성

본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 담체에 효소 및 상기 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 결합시킨 것이므로, 생화학 분야에서 사용되는 어피니티 크로마토그래피를 제조하는 방법을 응용함으로써, 당업자라면 용이하게 작성할 수 있다.

작성에 있어서는, 우선 사용하는 담체에 효소를 결합시킨다. 결합에 있어서는 필요에 따라서, 담체의 관능기를 활성화함으로써, 담체와 효소의 결합을 용이하게 한다. 예를 들면 담체로서 아가로스 겔을 이용하는 경우에는 미리 할로겐화 시안(브롬화 시안(cyanogen), 요오드화 시안, 염화 시안 등)으로 처리함으로써 아가로스 겔을 활성화한다. 활성화된 아가로스 겔도 시판되고 있으므로, 이것을 사용할 수도 있다.

필요에 따라서 활성화한 담체를 완충액으로 세정하고, 다음으로 동일한 완충액에 용해시킨 효소 용액으로 담체를 처리하고, 담체에 효소를 결합시킨다. 완충액에 포함되는 효소의 농도는 고정되는 효소의 종류에 따라 적당히 결정할 수 있다. 또한 여기서 사용하는 완충액의 조성, pH, 반응시간 등도, 고정하는 효소의 종류에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면 바실로라이신 MA를 담체에 고정하는 경우, 바실로라이신 MA 약 0.5 내지 10mg/m1, 바람직하게는 약 2.84 mg/ml를 포함한, pH 8 내지 9의 완충액(조성: 0.1M 탄산수소나트륨, pH 8.3, 그리고 약 0.5M NaCl, 약5% 이소프로필알코올을 포함한다)을 이용하여 약 2시간 반응시켰다.

다음으로 효소 용액을 흡인 등의 수단에 의하여 제거하고, 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 포함한 수용액으로 처리함으로써, 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 담체에 결합시킨다. 이 수용액에 포함되는 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 농도나 반응 시간은 분자의 종류에 의하여 적절하게 결정할 수 있다. 이와 같은 분자로서 라이신을 이용하는 경우, 라이신 염산염 약 0.1 내지 1M, 바람직하게는 약0.2M를 포함하는 약5% 이소프로필 알코올 수용액을 사용하여, 약 2시간 반응시킨다. 상기 반응은 모두 실온에서 행할 수 있다.

다음으로, 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 수용액을 흡인 등의 수단에 의하여 제거하고, 효소 및 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 결합시켜 후 세정함으로써, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 얻을 수 있다. 완충액의 종류는 고정하는 효소 및 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있으나, 바실로라이신 MA 및 라이신을 결합시킨 리액터의 경우, 20mM MES(2-〔몰폴리노〕에탄술폰산)Na-OH 완충액(pH 6.5)(완충액 B) 등의 완충액으로 세정할 수 있다. 상기 바실로라이신 MA 및 라이신을 결합시킨 리액터를 작성하는 각 공정에 사용하는 완충액 또는 수용액에 포함되는 이소프로필알콜 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약5%이다. 이소프로필알콜의 존재 하에서 상기 각 공정을 행함으로써, 담체에 고정된 효소의 실활(inactivation)을 방지하고, 효소를 안정적으로 장기간 유지할 수 있다.

또한, 상술한, 담체에 효소, 및 상기 효소의 기질과 특이적으로 결합시키는 분자를 결합시키는 순서와 관련하여서는 모두를 먼저 결합시키는 것도 가능하다.

이와 같이 하여 얻은 본 발명의 어피니티 트랩 리액터 0.01 내지 0.1%, 바람직하게는 약 0.02%의 소디움 아지드 중, 약 0 내지 5℃ 정도의 저온, 바람직하게는 약 4℃로 보존한다. 완충액의 종류는 적절하게 선택할 수 있다. 바실로라이신 MA 및 라이신을 결합시킨 리액터의 경우, 약 0.02% 소디움 아지드를 함유하는 20mM MES (2-〔몰폴리노〕에탄 술폰산)-NaOH 완충액 (pH6.5) 등의 완충액 중에서 보존할 수 있다. 이와 같이 소디움 아지드 용액 중, 저온에서 보존함으로써, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 효소를 실활시키지 않고, 장기에 걸쳐 안정적으로 보존할 수 있다.

본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 상기와 같은 구성으로 함으로써, 고정하는 효소와 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 종류에 제한되지 않고, 효소와 기질과의 반응을 고효율로, 또한 특이적으로 진행시킬 수 있다.

본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 사용

본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 이용하여, 소망하는 효소와 기질의 반응을 진행시키려면, 상기와 같이 조제한 본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 미리 완충액으로 평형화해 둔다. 완충액의 종류는 고정된 효소 및 기질과 특이적으로 결합하는 분자의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면 효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 경우, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약5%의 이소프로필 알코올을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH7.4)(완충액 C)를 이용할 수 있다.

다음으로 어피니티 트랩 리액터에 고정되어 있는 효소의 기질을 포함한, 생체 시료 등의 시료(혈액 등)를 원심분리함으로써 상정을 얻는다. 효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 경우에는 원심분리하기 전에, 혈장 등의 생체 시료에 미리 이소프로필 알콜을 얼음 상에서 첨가해둔다. 첨가 후의 이소프로필 알코올의 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약5%이다. 원심분리의 조건은 시료의 종류에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 얻어진 상정을 평형화시킨 본 발명의 어피니티 트랩 리액터에 첨가함으로써 생체 시료 중의 기질과 효소와의 반응을 진행시키고, 그 후 어피니티 트랩 리액터를 완충액으로 세정하고, 그 후 용출액을 첨가함으로써 효소 반응에 의하여 생긴 생성물을 용출시킨다. 세정에 사용하는 완충액으로서는 평형화에 이용한 완충액을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 경우, 약 0.5M의 NaCl을 포함한 상기 완충액 C로 세정한다. 용출액도, 효소, 기질의 종류에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 어피니티 트랩 리액터의 경우, 약 20OmM의 6―아미노헥산산을 포함하는, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약5%의 이소프로필 알콜 수용액을 용출액으로서 사용한다.

효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 어피니티 트랩 리액터의 경우, 상기 일련의 반응은 모두, 약 0 내지 50℃ 정도의 온도, 바람직하게는 약 4 내지 25℃의 온도로 행한다. 이러한 온도로 반응을 진행시킴으로써, 어피니티 트랩 리액터에 고정된 바실로라이신 MA는 자기 소화하지 않고 안정적으로 유지되는 한편, 플라스미노겐에 대한 바실로라이신 MA의 작용은 필요 최저한으로 확보되기 때문에, 효소 반응은 원활하고 특이적으로 진행된다. 또한 이러한 일련의 반응에 사용하는 각종 완충액에는 칼슘 이온을 함유시키지 않고, 칼슘 이온이 존재하지 않는 조건으로 각 반응을 진행시킨다.

사용 후의 본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 완충액으로 세정하고, 소디움 아지드를 포함한 완충액 중에서 보존한다. 완충액의 종류는 적절하게 선택될 수 있으나, 어피니티 트랩 리액터를 평형화하는데 이용한 완충액을 이용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 바실로라이신 MA를, 기질과 특이적으로 결합하는 분자로서 라이신을 결합시킨 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 경우, 약 1M의 NaC1, 약 200mM의 6-아미노헥산산을 함유하는 완충액 C로 세정하고, 약 0.02%의 소디움 아지드를 함유하는 완충액 C 중에서 보존한다. 이러한 조건으로 세정, 보존함으로써, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터는 수개월에 걸쳐, 반복 사용할 수 있다.

이상, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 작성법 및 사용법에 대하여 기재하였으나, 본 발명은 이 어피니티 트랩 리액터를 사용한, 생체 시료에 포함되는 플라스미노겐으로부터 BL-앤지오스타틴을 일단계로 얻는 방법에 관한 것이기도 하다.

본 방법은 플라스미노겐을 포함한 생체 시료를 바실로라이신 MA 및 라이신을 결합시킨 담체로 이루어지는 어피니티 트랩 리액터에 넣고, 약 0 내지 50℃, 바람직하게는 약 4 내지 25℃의 온도에서, 이소프로필 알콜의 존재하에, 칼슘 이온이 존재하지 않는 조건으로 반응시켜, BL-앤지오스타틴을 얻는다. 라이신은 기질인 플라스미노겐과 목적으로 하는 분해 생성물인 BL 앤지오스타틴 양자와는 특이적으로 결합하지만, 부생성물인 미니플라스미노겐과는 결합하지 않는다. 이 때문에, 효소 반응 후, 부생성물은 라이신을 사이에 두고 담체에 결합되지 않고 어피니티 트랩 리액터로부터 제거되기 때문에, 목적 생성물만을 선택적으로 회수할 수 있다.

이러한 특정 조건으로 본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 이용하여 효소 반응을 진행시킴으로써, 플라스미노겐으로부터 BL 앤지오스타틴을 일단계에서 고순도로 얻을 수 있다.

본 발명의 방법은 먼저 상세하게 기재한 본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 이용하여 먼저 기재한 본 발명의 어피니티 트랩 리액터의 사용법에 의하여 실시할 수 있다. 플라스미노겐으로부터 BL-앤지오스타틴을 일단계로 얻기 위한 구체적이고 상세한 조건은 이하의 실시예에 기재하는 바와 같으므로, 실시예의 기재에 기초하여 실시할 수 있다.

본 발명은 효소, 및 상기 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 결합시킨 담체로 이루어지는 어피니티 트랩 리액터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 생체 시료에 포함되는 플라스미노겐으로부터 BL-앤지오스타틴을 일단계로 얻는 방법으로서, 플라스미노겐을 포함한 생체 시료를 바실로라이신 MA 및 리신을 결합시킨 담체로 이루어지는 어피니티 트랩 리액터에 넣고, 약 0 내지 50℃, 바람직하게는 약 4 내지 25℃의 온도로, 이소프로필 알코올의 존재하, 그리고 칼슘 이온이 존재하지 않는 조건에서 반응시켜 BL-앤지오스타틴을 고순도로 얻는 방법에 관한 것이기도 하다.

이하에, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 기재된 것에 한정되는 것은 아니다.

예1. 바실로라이신 MA의 생산 및 정제 바실로라이신 MA는 Bacillus megaterium A9542 주(기탁 번호 FERM P-18268으로 경제 산업성 산업기술 종합연구소 생명공학 공업기술연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있음)로부터, 이하의 방법에 의하여 분리 정제하였다.

글루코스 1%, 전분 3%, 대두밀 1%, 펩톤 0.5%, 이스트 추출물 0.5%, CaCO₃ 0.2%, CB44 20.01%의 성분을 포함한 액체 배지(pH 7.0) 10Oml 포함하는 500ml용 삼각 플라스크로, Bacillus megaterium A9542 주를 28℃에서 6일간 진동 배양 후, 배양액 3리터를 세라이트를 사용하여 여과하고, 액 1리터를 H₂O로 5리터로 희석하고, 이소프로필 알코올을 최종 농도 5%(v/v)가 되도록 첨가하였다. 그 후, 20mM MES (2―〔N-몰폴리노〕에탄 술폰산)-NaOH 완충액(pH 6.5)/5% 이소프로필알코올로 평형화한 400ml의 카르복시메틸셀룰로스(CM-Ce11ulose, 생화학공업주식회사) 컬럼에 유속 15ml/분으로 주입하였다. 동일한 완충액 600ml로 세정한 후, 20mM MES/NaOH(pH 6. 5)/5% 이소프로필알코올/0.2M NaCl로 용출시켰다. 그 용출 획분을 60ml씩 분획하고, 활성이 인정된 획분을 모았다. 그 순도를 SDS-PAGE로 확인하고, 정제물 90mg을 얻었다.

예 2· 바실로라이신 MA 및 라이신을 고정한 본 발명의 어피니티 트랩 리액터 의 작성(리액터 10ml를 작성)

브롬화 시안으로 미리 활성화시켜 둔 아가로스 겔(세파로스 4B, 팔마시아사) 2.86g를]mM HC 용액 100ml로 현탁하고, 실온에서 15분간 교반하였다. 이를 컬럼으로 옮겨, 흡인하여 HCl 용액을 제거하고, 1mM HC1 용액 100ml로 3회, 다음으로 0.5 M NaCl, 5% 이소프로필 알코올을 포함한 완충액 A(0.1M 탄산수소나트륨, pH8.3) 75 ml로 1회 겔을 세정하였다. 2.84 mg/ml의 바실로라이신 MA용액을 같은 완충액 A로 작성하고, 그 17.6ml를 컬럼에 첨가하고, 실온에서 2시간 교반함으로써, 고정화 반응을 실시하였다. 반응 종료후, 흡인에 의하여 용액을 제거하고, 0.2M L-라이신 염산염을 포함한 5% 이소프로필알콜 용액(pH 8.0) 20ml를 첨가하고, 실온에서 2시간 교반함으로써 라이신의 고정화 반응을 실시하였다. 반응 종료후, 용액을 흡인에 의하여 제거하고, 5% 이소프로필 알코올을 포함한, 완충액 B(20mM MES(2-몰폴리노) 에탄 술폰산-NaOH) 500ml로 겔을 세정하고, 마지막으로 0.02% 소디움 아지드를 포함한, 상기 조성의 완충액 B중, 4℃에서 보존하였다.

예 3. 바실로라이신 MA/라이신 리액터를 이용한, 사람 혈장으로부터의 BL-앤지오스타틴의 일단계 정제 프로세스

구연산 처리한 사람 혈장 95ml에 이소프로필 알코올 5ml를 얼음 상에서 첨가하고, 30분간 방치한 후, 원심분리(22,000xg, 4℃, 1시간)에 의하여 상정을 얻고, 여과하였다. 이후의 조작은 모두 4℃에서 행하였다. 예2에서 작성한 본 발명의 바실로라이신 MA/라이신 리액터 10ml를, 5% 이소프로필알콜을 포함한 완충액 C (50 mM 인산나트륨, pH 7.4)로 평형화하였다. 평형화한 리액터에 상기 상정을 유속 1.5ml/분으로 첨가하였다. 그 후, 0.5M NaCl를 포함한 상기 조성의 완충액 C 200ml로 리액터를 세정하였다(3ml/분). 생성된 BL-앤지오스타틴의 용출은 200mM의 6―아미노헥산산을 포함하는 5% 이소프로필 알코올 용액 50ml로 행하였다. 그 결과, 대부분의 BL-앤지오스타틴은 10 내지 30ml의 용출액으로 용출되었다. BL-앤지오스타틴의 수량은 4.2mg이며, 순도는 95%였다.

또한, 사용후 리액터는 1M의 NaCl와 200mM의 6-아미노헥산산을 포함한 상기 조성의 완충액 C 50ml를 이용하여 4℃로 세정하였다. 그 후, 0.02% 소디움 아지드를 포함한 완충액 C 중, 4℃로 보존하였다. 이 상태로 세정, 보존한 리액터는 2개월 이상 반복하여 사용 가능하였다.

얻어진 BL-앤지오스타틴중 3μg를 정제수로 용해하여 10μl로 하고, 이것에 샘플 완충액 10μl (4% SDS, 10% 2-멜캅토에탄올, 20% 수크로스, 0.004% 브로모페놀 블루를 포함하는 125mM 트리스 염산 완충액 pH 6.8)을 첨가하고 그 중 15μl 7.5% 폴리아크릴 아미드 겔을 이용한 전기 영동으로 분획한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coumassie Brilliant Blue) R250로 염색하였다. 그 결과를, 도 1의 레인 2에 나타낸다.

도에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 이용하여 사람혈장 중 플라스미노겐으로부터 얻어진 BL-앤지오스타틴에는 플라스미노겐이나 부생성물 및 그 외의 혈장 단백질은 포함되지 않고, 고순도의 앤지오스타틴을 얻을 수 있었다.

비교예 1. 바실로라이신 MA에 의한 플라스미노겐의 분해 반응 바실로라이신 MA(5nM)과 플라스미노겐(3μM), 100mM NaCl, 0.Ol% Tween 80, 1mM CaCl₂를 포함한 5 OmM 트리스 염산 용액(pH 7.4)을 37℃에서 60분간 인큐베이트하였다. 그 후, 그 10μl를, 샘플 완충액(4% SDS, 10% 2-멜캅토 에탄올, 20% 수크로스, 0.004% 브로모페놀 블루를 포함한, 125mM 트리스 염산 완충액, pH 6.8) 10μ1에 첨가하고, 그 15μl를, 7.5% 폴리아크릴 아미드겔을 이용한 전기 영동으로 분획한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250로 염색하였다.

그 결과를, 도 1의 레인 1에 나타낸다.

도에 나타내는 바와 같이, 플라스미노겐을 바실로라이신에 의하여 직접 분해시킨 방법으로는 분해 생성물에 BL-앤지오스타틴 이외에, 미반응의 플라스미노겐이나 부생성물인 미니플라스미노겐이 포함되어 있고, 앤지오스타틴을 고순도로 얻을 수 없었다.

본 발명의 어피니티 트랩 리액터를 이용하면, 이용하는 효소와 기질의 종류에 의하여도 그 용도가 제한되지 않고, 담체에 결합한 효소와 기질의 반응이 효율적으로 진행된다. 또한 이 리액터를, 바실로라이신 MA와 라이신을 고정한 리액터로 함으로써, 바실로라이신 MA와 기질 플라스미노겐과의 반응과, 그 결과 얻을 수 있는 생성물 BL―앤지오스타틴의 정제까지의 공정을 일단계로 실시할 수 있다.

Claims

효소, 및 그 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자를 결합시킨 담체로 이루어지는 어피니티 트랩 리액터.
제1항에 있어서, 효소가 프로테아제인 어피니티 트랩 리액터.
제2항에 있어서, 효소가 바실로라이신 MA이고, 효소의 기질과 특이적으로 결합하는 분자가 라이신인 어피니티 트랩 리액터.
생체 시료에 포함되는 플라스미노겐으로부터 BL-앤지오스타틴을 일단계로 얻는 방법으로서, 플라스미노겐을 포함한 생체 시료를 바실로라이신 MA 및 라이신을 결합시킨 담체로 이루어지는 어피니티 트랩 리액터에 넣고, 0 내지 50℃의 온도에서, 이소프로필 알코올의 존재하에, 칼슘 이온이 존재하지 않는 조건으로 반응시켜 BL-앤지오스타틴을 얻는 방법.