KR20050058665A

KR20050058665A - Ｍ37 리파제, 이를 생산하는 포토박테리움속 ｍ37 균주 및상기 효소의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR20050058665A
Application number: KR1020030090612A
Authority: KR
Inventors: 이정기; 류형석; 김형권; 최원찬; 오태광; 한남수; 김영옥
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-17
Also published as: KR100575211B1

Abstract

본 발명은 리파제(lipase) 효소, 이를 생산하는 균주 및 상기 효소의 대량 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비이온성 계면활성에 의해 가수분해활성이 증가하는 서열번호 1로 기재되는 M37 리파제 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 대장균, 상기 효소를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주 및 형질전환 대장균을 이용한 M37 리파제의 대량 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 M37 리파제는 저온에서도 효과적으로 지질을 분해할 수 있으므로, 세제첨가제, 계면활성제 및 수질개선제로 이용뿐만 아니라 특정한 에스테르 결합 화합물의 합성으로 제약산업 등에 널리 활용될 수 있다.

Description

Ｍ37 리파제, 이를 생산하는 포토박테리움속 Ｍ37 균주 및 상기 효소의 대량 생산방법{M37 lipase, Photobacterium sp. M37 strain producing the same, and mass-produnction thereof}

본 발명은 리파제(lipase) 효소, 이를 생산하는 균주 및 상기 효소의 대량 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비이온성 계면활성에 의해 가수분해활성이 증가하는 M37 리파제 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자로 형질전환된 대장균, 상기 효소를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주 및 형질전환 대장균을 이용한 M37 리파제의 대량 생산방법에 관한 것이다.

리파제 효소는 생체내의 각종 대사반응을 촉진시키는 세포내 효소촉매로서 널리 연구되어 왔을 뿐만 아니라, 산업용 효소로서 각종 생물전환 반응에서 이용되고 있다. 이와 같이 산업적으로 중요시되는 이유는 제약산업에 널리 쓰이는 키랄(chiral) 소재에 에스테르(ester) 결합이 많이 포함되어 있기 때문이다. 비대칭 화학합성법으로 에스테르 화합물을 합성하는 경우, 최고 700 psi의 고압과 250℃ 이상의 고온에서 반응이 진행되기 때문에 에너지가 많이 소모되며 품질에 좋지 않은 영향을 미치는 여러 가지 부반응이 일어날 뿐만 아니라, 전환율 및 광학순도가 낮아 고순도의 키랄 화합물의 생산에 어려움이 있다. 반면에 리파제를 이용한 생물전환 공정은 효소 고유의 위치특이성과 입체특이성 및 다양한 기질특이성을 지니고 있어서 고순도의 키랄 소재를 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 최근 효소를 이용한 이상계, 미수계, 비수계 및 역상계의 효소반응계가 개발됨에 따라 고부가 가치의 키랄 소재의 제조에 에스터라제(esterase)/리파제 효소촉매가 점차 널리 이용되고 있다(민태익 편저, 산업과 미생물, 1998년 3월 21일 초판, 한림원).

에스터라제/리파제는 다양한 동물, 식물 및 미생물로부터 생산되고 있는데, 이중에서도 미생물 효소가 효소생화학적으로 가장 다양하며, 많은 효소가 산업적으로 유용한 특수기능을 지니고 있다. 리파제는 그 생산기원에 따라서 고유의 특수기능을 갖고 있기 때문에 산업적 활용시에 효소의 생화학적 특성을 신중히 고려해야 한다.

최근 장시간의 효소 반응 공정에서 그 활성을 잃지 않으며, 저온, 고온, 알칼리, 유기용매, 계면활성제 처리 등의 열악한 반응 환경에서도 높은 활성을 보이는 리파제의 탐색과 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히, 세제첨가제로 사용되거나 고온에서 불안정한 물질의 합성을 위해서는 저온성과 계면활성제 내성 등의 특성을 갖는 리파제가 요구된다. 그러나, 현재까지 개발된 대부분의 리파제의 경우, 저온에서 효소의 활성이 매우 약하며, 비이온성 계면활성제에 의해 효소의 활성이 대부분 실활된다.

이에, 본 발명자들은 계면활성제에 의해 활성화되고, 저온에서도 효소의 활성이 우수한 신규한 리파제 생산균주를 탐색하고자 연구를 수행한 결과, 신규한 리파제를 생산하는 포토박테리움속 M37(Photobacterium sp. M37)을 분리하고, 이 균주로부터 생산되는 리파제를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 아미노산 서열을 분석한 결과 기존에 보고된 미생물이 생산하는 리파제를 코딩하는 아미노산 서열과 20% 이하의 상동성을 나타내는 신규 단백질임을 확인하고, 상기 리파제의 산업적 이용을 위해 상기 유전자의 대량생산용 플라스미드를 제조하고 이를 도입한 형질전환된 대장균으로부터 M37 리파제를 대량으로 분리ㆍ정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 리파제(lipase) 효소, 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비이온성 계면활성에 의해 가수분해활성이 증가하는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 M37 리파제(lipase) 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 효소를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 M37 리파제를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환 대장균을 배양하고, M37 리파제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 단계; 및 상기 배양된 대장균으로부터 M37 리파제를 분리ㆍ정제하는 단계를 포함하는 상기 M37 리파제의 대량 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 비이온성 계면활성에 의해 가수분해활성이 증가하는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 M37 리파제(lipase) 효소를 제공한다.

본 발명의 서열번호 1로 기재되는 M37 리파제 효소는 비이온성 계면활성제에 의해 활성이 증가하고 저온에서도 높은 효소 활성을 가지고 있으며(20 내지 40℃의 온도범위에서 최적활성), 트윈(Tween) 60을 처리하면 기질에 대한 가수분해 활성이 증가하는 신규한 효소이다. 따라서, 본 발명의 M37 리파제는 다양한 반응 조건에서 생물전환반응을 수행할 수 있으며, 공정과정 동안 효소가 계면활성제에 의해서 불활성화 되지 않는 장점을 갖고 있다.

본 발명의 M37 리파제는 포토박테리움속 M37 균주로부터 유래한 것이다. 상기 균주의 리파제를 코딩하는 약 1.6 kb의 게놈 유전자의 염기서열의 ORF에 따라 서열번호 1로 기재되는 340개의 아미노산으로 구성되는 38,026 Da 분자량의 단백질이 코딩된다(서열번호 1 참조).

본 발명의 M37 리파아제는 활성부위가 세린(serine), 히스티틴(histidine), 아스탐산(aspartic acid)의 세 아미노산 잔기로 이루어진 세린 프로테아제(serine protease) 계열의 효소이며, 특히 일반적인 리파아제가 활성부위의 세린(serine) 잔기를 포함한 아미노산 서열이 Gly-X₁-Ser-X₂-Gly로 이루어지는 것과 유사하게 본 발명의 M37 리파아제는 서열번호 2로 기재되는 Gly-His-Ser-Lys-Gly 서열로 구성되어 있다.

본 발명의 M37 리파제를 구성하는 아미노산 서열은 기존에 보고된 미생물 유래의 리파제와는 상동성을 나타내지 않으며, 단지 아라비롭시스 탈리아나(Arabilopsis taliana) 유래의 추정 리파제의 아미노산 서열과 20% 이하의 상동성을 보이는 신규한 저온성 효소이다(도 5 참조).

본 발명의 M37 리파제는 최적 pH가 9.0이고, pH 5 내지 9까지의 넓은 범위에서 안정하다(도 9c 및 도 9d 참조). 또한, 효소 활성에 미치는 온도의 영향은 20 내지 40℃의 넓은 범위에서 최적활성을 나타내고, 5℃에서도 최적 효소활성의 88% 이상의 높은 활성을 나타낸다(도 9a 및 도 9b 참조). 또한, 본 발명의 M37 리파제는 비이온성 계면활성제에 의해 활성이 2 내지 3배 정도 증가하며, 담즙산인 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 타우로콜레이트(taurocholate)의 처리시에 활성이 3배 정도 증가된다(표 1 참조).

또한, 본 발명의 M37 리파제는 철 이온을 제외한 대부분의 금속이온에 의해 활성이 저해되지 않는다. 흔히 효소 저해제로 사용되는 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), DTT(1,4-dithiothreitol), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 등에 의해서 상기 M37 리파제의 활성은 거의 저해되지 않는다(표 2 참조). 또한, 본 발명의 M37 리파제는 기질로 이용되는 트리글리세리드(triglyceride) 중에서 짧은 사슬을 가진 트리부티린(tributyrin; C4)에 대한 활성이 현저하게 높고, 긴 사슬을 가진 트리카프리린(tricaprylin; C8), 트리미리스트린(trimyristin; C14), 트리스테아린(tristearin; C18)에 대해서는 아주 낮은 효소 활성을 보인다. 그러나, 이중결합을 하나 가지는 트리올레인(triolein; C18:1) 등 불포화 지방산을 다량 함유한 맥아유, 아마인유, 면실유에 대하여 특히 강한 활성을 나타낸다(도 10 및 표 3 참조).

또한, 본 발명은 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다. 이때, 상기 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하고, 상기 재조합 발현벡터는 pUML37 벡터 또는 pEML37 벡터인 것이 바람직하다. 또한 상기 형질전환된 대장균은 pEML37 벡터로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pEML37 또는 pUML37 벡터로 형질전환된 E. coli XL1-Blue/pUML37인 것이 바람직하다.

서열번호 1로 기재되는 상기 리파제를 코딩하는 유전자의 염기서열은 모두 1023개 염기로 구성되며(서열번호 3 참조), 이때, 상기 단백질의 아미노산을 코딩하는 유전자의 시작 코돈은 1번째 염기(ATG)에서 시작된다. 또한, 종료 코돈인 1021-1023번 염기인 TAA 코돈에서 상기 단백질의 코딩이 종료된다.

본 발명자들은 pUC118 플라스미드에 포토박테리움속 M37 균주의 염색체 DNA로부터 M37 리파제를 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 1.6 kb의 유전자를 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 pUML37 벡터라 명명하였다(도 4 참조). 또한, 상기 재조합 pUML37 벡터의 염기서열을 분석하여 1023 bp의 ORF(open reading frame)를 확인하였다(서열번호 3 참조). 또한, 상기 pUML3 벡터로 대장균 XL1-Blue의 형질전환을 수행하여 대장균 XL1-Blue/pUML37를 제조하였다.

또한, T7 프로모터를 갖는 pET-22b(+) 플라스미드에 상기 M37 리파제를 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 1.6 kb의 유전자를 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 pEML37 벡터라 명명하였다(도 6 참조). 상기 pEML37 벡터로 T7 RNA 중합효소를 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)에 상기 pEML37 벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이를 E. coli BL21(DE3)/pEML37로 명명하였다.

또한, 본 발명은 상기 효소를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주를 제공한다. 이때, 상기 균주는 포토박테리움속 M37인 것이 바람직하다.

본 발명자들은 서해안 계화도 갯벌로부터 계면활성제에 안정하며 저온에서도 높은 효소 활성을 갖는 리파제를 생산하는 균주를 분리하고, 이중에서 가장 높은 리파제 활성을 나타내는 미생물을 M37로 명명하였다(도 1 참조).

본 발명의 상기 M37 균주는 형태학적 특징으로 운동성이 있으며 그람 음성이고 간균의 형태이고, 아울러 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 균주를 동정하였다(서열번호 4 참조). 그 결과, 기타 유연관계의 해양 미생물과 상기 M13 균주의 16S rDNA의 염기서열을 비교한 결과, 상기 M37 균주는 포토박테리움속의 미생물과 97%의 상동성을 나타낸다(도 2 참조). 또한, 상기 M37 균주는 3 내지 4.5% 염농도에서 생육이 극대화되는 호염성 균주이다(도 3 참조).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 상기 M37 균주가 포토박테리움속에 속한다는 결론을 내리고, 포토박테리움속 M37(Photobacterium sp. M37)이라 명명하였으며, 이를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 12월 8일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10562BP).

이때, 상기 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하고, 재조합 발현벡터는 pEML37 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 형질전환 대장균은 E. coli BL21(DE3)/pEML37을 사용하는 것이 바람직하고, 유전자의 발현은 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 이루어지는 것이 보다 바람직하고, 15 ℃ 내지 20 ℃의 저온에서 상기 형질전환 대장균을 추가적으로 배양하는 것이 가장 바람직하다. 또한, M37 리파제를 분리ㆍ정제는 Ni-NTA 칼럼을 이용하고, 이미다졸 용액으로 용출하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 상기에서 제조한 형질전환 대장균 XL1-Blue/pUML37으로부터 M37 리파제의 발현량이 낮으므로, 상기 효소를 대량생산하기 위하여 강력한 T7 프로모터를 갖는 pET-22b(+)를 플라스미드를 이용하였다.

구체적으로, 재조합 벡터는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 이용하여, PCR을 수행하여 M37 리파제를 코딩하는 유전자를 증폭하고, T7 프로모터를 함유하는 pET-22b(+) 플라스미드에 상기 M37 리파제를 코딩하는 서열번호 3으로 기재되는 유전자를 삽입하여 대량생산용 재조합 pEML37 벡터를 제조하였다(도 6 참조).

또한, 형질전환 대장균은 T7 RNA 중합효소를 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)에 상기 pEML37 벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 본 발명자들은 상기 형질전환체를 E. coli BL21(DE3)/pEML37로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 2003년 12월 8일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10563BP).

아울러, 상기 유전자의 발현은 상기 형질전환 대장균을 배양하고, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)을 첨가하여 리파제를 코딩하는 유전자를 발현시켰다. 상기 유전자의 발현을 유도한 후, 상기 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37을 추가적으로 37℃, 28℃ 또는 18℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 균체를 원심분리하여 수용성 단백질을 분리하였다(도 7 참조). 그 결과, 18℃에 추가적 배양에서 상기 수용성 단백질내 리파제의 활성이 30,000 U/ℓ로 최대활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, M37 리파제의 분리ㆍ정제는 상기 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37이 생산하는 M37 리파제는 C-말단에 히스티딘-꼬리표(His-tag)를 갖고 있으므로, Ni-NTA 칼럼을 이용한 이미다졸 용액으로 단백질을 용출시켜 순수한 M37 리파제를 분리하였다(도 8 참조).

본 발명자들은 상기의 방법으로 형질전환 E. coli BL21(DE3)/pEML37에서 M37 리파제의 고발현 실험을 수행한 결과, 리터당 30,000 units의 M37 리파제를 고생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환 E. coli BL21(DE3)/pEML37로부터 최종적으로 정제한 M37 리파제의 비활성은 125 U/㎎이고, 대부분의 비이온성 계면활성제에 대해 안정할 뿐만 아니라 계면활성제에 의해 효소의 활성이 증가됨을 확인하였다.

따라서, 현재 에스테르 결합과 관련된 효소촉매인 에스터라제 및 리파제의 경우, 화학촉매에 비해 가격이 높기 때문에 일부 고부가가치의 물질전환을 제외하고는 사용하기 어려운 실정을 고려하면, 상기에서 설명한 본 발명의 상기 대량 발현시스템을 이용한 M37 리파제의 고발현에 의한 대량생산에 의하여 산업 전반에 M37 리파제의 경제적인 공급이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 리파제를 생산하는 미생물의 분리

리파제 생산균주를 분리하기 위하여, 본 발명자들은 서해안의 궁항과 계화도 갯벌에서 스크리닝 하였다(도 1).

구체적으로, 일반적인 토양 미생물과 구분하기 위하여, 3%의 소금이 함유된 배지에서도 생육하고 리파제 기질인 트리카프리린(tricaprylin; C8)이 함유된 배지에서 투명환을 생성하는 미생물을 상기 지역에서 분리한 후, 이를 액체 배양하여 배양 상층액의 리파제 활성이 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다(도 1).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 상기 리파제 활성이 가장 우수한 균주를 M37이라 명명하였다.

<실시예 2> M37 균주의 동정

상기 실시예 1에서 분리된 M37 균주의 분리 및 동정을 실험을 수행하였다.

그 결과, M37 균주의 형태학적 특징으로 운동성이 있으며, 그람 음성이고, 간균의 형태를 나타내었다.

또한, 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과(서열번호 4), 상기 M37 균주는 포토박테리움속의 미생물과 97%의 상동성을 나타냄을 확인하였다(도 2).

이에, 본 발명자들은 상기 분리된 M37 균주가 포토박테리움속(Photobacterium sp.)에 속하다는 결론을 내리고, 포토박테리움속 M37(Photobacterium sp. M37)이라 명명하였다. 그리고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 12월 8일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10562BP).

<실시예 3> 미생물의 염농도에 따른 생장변화

상기 실시예 2에서 동정된 해양미생물인 본 발명의 포토박테리움속 M37의 염농도에 따른 생육을 알아보기 위하여, LB 배지에 바다염 농도를 0 내지 6%까지 농도를 달리하여 균의 생육을 건조균체량으로 나타내었다(도 3). 비교대상으로는 일반적으로 해양미생물 배양시 이용되는 배지인 마린 브로스 2216(Marine broth 2216, Difco)을 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 포토박테리움속 M37 균주는 염농도가 1 %가 되기 전까지는 전혀 생육을 하지 못하였으며, 1% 이상의 염농도에서부터 빠른 생장을 하기 시작하여 3 내지 4.5% 염농도에서 생육이 극대화되는 것을 관찰하였고, 5% 이상의 염농도에서는 생육이 급격히 저해되는 것을 확인하였다(도 3).

<실시예 4> 리파제 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열결정

<4-1> 형질전환용 벡터의 제조

본 발명의 포토박테리움속 M37 균주의 염색체 DNA를 제한효소 Sau3 AI을 이용하여 2 내지 7 kb의 DNA 절편으로 완전히 절단한 후, 상기 DNA 절편을 제한효소 Bam HI으로 미리 절단한 3.2 kb의 pUC118 플라스미드(Takara사에서 구입)와 연결(ligation)하여 다양한 길이의 형질전환용 벡터를 제조하였다.

<4-2> 형질전환 대장균의 제조 및 pUML 37 벡터의 분리

상기 실시예 <4-1>에서 제조된 형질전환용 벡터로 대장균 XL1- Blue(Stratagene 사에서 구입) 적합 세포(competent cell)의 형질전환(electro-transformation)을 수행하였다. 구체적으로, 일렉트로포레이션(electrophoration)을 위하여 제조된 상기 숙주의 적합 세포를 포함한 60 ㎕를 연결 혼합액(ligation miture)과 혼합한 후, 상기 혼합액을 미리 냉각시켜둔 0.1 ㎝의 E. coli 펄서 큐벳(Pulser cuvette)에 옮겨 1분 동안 얼음에 방치하였다. 상기 큐벳을 E. coli 펄서 기구(Pulser apparatus, Bio-rad)를 사용하여 2.5 ㎸로 통전하여 일레트로포레이션을 수행하여 형질전환시켰다. 이후 상기 형질전환체를 포함한 혼합액에 1 ㎖의 LB 배양액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 앰피실린(ampicillin)이 들어있는 99%의 1,2,3-트리옥타노글리세롤(1,2,3-Trioctanoylglycerol)을 포함하는 TCN 배지(Sigma)에 30 ~ 100 ㎕씩 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

그 결과, 리파제 기질인 트리카프리린(tricaprylin; C8)이 함유된 배지에서 상기 기질을 분해하여 투명환을 생성하는 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니를 형성하는 재조합 대장균을 대장균 XL1-Blue/pUML37라 명명하였다.

상기 대장균 XL1-Blue/pUML37으로부터 플라스미드를 분리하여 분석한 결과, 3.2 kb의 pUC118 벡터 DNA에 1.6 kb의 외래 DNA가 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 1.6 kb의 외래 DNA를 갖는 재조합 벡터를 pUML37 벡터라 명명하였다(도 4).

<4-3> pUML 37 벡터로부터 리파제를 코딩하는 유전자의 서열분석

상기 실시예 <4-2>로부터 분리한 리파제를 코딩하는 유전자의 DNA 단편이 삽입된 재조합 pUML37 벡터의 염기서열을 분석하고, 'DNAstar'의 'ORF search' 프로그램을 통하여 1023 bp의 ORF(open reading frame)를 확인하였다(서열번호 3). 상기 ORF는 340개의 아미노산을 코딩할 수 있으며, 상기 아미노산의 분석 결과 약 38,026 Da의 분자량으로 계산되는 리파제를 코딩하는 것으로 분석되었다(서열번호 1).

'NCBI'의 'BLAST'프로그램을 이용해서 'Swissprot' 데이터베이스에 있는 기존 단백질의 아미노산 서열과 비교해 본 결과, 본 발명의 포토박테리움속 M37 유래의 리파제는 기존의 미생물 유래의 리파제와는 거의 상동성을 나타내지 않았으며, 단지 아라비롭시스 탈리아나(Arabilopsis taliana) 유래의 추정 리파제의 아미노산 서열과 20%의 낮은 유사성을 가지는 것을 확인함으로써 종래에 알려지지 않은 신규한 효소로 판정하고, 이를 M37 리파제라 명명하였다(도 5).

<실시예 5> M37 리파제 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 제조 및 이를 이용한 형질전환 대장균에서 M37 리파제의 고발현

본 발명의 M37 리파제는 비이온성 계면활성제에 의해서 효소의 활성이 증가하고 20 내지 40℃의 온도범위에서 최적활성을 보이기 때문에, 다양한 반응 조건에서 생물전환반응을 수행할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 공정 과정 동안 효소가 계면활성제에 의해서 불활성화 되지 않기 때문에 매우 유리하다.

그러나, 상기 실시예 <4-2>에서 제조된 형질전환 대장균 XL1-Blue/pUML37으로부터 M37 리파제의 발현량이 낮았다. 따라서, 상기 효소를 대량 생산하기 위하여, 하기의 실시예와 같은 강력한 T7 프로모터를 갖는 pET-22b(+) 플라스미드에 상기 M37 리파제를 코딩하는 유전자를 삽입한 재조합 발현벡터로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 고발현 실험을 수행하였다.

<5-1> 고발현 발현벡터 및 형질전환 대장균의 제조

M37 리파제를 코딩하는 유전자의 증폭을 위하여, 서열번호 3에 기초한 DNA 염기 배열로부터 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 2개의 프라이머를 제조하였다. 상기 프라이머와 Taq DNA 폴리머라제(솔젠트 사에서 구입)를 이용한 PCR을, 95℃에서 1분 동안 변성(denaturation), 55℃에서 1분 동안 결합(annealing) 및 75℃에서 1분 동안 신장(polymerization)의 사이클을 30회 반복 수행함으로써 1,023 bp의 리파제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

또한, T7 프로모터를 함유하는 pET-22b(+) 벡터(Novagen 사에서 구입)에 상기 M37 리파제를 코딩하는 유전자를 삽입하기 위하여, 제한효소 Nde I과 Hind Ⅲ으로 상기 합성된 유전자의 DNA 양끝을 절단한 후, 동일한 제한효소로 미리 절단한 대량생산용 벡터 pET-22b(+)에 상기 유전자를 연결(ligation)함으로써 대량 생산용 재조합 발현벡터 pEML37을 제조하였다(도 6).

또한, T7 RNA 중합효소를 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)에 상기에서 제조한 pEML37 발현벡터를 도입시켜 형질전환체를 제조하였다. 본 발명자들은 상기 형질전환체를 E. coli BL21(DE3)/pEML37로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 2003년 12월 8일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10563BP).

<5-2> T7 프로모터를 이용한 M37 리파제의 고발현

<5-2-1> IPTG 유도후 저온배양을 실시하지 않은 경우의 수용성 리파제 단백질의 생산

본 발명자들은 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 형질전환 대장균을 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 함유한 LB 배지를 사용하여 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀에서 흡광도가 0.5에 도달할 때까지 배양하고, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 최종농도 0.5 mM 되도록 첨가하여 M37 리파제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하고, 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 균체를 원심 분리하였다. 균체를 초음파로 분쇄하여 원심분리한 후, 수용성 단백질에 대한 12% SDS-PAGE을 수행한 결과 전체 단백질 중 리파제 함량이 매우 낮았다.

<5-2-2> IPTG 유도후 저온배양를 통한 수용성 리파제 단백질의 생산

본 발명자들은 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 형질전환 대장균을 100 ㎍/㎖의 암피실린을 함유한 LB 배지를 사용하여 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀에서 흡광도가 0.5에 도달할 때까지 배양하고, IPTG를 최종농도 0.5 mM 되도록 첨가하여 M37 리파제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하고, 37℃, 28℃ 또는 18℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균체를 원심분리하였다. 상기 균체를 초음파로 분쇄하고 다시 원심분리한 후, 수용성 단백질에 대한 12% SDS-PAGE을 행한 결과 18℃에서 가장 많은 양의 수용성 단백질이 생산됨을 확인하였다(도 7). 즉, 상기 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37의 경우 18℃에서 24시간 동안 추가적으로 배양한 후, 리파제의 활성이 30,000 U/L로 최대 활성을 나타내었다.

<실시예 6> 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37에서 리파제 단백질 분리ㆍ정제

형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37이 생산하는 M37 리파제는 C-말단에 히스티딘-꼬리표(His-tag)를 갖고 있으므로. 이하의 간단한 방법으로 순수 분리하였다.

0.5 mM IPTG 처리 후 24시간 동안 배양해서 얻은 균체를 초음파 분쇄법으로 파쇄한 후에 원심분리를 통해 상층액을 얻고, 이를 20 mM의 이미다졸(imidazole), 300 mM의 NaCl를 포함한 50 mM의 인산완충액(pH 7.0)으로 투석하였다. 그 후, Ni-NTA 컬럼(Qiagen 사에서 구입)의 상단에 상기 효소를 포함한 단백질 용액을 로딩(loading)한 후, 동일 완충액으로 컬럼을 깨끗이 세척하였다. 충분히 컬럼을 세척한 후, 이미다졸 농도를 200 mM로 높인 동일 완충액으로 상기 컬럼에 결합된 M37 리파제를 용출시킴으로써 M37 리파제를 순수하게 분리하였다(도 8).

<실시예 7> M37 리파제의 온도와 pH 특성실험

본 발명의 M37 리파제의 온도와 pH의 특성을 확인하였다.

다양한 pH에서 리파제의 활성을 측정한 결과, 최적 pH는 9.0인 것을 확인하였으며, 다양한 pH에서 1시간 동안 상기 리파제를 방치한 후, 남아있는 활성을 측정한 결과, pH 5 내지 9까지의 넓은 범위에서 안정한 것을 확인하였다(도 9c 및 도 9d).

또한, M37 리파제의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 조사한 결과, 상기 효소는 20 내지 40℃의 넓은 범위에서 최적활성을 나타내었고, 5℃에서도 최적 효소활성의 88%가 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 리파제의 열안정성을 측정하기 위하여, 다양한 온도에서 30분간 방치한 후 25℃에서 효소 활성을 측정한 결과 30℃까지 안정한 저온성 효소임을 확인하였다(도 9a 및 도 9b).

<실시예 8> M37 리파제의 계면활성제에 대한 영향

본 발명의 M37 리파제 활성에 대한 계면활성제의 영향을 검토하기 위하여, 각종 계면활성제를 1%(v/v)이 되도록 효소액에 첨가하여 상온에서 30분간 방치하여 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 비이온성 계면활성제에 의해서 상기 M37 리파제의 활성이 2 내지 3배 정도 증가하였으며, SDS와 같은 음이온성 계면활성제는 효소의 활성을 감소시켰다. 그리고, 담즙산인 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 타우로콜레이트(taurocholate)도 상기 리파제의 활성을 3배 가량 증가시켰다(표 1).

계면활성제	상대적 가수분해력 (%)
None	100
Na-deoxycholate	237
SDS	7
Taurocholate	277
Triton X-100	160
Tween 20	220
Tween 40	170
Tween 60	247
Tween 80	187

<실시예 9> M37 리파제 활성에 대한 금속이온 및 저해제의 영향

M37 리파제 활성에 대한 금속이온과 저해제의 영향을 알아보기 위하여, 최적의 효소 활성조건인 25℃, pH 8.0에서 4분간 효소 활성도를 측정하였다.

그 결과, 철 이온을 제외하고는 대부분의 금속이온에 의해 활성이 저해되지 않았다. 효소 저해제로 흔히 사용되는 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), DTT(1,4-dithiothreitol), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 등에 의해서 본 발명의 M37 리파제 활성이 크게 저해 받지 않았다(표 2).

시약	농도	상대적 가수분해력 (%)
None	1 mM	100
PMSF	1 mM	89
EDTA	1 mM	96
CaCl₂	1 mM	86
CuCl₂	1 mM	79
MgCl₂	1 mM	89
FeSO₄	1 mM	29
ZnCl₂	1 mM	71
MgSO₄	1 mM	86
DTT	1 mM	95
β-머캅토에탄올	1%	104

<실시예 10> M37 리파제를 이용한 트리글리세리드, 천연지방 및 천연유지의 분해

본 발명의 M37 리파제를 이용한 트리글리세리드에 대한 기질 특이성을 측정하였다. 그 결과, M37 리파제는 짧은 사슬을 가진 트리부티린(tributyrin; C4)에 대한 활성이 현저하게 높으며, 상대적으로 긴 사슬을 가진 트리카프리린(tricaprylin; C8), 트리미리스트린(trimyristin; C14), 트리스테아린(tristearin; C18)에 대해서는 아주 낮은 효소활성을 나타내었다. 그러나, 이중결합을 하나 가지는 트리올레인(triolein; C18:1)에서는 매우 높은 효소 활성을 보였다(도 10).

또한, 다양한 천연지방 및 유지에 대한 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 불포화지방산을 다량 함유한 맥아유, 아마인유, 면실유에 대하여 특히 강한 활성을 나타냈다(표 3).

천연지방 및 천연유	상대적 가수분해력(%)
올리브유(olive oil)	100
우지(beef tallow)	87
코코넛유(coconut oil)	45
옥수수유(corn oil)	169
면실유(cottonseed oil)	615
아마인유(linseed oil)	679
야자유(palm oil)	513
땅콩기름(peanut oil)	173
콩기름(soybean oil)	369
맥아유(wheat germ oil)	641

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 M37 리파제는 저온에서도 효과적으로 지질을 분해할 수 있으므로, 세제첨가제, 계면활성제 및 수질개선제로 이용뿐만 아니라 특정한 에스테르 결합 화합물의 합성으로 제약산업 등에 널리 활용될 수 있으며, 본 발명의 M37 리파제의 제조방법은 유전자 조작을 통한 대량 발현시스템을 이용하여 상기 리파제를 대량생산할 수 있으므로, 산업 전반에 M37 리파제의 경제적인 공급이 가능하다.

도 1은 포토박테리움속 M37 균주를 스크리닝한 대한민국 서해안 계화도 갯벌 지역을 나타낸 지도 및 사진(A)과 상기 균주의 분리 과정(B) 및 구균 형상(C)을 나타낸 사진이고,

도 2는 포토박테리움속 M37과 기타 유연 관계의 해양 미생물과의 16S rDNA 염기서열의 상동성을 비교한 모식도이고,

도 3은 포토박테리움속 M37의 NB 배지에서 염농도에 따른 균의 상대적 생장을 비교한 그래프이고,

도 4는 포토박테리움속 M37 유래의 M37 리파제(lipase)를 코딩하는 유전자의 클로닝 벡터인 4.8 kb의 pUML37 벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이고,

도 5는 포토박테리움속 M37 유래의 M37 리파제와 유전자 데이타베이스로부터 얻은 아라비돕시스 탈리아나(Alabidopsis thaliana) 유래의 추정 리파제의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 모식도이고,

도 6은 포토박테리움속 M37 유래의 M37 리파제의 대량 발현벡터인 pEML37 벡터의 제조과정을 나타낸 모식도이고,

도 7은 도 6의 pEML37 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pEML37의 저온 배양을 통하여 M37 리파제가 대량으로 발현되는 것을 나타낸 SDS 전기영동 사진이고,

레인 1 : 단백질의 분자량 마커(marker),

레인 2 내지 4 : E. coli BL21(DE3)/pEML37를 37℃에서 배양,

레인 5 내지 7 : E. coli BL21(DE3)/pEML37를 28℃에서 배양,

레인 8 내지 10 : E. coli BL21(DE3)/pEML37를 18℃에서 배양,

T : 전체 단백질,

S : 수용성 단백질,

P : 불용성 단백질,

도 8은 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pEML37로부터 대량으로 발현된 M37 리파제를 Ni-NTA 컬럼을 통하여 순수하게 분리된 것을 나타낸 SDS 전기영동 사진(A) 및 트리뷰티린 자이모그램(tributyrin zymogram)(B)이고,

레인 1 : 단백질의 분자량 마커(marker),

레인 2 : E. coli BL21(DE3)/pEML37로부터 분리된 수용성 단백질 전체,

레인 3 : 순수분리된 M37 리파제,

도 9a는 본 발명의 M37 리파제의 최적활성의 온도를 나타낸 그래프이고,

도 9b는 본 발명의 M37 리파제의 열안정성을 나타낸 그래프이고,

도 9c는 본 발명의 M37 리파제의 최적활성의 pH를 나타낸 그래프이고,

도 9d는 본 발명의 M37 리파제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이고,

도 10은 본 발명의 M37 리파제의 다양한 종류의 트리글리세리드(triglyceride)에 대한 기질 특이성을 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> M37 lipase, Photobacterium sp. M37 strain producing the same, and mass-produnction thereof <130> 3p-12-22 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Photobacterium sp. M37 <400> 1 Met Ser Tyr Thr Lys Glu Gln Leu Met Leu Ala Phe Ser Tyr Met Ser 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Ile Thr His Thr Gly Ser Ala Lys Lys Asn Ala Glu Leu 20 25 30 Ile Leu Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Lys Thr Trp Lys Pro Phe Gln 35 40 45 Glu Asp Asp Trp Glu Val Val Trp Gly Pro Ala Val Tyr Thr Met Pro 50 55 60 Phe Thr Ile Phe Asn Asp Ala Met Met Tyr Val Ile Gln Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ala Glu Gly Glu Tyr Val Ile Ala Ile Arg Gly Thr Asn Pro Val Ser 85 90 95 Ile Ser Asp Trp Leu Phe Asn Asp Phe Met Val Ser Ala Met Lys Lys 100 105 110 Trp Pro Tyr Ala Ser Val Glu Gly Arg Ile Leu Lys Ile Ser Glu Ser 115 120 125 Thr Ser Tyr Gly Leu Lys Thr Leu Gln Lys Leu Lys Pro Lys Ser His 130 135 140 Ile Pro Gly Glu Asn Lys Thr Ile Leu Gln Phe Leu Asn Glu Lys Ile 145 150 155 160 Gly Pro Glu Gly Lys Ala Lys Ile Cys Val Thr Gly His Ser Lys Gly 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Ser Thr Leu Ala Leu Trp Leu Lys Asp Ile Gln Gly 180 185 190 Val Lys Leu Ser Gln Asn Ile Asp Ile Ser Thr Ile Pro Phe Ala Gly 195 200 205 Pro Thr Ala Gly Asn Ala Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Asp Cys Leu 210 215 220 Gly Asp Gln Cys Thr Arg Ile Ala Asn Ser Leu Asp Ile Val Pro Tyr 225 230 235 240 Ala Trp Asn Thr Asn Ser Leu Lys Lys Leu Lys Ser Ile Tyr Ile Ser 245 250 255 Glu Gln Ala Ser Val Lys Pro Leu Leu Tyr Gln Arg Ala Leu Ile Arg 260 265 270 Ala Met Ile Ala Glu Thr Lys Gly Lys Lys Tyr Lys Gln Ile Lys Ala 275 280 285 Glu Thr Pro Pro Leu Glu Gly Asn Ile Asn Pro Ile Leu Ile Glu Tyr 290 295 300 Leu Val Gln Ala Ala Tyr Gln His Val Val Gly Tyr Pro Glu Leu Met 305 310 315 320 Gly Met Met Asp Asp Ile Pro Leu Thr Asp Ile Phe Glu Asp Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Leu Leu 340 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Photobacterium sp. M37 <400> 2 Gly His Ser Lys Gly 1 5 <210> 3 <211> 1023 <212> DNA <213> Photobacterium sp. M37 <400> 3 atgtcttata caaaagaaca actcatgttg gcattcagct atatgagcta ctatggcatc 60 actcacacag gttcagcaaa aaaaaatgct gagctcatcc ttaaaaaaat gaaagaagcc 120 ttgaaaacat ggaagccttt tcaggaagat gactgggaag tcgtctgggg tcctgcggtt 180 tataccatgc ctttcacaat cttcaacgat gccatgatgt atgtcataca gaagaaaggt 240 gctgaagggg aatacgtgat agccattcgc ggcaccaatc cagtatcaat ttcagactgg 300 ctgtttaatg atttcatggt cagcgcaatg aagaagtggc cttacgcatc cgttgaaggc 360 cgcatactca aaatatccga aagtaccagc tacggactga aaaccttaca gaaattgaag 420 ccaaaatccc atatccccgg cgaaaataaa acgattctgc agttcctgaa tgaaaagata 480 ggcccagagg gtaaagcaaa aatctgtgta acaggccaca gtaaaggcgg cgccttgtct 540 tccactctgg cactgtggtt gaaggacatc caaggagtaa aactctcgca aaacatcgat 600 atctcaacga ttccgtttgc cggaccaaca gccggtaatg ctgactttgc cgattacttt 660 gatgattgtc ttggtgatca atgcacccgc attgccaact cgttagatat tgtgccttat 720 gcctggaata caaattcatt aaaaaaactt aaatctatat atatttctga acaagcatca 780 gttaaaccgc ttctatatca acgcgcttta atccgtgcaa tgatcgcaga aactaaaggt 840 aaaaaataca agcaaattaa ggcggaaaca ccaccattag aaggcaacat taatcctatt 900 cttattgaat accttgtgca ggcagcatat cagcatgtcg tcggttaccc agaattaatg 960 ggtatgatgg atgatattcc tttaacagac atattcgaag atgcgatcgc gggtttgtta 1020 taa 1023 <210> 4 <211> 1481 <212> DNA <213> Photobacterium sp. M37 16S rDNA <400> 4 tagagttttg acctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag 60 cggtaacagg aagaagcttg cttctttgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgcctg 120 ggaatatgcc ttaatgtggg ggataactat tggaaacgat agctaatacc gcataacgtc 180 tacggaccaa agagggggac cttcgggcct ctcgcgctaa gattagccca ggtgggatta 240 gctagttggt ggggtaaagg ctcaccaagg caacgatccc tagctggtct gagaggatga 300 tcagccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360 ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt 420 tgtaaagtac tttcagtcgt gaggaagggt gtgtagttaa tagctgtaca tcttgacgtt 480 agcgacagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgcg 540 agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcatgcaggc ggttagttaa gcgagatgtg 600 aaagcccggg gctcaacctc ggaacagcat ttcgaactgg ctaactagag tcttgtagag 660 gggggtagaa tttcaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctgaaggaa taccggtggc 720 gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc tcagatgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtctac ttggaggttg tggccttgag 840 ccgtggcttt cggagctaac gcgttaagta gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta 900 aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg 960 caacgcgaag aaccttacct actcttgaca tccagagaag ccagcggaga cgcaggtgtg 1020 ccttcgggag ctctgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt 1080 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atccttgttt gccagcacgt aatggtggga 1140 actccaggga gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1200 ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct acaatggcgt atacagaggg ctgccaacca 1260 gcgatggtga gcgaatccca caaagtacgt cgtagtccgg atcggagtct gcaactcgac 1320 tccgtgaagt cggaatcgct agtaatcgtg aatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg 1380 ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggct gcaccagaag tagatagctt 1440 aacnttcggg agggcgttta ccncggtggg tcagacgggg g 1481 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 5 gaacatatgt cttatacaaa agaacaactc 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for PCR <400> 6 gaaaagcttt aacaaacccg cgatcgc 27

Claims

비이온성 계면활성에 의해 가수분해활성이 증가하는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 M37 리파제(lipase).
제 1항의 리파제를 코딩하는 유전자.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 2항 또는 제 3항의 유전자를 함유하는 pUML37 벡터 또는 pEML37 벡터.
제 4항의 벡터로 형질전환된 대장균.
제 5항에 있어서, 상기 대장균은 pUML37 벡터로 형질전환된 E. coli XL1-Blue/pUML37 또는 pEML37 벡터로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pEML37인 것을 특징으로 하는 대장균(수탁번호: KCTC 10563BP).
제 1항의 리파제를 생산하는 포토박테리움속(Photobacterium sp.) 균주.
제 7항에 있어서, 상기 균주는 포토박테리움속 M37인 것을 특징으로 하는 균주(수탁번호: KCTC 10562BP)
ⅰ) 제 2항 또는 제 3항의 M37 리파제를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계;

ⅲ) 상기 형질전환 대장균을 배양하고, M37 리파제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 단계; 및

ⅳ) 상기 배양된 대장균으로부터 M37 리파제를 분리ㆍ정제하는 단계를 포함하는 제 1항의 리파제의 대량 생산방법.
제 9항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 pEML37 벡터인 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 9항에 있어서, 상기 형질전환 대장균은 E. coli BL21(DE3)/pEML37인 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 11항에 있어서, 상기 유전자의 발현은 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 12항에 있어서, 상기 유전자의 발현 후, 12 내지 15℃의 저온에서 상기 형질전환 대장균을 추가적으로 배양하는 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 생산방법.
제 12항에 있어서, 상기 분리ㆍ정제 단계는 Ni-NTA 칼럼을 이용하고 이미다졸 용액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 생산방법.