KR20050053663A - 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
고도 불포화 지방산 함유 유지 또는 트리글리세라이드와 식물성 유지 또는 트리글리세라이드를 1,3-위치 특이적형의 리파제를 사용하여 에스테르 교환 반응에 의하여 생산된 유아용 조제유, 식품 및 건강 식품 및/또는 보조 식품 등의 분야에서 사용하기에 적합한 소화 흡수성이 높고, 산화 열화 내성이 있는 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 제공한다.
Description
본 발명은 미생물이 생산하는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 리파아제의 에스테르 교환 반응에 의하여 개량하는 방법과, 상기 개량된 유지 또는 트리글리세라이드 및 개량된 유지를 함유하는 인체 영양 조성물에 관한 것이다.
에이코사펜타엔산(이하, 'EPA'라 함) 및 도코사헥사엔산(이하, 'DHA'라 함)은 특히 동맥경화증 및 혈전증 등의 성인병에 대한 예방 효과, 항암 작용 및 학습 강화 효과를 비롯한 다양한 생리 기능을 갖는 것으로 알려져 있는 고도 불포화 지방산으로서, 이들은 흔히 의약품 및 특정의 건강 식품 및/또는 보조 식품으로 이용되고 있다. 그러나, 최근에는 그밖의 고도 불포화 지방산의 생리 기능에 대한 관심이 고조되고 있다.
아라키돈산은 고도 불포화 지방산 중의 1종으로서, 혈액 및 간 등의 중요한 기관을 구성하는 지방산의 약 10% (예컨대, 인간 혈액의 인지질 내의 지방산 조성비는 아라키돈산이 11%, 에이코사펜타엔산이 1%이고, 도코사헥사엔산은 3%를 차지한다)를 차지하고 있다. 이는, 세포막의 주요 성분으로서 막의 유동성 조절에 관여하고 신진 대사에 관련하여 다양한 작용을 하며, 또한 프로스타글란딘류(prostaglandins)의 직접적인 전구체로서 중요한 역할을 한다. 특히, 최근에 유아 영양소로서의 아라키돈산의 역할 및 신경 자극 작용을 나타내는 내인성 칸나비노이드(2-아라키도노일 모노글리세롤 및 아난다마이드)의 구성 지방산으로서 관심이 집중되고 있다. 리놀레산이 풍부한 식품을 섭취하면, 일반적으로 아라키돈산으로 변환되지만, 성인병 환자, 성인병에 걸리기 쉬운 사람, 유아 및 노인은 생합성에 관련된 효소의 작용이 감소되어, 결국에는 아라키돈산의 부족을 일으키기 쉽기 때문에, 트리글리세라이드 형태로 아라키돈산을 직접 섭취하는 것이 좋다.
어유(魚油)는 EPA 및 DHA의 풍부한 공급원이지만, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산 및 4,7,10,13,16-도코사펜타에논산 (22:5 ω6)은 종래의 유지 공급원으로부터 거의 얻을 수 없다. 현재, 미생물을 발효시켜 얻은 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드가 일반적으로 사용되고 있다. 예컨대, 아라키돈산을 구성 지방산으로 함유하는 유지나 트리글리세라이드가 생산 가능한 다양한 미생물들을 배양하여 아라키돈산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지나 트리글리세라이드를 얻을 수 있는 방법이 제안되어 있다. 이러한 방법에는 모르티에렐라(Mortierella) 속의 미생물을 사용하여 아라키돈산이 풍부한 유지나 트리글리세라이드를 얻는 방법들이 있다. (예컨대, 일본 특허 공개 공보 소63-44891호 및 소63-12290호 참조). 발효 생산된 아라키돈산을 구성 지방산으로서 함유하는 트리글리세라이드는 아라키돈산을 필요로 하는 용도, 예컨대 유아 영양 분야 및 특히 조제유 등에 사용된다.
아라키돈산 함유 유지를 조제유에 첨가하는 방법은 유아 영양학 분야에 개시되어 있다 (일본 특허 공개 공보 제11-151075, 일본 특허 공개 공보 제10-191886호를 참조). 첨가 원료에 사용된 아라키돈산 함유 유지는 진균류에 의하여 생성되며, 분자적으로 보면, 6~24% AAA(1 분자 중에 아라키돈산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 아라키돈산 함유량이 많으면, AAA 농도도 높아진다는 사실이 알려져 있다 (예컨대, Jim-Wen et al., In vitro hydrolysis of fungal oils: distribution of arachidonic acid-containing triacylglycerol molecular species, J. Am. Oil Chem. Soc., 75, pp. 507-510 (1998) 참조).
AAA를 고농도로 함유하는 유지는 생리적 조건하에서 사람의 소화 효소(췌장 리파제)의 작용을 받기 어렵다는 점에서 식물성 유지와 다르고, 췌장 리파제 활성이 낮은 유아나 노인이 이러한 유지류를 소화 흡수하는 것은 쉽지 않다 (예컨대, Jim-Wen Liu et al. 참조).
사람의 모유 중의 아라키돈산 함량은 전체 지방산 중 0.5%이며 (예컨대, Christie, W.W., "The positional distribution of fatty acids in triglycerides"in Analysis of oils and fats, Edited by Hamilton, R. J. and Russell, J. B. , pp. 313-339, Elsevier Applied Science, London (1986) 참조), 예컨대, 트리글리세라이드 1 분자당 1 잔기의 아라키돈산은 전술한 AAA의 1 분자 중에 아라키돈산의 농도보다 오히려 더 높을 가능성이 크다. 결국, 지방산 함량을 기초로 하여 진균류의 발효에 의하여 얻은 아라키돈산 함유 유지를 조제유에 첨가하는 것은 좋지 않다.
이들의 특성을 강화시키기 위하여, 유지를 효소적으로 개질(구강 내에서의 가용성, 결정성, 내열성)시키는 시도가 다양하게 수행되어 왔다. 이들 대부분은 카카오 대체유의 효소 합성 등의 식물성 유지의 효소 개질법을 포함하였다 (예컨대, 일본 특허 공개 공보 제55-71797호 및 일본 특허 공개 공보 제58-42697 참조). 여기에 제시되어 있는 제조 기술은 리파제 반응성이 높은 식물성 유지에 대한 것이고, 이에 반해 반응성이 불량한 고도 불포화 지방산에 풍부한 리파제 반응성의 면에서 적합하지 않다.
고도 불포화 지방산 중의 트리글리세라이드 또는 유지는 이들의 효소 반응성이 불량하기 때문에, 효소적 개질에 사용된 바 없으나, 고정화 효소를 변형시킴으로써 중쇄 지방산 및 고도 불포화 지방산이 풍부한 유지를 이용하여 고도 불포화 지방산 구조인 지질을 생산하는 것이 시도되었다 (일본 특허 공개 공보 제8-214891호, PCT/JP02-06702 참조).
이 방법에 따라, 트리글리세라이드의 1-위치 및/또는 3-위치에서 지방산은 옥타노산으로 치환되고, 이에 따라 유리 고도 불포화 지방산이 방출된다. 따라서, 고도 불포화 지방산이 풍부한 유지는 목적 생성물이 아니다. 또 다른 단점은 유리 지방산을 제거하기 위하여 정확한 증류 등의 더 나은 정제 기술을 요한다는 것이다.
후지모토(Fujimoto) 등은, 어유(특히 EPA 및 DHA가 풍부한 유지)는 쉽게 산화되고 산화 방지제의 첨가에 의하여 충분한 산화 안정성을 달성할 수 없다는 사실에 비추어, 유지 구조가 고도 불포화 지방산의 산화 안정성에 미치는 효과를 면밀히 연구하였다(Fujimoto, K.,"Effects of oil and fat structure on oxidation stability of polyunsaturated fatty acids", Science and Industry, 75, pp. 53-60, Osaka Industrial Research Association (2001) 참조). 정어리 유지(고도 불포화 지방산이 풍부하다)에 특수한 유지 (중쇄 지방산의 C8 및 C14 트리글리세라이드)를 첨가하고, 위치 비특이적형의 리파제로 에스테르 교환시킴으로써 산화 안정성이 향상된다는 사실을 발견하여, 화학적으로 합성된 고도 불포화 지방산의 트리글리세라이드 EEE(트리-EPA)의 산화 용이성을 시험하고, 고도 불포화 지방산이 분자간에 분산되어 존재하는 형태와 동일 분자 내에 고도로 응축되어 존재하는 상태를 비교하여, 분산된 형태가 더 좋다는 것을 확인하였다.
어유 등에 함유된 고도 불포화 지방산의 산화를 방지하기 위하여, 에스테르 교환 반응시켜 유지를 안정화시키는 방법이 개시되어 있다 (일본 특허 공개 공보 제6-287593호 참조). 그러나, 어유 등에 함유된 고도 불포화 지방산은 에스테르 교환 반응에 사용되는 리파제의 반응성이 낮다. 따라서, 이 방법에 따르면, 리파제 반응성을 보장하기 위하여, 어유 등으로부터 정제된 1 종 이상의 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지를 희석하는 데에 리파제 반응성이 높은 식물성 유지가 다량 사용된다. 결국, 안정화한 유지의 고도 불포화 지방산 함량을 증가시키는 것은 불가능하였다.
발명의 개요
따라서, 유아용 조제유, 식품 및 건강 식품 및/또는 보조 식품 분야에 사용될 수 있고, 소화 흡수성이 용이하고 산화 열화 내성이 있는 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 제공하는 것이 요망되어 왔다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리파제 에스테르 교환 반응에 의하여 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 개량하여, 고도 불포화 지방산을 분산시킨 유지를 제조하는 방법 및 이들을 함유하는 조성물 및 이들을 함유하는 식품 또는 건강 식품 및/또는 보조 식품을 제공하려는 것이다.
고도 불포화 지방산의 함량이 높고, 소화 흡수성이 우수하며, 산화 열화에 대 내성이 있는 고도 불포화 지방산이 풍부한 유지 또는 트리글리세라이드를, 진균류가 생산한, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 1종 이상의 유지 또는 트리글리세라이드 50 ~ 100 중량부와 1종 이상의 식물성 유지 또는 트리글리세라이드 0 ~ 50 중량부를 1,3-위치 특이적형의 리파제를 사용하여 탈산소 상태로 하여, 반응 온도를 상승시켜 에스테르 교환시킴으로써 성공적으로 얻어지게 되었다.
도 1은 에스테르 교환 반응에 있어서 트리아라키돈산 트리글리세라이드(AAA)의 감소에 미치는 야자유 및 대두유의 효과를 도시한 그래프이다.
특히, 본 발명은,
고정화 효소를 사용하여 열적 안정성을 증가시키고, 고온의 반응 온도에서 효소를 사용하는 것을 가능하게 함과 동시에, 원료/반응 유지의 산화 열화를 방지할 수 있으므로, 고온 반응 중에 고정화 효소 자체 중의 산소를 제거하는 방법을 발견하여 산화 열화를 방지하고 실용적인 효소 반응을 완성하였고,
에스테르 교환 반응은 가수 분해 및 에스테르 합성 반응간의 평형에 의하여 일어나므로 효소의 활성화에 사용된 수분이 효소의 활성 후에 효율적으로 제거되어, 부차적으로 생산되는 유리 지방산, 모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 양을 최소화하는 방법을 발견하여, 실용적인 효소 반응을 완성하였으며,
이에 따라 에스테르 교환 반응에 의하여 변환된 유지의 상업적 생산에 적합한 방법을 제공하려는 것이다.
따라서, 본 발명은 진균류가 생산한 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 원료로 사용하여 리파제 에스테르 교환 반응에 의하여 얻은 식용 에스테르 교환 유지를 제조하는 방법 및 이 유지를 함유하는 조성물을 제공한다.
모유 지질 중의 아라키돈산의 함량은 1 wt% 미만이기 때문에, 트리글리세라이드 1 분자 중에 아라키돈산 잔기는 기껏해야 1 잔기 존재한다고 추정된다. 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 진균의 발효법에 의하여 제조된 아라키돈산이 풍부한 유지(SUNTGA40S:산토리 카부시키가이샤의 상품명)의 분자종을 이하의 표 1에 나타낸다.
| 분자종 | 함량 (wt%) |
| AAA | 10.57 |
| XAA | 37.56 |
| XXA | 26.52 |
| XXX | 25.35 |
이 경우, A는 트리글리세라이드에 결합된 아라키돈산을 나타내고, X는 아라키돈산 이외의 트리글리세라이드에 결합된 지방산을 나타낸다. 구체적으로는, "AAA"는 1 분자 중에서 아라키돈산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 나타내고, "XAA"는 아라키돈산을 2 잔기, 아라키돈산 이외의 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 나타내며, "XXA"는 아라키돈산을 1 잔기, 아라키돈산 이외의 지방산을 2 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 나타낸다. 아라키돈산을 함유하는 트리글리세라이드는 전체 트리글리세라이드의 74.7%를 함유하지만, 모유 중에 존재할 것이라고 추정되는 XXA는 26.52%이고, 비존재형으로 생각되는 AAA 또는 XAA가 48%로 존재한다. 이 48%의 AAA 및 XAA를 XXA의 형태로 변환시킴으로써, 모유에 가까운 아라키돈산의 형태로 된다고 생각하였다.
본 발명자들은 이상에서 나타낸 발효법에 의하여 생산된 진균의 아라키돈산이 풍부한 유지 및 트리글리세라이드를 개량시킬 목적으로 산소가 제거된 상태로 1,3-위치 특이적형의 리파제를 사용하여 식물성 유지가 비교적 적은 에스테르 교환 유지를 제조하는 것을 시도하였다. 그 결과, 본 발명자들은 진균성 아라키돈산 유지가 풍부하고 소화 또는 흡수되지 않는 원료 AAA 트리그리세라이드의 1-위치 및 3-위치에 결합된 아라키돈산을 분산시키는 한편 사람 모유의 구조 형태(XXA)에 근접시키는 데에도 성공하였다.
본 발명의 에스테르 교환 방법에 의하여 개량된 유지는 유아 영양 분야에서 조제유에 첨가하여 사용하는 것을 비롯하는 것을 비롯하여, 식품 및 건강 식품 및/또는 보조제 등에 광범위한 목적으로 사용될 수 있다.
효소 에스테르 교환 반응에 의하여 유지를 개량하는 방법은 오랫동안 수행되어 왔으며, 이는 선행 기술에 기재되어 있다. 이 아라키돈산이 풍부한 유지는 리파제의 생리적 반응 조건하에서 작용하기 어려운 AAA 등의 수의 아라키돈산 잔기를 포함하며, 에스테르 교환 반응에 있어서 효소의 반응성에 문제가 있다. 에스테르 교환 반응의 효율을 증대시키려면, 리파제를 고정화시키고, 내열성을 부여하여 반응 온도를 상승시킴으로써 에스테르 교환율을 향상시키는 것이 요망된다 (예컨대, 일본 특허 공개 공보 제8-214891호, PCT/JP02-06702 참조). 그러나, 반응 효율을 향상시키기 위하여 반응을 고온에서 수행하게 되면 원료인 아라키돈산이 풍부한 유지는 산화 열화를 일으키기 쉽다. 특히, 고정화 효소를 사용할 경우, 고정화 담체 중에 침투된 산소를 제거함으로써 문제가 생기게 된다. 그러므로, 본 발명자들은 고정화 효소로부터 산소를 효율적으로 제거하는 방법을 발견하고, 저산소 조건하에서의 에스테르 교환 방법을 개발하였다.
POV(과산화물값)가 유지의 산화 열화도를 나타내는 파라메터로서 광범위하게 사용되고 있다. 에스테르 교환 반응을 위한 반응계 중의 산소의 양을 변화시키고 POV를 측정함으로써 유지의 산화 열화도를 비교 검토하였다. 산소의 양은 다음의 4 가지 레벨로 판정하였다. 즉, 최상의 탈산소 레벨 = "탈기 및 질소 통기 (blow)",상식적인 질소 통기에 의하여 질소 치환한 레벨 = "질소 통기", 반응 용기를 전혀 질소 치환하지 않은 레벨 = "질소 무치환", 최후 고정화 효소의 담체만을 사용하여, 질소 무치환의 상태로 컨트롤하기 위한 레벨 = "컨트롤". 30, 45, 55℃의 온도에서 소정 시간 동안 반응시킨 후, POV 값을 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 잔존하는 산소의 양에 비례하여, POV 값이 상승하고, 특히 상식적인 질소 통기에 의하여 질소 치환한 레벨에서의 탈기 상태 "질소 통기"에서는, 반응 온도의 상승과 함께 POV 값이 상승하기 때문에, 산소의 제거가 불충분하다고 생각되었다. 이는, 이 조건하에서 반응이 유지의 열화를 막을 수 없다는 것을 의미하고, 이들 결과는 POV 값의 증가는 탈산소 레벨을 다음의 "탈기 및 질소 통기" 레벨까지 증가시킴으로써 억제되어 충분한 품질의 유지를 얻을 수 있다는 사실을 나타내었다.
| 30℃, 1일 | 45℃, 3일 | 55℃, 1일 | |
| 탈기 및 질소 통기 | 0.87 | 0.88 | 0.87 |
| 질소 통기 | 1.07 | 1.23 | 2.75 |
| 질소 무치환 | 1.28 | 1.86 | 3.15 |
| 컨트롤 | 2.69 | 4.50 | 4.05 |
(POV: meq/kg 유지)
리조퍼스 델레마르 (Rhizopus delemar; 현재의 Rhizopus oryzae)의 리파제의 경우, 소량의 수분을 가하여(약 2%) 효소를 활성화시킬 필요가 있다. 이는 활성화 및 고정화 효소 중의 여분의 수분을 제거하기 위한 조작을 필요하게 된다. 또한, 이 작업은 탈산소 조작에 의하여 수행되어야 하는데, 이는 효소의 활성화 또는 수분 제거와 동시에 수행될 수 있다. 효소의 활성화 단계시, 고정화 효소에 원료 유지 및 소량의 물을 가하고, 약 1일간 30~40℃에서 반응을 수행하여 효소를 활성화시킨다. 고정화 효소의 활성화만을 위한 것이라면, 고가의 고도 불포화 지방산을 함유한 유지 대신에, 저렴한 식물성 유지를 사용하여도 좋다. 산소의 제거 방법은 고정화 효소에 수분을 함유하는 원료 유지를 가하는 단계 중에 또는 전에, 진공 펌프 등의 감압기를 사용하여서 원료 유지와 고정화 효소를 탈기시키고, 압력을 상압(常壓)으로 복원시킬 경우에는 공기를 배기시키는 대신에 질소 가스를 배기시킬 수 있다. 이 진공/상압으로 복원 조작을 반복함으로써 고정화 효소 중의 산소를 제거할 수 있다. 활성화 반응의 종료 후, 유지를 제거하고, 상기 진공/질소 가스 배기 공정을 더 반복함으로써 유지가 흡수된 고정화 효소로부터 산소를 제거한다. 이어서, 산소가 제거된(질소가 치환된) 원료 유지를 가하여 에스테르 교환하는데, 이는 고온하에서도 유지의 산화 열화를 방지하면서 수행될 수 있다.
<효소의 활성화에 사용된 수분의 제거 또는 효소에 함유된 수분의 제거 방법>
전술한 조작으로 활성화한 고정화 효소로부터 여분의 수분을 제거하여야 한다. 여분의 수분이 존재하면 리파제에 의한 가수 분해 반응이 촉진되고, 에스테르 교환 반응 중에 부차적인 생성물인, 디글리세라이드, 모노글리세라이드 및 유리 지방산이 생성된다. 이들 생성물을 방지하기 위하여, 반응계로부터 수분을 제거하여야 한다. 활성화한 고정화 효소로부터 활성화에 사용된 유지를 제거하고, 반응 원료의 유지(미리 탈산소 또는 탈수시킨 유지)로 1회 세정한 후, 이를 45℃에서 1일간 조유지(粗油脂)와 반응시킴으로써 여분의 수분을 제거할 수 있다. 그 다음의 반응으로부터는 디글리세라이드 등의 양이 적은 에스테르화 교환 유지를 얻는다. 제조 비용을 절감하기 위한 목적이라면, 활성화 및 수분 제거 반응에 고가의 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지 대신에 야자유 등의 경제적인 식물성 유지를 사용하여도 좋다.
리조푸스 델레마르(R. delemar)의 고정화 효소의 경우에는, 수분에 의한 효소 활성화가 필요하지만, 구득이 용이한 고정화 효소리조무코르 미에헤이 리파제 키라자임(Rhizomucor miehei lipase Chirazyme) L-9, c.-f., C2, lyo, 베르링거 만하임(Berlinger Mannheim) 제품)의 경우에는 물에 의한 활성화는 필요하지 않지만, 고정화 효소 중에 함유된 미량의 수분에 의하여 활성형으로 존재한다. 그러나, 이 고정화 효소 중에 여분의 수분이 함유되어 있으며, 따라서, 리조푸스 델레마르(R. delemar)의 경우와 동일하게 수분을 제거하여야 한다. 수분 제거에 사용되는 방법은 전술한 방법일 수 있으며, 특별한 조작은 필요하지 않다. 마찬가지로, 상기 효소의 경우, 산소 제거는 탈수 공정에서 수행하여도 역시 좋다.
<효소 반응용 반응기>
이상에서는 효소 반응은 배치식[회분식(回分式)] 에스테르 교환 반응에 대하여 설명되어 있다.
고정화 효소를 사용하여 1 종 이상의 유지의 에스테르 교환 반응을 행하는 방법으로서, 배치식 방법 외에 컬럼식 방법이 있다. 특히, 고정화 효소를 컬럼식 자켓 부착형(jacketed) 용기 내에 채우고, 배양 및 가열하여 컬럼 온도를 조절하면서 원료 유지를 컬럼 내에 도입하고, 출구에서 에스테르 교환 유지를 꺼낸다. 경우에 따라, 유지를 순환시키면서 컬럼을 통과시켜 변환율을 증대시킬 수 있다. 이 경우에는, 활성화시 또는 수분 제거시에 원료 유지를 컬럼에 통과시켜 내부의 고정화 효소를 유지에 노출시키고, 진공 탈기와 강제적인 질소 가스의 통기를 조합하여 산소를 제거할 수가 있다. 활성화하여 수분을 제거한 후에, 유지의 에스테르화 교환 반응을 행해도 좋다.
<에스테르 교환 반응용 원료 유지>
고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 1종 이상의 유지 또는 트리글리세라이드 50~100 중량부와 1종 이상의 식물성 유지 또는 트리글리세라이드 0~50 중량부를 혼합하면, 균일한 상태의 액상 유지로 되고, 지금까지 설명하였던 방법으로 산소가 제거된 고정화 효소에 의하여 에스테르화 교환 반응을 수행하여, 고도 불포화 지방산을 함유하는 개질 유지를 얻을 수 있다.
<식물성 유지>
반응에 사용된 식물성 원료 유지는 식용으로 보통 사용되는 것일 수 있다. 사용된 식물성 유지는 변환된 유지이어도 좋다. 이들 식물성 유지는 에스테르 교환용의 포화 지방산의 공급원으로서 사용되고 있다. 예컨대, 대두유, 홍화유, 올리브유, 쌀겨유, 참기름 등의 리놀산이 풍부한 유지, 올레산/리놀산이 풍부한 유지 및 야자유, 야자핵유, 카카오유, 코코넛유, 라드유 등의 포화 지방산이 풍부한 유지 및 MCT(탄소 수 8개의 포화 중쇄 지방산 및 탄소 수 10개의 포화 중쇄 지방산을 포함하고, 동일 또는 상이한 지방산으로 된 트리글리세라이드) 등의 트리글리세라이드 식물성 유지로부터 전환시켜 얻은 유지를 들 수 있다. 산화에 대한 저항성을 부여한다는 점에서, 그리고 모유 성분에 매우 근사하다는 점에서, 포화 지방산이 풍부한 포화 지방산계의 유지가 좋다.
에스테르화 교환 반응에서 포화 지방산의 공급원으로서 사용되는 식물성 유지를 포화 지방산이 풍부한 야자유 및 비교적 불포화 지방산이 풍부한 대두유에 비교하여 보면, 에스테르 교환 반응 중의 AAA의 감소 속도는 양쪽 유지가 대략 동일하여, AAA의 함량에는 별다른 차가 보이지 않으며, 따라서, 소화 흡수성이 더욱 양호한 유지로의 개선 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 에스테르화 교환 반응에 의하여 도입된 지방산의 차이로 인하여, 산화 열화에 대한 강도에는 다소 차이가 있다는 것이 밝혀지게 되었다.
본 발명에 따르면, 리파제에 의하여 MCT, 특히 구성 지방산으로서 옥타논산을 함유하는 트리글리세라이드 및 미생물 아라키돈산 트리글리세라이드를 에스테르 교환하여 "8A8", "88A" 등의 구성 지방산으로서 아라키돈산을 함유하는 트리글리세라이드를 생산한다. 이 방법은 경제적인 면에서 아라키돈산의 낭비 없이, 아라키돈산을 함유하는 유지를 생산하는 데 유용하며, 이로부터 얻은 아라키돈산 함유 유지는 소화 흡수성이 개선된 신규의 유지로서 유용하다.
이들 유지로부터 분리되거나 부분 수소 첨가에 의하여 포화 지방산 함량이 증가된 유지도 역시 들 수 있으나, 사용 가능한 유지는 이들로 한정하는 것은 아니다.
<고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지>
고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산 할 수 있는 미생물을 배양하는 것이 필수적이다. 여기서, 미생물이라 함은, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유한 ω6, ω9, 또는 ω3계의 고도 불포화 지방산의 적어도 1종을, 주로 트리글리세라이드 구성 지방산으로서 생산하는 미생물이 바람직하다.
탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유한 ω6, ω9, 또는 ω3계의 고도 불포화 지방산으로서는, 디호모-γ-리놀렌산 (8, 11, 14- 에이코사트리엔산: DGLA), 아라키돈산 (5, 8, 11, 14- 에이코사테트라엔산), 7, 10, 13, 16-도코사테르라엔산 (22:4 ω6), DPA ω6 (4, 7, 10, 13, 16-도코사펜타엔산), 8, 11-에이코사디엔산, 미드산 (5, 8, 11-에이코사트리엔산), 8, 11, 14, 17-에이코사테트라엔산 (20:4 ω3), EPA (5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타엔산), DPA ω3 (7, 10, 13, 16, 19-도코사펜타엔산) 및 DHA (4, 7, 10, 13, 16, 19-도코사헥사엔산)을 들 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 어떠한 미생물도 사용할 수 있다. 아라키돈산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산 할 수 있는 미생물의 예로서는, 모르티에렐라 (Mortierella) 속, 코니디오보루스 (Conidiobolus) 속, 피티움 (Pythium) 속, 피토프토라 (Phytophthora) 속, 페니실리움 (Penicillium) 속, 클라도스포리움 (Cladosporium) 속, 무코르 (Mucor) 속, 퓨사리움 (Fusarium) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 로도토루라 (Rhodotorula) 속, 엔토모프토라 (Entomophthora) 속, 에키노스포란기움 (Echinosporangium) 속 또는 사프로레기나 (Saprolegnia) 속에 속하는 미생물류를 들 수 있다. 모르티에렐라 (Mortierella) 속 모르티에렐라 (Mortierella) 아속에 속하는 미생물들의 예로는, 모르티에렐라 엘롱가타 (Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아 (Mortierella exigua), 모르티엘라 하이그로필라 (Mortierella hygrophila), 모르티엘라 알피나 (Mortierella alpina) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 모르티에렐라 엘롱가타 (Mortierella elongata) IF08570, 모르티에렐라 엑시구아 (Mortierella exigua) IF08571, 모르티엘라 하이그로필라 (Mortierella hygrophila) IF05941, 모르티엘라 알피나 (Mortierella alpina) IF08568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250. 53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 균주를 들 수 있다. DHA 생성 미생물의 예로서는, 크립테코디늄 (Crypthecodenium) 속, 트라우토치트륨 (Thrautochytrium) 속, 스치코치트륨 (Schizochytrium) 속, 울케니아 (Ulkenia) 속, 자포노치트륨 (Japonochytrium) 속, 알리프토로스 (Haliphthoros) 속 등에 속하는 미생물들을 들 수 있다.
이들 균주들은 모두 일본의 기탁 기관인 일본굽 오사카시의 재단 법인 발효 연구소 [Institute for Fermentation, Osaka (IFO)], 미국의 기탁 기관인 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션[American Type Culture Collection (ATCC)] 및 네덜란드 기탁 기관인 센트랄뷰로 포오르 심멜컬투르[Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS)]로 부터 제한 없이 입수할 수 있다. 또한, 본 발명의 연구 그룹이 토양으로부터 분리한 균주 모르티엘라 엘로가타 (Mortierella elongata) SAM0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 균주를 배양하려면, 그 균주의 포자 또는 균사체 또는 미리 배양하여 얻을 수 있는 종배양액 또는 종배양액에 의하여 회수한 균체를 액체 또는 고체 배지에 접종하여 본배양한다. 액체 배지의 경우, 탄소원으로서는 포도당, 과당, 크실로스, 자당, 맥아당, 가용성 녹말, 당밀, 글리세롤, 만니톨 또는 사카라이드된 전분 등이 일반적으로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 질소 공급원으로서는, 펩톤, 효모 추출물, 밀씨 추출물, 쇠고기 추출물, 카사미노산, 녹말 전분, 옥수수 침지수 농축물, 대두 단백질, 탈지방 대두 및 면실박 등의 천연 질소 공급원 뿐만 아니라 우레아 등의 유기 질소 공급원 및 질화나트륨, 질화암모늄 및 황화암모늄 등의 무기 질소 공급원을 사용할 수 있으며, 특히, 대두, 탈지방 대두, 대두 플레이크, 식용 대두 단백질, 콩비지, 대두유, 볶은 대두분 등의 대두 유래의 질소원을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, 1종 이상의 가열 변성 탈지방 대두를 사용할 수도 있으며, 더욱 바람직하게는 탈지방 대두를 약 70~90℃에서 가열 처리하고 에탄올 가용 성분을 제거한 것을 사용하거나 또는 이를 전술한 질소원과 혼합하여 사용할 수 있다. 필요한 경우, 인산 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 이외에도, 철, 구리, 아연, 망간, 니켈, 코발트 등의 금속 이온 또는 비타민 등을 미량 영양원으로서 사용할 수도 있다.
이들 배지 성분은 미생물의 생육을 저해하지 않는 농도로 제공되는 한, 특별히 제한은 없다. 실용상, 일반적으로 탄소원은 전체 첨가량이 0.1~40 wt%, 바람직하게는 1~25 wt%, 질소원의 전체 첨가량은 2~15 wt%, 바람직하게는 2~10 wt%, 더욱 바람직하게는, 초기 탄소원 첨가량은 1~5 wt%, 초기 질소원 첨가량은 3~8 wt%로 하며, 배양 중에는, 탄소와 질소원을, 더욱 바람직하게는 탄소원만 첨가한다. 고도 불포화 지방산의 수율을 증대시키기 위해서는, 불포화 지방산 전구체로서, 예컨대 헥사데칸 또는 옥타데칸 등의 탄소원; 올레산 또는 리놀레산 등의 지방산 또는 그 염, 또는 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르 또는 소르비탄 지방산 에스테르; 또는 올리브유, 대두유, 채종유, 면실유 또는 코코넛 유지를 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 기질 첨가량은 배지에 대하여 0.001~10 wt%이고, 바람직하게는 0.5~10 wt%일 수 있다. 또한, 이들 기질 중의 임의의 것을 유일한 탄소원으로서 사용하여 배양할 수도 있다.
고도 포화 지방산 생성 미생물의 배양 온도는 미생물에 따라 다르지만, 5~40℃, 바람직하게는 20~30℃ 일 수 있으며, 또는 20~30℃에서 배양하여 균체를 증식시킨 후 5~20℃에서 배양을 계속 유지시켜 불포화 지방산을 생성시킬 수 있다. 이러한 온도 관리에 의하여 생성 지방산 중의 고도 불포화 지방산의 비율을 상승시킬 수 있다. 배지의 pH는 4~10, 바람직하게는 5~9이며, 배양 방법은 통기 교반 배양, 진탕 배양, 고체 배양 또는 정치 액체 배양일 수 있다. 배양은 일반적으로 2~30일, 바람직하게는 5~20일, 더욱 바람직하게는 5~15일 동안 수행된다.
모르티에렐라 (Mortierella) 속 모르티에렐라 아속(亞屬)에 속하는 미생물은 아라키돈산을 주요 구성 성분으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 미생물로서 알려져 있지만, 본 발명자들은 전술한 균주를 변이 처리시킴으로써 디호모-γ-이놀렌산을 주요 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 미생물 (일본 특허 공개 공보 제5-91887호 참조) 및 ω9 계의 고도 불포화 지방산을 주요 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 미생물(일본 특허 공개 공보 제5-91888호 참조)를 얻었다. 또한, 본 발명자들은, 고농도의 탄소원에 내성이 있는 미생물(PCT 특허 공보 WO 98/39468호)을 얻었는데, 이 미생물은 모르티에렐라 속 모르티에렐라 아속에 속하는 미생물이다. 그러나, 본 발명은 모르티에렐라 속 모르티에렐라 아속에 속하는 미생물에 한정되지 않으며, 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생성할 수 있는 어떠한 미생물도 사용할 수 있다.
전술한 방법으로 배양된 미생물로부터 조유를 얻는 방법으로서, 배양액을 살균, 농축, 산성화 등의 처리를 행한 후 또는 직접적으로, 자연 침전, 원심 분리 및/또는 여과 등의 통상의 고체/액체 분리 수단에 의하여 배양 균체를 얻을 수 있다. 응집제 또는 여과 조제를 첨가하여 고체/액체 분리를 촉진시킬 수도 있다. 응집제로서는, 예컨대 염화알루미늄, 염화칼슘, 알긴산, 키토산 등을 사용할 수 있다. 여과 조제로서는, 예컨대 규조토를 사용할 수 있다. 배양 균체는 세정, 분쇄, 건조시킨 것이 바람직하다. 건조는 동결 건조, 풍건, 유동층 건조 등으로 수행될 수 있다. 건조 균체로부터 조유를 얻기 위한 방법은, 유기 용매에 의하여 추출하거나 압착할 수 있으나, 질소 기류하에 유기 용매로 추출하는 것이 좋다. 유기 용매로서는, 에탄올, 헥산, 메탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 페트롤륨 에테르, 아세톤 등을 사용할 수 있고, 메탄올/석유 에테르 교호 추출 또는 클로로포름-메탄올-물로 이루어진 단층계의 용매도 사용할 수 있다. 그러나, 조유를 얻는 데 사용된 추출 방법은 이들 방법에만 한정되지 않으며, 균체로부터 유지를 추출하는 데 효율적인 어떠한 방법도 가능하다. 예컨대, 초임계 추출법을 유효한 수단으로 사용할 수 있다. 유기 용매 또는 초임계 유체로 추출하여 얻은 추출물로부터 감압하 등의 조건하에 유기 용매 또는 초임계 유체 성분을 제거함으로써 목적하는 조유를 얻을 수 있다. 상기 방법 대신에 습균체를 사용하여 추출을 수행할 수도 있다. 이 경우에, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 등의 물에 대한 상용성 용매 또는 물 및/또는 기타 용매가 함유하는 용매류를 비롯한 물에 대하여 상용성의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 기타의 수순은 전술한 바와 동일하다.
또한, 조유 대신에 정제 유지를 에스테르 교환의 기질로서 사용할 수 있다. 유지 정제 공정은 탈고무, 탈산, 스팀 증류, 탈색, 컬럼 처리, 분자 증류, 윈터링(wintering) 등의 통상의 방법으로 수행될 수 있다.
<에스테르 교환 반응에 사용되는 리파제>
본 발명에 사용되는 리파제의 예로서는, 리조푸스 (Rhizopus) 속, 리조무코르 (Rhizomucor) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속 등에 속하는 미생물에 의하여 생산된 것 이외에도, 돼지 췌장 리파제를 들 수 있다. 이들 리파제는 구득이 용이한 것들일 수 있다. 이들의 예로서는, 리조푸스 델레마르 리파제 (Rhizopus delemar lipase) [탈리파제, 타마베 세이야쿠사 (Tanabe Seiyaku)의 제품] (리조푸스 델레마르는 현재, 분류학상 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae)로 분류됨), 리조푸스 니베우스 리파제 (Rhizopus niveus lipase) [(뉴라제 (Newlase) F3G, 아마노엔자임사(Amano Enzyme Co. , Ltd.)의 제품 (리조푸스 니베우스는 분류학상 리조푸스 델레마르와 동일하게 분류되며, 양자는 리조푸스 오리자에로 명명됨], 리조무코르 미에헤이 리파제 (Rhizomucor miehei lipase) 노보 노르디스크사 (Novo Nordisk Co. , Ltd.)의 리보자임 IM, 또는 베리링거 만나헤임사(Berlinger Mannheim)의 키라자임 (Chirazyme) L-9, c.-f., C2, lyo] 및 아스페르길루스 니거 리파제 (Aspergillus niger lipase) [리파제 A, 아마노 엔자임사(Amano Enzyme Co. , Ltd.)의 제품]가 있는데, 이들 효소로 특별히 한정되는 것은 아니며, 1,3-위치 특이적형 리파제라면 어떠한 리파제를 사용하여도 좋다.
상기 리파제의 사용 형태는, 고도 불포화 지방산에 대한 반응 효율을 증진시키고 반복 사용을 위한 안정성을 부여하기 위한 목적으로, 고정화시킨 담체 상에 고정화 리파제를 사용하는 것이 바람직하다. 고정화 담체로서, 셀라이트, 이온 교환 담체, 세라믹, 단백질을 흡착하는 흡착 담체 등을 사용할 수 있다. 예컨대, 셀라이트로서는, 분말상 규조토 및 입상 규조토, 이온 교환수지로서는, Dowex MARATHON WBA (다우 케미컬) 및 DIAION WA30 [미쓰비시 카가쿠], 세라믹으로서는 SM-10(니혼 가이시), 그리고 흡착 수지로서는 DIAION HP 20 [미쓰비시 카가쿠]을 들 수 있다. 상기 이온 교환 수지 등은 단지 일례에 불과한 것으로서, 신규의 개선된 수지가 계속해서 개발되고 있으며, 이들은 구득이 용이하다. 이러한 개선된 수지들도 역시 사용에 있어 적합한 것으로 생각된다.
<에스테르 교환 반응의 반응 온도 및 반응 시간>
에스테르 교환 반응은 효소 반응성을 고려하여 30~60℃에서 수행하는 것이 좋다. 고정화 효소를 사용하여 반응을 연속적으로 수행할 경우, 고정화 효소의 안정성을 고려하여 30~50℃에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 반응에 필요한 시간은 가급적 짧게 반응시키는 것이 좋지만, 반응 후에, 에스테르 교환 유지의 XXA 또는 AAA 함량을 고려하면 1~7일 동안 반응시키는 것이 좋다. 원료 유지(고도 불포화 지방산이 풍부한 유지)는 반응 중에 산화되기 쉽기 때문에, 전술한 방식으로 산소를 제거하는 것이 좋으며, 무산소 조건하에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다.
<에스테르 교환 반응 후의 정제>
이러한 방식으로 에스테르 교환 반응에 의하여 개량시킨 유지는 효소 반응기(컬럼식 반응 또는 배치식 반응기) 내에서 고정화 효소로부터 용이하게 분리될 수 있다. 제조된 유지 성분의 대부분은 트리글리세라이드의 형태이며, 탈산, 탈고무, 탈색, 스팀 증류 등, 유지의 정제에 사용되는 통상의 방법에 의하여 정제할 수 있다.
본 발명의 유지는 미생물이 생산하는 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드의 리파제 에스테르 교환 반응에 의하여 얻은 개량된 유지 또는 트리글리세라이드로서는, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드이며, 1 분자 중에 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 동일한 고도 불포화 지방산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드를 들 수 있다.
본 발명의 유지는 바람직하게는 트리글리세라이드를 90% 이상 함유하는 것이 좋다. 상기 유지는 어떠한 형태도 가능하지만, 본 발명에서는, 디글리세라이드 및 모노글리세라이드, 에스테르 교환에 의한 생성물인 가급적 미량의 유리 지방산 이외에도 이들의 주생성물로서 트리글리세라이드를 포함한다.
본 발명의 유지는, 예컨대 아라키돈산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 아라키돈산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, AAA를 4.0% 이하를 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드는 용도에 있어서 무한한 가능성이 있으며, 식품, 음료, 화장품, 의약품의 원료 및 첨가물로서 사용될 수 있다. 더욱이, 이들의 사용 목적 또는 사용량에 있어서 제한이 없다.
예를 들면, 식품 조성물로서는 일반적인 식품뿐만 아니라, 기능성 식품, 영양 보조 식품, 미숙아용 조제유, 유아용 조제유, 유아용 식품, 임산부용 식품 및 노인용 식품을 들 수 있다. 유지를 함유하는 식품의 예로서는, 육류, 어류 및 견과류 등의 본래 유지를 함유하는 천연 식품, 수프 등의 조리시에 유지가 첨가되는 식품, 도넛 등의 열매체로서 유지를 사용하는 식품, 버터 등의 유지 식품, 쿠키 등의 가공시에 유지가 첨가되는 가공 식품 및 하드 비스켓 등의 최종 마무리 가공시에 유지를 분무 또는 도포하는 식품을 들 수 있다. 또한, 유지를 함유하지 않는, 농산물, 발효 식품, 축산 식품, 수산 식품 또는 음료에 첨가될 수도 있다. 또한, 이들은 기능성 식품 또는 의약품의 형태일 수도 있으며, 예컨대 경장 영양제, 분말, 과립, 로젠지제, 내복막, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등이 있다.
다음에, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하겠다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고정화 효소의 제조 (1,3-특이적 리파제의 고정화에 의한 안정성 부가 및 탈산소화)
이온 교환 수지 (DOWEX MARATHON WBA: 다우 케미컬) 100 g을 리조푸스 델레마르(Rhizopus delemar) 리파제 수용액(탈리파제 분말 12.5%, 타나베 세이야큐사) 80 ml에 현탁시킨 후, 이 현탁액을 감압 건조하여 고정화 효소를 얻었다. 그 다음, 아라키돈산을 40% 함유하는 트리글리세라이드 (SUNTGA40S, 산토리 카부시키카이샤사의 상품명)(25g), 야자유 (15g), 상기 고정화 리파제 (4 g) 및 물 (800 ㎕)을 밀폐시킬 수 있는 병에서 칭량하였다. 반쯤 열린 병을 데시케이터 내에 넣고, 이 데시케이트에 진공 펌프를 연결하여 내용물을 감압하였다. (데시케이터 중의 병에서 유지와 함께 넣은 고정화 효소 담체로부터 유지 중에 거품이 생성되어, 고정화 효소를 함유하는 공기가 방출된다) 이어서, 데시케이터를 질소 가스로 배기시켜 데시케이터 내부를 상압으로 복원시켰다. 이 감압화/상압화 조작을 반복하여 고정화 담체의 매트릭스 중에 존재하는 산소를 질소로 치환하고 병을 밀폐하였다. 그 다음, 고정화 효소의 활성화를 위하여, 병을 30℃에서 24 시간 동안 교반하였다(100 rpm). 활성화 종료후, 활성화에 사용된 유지를 제거하고 탈산소화 조작을 1회 이상 수행하여 활성화한 고정화 효소를 얻었다. 기타 식물성 유지와 함께 에스테르 교환 반응을 수행할 경우, 고정화 효소를 활성화하기 위하여, 야자유 대신에 에스테르 교환에 사용된 식물성 수지를 사용하여, 상기 야자유와 마찬가지로 SUNTGA40S (25g), 식물성 유지 (15g), 고정화 리파제 (2g) 및 물 (800 ㎕)을 혼합하고, 전술한 탈산소화 및 고정화 효소 활성화 공정을 수행하여 에스테르 교환 반응을 행하였다.
실시예 2: 유지 중의 지방산 함량 측정 방법
유지를 약 10~20 mg 스크루 캡 시험관에 채취하고, 여기에 메탄올성 HCl 2 mL와 디클로로메탄 1 mL를 가하여, 시험관 상단을 밀봉하여 50℃에서 3 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 상기 혼합물을 실온까지 냉각시킨 다음, 헥산을 가하여 지방산 메틸 에스테르를 추출하고, 회수된 헥산층을 감압 농축시켰다. 얻은 지방산 메틸 에스테르를 전체 지방산 메틸 에스테르 농도가 약 1%로 되도록 헥산에 용해시켜 가스크로마토그래피(GC) 분석에 제공하였다. GC 분석 조건 및 성분 동정은 문헌 [Official Methods and Recommended Practices of the AOCS 5th Edition (American Oil Chemists' Society, 1998))의,"Fatty Acid Composition by GLC(Method Ce 1b-89)"]에 따라 수행하고, Supelcowax-10 컬럼을 사용하였다. 검출된 전체 피크 면적에 대한 아라키돈산 메틸 에스테르 피크 면적의 비율을, 유지 중의 아라키돈산 함량으로서 기록하였다. 아라키돈산 이외의 지방산들에 대한 각 지방산 함량을 동일한 방법으로 측정하였다.
실시예 3: 트리글리세라이드의 분석 방법
HPLC 분석법을 다음의 조건으로 수행하여 효소 반응으로 개질된 유지 중의 각 트리글리세라이드의 함량을 측정하였다.
컬럼: 역상 컬럼(Cosmosil 4.6×250 mm 5C18-MS)
용매: 아세톤 : 아세토니트릴 (1:1) 1ml/분
분석 시간: 55분
측정기: 굴절계 검출기 (셀온도: 40℃)
시료: 유지 또는 트리글리세라이드를 클로로포름 중에 용해시킨 10% 용액 중 5㎕를 주입
전술한 측정 조건하에서 각각의 트리글리세라이드를 분석하였다. 각각의 트리글리세라이드의 분자종을 일본 특허 공개 공보 제2000-513575호에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 특히, 각각의 트리글리세라이드의 피크를 분리하고, 가수 분해시킨 다음, 메틸 에스테르로 변환시켰다. GC에 의하여 분자종을 결정하였다.
전술한 방법에 의하여 SUNTGA40S 및 에스테르 교환 반응으로 얻은 유지의 각 트리글리세라이드를 분석하고 계산함으로써, SUNTGA40S 아라키돈산의 형태 및 각 XXA 트리글리세라이드의 비율 및 함량을 측정할 수 있었다. XXA는 LLA, PGA, OLA, PLA, OOA, POA, PPA, SOA, PSA, SSA 및 LC22A의 전체 중량%를 나타낸다. 여기에 사용된 약호는 다음과 같다. L: 리놀레산, P: 팔미트산, G: γ-리놀렌산, O: 올레산, S: 스테아르산, C22: 선형 포화된 C22 지방산, X: 아라키돈산 이외의 지방산, A: 아라키돈산. (각각의 지방산 잔기의 글리세린에의 결합 위치는 규정되지 않았다.)
실시예 4: 실시예 1에서 얻은 활성화한 고정화 리파제를 사용한 아라키돈산 함유 유지(SUNTGA40S: 아라키돈산으로서 약 40% 함유)의 개질
이하의 표 3에 나타낸 원료 조성물을 이용하여 30℃에서 교반 (100rpm)함으로써 효소 반응을 수행하고, 에스테르화 반응의 진행 정도를 확인하기 위한 시료 채취를 행하면서 반응을 계속시켰다. 시료 채취된 유지의 트리글리세라이드를 분석하여 AAA 변화량을 측정하였다.
| SUNTGA40S | 25 g |
| 야자유 또는 대두유 | 15 g |
| 고정화 리파제 | 2 g |
도 1은 고도 불포화 지방산이 풍부한 유지 또는 트리글리세라이드의 일종인 아라키돈산 함유 유지를 야자유 또는 대두유 등의 식물성 유지와 혼합하고, 에스테르 교환 반응시킬 때의 AAA 함량의 변화를 나타낸 것이다. 포화 지방산이 풍부한 야자유와의 에스테르 교환 반응에서도, 불포화 지방산이 풍부한 리놀레산계 대두유와는 AAA의 감소 속도가 동일하였다.
이는 사용된 식물성 유지의 종류에 관계 없이, 혼합 비율이 동일하게 되면, 본 발명에 따른 AAA의 소실 속도는 동일하다는 증거이다.
실시예 5: CDM 시험
효소에 의하여 변환된 아라키돈산이 풍부한 유지의 산화 안정화를 확인할 목적으로, 시험 시료를 준비하여 CDM 시험으로 산화 안정화를 측정하였다. CDM 시험은 시료 유지를 반응기에서 가열(일정 온도에서)하면서, 청정 공기를 불어넣고 산화에 의하여 생성된 휘발성 분해물을 물 중에서 포획함으로써 수행하였다. 물의 전도율이 급격히 변화되는 굴곡점까지의 시간 경과에 의하여, 시료 유지의 안정성을 나타내었다. 그의 시간이 짧다는 것은 산화 열화되기 더욱 쉬운 유지를 나타낸다.
실시예 3에 기초하여, 원료 유지 (40g)에 고정화 효소(활성화시킨 것)의 2배량 (4g)을 가하여, 30℃, 100 rpm 에서 반응시켰다. 반응 후, 유지와 고정화 효소를 데칸트로 경사(傾瀉) 분리하여 반응 유지를 얻었다. 얻은 유지의 AAA 함량을 HPLC로 분석하고, CDM 시험에 의하여 안정성을 측정하였다. 반응 시간을 변화시켜, AAA 함량이 다른 개질 유지 1 및 개질 유지 2를 얻었다.
| 시료 | CDM (hr) | AAA 함량 (%) |
| 야자유/SUNTGA40S개질 유지 1개질 유지 2미개질 유지 | 6.45.74.6 | 3.904.446.46 |
| 대두유/SUNTGA40S개질 유지 1개질 유지 2미개질 유지 | 4.13.63.5 | 3.694.287.01 |
표 4에 나타낸 바와 같이, 반응 원료의 식물성 유지로서 야자유인 포화 지방산 유지를 사용한 경우, 문제의 AAA 함량이 감소되고, 유지의 산화에 대한 안정성은 증가되었다.
한편, 리놀레산 유지의 대두유를 반응 원료로 사용한 경우, AAA는 야자유와 유사한 감소를 보였지만, CDM에 의하여 측정된 안정성은 야자유 정도의 높은 효과를 얻지 못하였다.
실시예 6: 야자유로 희석시킨 아라키돈산이 풍부한 유지(SUNTGA40S)의 에스테르 교환 반응에 있어서 시간에 따른 성분 변화
진균이 생산하는 아라키돈산이 풍부한 유지는 AAA를 다량 함유하고 있기 때문에, 모유의 아라키돈산 형태(XXA)에 근접하기 위하여, 리파제 에스테르 교환 반응에 의하여 AAA를 XXA로 변환시키고, 시간적 경과와 각 성분 비율의 변화를 실험적으로 측정하였다.
| 시간 (hr) | ||||
| 트리글리세라이드 성분 (%) | 0 hr | 48 hr | 96 hr | 176 hr |
| AAAXAAXXA | 6.3723.1916.11 | 5.1619.0929.33 | 4.3317.0035.41 | 3.4114.8640.55 |
실시예 1의 방법에 의하여 고정화 효소를 활성화시키고, 이어서, SUNTGA40S 25g 및 야자유 15g을 활성화시킨 고정화 효소 2g에 가하여, 탈산소 후, 30℃에서 반응시켰다. 여러 시간에서 시료 채취를 수행하고, 트리글리세라이드를 실시예 2에 기재된 방법(HPLC 분석법)에 의하여 분석하여, 각각의 성분 함량을 계산하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 시간에 따라 AAA가 감소된 반면, 그 변환체라고 생각하였던 XXA는 증가되었다. 이들 조건하에서, AAA가 유지 혼합 후 약 1/2로 감소되고, XXA가 2배 이상 되는 데에 1주일이 걸렸다. 반응 온도 및 고정화 효소 첨가량의 최적 조건을 결정하기 위해 다음의 실시예를 수행하였다.
실시예 7: 에스테르 교환 반응 중의 반응 온도의 영향
실시예 1에서 제조된 고정화 효소를 사용하여 에스테르 교환 반응에 대한 반응 온도의 영향을 시험하였다. 실시예 1의 방법으로 고정화 효소를 활성화시킨 다음, 활성화한 고정화 효소 2 g에 SUNTGA40S 25g, 야자유 15g을 첨가하고, 탈산소 후에 서로 다른 온도에서 반응시켰다. 반응 1일 후에, 반응시킨 유지 시료를 채취하여, 실시예 2에 기재된 방법(HPLC 분석법)에 따라 트리글리세라이드를 분석하여 AAA 잔존량을 산출하였다 (표 6).
| 반응 온도 | AAA 잔존량(%) | AAA 감소율(%, 24 시간당) |
| 반응 전 | 6.37 | |
| 30℃ | 5.86 | 9% |
| 45℃ | 4.50 | 29% |
| 55℃ | 2.43 | 62% |
에스테르 교환 반응은 60℃ 이하에서 수행하는 것이 일반적이기 때문에, 30℃, 45℃ 및 55℃에서 반응을 수행하여, 반응성을 확인하였다. 상기 표에 나타낸 바와 같이, 에스테르화 반응은. 반응 온도가 높을 수록 더욱 효율적으로 진행된다는 것이 확인되었다. 따라서, 고온하에서의 반응 중의 산화 열화를 방지한다는 의미에서 탈산소 공정은 중요하게 되었다.
실시예 8: 리조쿠코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제를 고정화시킨 효소제에 의한 검토
실시예 5와 동일한 방법으로, 첨가하는 효소의 양을 10%로 하고, 야자유로 희석시킨 SUNTGA40S(산토리 카부시키카이샤사의 상품명)을 사용하여, 실시예 1에서 고정화하여 활성화시킨 리조푸스 델레마르(R. delemar) 리파제와 시판품으로서 입수 가능한 것으로서 물에 의한 활성화가 불필요한 리조푸스 미에헤이(R. miehei) 고정화 리파제(Chirazyme L-9, c.-f., C2, lyo, 베르링거 만헤임 사)의 에스테르 교환 활성을 비교하였다.
| 분자종 | R. delemar | R. miehei |
| AAA | 2.86 | 2.53 |
| XAA | 14.95 | 14.05 |
| XXA | 43.33 | 44.20 |
실시예 3에 기재된 방법(HPLC 분석)으로 각각의 트리글리세라이드를 분석하여 각각의 성분 함량을 산출하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 양효소 반응을 45℃에서 48 시간 수행하였다. AAA의 감소율 및 XXA의 증가율은 양효소가 거의 동등하였는데, 이는 이들의 에스테르 교환 반응에 대한 적합성을 나타내는 것이다.
실시예 9: 에스테르 교환 반응에 의한 아라키돈산의 개량
본 발명자들은 모르티에렐라 속에 속하는 미생물을 배양함으로써, 아라키돈산을 주구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 미생물을 얻고, 공업적 규모로 발효 생산하여 정제된 유지를 얻기 위한 방법을 개발하였다.(히가시야마(Higashiyama) 등, Enhancement of Arachidonic Acid Production by Mortierella alpina 1S-4, J. Am. Oil Chem. Soc., 75, pp. 1501-1505(1998) 참조). 전술한 방법으로 얻은 아라키돈산을 주구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 원료 물질 유지로 하고, 실시예 1의 방법으로 얻은, 탈산소화시켜 활성화시킨 고정화 효소 [리조푸스 델레마르 (R. delemar) 리파제]를 사용하여 식물성 유지인 야자유와 에스테르 교환을 달성하였다. 40 wt%의 아라키돈산을 주구성 지방산으로 함유하는 유지 (250 g), 야자유 (150 g) 및 고정화 효소 (40 g)를 45℃에서 48 시간 반응시켰다. 반응 원료 유지 의 97%가 트리글리세라이드의 형태로 존재하고, 주구성 지방산으로서의 아라키돈산이 25% 존재하고, 트리글리세라이드 중의 트리-아라키돈산 (AAA)가 6.37% 존재하였다. 에스테르 교환 반응에 의하여 얻은 유지를 여과하여 고정화 효소를 분리하여, 트리글리세라이드 95.1%, AAA 2.83% 및 XXA (아라키돈산 잔기가 1개 결합된 모노아라키돈산) 42.3% 함유하는 아라키돈산이 풍부한 유지 또는 트리글리세라이드를 385 g 얻었다.
실시예 10: 에스테르 교환 반응에 의한 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)가 풍부한 유지의 개량
본 발명자들을 모르티에렐라 속 모르티에렐라 아속에 속하는 미생물을 변이 처리시킴으로써, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)를 주구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 생산할 수 있는 미생물을 얻고, 공업적 규모로 발효 생산하여 정제된 유지를 얻기 위한 방법을 개발하였다. (일본 특허 공개 공보 제5-91887호 참조). 전술한 방법으로 얻은 DGLA를 구성 지방산으로서 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드를 원료 유지로서 하고, 실시예 1의 방법으로 얻은, 탈산소화시키고 활성화시킨 고정화 효소 [리조푸스 델레마르 (R. delemar) 리파제]를 사용하여, 식물성 유지인 야자유와 에스테르 교환 반응을 행하였다. 40 wt%의 DGLA를 주구성 지방산으로서 함유하는 유지 (25 g), 야자유 (15 g) 및 고정화 효소 (4 g)를 45℃에서 48 시간 반응시켰다. 반응 초기에는 트리글리세라이드 97.2%, 구성 지방산인 DGLA는 25%로 존재하고, 트리글리세라이드 중의 트리-디호모-γ-리놀렌산(DDD)는 6.09% 존재하였다. 반응시에, 트리글리세라이드는 95.3%, DDD는 트리글리세라이드의 3.03%까지 감소하였다. 따라서, 아라키돈산 함유 유지 또는 트리글리세라이드와 유사하게, DGLA를 주구성 지방산으로서 함유하는 유지 중의 DGLA는 감소되었다.
실시예 11: 아라키돈산 함유 유지(조유)의 제조
아라키돈산 생산 균주로서 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용하였다. 보존 균체를 효모 추출물 1%, 글루코스 배지 2%, pH 6.3에서 접종하여, 28℃의 온도에서 100 rpm의 교반 속도로 종배양(제1 단계)을 개시하여 3일간 유지시켰다. 효모 추출물 1%, 글루코스 2%, 대두유 배지 0.1%로 된 pH 6.3의 배지 30 L를 50L용 통기 교반 배양조에서 제조한 후, 여기에 종배양액 (제1 단계)을 첨가하고, 200 rpm의 교반 속도로, 28℃의 온도에서, 내부압 150 kPa의 조건하에서 종배양 (제2 단계)을 개시하여 2일간 유지시켰다. 다음에, 4500 L의 배지(배지 A: 대두분 270 kg, KH2PO4 16.2 kg, MgCl2·6H2O 2.7 kg, CaCl2·2H2O 2.7 kg, 대두유 54 kg)를 121℃에서 20분간 멸균시켰다. 또한, 800L의 별도의 배지(배지B: 함수 글루코스 108 kg)를 140℃에서 40분간 멸균하고, 이를 상기 배지 A에 첨가하여 배지 C를 제조하였다. 배지 C를 pH 6.1로 조절한 후, 여기에 종배양액(제2 단계)를 옮겨서, 총계 5400 L의 초기 배양액량(배양조 부피 10 kL)으로 만들었다. 온도 26℃, 통기량 49 Nm3/hr 및 내부압 200 kPa의 조건에서 배양을 개시하였다. 또한, 표 8에 나타낸 바와 같이, 배지 유가((培地流加)를 행하여 210 시간 본배양을 행하였다. 배양 종료 후, 배지 유가에 의한 증가분 증발로 인한 감소분의 결과로, 배양액량은 7100L이었다.
| 본배양 시간 | 유가 배지 |
| 19 시간 후 | (함수 글루코스 243 kg + 대두유 54 kg)/400 L |
| 43 시간 후 | 함수 글루코스 243 kg/400 L |
| 67 시간 후 | 함수 글루코스 216 kg/380 L |
| 91 시간 후 | 함수 글루코스 162 kg/300 L |
| 120 시간 후 | 함수 글루코스 108 kg/200 L |
배양 종료 후, 120℃에서 20분간 멸균을 행한 다음, 여과 프레스로로 습균체를 회수하여, 유동층 건조기를 사용하여 2 wt%의 수분 함량까지 건조시키고, 공기 수송기를 사용하여 포장(충전) 장소까지 건조 균체를 수송하였다. 얻은 건조 균체를 부피 약 100 L의 알루미늄 백 내에 질소 가스와 함께 포장하고, 포장 백의 입구를 밀봉한 후, 이를 10 ℃ 이하의 냉장고에서 보관하였다.
컨테이너 백에서 꺼낸 건조 균체를 헥산으로 추출하고, 헥산 용액을 여과하여 고형분을 제거한 후, 감압하에 가열하여 헥산을 제거하고, 아라키돈산을 구성 지방산으로서 함유하는 조유를 얻었다.
조유를 분석한 결과, 총지방산 중 아라키돈산 함량은 29.6%, 트리글리세라이드 함량은 94%이었다.
실시예 12: 실시예 11에서 제조된 유지의 에스테르 교환 반응
실시예 11에서 제조된 아라키돈산 29.6%를 함유하는 조유(트리글리세라이드 94%)를 식물성 유지를 첨가하지 않고 리파제 에스테르 교환 반응만을 행하여 조유의 개량을 시도하였다. 리조푸스 델레마르(R. delemar)의 고정화 리파제를 사용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 탈산소, 활성화하여, 아라키돈산을 29.6% 함유하는 조유 (40g)에 활성화시킨 고정화 효소 (4g)를 첨가하여, 45℃에서 48 시간 교반시키면서 반응시켰다. 반응 초기에, AAA는 6.08%, XXA는 24.15%인 조성을 함유하는 유지는, 반응이 종료시에는 AAA가 3.21%, XXA가 40.37%인 조성으로 변환되었다. 조유를 사용한 경우, 식물성 유지를 일부러 첨가하지 않고, 실시예 6 및 8에 나타낸 바와 같이, 미생물이 생산하는 불포화 지방산을 주구성 지방산으로 함유하는 유지의 에스테르 교환 반응과 유사하게 개량된 유지가 에스테르 교환 반응되었음을 발견하였다.
실시예 13: 우유에의 첨가
분말 우유 100 g에 실시에 9에서 얻은 개질 유지 1 (신규의 에스테르 교환 유지) 0.44 g을 첨가하여 거의 모유와 흡사한 조제유를 제조하였다. 조제유는 전체 지방산에 대하여 아라키돈산 함량이 0.5% 이었다.
실시예 14: 버터에의 첨가
버터 제조 공정 중의 교반 조작으로 버터 우유가 제거된 버터 지방 100 g에 실시예 9에서 얻은 개질 유지 1 (신규의 에스테르 교환 유지)의 1.97을 첨가하고, 이 혼합물을 균일한 조성이 되도록 혼합하여 아라키돈산이 첨가된 버터를 얻었다.
실시예 15: 쥬스에의 첨가
β-덱스트린 2g을 20%의 에탄올 수용액 20 ml에 첨가한 다음, 여기에 교반기에 의하여 교반시키면서 0.05 wt%의 비타민 E를 함유하는 실시예 9에서 얻은 개질 유지 1(신규의 에스테르 교환 유지) 100 mg을 첨가하고, 이 혼합물을 50℃에서 2 시간 배양하였다. 실온까지 냉각 후(약 1 시간), 교반을 계속하면서 4℃에서 10 시간 배양을 꼐속하였다. 생성된 침전을 원심 분리하여 회수하고, n-헥산으로 세정한 후, 이를 동결 건조하여 아라키돈산 함유 트리글리세라이드를 함유하는 시클로덱스트린 포접 화합물 1.8 g을 얻었다. 이 분말 1g을 10 L의 쥬스와 균질하게 혼합하여 아라키돈산 함유 에스테르 교환 유지를 함유하는 쥬스를 조제하였다.
실시예 16: 에스테르 교환에 의하여 동일 분자 중에 중쇄의 지방산 및 아라키돈산을 함유하는 트리글리세라이드를 제조하고 유지를 정제하는 방법.
실시예 1의 방법으로 제조된 고정화 리파제를 실시예 1에 따라 탈산소 및 활성화시켰다. 특히, 40%의 아라키돈산을 함유하는 트리글리세라이드 (SUNTGA40S, 산토기 카부시키카이샤의 상품명)(200 g), MCT (COCONARD RT, 카오사(Kao Corp.)의 상품명) (200 g), 전술한 고정화 리파제 (40 g) 및 물 (8 ml)을 밀폐 가능한 병에 넣고 실시예 1에 기재된 탈산소 및 효소 활성 공정을 수행하였다.
활성화 공정에 사용된 유지를 제거한 다음, SUNTGA40S (200 g) 및 MCT (200 g)을 고정화 효소가 들어있는 병에 새로이 첨가하여 30℃에서 48 시간 교반 (100 rpm)시켰다.
반응 종료 후, 상기 유지를 병에서 꺼내고 에스테르 교환된 유지 중 트리글리세라이드를 실시예 3에 기재된 HPLC법에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 표 9에 나타내었다. HPLC법은 중쇄 지방산 및 에스테르 교환 반응으로 얻은 아라키돈산 함유 트리글리세라이드(예컨대, 1,2-위치에 옥타논산 및 3-위치에 아라키돈산이 있는 트리글리세라이드(88 A), 1,3-위치에 옥타논산, 2-위치에 아라키돈산이 있는 트리글리세라이드 (8A8) 등)를 분리 분석할 수 없다. 따라서, 이를 GC(아래에 나타낸 조건)와 함께 조합하여 88A 및 8A8을 분리 분석하였다. 크로마토그래프상에, 17.01분에 88A가 나타났고, 17.15분에 8A8가 나타났다.
상기 반응으로부터 얻은 각 트리글리세라이드의 함량을 표 10에 나타내었다.
[GC 분석법]
컬럼: Frontier Ultra ALLOY UA-17-15M-0.1F(15m ×0.25 mm ×0.1 ㎛)
컬럼 온도: 260℃ - (1℃/분) - 290℃ - (10℃/분) - 390℃ (5분)
분석 시간: 45분
주입부 온도: 310℃
검출기 온도: 370℃ (수소 이온화 검출기)
캐리어 가스: 헬륨
라인 스피드: 40 cm/분
시료: 헥산 중에 용해된 유지 (트리글리세라이드) 1% 용액 중 1 ㎕ 주입
분석 후 잔존하는 에스테르 교환된 유지를 분자 증류하여, 반응 후에 잔존하는 MCT를 약 85% 제거하였다.
| 트리글리세라이드 | 반응 전(wt%) | 반응 후(wt%) |
| 8A8 등8P88L88O8AAA8AAGAALAAPAASAAC22AAC24AALLAPGAOLAPLAOOAPOAPPASOAPSASSALAC22888기타 트리글리세라이드 | 0.000.000.000.004.840.000.793.065.553.971.303.720.551.880.673.040.602.971.320.901.300.930.5750.0012.04 | 15.876.966.5815.231.676.250.002.864.711.450.280.521.450.910.281.010.000.840.410.700.230.440.2723.277.81 |
8A8 등: 8A8 (88A, 9A8), 8G8, 8D8
지방산은 숫자·문자 기호 (글리세린 골격의 결합 위치를 특정하지 않음)로 표기하였다.
(상기 표에서, 88A 및 8A8 이외의 트리글리세라이드의 글리세린 골격의 위치는 상기 표에 기재하지 않았다.)
지방산 기호 :
8: 옥타노산, A: 아라키돈산, D: DGLA, P: 팔미트산, S: 스테아르산, O: 올레산, G: γ-리놀렌산, L: 리놀레산, C22: 포화 C22 선형 지방산, C24: 포화 C24 선형 지방산
| 트리글리세라이드 | 반응 전(wt%) | 반응 후(wt%) |
| 88A8A888G + 8G888D + 8D888L + 8L888P + 8P888O + 8O88AA + A8AAAAXAA + AXAXXA + XXX888기타 트리글리세라이드 | 0.000.000.000.000.000.000.000.004.8418.3914.7350.0012.04 | 8.365.370.351.796.586.9615.236.251.679.826.5423.277.81 |
트리글리세라이드류는, 1, 2, 3 또는 3, 2, 1 순서로 상기 표에 나타낸 지방산의 결합 위치와 함께, 이들의 구성 지방산의 종류로 나타내었다. 트리글리세라이드 중의 글리세린의 2-위치는 비대칭 탄소이므로, 1-위치 및 3-위치는 엄밀히 말하자면 입체적으로 다르다. 그러나, 1-위치 및 3-위치는 리파제에 의한 인식에 의하여 증명된 생리적 조건과 기본적으로 동등하므로, 트리글리세라이드는 양말단 위치가 중심 지방산(2-위치)에서 바뀌더라도 동일한 것으로 생각된다.
표 중의 기호 설명
지방산은 숫자·문자로 표기하였다.
지방산 기호:
8: 옥타노산, A: 아라키돈산, D: DGLA, P: 팔미트산, S: 스테아르산, O: 올레산, G: γ-리놀렌산, L: 리놀레산, C22: 포화 C22 선형 지방산, C24: 포화 C24 선형 지방산
XAA + AXA: GAA, LAA, PAA, SAA, C22AA, C24AA의 합
XXA + XAX: LLA, PGA, OLA, PLA, OOA, POA, PPA, SOA, PSA, SSA, LAC22의 합
XAA 또는 XXA로 나타낸 특정의 트리글리세라이드(예컨대, PGA)의 지방산 결합위치는 표기하지 않았다. 구체적인 함량은 표 9에 나타나 있다.
Claims (30)
- 진균류가 생산한, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 1종 이상의 유지 또는 트리글리세라이드 50 ~ 100 중량부와 1종 이상의 식물성 유지 또는 트리글리세라이드 0 ~ 50 중량부를 1,3-위치 특이적형의 리파제를 사용하여 에스테르 교환시켜, 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 에스테르 교환 반응은 탈산소 상태에서 수행되는 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 진균류가 생산한 지방산은 ω6 계의 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산인 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 진균류가 생산한 지방산은 ω9 계의 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산인 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 진균류가 생산한 지방산은 아라키돈산인 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 지방산은 모르테에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물에 의하여 생산된 아라키돈산인 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 진균류가 생산한 지방산은 디호모-γ-리놀렌산인 것인 제조 방법.
- 제1항 또는 2항에 있어서, 진균류가 생산한 지방산은 미드산인 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리파제는 리조푸스 델레마르 (Rhizopus delemar), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 또는 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae)인 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 동일한 고도 불포화 지방산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 진균류가 생산한 ω6계의 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는, ω6계의 고도 불포화 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, 탄소 수 20개 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 동일한 진균류가 생산한 ω6계의 고도 불포화 지방산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 진균류가 생산한 ω9계의 고도 불포화 지방산을 15% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는, ω9계의 고도 불포화 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 동일한 진균류가 생산한 ω9계의 고도 불포화 지방산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 아라키돈산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 아라키돈산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나 AAA(분자 중에 아라키돈산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드)를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 디호모-γ-리놀렌산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 디호모-γ-리놀렌산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나 DDD(분자 중에 디호모-γ-리놀렌산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드)를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제1항 내지 9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 미드산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 미드산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나 MMM(분자 중에 미드산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드)를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는, 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 함유하고/함유하거나, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 동일한 고도 불포화 지방산을 3 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 4.0% 이하 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 아라키돈산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 아라키돈산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 및/또는 AAA를 4.0% 이하 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드.
- 디호모-γ-리놀렌산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 디호모-γ-리놀렌산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 및/또는 DDD를 4.0% 이하 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드.
- 미드산을 20% 이상 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드로서, 1 분자 중에 미드산을 1 잔기 함유하는 트리글리세라이드를 40% 이상 및/또는 MMM을 4.0% 이하 함유하는 유지 또는 트리글리세라이드.
- 진균류가 생산한 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산을 20% 이상 함유하는 1종 이상의 유지 또는 트리글리세라이드 50 ~ 100 중량부와 1종 이상의 중쇄의 지방산 트리글리세라이드 (ZZZ) 0 ~ 50 중량부를 1,3-위치 특이적형의 리파제를 사용하여 에스테르 교환시켜, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산 및 1종 이상의 중쇄 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드의 제조 방법.
- 제21항에 있어서, 탄소 수 20개 이상 및 이중 결합을 2개 이상 함유하는 고도 불포화 지방산이 아라키돈산인 것인 제조 방법.
- 제21항 또는 22항에 있어서, 중쇄 지방산 트리글리세라이드는 트리-옥타논산 글리세라이드인 것인 제조 방법.
- 제21항 내지 23 항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의하여 얻은 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 아라키돈산 (A) 및 중쇄 지방산 (Z)을 구성 지방산으로서 함유하는 트리글리세라이드와, ZAZ(중쇄의 지방산 2 잔기 및 아라키돈산 1 잔기를 함유하는 트리글리세라이드, 여기서 아라키돈산은 2번 위치에 결합됨) 및 ZZA(중쇄의 지방산 2 잔기 및 아라키돈산 1 잔기를 함유하는 트리글리세라이드, 여기서 아라키돈산은 1 또는 3번 위치에 결합됨)의 각각을 1 wt% 이상 함유하는 에스테르 교환 유지 또는 트리글리세라이드.
- 제25항에 있어서, 중쇄 지방산은 옥타논산인 것인 에스테르 교환 유지.
- 제10항 내지 20항 및 24항 내지 26항 중 어느 하나의 항에 따른 유지 또는 트리글리세라이드를 함유하는 사람 영양 조성물.
- 제10항 내지 20항 및 24항 내지 26항 중 어느 하나의 항에 따른 유지 또는 트리글리세라이드를 함유하는 식품 조성물.
- 제28항에 있어서, 식품 조성물은 기능성 식품, 영양 보조 식품, 미숙아용 조제유, 유아용 조제유, 유아용 식품, 임산부용 식품 및 노인용 식품인 것인 식품 조성물.
- 제10항 내지 20항 및 24항 내지 26항 중 어느 하나의 항에 따른 유지 또는 트리글리세라이드를 함유하는 동물용 사료.
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