KR20050025648A

KR20050025648A - 물질을 동정하는 방법

Info

Publication number: KR20050025648A
Application number: KR1020057001209A
Authority: KR
Inventors: 그라처사빈; 드후프멜치에; 마이베른하르트
Original assignee: 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2002-07-23
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-03-14
Also published as: EP1527340A2; CN1672046A; ZA200500326B; DE50312072D1; EP1527340B1; IL166345A0; CA2493323A1; KR101089048B1; US8642259B2; US20040092474A1; AU2003260308B2; HK1083534A1; RU2325652C2; CN100397078C; MXPA05000837A; IL166345A; DE10233516A1; NO20050919L; JP4546827B2; ATE447176T1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 리포터 유전자를 지닌 세포를 분석하여 세포 증식에 영향을 미치는 표적 분자의 활성에 영향력을 제공할 수 있는 물질을 동정하는 세포성 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 하나 이상의 세포를 시험할 물질과 접촉시키는 단계, 세포 증식을 검출하는 단계 및 리포터 유전자 생성물을 검출하는 단계로 이루어진다.

Description

물질을 동정하는 방법{Method for identifying substances}

도 1은 다중 수용체 포맷에서 이중 리포터 유전자 분석의 원리를 설명한다. 도 1a는 효능제 유도된 성장 판독을 도시한다. 도 1b는 효능제 유도된 β-갈락토시다제 매개 색상 판독이다. 최종적으로 도 1c는 이중 효능제 유도된 성장 및 색상 판독을 도시한다.

도 2A 내지 D는 YNL279w 프로모터를 기본으로 하는, 균주를 작제하는데 사용되는 플라스미드를 도시한다.

도 3은 단지 하나의 리포터 유전자를 사용하는 것과 비교하여 이중 리포터 유전자 분석법이 어떻게 효모 액체 분석법의 수행능을 개선시키는지를 설명한다.

도 4는 사용되는 Gα이식체의 함수로서 효모 시그날 전달 경로에 대한 사람 브래디키닌 B2 수용체의 결합을 지적한다. 공(empty) 벡터 p426GPD는 항상 대조군으로서 사용된다.

도 5는 이중 리포터 유전자 분석법이 또한 길항제를 스크리닝하는데 사용될 수 있음을 지적한다. 여기에 나타낸 예는 사람 브래디키닌 B2 수용체와 공 벡터 대조군이다.

도 6A 및 B는 YNL279w 프로모터를 사용하는 경우, 효소 기질과 29시간동안 항온처리한 후에도 FUS1 프로모터를 사용하는 경우 보다 명백히 적은 기본 시그날이 생성됨을 지적한다.

도 7은 다중 수용체 포맷에서 분석 수행 방법을 설명한다. 도 7A는 다양한 GPCR이 각각의 경우 별도의 효모 균주에서 발현되고 이들 모두가 함께 하나의 균주에서 발현되지 않음을 설명한다. 도 7B는 미세역가 플레이트에서 단일 수용체 포맷과 비교하여 다중 수용체 포맷에서의 분석 수행능을 입증한다.

도 8은 효소 기질인 CPRG가 단지 리간드와 항온처리한 후에 세제와 함께 첨가되는 경우 분석 수행능이 증가함을 지적한다.

재료 및 방법

플라스미드 및 효모 유전학

모든 분자 생물학적 및 유전학적 조작은 표준 방법[문헌참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York; Guthrie und Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego]에 따라 수행하였다.

수용체에 대한 발현 작제물:

모든 발현 작제물은 에피좀 2μ효모 이. 콜리 셔틀 벡터 p426GPD(문헌참조: Mumberg et al., Gene 156, 119-122(1995))를 기본으로 한다. 사람 G 단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 cDNA 서열을 당해 벡터의 GPD 프로모터와 CYC 터미네이터 사이에 클로닝하여 효모 세포에서 항상성으로 고발현되도록 한다. 하기의 사람 GPCR은 당해 벡터에 클로닝하였다: EDG1 수용체(Genbank NM_001400), EDG5 수용체(Genbank NM_004230), 브래디키닌 B2 수용체(Genbank NM_000623), M1 무스카린 수용체(Genbank NM_000738), 성장억제호르몬 SSTR2 수용체(Genbank NM_001050), M3 무스카린 수용체(Genbank NM_000740).

효모 균주:

모든 효모 균주는 ATCC 기탁번호 제208352호하에 기재된 사카로마이세스 세레비지애 야생형 W303-1a를 기본으로 한다.

유전자형: MATa, ade2-1, ura3-1, his3-11, trp1-1, leu2-3, leu2-112, can1-100.

2개의 상이한 세트의 효모 균주를 사용하였다. 하나의 세트는 YLJ21로부터 유래하는 것이고 리포터 유전자를 발현하기 위해 FUS1 유전자의 프로모터를 사용하는 반면 또 다른 세트는 YSG13으로부터 유래하고 YNL279w 유전자의 프로모터를 사용한다.

효모 균주 YLJ21은 에케하르트 레버러(Ekkehard Leberer)에 의해 제공되었다.

유전자형: MATa, ste2::KanR sst2::ura3^FOA far1::hisG FUS1::HIS3 mfa2::FUS1-lacZ::ura3^FOAade2-1, ura3-1, his3-11, trp1-1, leu2-3, leu2-112, can1-100.

페로몬 반응 경로의 활성화는 HIS3 유전자 좌위 및 MFA2 유전자 좌위에서 각각 통합된 2개의 리포터 유전자 FUS1::HIS3 및 FUS1-lacZ의 도움으로 측정할 수 있다. FAR1 유전자는 hisG 반복체로 대체되어 세포는 심지어 페로몬 반응 경로가 활성화되는 경우라도 계속 성장할 수 있다. SST2 유전자는 URA3 유전자로 대체되어 Sst2p의 GTPase 기능으로 인한 G 단백질 시그날의 하향 조절을 차단한다. ura3 마커는 각각의 경우 5-플루오로오로트산 함유 배지상에서 선별함에 의해 다시 회수하였다. α인자 수용체를 암호화하는 유전자 STE2는 KanR 유전자로 대체하였다.

효모 균주 YSG13은 하기와 같이 제조하였다:

유전자형:

MATa, ste2::KanR sst2::pYNL279w-HIS3 far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 ade2-1, ura3-1, his3-11, trp1-1, leu2-3, leu2-112, can1-100

균주 작제:

ste2::KanR

효모 STE2 유전자를 가나마이신 내성 유전자로 대체하기 위해, 플라스미드 pLJ51을 BamHI 및 EcoRI로 절단하였고 이를 사용하여 야생형 효모 균주 W303-1a를 형질전환시켰다. YPD+G418 배지상에서 선별하였다.

sst2::pYNL279w-HIS3

또 다른 단계에서, 효모 SST2 유전자는 YNL279w 프로모터의 통제하에 HIS3 유전자를 발현시키는 카세트로 대체하였다. 당해 목적을 위해, 플라스미드 sst2::279LHIS3/pCR-BluntII는 BamHI 및 NotI로 절단하였고 이를 사용하여 형질전환시켰다. SC/Gluc-His+α인자 배지상에서 선별하였다.

far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2

이어서, FAR1 유전자는 YNL279w 프로모터의 통제하에 β-갈락토시다제에 융합된 Fus1p의 136개의 N-말단 아미노산의 발현을 허용하는 카세트로 대체하였다. 당해 목적을 위해, 플라스미드 pBSfar1::YNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 w/o를 SacII 및 XhoI로 절단하였고 이를 사용하여 형질전환시켰다. SC/Gluc-Ade 배지상에서 선별하였다.

모든 단편의 게놈으로의 올바른 통합은 항상 PCR를 통해 조사하였다.

이식체의 YLJ21 및 YSG13으로의 도입:

균주 YLJ21 및 YSG13으로부터 개시하여, 효모 게놈에서 효모 G 단백질 α-서브유니트 Gpa1의 마지막 5개의 아미노산은 최종적으로 사람 G 단백질 α-서브유니트의 마지막 5개의 아미노산으로 대체하였다. 당해 목적, 예를 들어, 효모 균주 YEW3를 작제하기 위해, 플라스미드 GPA1-C5-G알파 q 통합체를 SacI로 절단하였고 이를 사용하여 효모 균주 YLJ21을 형질전환시켰다. SC/Gluc-Trp 배지상에서 선별하였다. 기타 이식체는 동일한 방식으로 통합하였다. 표 1은 다양한 이식체 및 이로부터 유도된 효모 균주를 열거한다.

G 단백질 이식체

GPA1/GαX 이식체	대표적인 사람 G 단백질 α서브유니트	5C-말단 아미노산	FUS1 프로모터	YNL279w프로모터
GPA1	-	KIGII	YLJ21	YSG13
i1	t, i1, i2	DCGLF	YEW11	YEW25
i3	i3	ECGLY	YEW7	YEW21
o	o1, o2	GCGLY	YEW8	YEW22
z	z	YIGLC	YEW12	YEW26
q	q, 11	EYNLV	YEW3	YEW17
14	14	ENFLV	YEW6	YEW20
16	15,16	EINLL	YEW2	YEW16
12	12	DIMLQ	YEW13	YEW27
13	13	QLMLQ	YEW14	YEW28
s	s1, s2	QYELL	YEW1	YEW15

이중 리포터 유전자 분석:

벡터 p426GPD로 클로닝된 사람 GPCR을 사용하여 적당한 효모 균주를 형질전환시키고 30℃에서 3일동안 탄소원으로서 2% 글루코스를 함유한 우라실 부재의 SC 선별 플레이트(SC/Gluc-Ura)상에서 배양하였다. 따라서 수득된 단일 세포 콜로니를 사용하여 SC/Gluc-Ura중의 2ml의 밤샘용 배양물에 접종한다. 다음날, 세포를 SC/Gluc-Ura-His(pH 6.8)중에서 1:100으로 희석한다. 리포터 유전자 발현용 FUS1 프로모터를 사용하는 효모 균주의 경우에, 2 내지 10mM의 3-아미노트리아졸(3-AT, Sigma)를 추가로 당해 배지에 첨가한다. 각각의 경우, 90㎕의 희석된 세포 현탁액을, 이미 연구될 리간드 10㎕를 함유하는 96웰 미세역가 플레이트로 피펫팅한다. 플레이트를 30℃에서 5 내지 24시간동안 진탕하에 또는 진탕 부재하에 배양한다. 이어서 각각의 웰에 분석 혼합물 50㎕를 첨가한다. 분석 혼합물은 150㎍/ml의 디기토닌(Sigma), 300㎍/ml의 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노사이드(CPRG, Roche) 및 300mM의 인산나트륨 완충액(pH 6.7)으로 구성된다. 2시간동안 30℃에서 진탕하에 또는 진탕 부재하에 배양시킨 후, β-갈락토시다제 활성을 분광광도계(Spectramax Plus, Molecular Devices)로 574nm에서의 흡광도로서 측정한다. 데이타를 분석하고 그래프패드 프리즘 3.0 컴퓨터 프로그램을 사용하여 용량 반응 곡선을 작성한다. 모든 측정은 3회 측정치의 평균치이다.

실시예 2:

단독의 하나의 리포터 유전자를 사용한 것과 동시에 2개의 리포터 유전자를 사용한 것의 비교

효모 균주 YLJ21을 공 벡터 p426GPD 또는 p426GPD에 클로닝되었던 사람 GPCR EDG1 및 EDG5로 형질전환시켰다. 이어서 형질전환된 효모를 30℃에서 2ml의 SC/Gluc-Ura중에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배양물을 2mM 3-AT 부재(도 3A) 또는 존재(도 3B)하에 SC/Gluc-Ura-His 배지(pH 6.8)로 1:100으로 희석하였다. 각각의 경우, 희석된 세포 현탁액 90㎕를 각각의 경우 연속 희석된 스핑고신 1-포스페이트(Biomol) 또는 대조군으로서 순수한 물 10㎕를 이미 함유하고 있는 96웰 미세역가 플레이트의 웰에 피펫팅한다. 당해 플레이트를 30℃에서 23시간동안 진탕(700rpm)시키면서 배양하였다. 효모 세포의 성장으로부터 비롯된 탁도는 광도계로 630nm에서 측정하였다(도 3A 및 B, 각각의 경우 왼쪽 그래프). 이어서 웰당 분석 혼합물 50㎕를 첨가하였다. 30℃에서 2시간동안 진탕시키면서 배양한 후, β-갈락토시다제 활성을 광도계로 574nm에서 흡광도로서 측정하였다. 도 3A의 왼쪽 그래프는 리포터 작제물로서 FUS1-HIS를 사용하는 경우, 어떠한 용량 반응 곡선도 3-AT의 첨가 없이는 가시화되지 않음을 지적한다. FUS1 프로모터는 시그날 전달 경로의 자극 없이도, 즉, 프로모터가 엄격하게 조절되지 않는 경우에도 배지상에서 매우 높은 기본 시그날을 유도한다. 대조적으로, His3p의 경쟁 억제제인 3-AT 2mM이 첨가되는 경우, 기본 시그날은 억제되고 측정된 시그날의 수준은 EDG1 또는 EDG5가 발현되는 경우(도 3B, 왼쪽 그래프) 배지중의 스핑고신 1-포스페이트의 양에 의존한다[문헌참조: Ancellin et al., J Biol Chem 274, 18997-19002(1999)]. 도 3A의 오른쪽 그래프는 LacZ 리포터 유전자가 또한 허용가능한 용량 반응 곡선을 유도하지만 측정 허용범위가 매우 작음을 설명한다. 도 3B의 오른쪽 그래프는 HIS3 및 LacZ의 동시 사용이 시그날 대 기준치 비율을 몇배 더 우수하게 함을 지적한다. 전반적으로, 당해 실험은 사람 GPCR EDG1 및 EDG5가 효모 내인성 Gα서브유니트 Gpa1p를 통해 페로몬 반응 경로에 커플링할 수 있음을 지적한다.

실시예 3

사람 브래디키닌 B2 수용체를 Gα이식체를 통해 효모의 시그날 전달 경로로 결합시킴에 의한 이중 리포터 유전자 분석법

효모 균주 YLJ21(Gpa1), YEW1(Gpa1/Gαs), YEW2(Gpa1/Gα16) 및 YEW3(Gpa1/Gαq)는 공 벡터 p426GPD 또는 사람 브래디키닌 B2 수용체가 클로닝된 p426GPD로 형질전환시킨다. 당해 분석은 상기된 바와 같은 표준 조건하에 2mM의 3-AT의 존재하에 수행하였다. 사용되는 리간드는 천연 효능제 브래디키닌(Sigma)이고 항온처리는 20시간동안 수행하였다. 도 4는 브래디키닌 B2 수용체가 단지 Gpa1p만이 유용한 경우 페로몬 반응 경로에 거의 결합할 수 없다는 사실을 설명한다. 대조적으로, 효모가 Gα이식체 Gpa1/Gα16 또는 Gpa1/Gαq를 발현하는 경우, 수용체는 당해 시그날 전달 경로에 성공적으로 결합하였다. Gpa1/Gαq는, 사람 브래디키닌 B2 수용체가 천연 세포 환경에서 Gαq와 커플링함으로서 예상되는 바와 같이 가장 효과적인 커플링을 허용한다[문헌참조: Hall, Pharmacol. Ther. 56, 131-190(1992)].

실시예 4:

길항제 분석을 위한 이중 리포터 유전자 분석법의 사용

효모 균주 YEW3(Gpa1/Gαq)을 공 벡터 p426GPD 또는 사람 브래디키닌 B2 수용체가 클로닝된 p426GPD로 형질전환시켰다. 당해 분석은 실시예 2와 유사한 방식으로 수행하였다. 단지 차이는 시험 플레이트의 각각의 웰이 1nM의 브래디키닌 효능제를 함유하고 여기에 길항제 HOE140(Sigma; Hall, Gen. Pharmacol. 28, 1-6(1997))의 희석물이 첨가되었다는 것이다. 도 5는 증가량의 HOE140이 브래디키닌에 의해 유발된 시그날을 기본 수준으로 억제함을 지적한다. 따라서, 이중 리포터 유전자 분석법은 또한 길항제 분석을 위해 적합하다.

실시예 5:

FUS1 프로모터와 YNL279w 프로모터의 비교

효모 균주 YEW3(Gpa1/Gαq, FUS 프로모터) 및 YEW17(Gpa1/Gαq, YNL279w 프로모터)를 공 벡터 p426GPD 또는 사람 브래디키닌 B2 수용체가 클로닝된 p426GPD로 형질전환시켰다. 당해 분석은 상기된 바와 같은 표준 조건하에 YEW3의 경우 2mM 3-AT의 존재하에 수행하였고 YEW17의 경우에는 3-AT 부재하에 수행하였다. 분석 혼합물을 첨가한 후, β-갈락토시다제 활성은 2시간 후 및 다시 29시간 후에 측정하였다. 도 6A 및 보다 구체적으로, 도 6B에서 나타낸 바와 같이, 수용체 형질전환된 균주 또는 기타 공 벡터로 형질전환된 대조군 균주의 기본 시그날은 3-AT가 배지내에 존재하더라도 FUS1 프로모터의 경우에 시간이 경과함에 따라 상당히 증가한다. YNL279w 프로모터의 경우, 기본 시그날은 시간이 경과해도 실질적으로 변화하지 않는다. 3-AT는 첨가될 필요가 없다. 이로부터, YNL279w가 매우 엄격하게 조절되는 것으로 결론지을 수 있다. 이것은 특히, 시간 마다 정확하게 측정할 필요가 없어 보다 유동적인 작업을 가능하게 하기 때문에 고속 분석법에서 유리함을 입증한다.

실시예 6:

다중 수용체 포맷(다중 포맷)에서 분석 수행

YEW3(Gpa1/Gαq)을 사람 M1 무스카린 수용체로 형질전환시키고 YLJ21(Gpa1)은 성장억제호르몬 수용체 2 및 EDG5로 형질전환시켰다. 수용체는 p426GPD에 클로닝하였다. 당해 과정은 상기된 표준 방법에 따라 수행하였다. 당해 수용체는 단독으로 또는 혼합물로 시험되었다. 혼합물의 경우에, 단독 시험에서와 같이 동일한 밤샘용 배양물을 사용하였다. 이들은 SC/Gluc-Ura-His(pH 6.8)중에서 단지 1:100의 희석으로 혼합하였고 따라서, 혼합물은 전반적으로 단독의 시험에서의 세포 보다 3배 많은 세포를 함유한다. 도 7A는 모든 수용체가 별도로 별현되지 하나의 세포에서 함께 발현되지 않음을 설명하고자 한 것이다. 리간드 카바콜(Sigma; 10^-8M 내지 10^-2M로의 희석), 성장억제호르몬-14(Bachem; 10^-10M 내지 10 ^-4M) 및 스핑고신 1-포스페이트(Biomol, 10^-10M 내지 10^-4)을 사용한 항온처리는 24시간동안 수행하였다. 도 7B에서 나타낸 바와 같이, 효능제는 또한 혼합물중에서 검출될 수 있다.

실시예 7:

β-갈락토시다제에 대한 2개의 검출 방법의 비교

통상적으로, 효모 CPRG 분석은, 수용체 형질전환된 세포가 리간드와 접촉하고 있는 전체 기간동안 CPRG가 배지에 존재하는 방식으로 수행한다[문헌참조: Brown et al., Yeast 16, 11-22(2000) and WO 99/14344]. 도 8은 당해 방법과 본 발명에 설명된 방법을 비교한 것이다. YEW3(Gpa1/Gαq)를 p426GPD에 클로닝된 사람 M1 및 M3 무스카린 수용체를 사용하여 형질전환시켰다. 밤샘용 배양물을 기재된 바와 같이 배양하였고 이어서 2개의 상이한 배지에서 OD₆₀₀이 0.02가 되도록 1:100으로 희석하였다. 한 경우(도 8A)에, 세포는 SC/Gluc-Ura-His, 2mM 3-AT, 0.1mg/ml의 CPRG, 0.1M의 인산나트륨 완충액(pH 7)중에서 희석하였다. 다른 경우에, 분석은 2mM 3-AT의 존재하에 상기된 바와 같이 수행하였다(도 8B). 무스카린 수용체에 대해 사용된 리간드는 카바콜이었다. 도 8A의 데이타에 대해 28시간동안 분석을 수행한 후 광도계에서 분석 플레이트를 분석하였다. 도 8B의 경우에, 26시간동안 항온처리함에 이어서 분석 혼합물을 첨가하였다. 2시간 후에 측정하였다.도 8이 설명하는 바와 같이, CPRG 및 세제의 첨가, 본 경우에 디기토닌의 첨가는 리간드와의 항온처리 후에만이 분석 수행능을 상당히 개선시킨다. 본원에 기재된 방법의 또 다른 잇점은 특히, 스크리닝동안에 화학적 화합물과의 장기 항온처리 동안에 가능한 CPRG의 상호작용이 배제될 수 있다는 사실이다.

실시예 1

G 단백질-커플링된 수용체의 활성에 작용하는 물질에 대한 스크리닝

제약 산업을 위해 가장 중요한 부류의 표적 분자중 하나는 G 단백질 커플링된 수용체이다. 과거에, 수많은 대표적인 당해 단백질 계열이 점차적으로 클로닝되었고 약리학적 특성이 분석되었다. 현재 전체 사람 게놈의 서열이 분석된 이래로, 다수의 GPCR이 서열 수준에서 최근에 동정되었다. 제약 산업의 주요 목적은 현재 광범위한 라이브러리의 물질을 스크리닝하여 당해 수용체에 대한 리간드를 동정하는 것이다. 불행하게도, 현재 방법 및 기술을 사용하여 물질을 모색하기 위한 실질적인 장애는 당해 수많은 표적 분자에 대해 당해 라이브러리를 스크리닝해야하기 때문에 시간과 비용이 요구된다는 것이다. EP 0 708 922 B1은 세포 배양물에서 다수의 GPCR을 동시에 스크리닝하기 위한 가능성을 논의하고 있다. 당해 문헌에 기재된 포유동물 세포는 GPCR을 과발현하고 수용체를 활성화시키는 물질과 접촉하였을때 이에 응답하여 성장이 증가된다. 당해 물질에 의해 활성화된 수용체를 발현하지않는 세포일지라도 비록 느리지만 계속 성장하기 때문에 당해 시험 시스템의 민감성은 매우 높지 않다. 더욱이, 당해 방법은 배양 시간이 매우 길기 때문에 시간 소모적이고 포유동물 세포 시스템이기 때문에 고비용이다.

저렴하게 GPCR를 스크리닝하는 한가지 가능성은 효모를 기반으로 하는 시험 시스템을 사용하는 것이다. 시간은 또한 약제 연구에서 매우 중요한 요소이기 때문에 본 발명의 목적은 다수의 GPCR을 동시에 스크리닝할 수 있게 하는 효모 시스템을 고안하는 것이다. 고속 스크리닝에 사용하기 위해서는 당해 방법은 조작하기가 매우 용이하고 매우 큰 측정 허용범위(measurement window)를 가져야만 한다. G 단백질 커플링 수용체(GPCR)은 다수의 생리학적 과정에 중요한 역할을 수행한다. 이들은 지금까지 공지된 것중에 가장 중요한 단백질 계열중 하나이고 사람 게놈에서 약 1000개의 유전자가 당해 수용체 부류를 암호화하고 있는 것으로 추정된다. GPCR은 특징적인 구조를 갖는다. 이들은 세포막의 인지질 이중층을 통과하면서 7개의 α-헬릭스 형태로 휘감아 이들 자신이 원형 패턴으로 배열되어 있는 통합 막 단백질이다. 현재 처방을 통해 유용한 약제의 약 50%가 GPCR에 결합하는 것으로 평가된다. 이것은 제약 산업에서 당해 수용체 부류의 중요성을 강조한다. 당해 단백질 계열의 크기 및 중요성 덕택으로 및 많은 GPCR(희귀 GPCR)에 대한 화학적 결합 파트너가 아직 공지되어 있지 않다는 사실의 관점에서, 당해 수용체 계열은 미래의 신규 약물을 모색하는데 있어서 적합한 표적 단백질에 대한 가장 중요한 보고중 하나일 것으로 추정할 수 있다.

모든 G 단백질 커플링된 수용체는 공통된 기본 원칙에 따라 작용한다: 세포외 리간드의 결합은 수용체 단백질에 형태적 변화를 유도하여 후자가 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질(G 단백질)과 접촉할 수 있도록 한다. 원형질 막의 세포질 측면에 위치한 G 단백질은 세포외 신호를 세포내부로 매개한다. 수용체의 특이성에 따라, 이들은 다양한 시그날 전달 경로를 자극할 수 있고 이들 모두는 예를 들어, cAMP, cGMP, Ca²⁺ 등과 같은 제2 메신저의 형성을 유도하여 세포내 단백질의 활성화 또는 불활성화를 통해 세포내 반응을 자극한다. 이종삼량체 G 단백질은 3개의 서브유니트, α, β및 γ를 포함한다. G 단백질에서, 이종삼량체 GDP는 Gα서브유니트에 결합한다. 리간드 활성화된 수용체와의 상호작용은 GDP를 GTP로 대체시킨다. 이로부터 비롯된 형태적 변화는 G 단백질 이종삼량체가 α서브유니트 및 βγ복합체로 해리되도록 유도한다. 활성화된 α서브유니트 및 βγ복합체 둘다는 세포내 효능인자 단백질에 영향을 줄 수 있다. α서브유니트는 4개의 상이한 종류로 분류될 수 있다: Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα12.

GPCR은 시그날 전달에 관여하는 G 단백질에 따라 분류되는데, 즉, Gs 계열의 GPCR은 Gαs의 활성화를 통해 아데닐레이트 사이클라제 자극을 매개함에 따라서 세포내 cAMP 농도를 증가시킨다. Gi 계열의 GPCR은 Gαi의 활성화를 통해 아데닐레이트 사이클라제 억제를 매개함에 따라서 세포내 cAMP의 농도를 감소시킨다. Gq 계열의 GPCR은 Gαq의 활성화를 통해 다양한 PLCβ동형(isoform)의 자극을 매개하여 막 결합 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트를 가수분해시켜 디아실글리세롤 및 이노시톨 트리포스페이트(IP₃)의 생성을 유도한다. IP₃은 세포내 저장물로부터 Ca²⁺를 방출시킨다. Gα12는 rho-특이적 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자와 상호작용한다.

당해 시그날은 GTPase 활성을 갖는 Gα서브유니트가 결합된 GTP를 가수분해할때까지 유지된다. RGS(G 단백질 시그날 전달 조절인자) 단백질 계열의 구성원은 Gα서브유니트의 GTPase 활성에 대해 활성화제로서 작용함에 의해 시그날의 지속성을 제어한다. 당해 G 단백질 조절 시그날 전달 시스템은 모든 진핵 시스템에 공통된 것으로 나타난다.

당해 시그날 시스템의 매우 널리 특징 분석된 예는 제빵 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 "페로몬 반응 경로"이다. MATa 교배 유형을 갖는 효모 세포는 STE2 유전자가 암호화하는 수용체를 발현한다. 당해 수용체는 α인자와 결합함에 의해 활성화되고 펩타이드 페로몬은 기타 교배 유형(MATα)의 효모 세포에 의해 방출된다. 효모의 이종삼량체 G 단백질은 유전자 GPA1(Gα), STE4(Gβ) 및 STE18(Gγ)의 생성물로 이루어진다. Gβγ복합체는 Ste2p 수용체의 활성화 후 방출되고 시그날을 미토겐-활성화된 단백질 키나제 연속 반응으로 전달한다. 이것은 사이클린-의존성 키나제 억제제 Far1p를 활성화시켜 세포 주기를 정지시키고 교배 과정에 관여하는 다수의 유전자(예를 들어, FUS1)를 전사 유도한다. 당해 경로는 RGS 계열의 한 구성원인 Sst2p에 의해 탈감작된다. 기타 교배 유형(MATα)의 효모 세포는 상이한 수용체(Ste3p)를 발현함에 따라서 MATa 세포에 의해 방출되는 다른 페로몬(a-인자)에 응답한다. 이를 제외하고는 2개의 교배 유형에 사용되는 시그날 장치는 동일하다. 포유동물 GPCR이 효모의 G 단백질 시그날 시스템에 커플링될 수 있음은 수차례 입증되었다. 래트 성장억제호르몬(somatostatin) 2 수용체(문헌참조: Price et al., Mol Cell Biol 15, 6188-6195(1995)) 및 래트 아데노신 A_2a 수용체(문헌참조: Price et al., Molecular Pharmacology 50, 829-837(1996))를 포함하는 몇몇 수용체는 직접적으로 효모 Gα단백질 Gpa1p와 상호작용할 수 있는 반면에 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체(GHRHR)(문헌참조: Kajkowski et al., J Recept Signal Transduct Res 17, 293-303(1997))를 포함하는 기타 수용체는 Gpa1p와 비양립성이다. 그럼에도 불구하고 당해 수용체가 커플링할 수 있기 위해, 효모 Gα서브유니트가 결실될 수 있고 대신에 이종 수용체가 전장 포유동물 Gα서브유니트와 함께 발현된다. 이와는 별도로서, Gpa1p의 C 말단 도메인(펩타이드 서열의 약 3분의 1)이 포유동물 Gα서브유니트의 상응하는 영역으로 대체된 하이브리드 Gα서브유니트가 양쪽 방법에 사용되었다[문헌참조: WO 95/21925]. 하이브리드 또는 기타 변형되거나 이종 Gα서브유니트는 효모 시그날 전달 시스템과 커플링할 수 있기 위해서는 몇몇 기준을 충족시킬 필요가 있다. 가장 중요한 하나는 당해 서브유니트가 효율적으로 효모 Gβγ에 결합하여 활성화된 GPCR의 부재하에 시그날을 방해할 수 있느냐는 것이고 또 다른 한편 효능제에 의해 활성화된 수용체에 효과적으로 결합하여 시그날을 도입할 수 있느냐하는 것이다. 문헌[참조: Conklin et al., Nature 363, 274-276(1993)]은 처음으로, Gαq의 5개의 C-말단 아미노산이 상응하는 Gαi 서열(Gαqi5)에 의해 대체됨에 따라서 정상적으로 Gαi 커플링된 수용체가 Gαq 시그날 전달 경로에 재커플링될 수 있도록 하는 하이브리드를 보고하였다. 문헌[참조: WO 99/14344 and Brown et al., Yeast 16, 11-22(2000)]은 이러한 동일한 방법이 또한 효모에서 작용함을 입증한다. 이 경우에, Gpa1p의 5개의 C-말단 아미노산은 모든 사람 Gα단백질의 상응하는 아미노산으로 대체되었다. 소위 "이식체(transplant)"로 호칭되는 이들 하이브리드를 사용함으로써 수많은 포유동물 GPCR을 효모의 교배 경로에 커플링시킬 수 있다.

본 발명에 사용되는 효모 균주는 SST2, FAR1 및 세포의 교배 유형에 따라 STE2 또는 STE3 유전자가 결실되어 있다. RGS 단백질 계열의 구성원인 SST2는 결실되어 있어 시그날의 하향 조절을 차단한다. FAR1의 결실은 페로몬 반응 경로가 작동되지 않는 상황하에서도 세포를 계속 증식시킬 수 있다. STE2 또는 STE3의 비작동은 이종삼량체 G 단백질에 대한 목적하지 않은 경쟁을 차단한다. GPA1 유전자는 효모 게놈에서 상기된 이식체로 대체되었다. 천연 유전자 좌위에서 GPA1 프로모터의 통제하에 있는 당해 이식체의 발현은 이종삼량체 G 단백질의 화학양론이 유지되는 것을 보장한다. 생물학적 유기체의 하나 이상의 GPCR-의존성 시그날 전달 경로의 작용은 억제 또는 자극 방식으로 변형될 수 있다. 시그날 전달 경로 의존성 측정가능한 시그날이 화학적 화합물의 부재하에서보다 존재하에서 보다 약해지는 경우 당해 화학적 화합물은 억제 작용을 갖는 것이다. 당해 작용을 유발하는 화합물은 또한 길항제로서 언급된다. 한편, 시그날 전달 경로 의존성 측정가능한 시그날이 화학적 화합물의 부재하에서보다 존재하에서 보다 강해지는 경우 당해 화학적 화합물은 자극 작용을 갖는 것이다. 당해 화합물은 또한 효능제로서 언급된다. 유전자 FUS1, FUS2[문헌참조: Cismowski et al., Nat Biotechnol 17, 878-883(1999); Frederickson, Nat Biotechnol 17, 852-853(1999)] 및 YNL279w(WO 02/40660)의 프로모터를 사카로마이세스 세레비지애에서 기능적 분석에 사용하는 것이 문헌에 보고되었다. 교배 인자에 의한 페로몬 반응 경로의 자극에 응답하여 당해 유전자의 발현이 증가된다. 당해 유전자중 하나의 프로모터 요소가 작동적으로 구조 유전자에 연결되는 경우, 당해 구조 유전자(또한 리포터 유전자로서 언급됨)의 발현은 기재된 효모 시그날 전달 경로를 통해 조절될 수 있다. 당해 리포터 유전자는 일반적으로, 특정 물질(예를 들어, CYH2 또는 G418^R)에 대해 내성 또는 민감성을 부여하는 자극된 시그날 전달 경로 또는 유전자의 경우에서 처럼 상응하게 고갈된 배지에서 세포 성장을 허용하는 HIS3 또는 기타 영양요구성 마커 유전자(예를 들어, URA3, LEU2, ADE2, LYS1 또는 TRP1)과 같은 내인성 성장 마커이다. 그러나, 또한 β-갈락토시다제(LacZ) 또는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 세포내 효소 또는 포스파타제(PHO5)와 같은 분비된 효소를 암호화하는 리포터 유전자를 사용할 수 있다. 사용되는 리포터가 CAN1인 경우, 카나바닌 함유 배지에서 세포는 성장한다. 이종으로 발현된 GPCR의 활성화제(효능제)의 존재하에 CAN1 유전자가 발현되어 세포는 카나바닌 함유 배지에서 더 이상 성장할 수 없다. 억제제(길항제)의 첨가는 당해 선택 배지에서 배양물의 성장을 유도한다. 문헌에 보고된 효모 GPCR 분석법은 FUS1 프로모터(FUS-1-HIS3 또는 FUS1-lacZ)의 통제하에 있는 단지 하나의 리포터 유전자, 주로 HIS3 또는 LacZ를 사용한다[문헌참조: Price et al., Mol Cell Biol 15, 6188-6195(1995); Price et al Molecular Pharmacology 50, 829-837(1996); Campbell et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2413-2418(1999); Pausch, Trends Biotechnol 15, 487-494(1997)]. FUS1-HIS3이 사용되는 경우, 시그날 전달 경로의 활성화는 히스티딘 부재의 액체 배지에서 효모 배양물의 탁도로서 측정된다. 본 발명자의 실험은 단일 성장 판독을 통해 시그날 대 기준치 비율이 액체 배양에서 약 30-50:1임을 입증하였다(도 1a 및 3 참조). 효소 기질로서 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노시드(CPRG)를 사용한 β-갈락토시다제 액체 분석법은 자극 후, 시그날이 기준치 보다 약 2 내지 3배 증가함을 보여주었다(도 1b 참조). 추가로 측정 허용범위를 증가시키고자 2개의 리포터 유전자를 동시에 효모 세포에 사용하였고 이것은 2개의 측정된 시그날을 증대시켜야만 한다. 도 1c는 당해 원리를 설명한다. 이러한 이중 리포터 유전자 분석법은 결과적으로 시그날 대 기준치 비율을 약 100 내지 150:1로 개선시켰다. 문헌[참조: Brown et al., Yeast 16, 11-22(2000)]은 유사한 분석법을 기재하고 있다. 여기에 또한 FUS1-HIS3 및 FUS1-lacZ를, 기질로서 CPRG를 사용하는 β-갈락토시다제 액체 분석법에 사용하였다. CPRG는, 리간드를 사용하여 수용체를 자극시키는 전체 기간동안에 여기에 첨가된다. 대조적으로, CPRG는, 리간드를 사용한 수용체의 자극 후에만 완충액중의 세제와 함께 당해 방법에 첨가되고 β-갈락토시다제의 측정을 상당히 개선시켰다. 한편, CPRG가 리간드 유도된 성장 동안에 존재하는 경우, 후자는 용이하게 억제되는 한편 CPRG는 단지 어렵게 원형질 막을 통해 세포 내부에 도달할 수 있다. CPRG가 단지 성장이 종료된 후에 원형질 막을 붕괴시킬 수 있는 세제와 함께 첨가되는 경우 2개의 문제가 해결된다. 바람직한 양태에서, 당해 방법은 이중 리포터 유전자 분석법을 사용하는 것이고 하나의 리포터는 성장 마커이고 또 다른 리포터 유전자는 효소 또는 GFP이다. 단지 이러한 성장, 대수 증식 및 다소 선형 유도된 측정가능한 효소 또는 형광 단백질의 발현의 조합은 기재된 시그날을 증폭시키는데, 즉, 대형 측정 허용범위를 유도한다. EP 0 708 922 B1(Acadia Pharmaceuticals)은 또한 수용체 자극에 대한 응답으로서 성장을 기초로하는 방법을 기재하고 있다. 이 경우에, 리간드 자극된 수용체 발현 세포는 비자극 세포보다 신속하게 성장한다(EP 0 708 922 B1의 도 2 및 도 10 참조). 그러나 본원에 기재된 발명에서, 당해 비자극된 효모 세포는 전혀 성장하지 않는다(목록된 예 참조(예를 들어, 도 3B의 왼쪽 그래프 참조)). EP 0 708 922 B1은 또한 측정가능한 시그날로서 이종으로 발현된 효소 β-갈락토시다제의 활성을 사용한다. 그러나 여기에서, LacZ는 항상성으로 발현되기 때문에 측정된 효소 활성은 단지 리간드에 의한 시그날 전달 경로의 자극에 대한 응답으로서 성장한 세포 수에 대한 척도인 것이지 시그날 전달 경로 자극의 강도에 대한 척도는 아니다. 대조적으로, 본원에 기재된 발명에서 LacZ 발현은 페로몬 반응 경로에 의해 유도된 프로모터(예를 들어, FUS1 또는 YNL279w)의 통제하에 있다. 도 3A는, 효모 세포가 동일한 수일지라도(왼쪽 그래프), β-갈락토시다제의 측정가능한 활성은 첨가되는 리간드의 양, 즉 시그날 전달 경로 자극(오른쪽 그래프)의 강도에 의존한다. EP 0 708 922 B1(p 10)에 따르면, 세포의 "증폭"은 특히, "수용체로 형질 감염되지 않은 세포의 성장과 비교하여 "수용체 형질감염된 세포의 성장을 의미하는 것으로서, 즉 수용체 형질감염되고 형질감염되지 않은 세포 둘다는 성장할 수 있지만 형질감염된 세포가 리간드로 자극된 후 보다 신속하게 성장한다. 제33면 및 제44면상의 도면은 이를 설명한다. 기재된 세포주에는 발현되어 성장을 가능하게 하는 어떠한 리포터 작제물이 없다. 성장을 가능하게 하는 유일한 변형은 리간드 자극된 과발현된 수용체이다.

그러나 바람직한 양태에 따라 이중 선별이 수행된다: 영양 배지는 여기서 사용되는 효모 균주가 생존을 위해 필요한 물질인 우라실 및 히스티딘이 결핍되어 있다. 본 발명자는 수용체 플라스미드에 대한 선별 마커로서 URA3 유전자를 사용했기 때문에 수용체 플라스미드가 없는 세포는 전혀 성장할 수 없다. 수용체 DNA 형질감염된 세포는 또한 원칙적으로, 이들이 리간드의 존재에 의해 자극되지 않는 경우 당해 영양 배지상에서 성장할 수 없다. 리간드가 발현된 수용체 유전자 HIS3에 결합되는 경우에만 세포는 당해 영양 배지상에서 성장할 수 있다. 원칙적으로, 수용체로 형질감염되었지만 리포터 유전자로서 HIS3과 같은 임의의 성장 마커를 함유하지 않는 효모 균주는 증식에 응답하지 않는다.

기재된 방법은 단일 수용체 포맷 및 다중 수용체 포맷(다중 포맷) 둘다에 사용될 수 있다. 당해 분석법의 잇점은 특히 다중 수용체 포맷에서 명백하게 나타난다. 도 1c는 이를 설명하기 위한 것이다. 이론적으로는 적합한 리간드(화학적 화합물 또는 천연 리간드)와 접촉하는 경우 자극에 대한 응답으로서 기타 비응답 효모 세포의 기준치로부터 증가하기 위해 특정 수용체를 발현하는 단일 효모 세포로도 충분해야한다. 이러한 방법은 다수의 GPCR이 동시에 스크리닝될 수 있도록 하기 때문에 고속 스크리닝을 위한 잇점을 가져다 준다. 특히, 제약 산업에서 중요한 희귀 GPCR은 처음부터 명백하지 않기때문에 본원에 기재된 방법은 회사의 시간 및 비용의 투자를 최소화한다. GPCR이 커플링하는 Gα서브유니트는 또한 밝혀지지 않았기 때문에 본 발명의 방법은 또한 다수의 이식 균주에서 하나 이상의 희귀 GPCR을 동시에 시험할 수 있는 가능성을 제공한다.

본 발명은 표적 분자의 활성에 영향력을 제공할 수 있는 물질을 동정하는 세포성 방법에 관한 것이다. 세포성 표적 분자에 작용하는 신규 약제의 개발은 통상적으로 이들이 연구될 표적 분자에 효과를 갖는지의 여부에 대해 다양한 잠정적인 활성 물질을 연구할 수 있게 하는 생화학적 또는 세포성 기능적 분석법을 사용한다. 세포성 분석법은 통상적으로 연구될 표적 분자의 활성이 세포 증식에 효과를 갖는 성장 기반 시험 시스템을 기초로 작용한다. 추가로, 표적 분자의 활성이, "리포터 유전자 생성물"의 활성 또는 발현을 기준으로 검출 가능하고 정량 가능한 시험 시스템은 공지되어 있다. 양 유형의 분석법은 고속 스크리닝(HTS)에서도 표적 분자의 활성을 조절하는 신규 활성 물질이 동정될 수 있도록 하지만 이들 공지된 시험 시스템의 단점은 이들이 보통 시그날 대 기준치 비율이 상대적으로 낮아 특히, HTS 포맷으로 사용되는 경우 이의 특이성이 매우 낮다는 것이다. 언급된 선행 기술의 단점의 관점에서, 본 발명의 목적은 HTS 포맷에서 고도로 효율적인 스크리닝을 가능하게 하는 시험 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명에 따라, 당해 목적은,

a. 하나 이상의 리포터 유전자를 지닌, 분석할 하나 이상의 세포를 시험될 물질과 접촉시키는 단계;

b. 세포 증식을 검출하는 단계 및

c. 리포터 유전자 생성물의 활성을 검출하는 단계를 포함하여,

상기 세포를 분석함으로써 세포 증식에 효과를 갖는 표적 분자의 활성에 영향력을 제공할 수 있는 물질을 동정하는 세포성 방법에 의해 성취된다.

세포 증식 및 리포터 유전자 활성의 검출은 반드시 상기 순서일 필요는 없다.

리포터 유전자는 세포의 게놈내로 통합되어 안정하게 또는 일시적으로 당해 세포내로 형질감염될 수 있다. 용어 "리포터 유전자 생성물"은 mRNA 및 단백질 둘 다를 포함한다. 적합한 리포터 유전자 및 이의 생성물은 당업자에게 충분히 잘 공지되어 있고 본 발명에서는 특히 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제, 산성 포스파타제 또는 형광 단백질(예를 들어, GFP, BFP, 아에쿠오린) 등과 같은 효소가 적합하다. 리포터 유전자에 대해 적합한 프로모터는 특정 시험 시스템의 유형 및 표적 및 사용되는 세포 유형에 의존한다. 리포터 유전자는 바람직하게 표적 분자가 직간접적으로 커플링되어 있는 시그날 형질도입 경로를 통해 조절되는 프로모터의 통제하에 있다. 외부에서 첨가된 기질을 전환시키는 것을 토대로 활성이 검출가능한 효소를 생성하는 리포터 유전자가 바람직하다.

본 발명의 범위내에서의 표적 분자는 사용되는 세포 증식에 직간접적인 효과를 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, 표적 분자는 방법에 사용되는 세포의 증식에 영향력을 발휘하여 활성 상태에서는 당해 세포를 직접적으로 활성화시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 표적 분자는 항상성으로 활성일 수 있고 시험될 물질에 의해 억제되거나 불활성 상태로 존재할 수 있고 시험될 물질에 의해 활성화될 수 있다. 그러나 바람직한 양태에 따라, 표적 분자는 단지 당해 증식에 직접적으로 영향을 주는 분자(예를 들어, 효모 세포에서 FUS-1-HIS3, 하기 참조)의 중재에 의해서만 활성 상태에서 당해 방법에 사용될 세포의 증식에 영향력을 발휘한다. 원칙적으로, 모든 유형의 세포외, 막 결합 또는 세포내 생물학적 분자는 표적 분자로서 적합하고 사람 생분자, 특히, 단백질 또는 핵산, 세포 분열의 시그날 전달 연속 반응의 구성원들중에서 특히 GPCR, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제 등이 바람직하다.

분석될 물질의 표적 분자에 대한 영향은 예를 들어, 표적 분자 자체와의 상호작용 또는 표적 분자의 활성 또는 발현에 직접 효과를 갖는 분자에 영향력을 제공함에 의해 표적 분자의 활성을 촉진시키거나 억제할 수 있다

세포 증식 및 리포터 유전자 생성물 활성은 순수하게 정성적으로 또는 기타의 정량적으로 검출될 수 있고 다양한 유형의 검출법(예를 들어, 현탁액중의 세포의 경우 액체 배양물의 탁도를 결정함에 의해 또는 리포터 유전자 생성물 활성 등의 비색 측정 또는 발광 측정에 의해 직간접적으로 세포 밀도를 측정하여)은 통상적으로 당업자에게 공지되어 있다.

바람직한 양태에 따라, 표적분자의 활성은 리포터 유전자 생성물의 활성, 바람직하게는 발현에 효과를 갖는다. 당해 표적 분자는 직접적으로(표적 분자 자체가 리포터 유전자 생성물의 활성/발현에 영향을 준다) 또는 간접적으로(표적 분자는 이에 의해 활성화되는 세포 대사 또는 시그날 전달 연속 반응을 통해 리포터 유전자 활성 또는 발현에 영향을 준다) 리포터 유전자 생성물의 활성 또는 발현에 작용할 수 있다.

표적 분자는 바람직하게 이종 분자(즉, 천연적으로 존재하지 않거나 본 발명의 방법에 사용되는 세포에서 발현되지 않는 분자)이고 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편이 특히 바람직하다. 이종 표적 분자는 세포의 게놈내로 통합되거나 안정하게 또는 일시적으로 당해 세포에 형질감염될 수 있으며 당해 표적 분자의 발현은 항상성이거나 유도성일 수 있다.

바람직한 양태에 따라, 이종 표적 분자는 키메라 분자와 상호작용함에 의한 방법에 사용되는 세포의 증식에 작용한다. 본 발명에서는 이종 표적 분자가 사람외 세포, 특히, 효모 세포의 게놈내로 안정하게 통합되고 이종 분자와 상호작용하고 효모 세포에 고유한 시그날 전달 연속 반응 또는 대사 연속 반응에 통합할 수 있는 키메라 분자를 통해 세포 증식에 영향을 주는 사람 분자인 방법이 특히 바람직하다. 본 발명에서는 아미노산 서열이 사람 및 효모 부분인 재조합 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편인 키메라 분자가 특히 바람직하다. 본 발명의 범위내에서는 이종 표적 분자로서 사람 GPCR과 키메라 G 단백질 서브유니트와의 조합("이식체", 하기 참조)이 특히 적합하고, 원칙적으로 키메라 형태로 존재하는 임의의 서브유니트일 수 있다.

기질 전환을 기준으로 결정되는 활성을 갖는 리포터 유전자 생성물을 사용하는 경우, 분석될 물질의 첨가 후에, 특정 시간 지체 후 기질을 첨가하는 것이 유용하다. 바람직하게, 분석될 물질과 기질의 첨가 사이의 시간 간격은 적어도 당해 방법에 사용되는 세포가 1회의 세포 주기를 완료하는 시간이고 특히, 2회 내지 24회 세포 주기를 완료하는 간격이 바람직하다. 효모 세포를 사용하는 경우, 시간 간격은 바람직하게 약 4 내지 48시간이고 바람직하게는 20 내지 30시간이고 특히 24시간이다.

리포터 유전자의 활성은 바람직하게 세포를 붕괴시키거나, 특히 바람직하게는 세포 벽이 침투성이 되게하거나 이를 파괴하는 물질(간편하게 세제 또는 2개 이상의 세제의 배합물; 특히 디기토닌, 트리톤 X-100, 노니데트 P-40, 트윈 20, CHAPS 또는 SDS가 적합하다)을 첨가함에 의해 검출된다. 각각의 경우 최종 농도를 기준으로, 농도 범위가 10 내지 600㎍/ml, 바람직하게는 20 내지 400㎍/ml이고 특히 바람직하게는 40 내지 60㎍/ml인 디기토닌 및/또는 농도 범위가 0.005 내지 0.4용적%, 바람직하게는 0.01 내지 0.2용적%인 트리톤 X-100이 특히 바람직하다. 세제는 바람직하게 완충액, 특히 당업자에게 충분히 널리 공지된 조건을 갖는 적합한 완충액(생리학적 완충액, 중성 pH, 등장성 염 농도 등)중의 반응 혼합물에 첨가한다.

광범위한 세포 유형이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 기본적으로, 원핵생물 및 진핵생물 둘다, 식물 또는 동물 세포가 적합하다. 그러나, 진핵 세포가 바람직하고 특히 포유동물 세포 또는 효모 세포가 바람직하고, 특히, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 균주가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따라, 적어도 표적 분자의 유형이 서로 상이한 다양한 세포가 사용되고 단일 방법 또는 단일 과정 수행으로 동시에 스크리닝된다("다중 방법").

특히, 바람직한 양태에 따라, 본 발명은 클로닝된 G 단백질 커플링된 수용체에 대한 리간드로 작용하는 물질을 동정하는데 광범위하게 사용가능한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 민감하고 강도가 있어 다중 포맷의 고속 분석법에서 다수의 GPCR을 동시에 분석할 수 있다.

본 발명은 예시적 양태 및 도면을 참조로 하기에서 추가로 설명된다.

Claims

a) 하나 이상의 리포터 유전자를 지닌, 하나 이상의 세포를 시험할 물질과 접촉시키는 단계,

b) 세포 증식을 검출하는 단계 및

c) 리포터 유전자 생성물의 활성을 검출하는 단계를 포함하여, 상기 세포를 분석함으로써 세포 증식에 있어 효과가 있는 표적 분자의 활성에 영향력을 제공할 수 있는 물질을 동정하는 세포성 방법.
제1항에 있어서, 표적 분자의 활성이 리포터 유전자 생성물의 활성, 바람직하게는 발현에 대해 효과를 갖는 방법.
제1항에 있어서, 표적 분자가 이종 분자, 바람직하게는 이종 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편인 방법.
제1항에 있어서, 리포터 유전자 생성물이 기질의 전환을 기초로 활성이 검출될 수 있는 효소인 방법.
제4항에 있어서, 기질이 분석될 물질의 첨가 후, 특정 시간 지체 후 첨가되는 방법.
제5항에 있어서, 분석될 물질과 기질의 첨가 사이의 시간 간격이, 사용되는 세포가 1회 이상의 세포 주기, 바람직하게는 2 내지 24회 세포 주기를 완료하는 지속시간에 상응하는 방법.
제1항에 있어서, 리포터 유전자 생성물의 활성이 세포를 붕괴시킴에 의해, 바람직하게는 세포 벽을 침투가능하게 하거나 이를 파괴하는 물질과 함께 기질을 첨가함에 의해 검출되는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자 자체가 세포 증식에 영향력을 발휘하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 직접적으로 증식에 영향을 주는 분자를 개재시켜 세포 증식에 대해 영향력을 발휘하는 방법.
제9항에 있어서, 표적 분자가 키메라 분자와 상호작용함에 의해 세포 증식에 작용하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 효모 세포, 바람직하게는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 기원의 효모 세포인 방법.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적 분자를 갖는 세포들이 하나의 방법에서 동시에 스크리닝되는 방법.