CN1672046A - 鉴定物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定能够影响靶分子活性的物质的细胞方法,其中,待分析的细胞携带至少一种报道基因且所述靶分子的活性影响细胞增殖。所述方法包括使至少一种细胞接触待测物质,检测细胞增殖,并检测报道基因产物的活性。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴定能够影响靶分子活性的物质的细胞方法。
背景技术
作用于细胞靶分子的新药物的开发通常利用生化或细胞功能测定法进行,这些测定法能研究许多假定的活性物质是否可以影响待研究的靶分子。
细胞测定法通常以基于生长的测试体系为基础发挥作用,在所述系统中待研究的靶分子的活性对细胞增殖产生影响。此外,还已知如下测试体系,其中根据“报道基因产物”的活性或表达,可以检测和定量靶分子的活性。虽然即使在高流通量筛选(HTS)中,所说的两种类型测定法都能够鉴定调控靶分子活性的新活性物质,但这些已知测试体系仍存在缺点,即,它们通常相对低的信噪比(signal-to-background ratio),这使得它们的特异性非常低,尤其当它们以HTS格式应用时。
鉴于所提及的现有技术的缺点,本发明的一个目的是提供能在HTS形式中进行高效筛选的测试体系。
发明内容
依照本发明,这个目的通过用于鉴定能够影响靶分子活性的物质的细胞方法达到,其中待分析的细胞携带至少一种报道基因且该靶分子的活性影响细胞增殖,该方法包括下列步骤:
a.使至少一种细胞接触待测物质;
b.检测细胞增殖,
c.检测报道基因产物的活性。
细胞增殖的检测和报道基因活性的检测不一定要以上述次序进行。
报道基因可整合入细胞基因组或稳定或瞬时转染进入所说细胞。术语报道基因产物包括mRNA和蛋白质。适宜的报道基因及其产物对于本领域技术人员来说是众所周知的,且在此特别适宜的是诸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶之类的酶或诸如GFP、BFP、水母发光蛋白之类的荧光蛋白质,等等。用于报道基因的适宜启动子取决于具体测试体系的类型和靶目标以及所用的细胞类型。报道基因优选处于如下启动子的控制下,所说的启动子通过靶分子所直接或间接地偶联的信号传导途径进行调节。优选产物是酶的报道基因,其中所说的酶的活性可通过外部添加的底物的转化进行检测。
本发明范围内的靶分子可以直接或间接作用于所用细胞的增殖。就此而论,靶分子可以对本方法所用细胞的增殖施加影响(并因此,在活性状态下,直接激活或抑制所说的细胞)。靶分子可以例如具有组成型活性并被待测物质抑制,或者可以以非活性状态存在并被待测物质激活。不过,按照优选的实施方案,靶分子仅以活性状态通过干扰直接影响本方法所用细胞的增殖的分子来影响所述细胞的增殖(如,酵母细胞中的FUS1-HIS3,见下文)。原则上,所有类型的细胞外的、膜结合的或细胞内的生物分子都适于作为靶分子,尤其优选人的生物分子,特别是蛋白质或核酸,其中特别是细胞分裂信号转导级联反应的成员,特别是GPCR、蛋白激酶、蛋白质磷酸酶,等。
待分析的物质对靶分子的影响可以促进或抑制后者的活性,例如通过与靶分子本身相互作用或通过影响能作用于靶分子的活性或表达的分子来实施促进或抑制作用。
可以纯粹定性或定量地检测细胞增殖和报道基因产物的活性,本领域技术人员已知各种类型的检测(例如通过测定细胞悬浮液中液体培养物的混浊度来直接或间接的测定细胞密度;报道基因产物活性的比色测定或发光测定(luminometric),等等)。
按照优选的实施方案,靶分子的活性对报道基因产物的活性(优选其表达)有影响。所说靶分子可以直接(靶分子本身影响报道基因产物的活性/表达)或间接(靶分子通过激活细胞代谢或信号级联反应影响报道基因的活性或表达)影响报道基因产物的活性或表达。
靶分子优选异源分子(即非天然存在或表达于本发明方法所用细胞中的分子),尤其优选寡核苷酸、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白质、或蛋白质片段。异源靶分子可以整合入细胞基因组中或者通过稳定或瞬时转染进入所说的细胞,靶分子的表达可以是组成型的或诱导型的。
根据优选的实施方案,异源靶分子通过与嵌合分子的相互作用而作用于本方法所用细胞的增殖。在此特别优选这样的方法,其中异源靶分子是稳定整合入非人细胞,尤其是酵母细胞的人分子,其通过能与异源分子相互作用并能参与酵母细胞固有的信号转导级联反应或代谢级联反应的嵌合分子影响细胞的增殖。在此尤其优选地,所说嵌合分子是氨基酸序列具有来自人的部分和来自酵母的部分的重组蛋白质、多肽或蛋白质片段。在本发明范围内特别适宜的是作为异源靶分子的人GPCR与嵌合G蛋白亚基(“移植体”,见下文)的组合,原则上任何以嵌合形式存在的亚基均是可以的。
在使用基于底物转化来测定其活性的报道基因时,在添加待分析物质后延迟加入底物是有利的。添加待分析物质与添加底物之间的优选时间间隔至少是本发明方法所用细胞完成一个细胞周期的时间,尤其优选2-24个细胞周期的时间间隔。在使用酵母细胞时,时间间隔优选为约4-48小时,优选20-30小时,尤其是24小时。
报道基因的活性优选通过破碎细胞来检测,尤其优选通过添加透化或破坏细胞壁的物质(方便的是一种去污剂或两种或多种去污剂的组合;在此特别适宜的是毛地黄皂苷、Triton X-100、Nonidet P-40、Tween 20、CHAPS或SDS)来进行细胞破碎。尤其优选浓度为10-600μg/ml,优选20-400μg/ml,特别优选40-60μg/ml的毛地黄皂苷,以及/或浓度为0.005%-0.4%体积,优选0.01%-0.2%体积的Triton X-100,所说的每个浓度指的都是终浓度。优选在缓冲溶液中将去污剂加到反应混合物中,尤其适宜的缓冲条件对于本领域技术人员来说是众所周知的(生理缓冲液、中性pH、等渗盐浓度,等等)。
各种各样的细胞类型都可以用于本发明的方法中,因此,原则上,原核和真核细胞、植物或动物细胞都是适宜的。不过,优选真核细胞,尤其优选哺乳动物细胞或酵母细胞,特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
根据本发明的另一优选实施方案,使用多种细胞并同时通过一个处理或方法流程进行筛选,其中所说细胞彼此至少由于靶分子的不同类型而不同(“复式方法”,multiplex method)。
按照一个特别优选的实施方案,本发明涉及一种可以用于鉴定作为克隆的G蛋白偶联受体之配体的物质的广泛可用的方法。本发明的方法灵敏而有效,因此可以在高流通量试验中以复合形式同时测定多种GPCR。
本发明通过以下例证性的实施方案和附图得到了进一步的描述。
具体实施方式
筛选影响G蛋白偶联受体活性的物质
制药业上最重要的一类靶分子是G蛋白偶联受体。在过去,已有众多此蛋白家族的代表性蛋白质被逐步克隆并进行了药理学表征。因为目前已对整个人类基因组进行了测序,所以最近已在序列水平上鉴定到大量GPCR。目前制药业的一个主要目标是通过筛选全面的物质文库鉴别这些受体的配体。遗憾的是,利用目前的方法和技术发现这些物质存在着实质性障碍,即在所说文库中筛选此众多的靶分子需要的时间和成本。EP 0 708922 B1讨论了在细胞培养物中同时筛选多种GPCR的可能性。其中描述的哺乳动物细胞过量表达GPCR,并且在与激活受体的物质接触时有生长增加的反应。因为不表达所说物质所激活的受体的细胞仍然继续生长(虽然相比较而言生长更慢),所以该测试体系的灵敏度不是非常高。此外,因为保温时间很长,此方法是耗时的,而因为是哺乳动物细胞体系,所以此方法又是昂贵的。
低成本筛选GPCR的一种可能方案是使用基于酵母的测试体系。因为时间也是制药学研究中一个非常重要的因素,所以本发明的目的是设计一种可以同时筛选许多GPCR的酵母体系。为了可以用于高流通量筛选中,所说方法应非常易于操作并具有非常大的测量窗口。
G蛋白偶联受体(GPCR)在许多生理学过程中起着重要的作用。它们是目前已知的最重要的蛋白质家族之一且据推测人类基因组中约1000个基因编码这种受体。GPCR具有特征性结构:它们是以α-螺旋形式7次环绕排列穿越细胞膜磷脂双层的整合膜蛋白。据估计目前约50%的处方药物与GPCR结合。这增强了此类受体对于制药业的重要性。由于此蛋白质家族的大小和重要性,而且鉴于许多GPCR(孤儿GPCR)的化学结合配偶体仍是未知的这一事实,可以认为此类受体将是未来寻找新药用物质时用作适宜靶蛋白的最重要储备之一。
所有的G蛋白偶联受体都按照一个共同的基本原则发挥作用:与细胞外配体的结合导致受体蛋白质构象改变,从而使得受体蛋白可以与鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)接触。位于质膜胞质侧的G蛋白介导了信号从胞外向细胞内部的传导。依赖受体的特异性,它们可激发各种信号转导途径,所有这些均导致诸如cAMP、cGMP、Ca2+等第二信使或其它第二信使的形成,而这些第二信使通过激活或失活细胞内蛋白质引发细胞内的反应。异源三聚体G蛋白包含α、β和γ三个亚基。在G蛋白异源三聚体中GDP与Gα亚基结合。与配体活化的受体的相互作用导致GDP被GTP取代。由此产生的构象改变导致G蛋白异源三聚体解离成一个α亚基和一个βγ复合体。活化的α亚基和βγ复合体都会影响细胞内效应蛋白。α亚基可划分为四种不同的类型:Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。
按信号转导中所涉及的G蛋白对GPCR进行分类,即,Gs家族的GPCR通过Gαs的活化介导腺苷酸环化酶的刺激作用并因此提高细胞内cAMP的浓度。Gi家族的GPCR通过Gαi的活化介导腺苷酸环化酶的抑制作用并因此降低细胞内cAMP的浓度。Gq家族的GPCR通过Gαq的活化介导各种PLCβ同种型的刺激作用并导致膜结合磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解成二酰甘油和肌醇三磷酸(IP3)。IP3使Ca2+自胞内贮库释放。Gα12与rho特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用。
信号维持到具有GTPase活性的Gα亚基水解结合的GTP为止。RGS(G蛋白信号传导调节剂)蛋白家族成员通过作为Gα亚基GTPase活性的活化剂来调控信号的持续时间。此G蛋白控制的信号转导系统似乎对于所有真核体系都是共同的。
在这一信号体系中得到充分鉴定的一个例子是面包酵母(酿酒酵母)的“信息素应答途径”。MATa交配型的酵母细胞表达STE2基因编码的受体。此受体通过α因子的结合被激活,α因子是另一交配型(MATα)酵母细胞所释放的肽信息素。酵母的异源三聚体G蛋白由基因GPA1(Gα)、STE4(Gβ)和STE18(Gγ)的产物组成。Gβγ复合体在Ste2p受体活化后被释放并将信号转换成促分裂原活化蛋白激酶级联反应。这引起细胞周期蛋白依赖型激酶抑制剂Far1p的活化,从而导致细胞周期滞止,并引起对交配过程中所涉及的许多基因(如,FUS1)的转录诱导。此途径通过RGS家族的一个成员-Sst2p脱敏。另一交配型(MATα)的酵母细胞表达不同的受体(Ste3p)并因此对MATa细胞释放的另一信息素(a-因子)产生反应。除此之外,两种交配类型所用的信号传导设备是相同的。
已数次证实了哺乳动物GPCR可以与酵母的G蛋白信号系统偶联。一些受体,包括大鼠促生长素抑制素2受体(Price等,Mol Cell Biol 15,6188-6195(1995))和大鼠腺苷A2a受体(Price等,Molecular Pharmacology50,829-837(1996))可与酵母Gα蛋白质Gpa1p直接相互作用,而其它受体,包括生长激素释放激素受体(GHRHR)(Kajkowski等,J ReceptSignal Transduct Res 17,293-303(1997))则与Gpa1p不相容。不过,为了使这些受体能够进行偶联,可以将酵母Gα亚基缺失,并改为表达异源受体和全长哺乳动物Gα亚基。或者,可以利用杂合的Gα亚基,其中Gpa1p的C末端结构域(约占肽序列的三分之一)已被哺乳动物Gα亚基的相应区域所取代;两种方法均参阅WO 95/21925。杂合的或其它修饰的或异源的Gα亚基都需要达到一些标准,以便能够与酵母信号转导系统偶联。最重要的一条是,所说的亚基一方面能有效结合酵母Gβγ,以便能在缺乏活化的GPCR的情况下阻断信号,而另一方面,其又能有效结合激动剂所活化的受体以便随后能转导该信号。文献Conklin等,Nature 363,274-276(1993)首次描述了一种杂合体,其中Gαq的5个C末端氨基酸已被相应的Gαi序列代替(Gαqi5),从而使得正常的Gαi偶联受体又可以与Gαq信号转导途径偶联。WO 99/14344和Brown等,Yeast 16,11-22(2000)证实,此同一方法在酵母内也是可行的。这种情况下,Gpa1p的5个C末端氨基酸被人Gα蛋白的相应氨基酸所取代。使用这些被称为“移植体(transplant)”的杂合体,可以允许许多哺乳动物GPCR与酵母的交配途径偶联。
此处所用的酵母菌株在SST2、FAR1中,以及取决于细胞的交配类型,在STE2或STE3基因中有缺失。缺失SST2(RGS家族的一个成员),目的在于防止信号的下调。FAR1的缺失可以使细胞即使在信号素应答途径被关闭的情况下仍能继续生长。STE2或STE3的关闭,目的在于防止对异源三聚体G蛋白的不想要的竞争。在酵母基因组中GPA1基因被上述移植体取代。所说移植体在天然基因座位置于GPA1启动子控制下表达,从而保证了异源三聚体G蛋白的化学计量能得以保持。
可以以抑制或刺激方式修饰生物有机体的至少一种GPCR依赖型信号转导途径的作用。当信号转导途径依赖型可检测信号在某化合物存在的情况下比在该化合物缺失的情况下弱时,该化合物具有抑制作用。引起这样作用的化合物也称为拮抗剂。另一方面,当信号转导途径依赖型可检测信号在化学化合物存在情况下比在该化合物缺乏的情况下强时,该化学化合物具有刺激物的作用。这样的化合物也称为激动剂。
已有报道将基因FUS1、FUS2(Cismowski等,Nat Biotechnol 17,878-883(1999);Frederickson,Nat Biotechnol 17,852-853(1999))和YNL279w(WO 02/40660)的启动子用于酿酒酵母中的功能性试验。作为对交配因子刺激信息素应答途径的响应,所说基因的表达增加。如果这些基因之一的启动子元件与结构基因发生功能性连接,所说结构基因(也称为报道基因)的表达就可通过所述的酵母信号转导途径进行调控。这样的报道基因通常是内源性生长标记物,诸如HIS3或其它营养缺陷型标记基因(如,URA3、LEU2、ADE2、LYS1或TRP1)(它们在信号转导途径受到刺激的情况下将允许细胞在相应的营养缺陷的培养基中得以生长),或者是赋予对特定物质(如,CYH2或G418R)的抗性或敏感性的基因。不过,还可以使用编码诸如β-半乳糖苷酶(LacZ)或“绿色荧光蛋白”(GFP)等胞内酶或编码诸如磷酸酶(PHO5)等分泌型酶的报道基因。如果所用的报道基因是CAN1,则使细胞生长于含刀豆氨酸的培养基中。当存在异源表达的GPCR的活化剂(激动剂)时,CAN1基因将被表达,从而使细胞不再能生长于含刀豆氨酸的培养基中。添加抑制剂(拮抗剂)则导致培养物在此选择性培养基中生长。
文献中描述的酵母GPCR试验通常只利用一种报道基因,主要是在FUS1启动子控制下的HIS3或LacZ(FUS1-HIS3或FUS1-lacZ)(Price等,Mol Cell Biol 15,6188-6195(1995);Price等,Molecular Pharmacology50,829-837(1996);Campbell等,Bioorg.Med.Chem.Lett.9,2413-2418(1999);Pausch,Trends Biotechnol 15,487-494(1997))。如果使用FUS1-HIS3,按照未含组氨酸的液体培养基中酵母培养物的浊度测量信号转导途径的活化。本发明人的实验证实了液体培养物中单一生长读出信息给出了约30-50∶1的信噪比(见图1a和3)。以氯酚红β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)作为酶底物进行的β-半乳糖苷酶液体试验显示,在刺激后,信号相对于背景增加约2-3倍(也参见图1b)。为了进一步增大测量窗口,将两种报道基因同时用于酵母细胞中,因为这应是两个测量信号的乘积。图1c说明了此原理。这种双报道基因测定法产生的信噪比因此提高到了约100-150∶1。文献Brown等,Yeast 16,11-22(2000)描述了类似的试验。FUS1-HIS3和FUS1-lacZ在此也被同时应用于以CPRG为底物的β-半乳糖苷酶液体试验中。在该文献中在用配体刺激受体的整个期间中均添加有CPRG。相反,在本发明方法中只在用配体刺激受体后才将CPRG与去污剂在缓冲液中一起添加,从而使β-半乳糖苷酶测量有了明显的改进。另一方面,如果CPRG存在于配体诱导的生长期间,则生长容易被抑制,且再一方面,CPRG通过质膜到达细胞内部是困难的。如果只是在生长完成后才将CPRG与能破坏质膜的去污剂一起加入,则可以避免上述两个问题。
在优选的实施方案中,本发明方法利用了双报道基因试验,一个报道基因是生长标记,而另一报道基因是酶或GFP。只有可测量的酶或荧光蛋白的或多或或少的线性诱导表达与生长(对数事件)的这种组合,才导致所述的信号扩大,即,大的测量窗口。EP 0 708 922 B1(AcadiaPharmaceuticals)也描述了一种以应答受体刺激出现的生长为基础的方法。在这种情况下,受配体刺激的表达受体的细胞只是比未受刺激的细胞生长快(参阅EP 0 708 922 B1中的图2和图10)。而在本文所述的发明中,这样的未受刺激的酵母细胞根本不生长(参见列举的实施例(如,图3B,左图))。EP 0 708 922 B1也将异源表达的β-半乳糖苷酶的活性用作可检测信号。不过,此处LacZ被组成型表达,即,所测量的酶活性只是作为应答配体对信号转导途径的刺激作用而生长的细胞数目的一个量度,而不度量信号转导途径的刺激强度。相反,在本文所述的本发明中LacZ表达是在信息素应答途径所诱导的启动子(如,FUS1或YNL279w)的控制下进行的。图3A说明,即使使用相同数目的酵母细胞(左边的曲线图),β-半乳糖苷酶的可检测活性也取决于所加入配体的量,即,取决于信号转导途径刺激作用的强度(右边的曲线图)。
按照EP 0 708 922 B1(参阅第10页),细胞的“扩增”指“受体转染的细胞的生长,特别是与未被受体转染的细胞的生长相比而言”,即,经受体转染的和未经受体转染的细胞都能生长,只是在用配体刺激后被转染的细胞生长得更快。关于此,第33页和第44页的图有说明。在此细胞系中,根本不存在其表达可以造成细胞生长的报道基因构建体。使细胞有可能生长的唯一修饰是受配体刺激的过表达受体。
然而本发明中,按照优选的实施方案,进行双重选择:营养培养基缺乏此处所用酵母菌株生长所必需的物质-尿嘧啶和组氨酸。因为我们利用URA3基因作为受体质粒上的选择性标记,不含有受体质粒的细胞根本就不生长。
被受体DNA转染的细胞原则上也不能在所说的营养型培养基上生长,除非它们受存在的配体刺激。只有当配体结合时,报道基因HIS3才表达且细胞才能够在所说的营养培养基上生长。
原则上,已被受体转染但未携带任何诸如HIS3等生长标记作为报道基因的酵母菌株将不存在生长应答。
所说的方法可以以单一受体形式和多重受体形式(复式)应用。此测定法的有利之处在多重受体形式中尤为显著。图1C意图说明这一点。理论上说,表达特定受体的单酵母细胞,当用适当的配体(化学化合物或天然配体)接触时,作为对刺激作用的响应,应足以从其它未响应的酵母细胞背景中“突显”出来。这就为高流通量筛选带来了优势,因为这种方法可以同时筛选数种GPCR。尤其是对于在开始时在制药业中的重要性尚不清楚的孤儿GPCR而言,本文所述的方法可以使公司所投入的时间和金钱都缩减到最少。因为GPCR偶联的Gα亚基也是未知的,所以本方法还提供了同时在数个移植体株系中测试一种或多种孤儿GPCR的可能性。
附图简述
图1描述了多重受体形式的双报道基因试验的原理:图1a描述了激动剂诱导的生长读出信息。图1b是激动剂诱导的β-半乳糖苷酶介导的颜色读出信息。最后,图1c描述了激动剂诱导的生长和颜色双重读出信息。
图2A-D描述了用于构建以YNL279w启动子为基础的株系的质粒。
图3说明了与只利用一种报道基因相比,双报道基因试验如何提高了酵母液体试验的性能。
图4以所用Gα移植体的函数形式显示了人缓激肽B2受体与酵母信号转导途径的结合。空载体p426GPD总是用作对照。
图5说明双报道基因试验还可用于筛选拮抗剂。此处显示的例子是人缓激肽B2受体和空载体对照。
图6A和B指出,即使在与酶底物保温29小时后,使用YNL279w启动子产生的背景信号也明显低于用FUS1启动子所产生的背景信号。
图7解释了如何以多重受体形式进行试验。图7A说明了在每种情况下各种GPCR分别表达于独立的酵母菌株中,而非它们一起表达于一个菌株中。图7B展示了在微量滴定板中多重受体形式与单一受体形式相比的试验性能。
图8指出如果仅仅在与配体保温后才将酶底物CPRG与去污剂一起加入,则可以提高试验的性能。
实施例
实施例1:
材料和方法
质粒和酵母遗传学:
按标准方法进行所有的分子生物学和遗传学操作(Ausubel等,分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology),Wiley&Sons,纽约;Guthrie und Fink,酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology),酶学方法(Methods in Enzymology),学术出版社,San Diego)。
受体的表达构建体:
所有的表达构建体都以附加型2μ酵母-大肠杆菌穿梭载体p426GPD(Mumberg等,Gene 156,119-122(1995))为基础。为了在酵母细胞中获得高的组成型表达,将编码人G蛋白偶联受体的cDNA序列克隆入此载体的GPD启动子和CYC终止子之间。以下人GPCR被克隆入此载体中:EDG1受体(Genbank NM_001400)、EDG5受体(Genbank NM_004230)、缓激肽B2受体(Genbank NM_000623)、M1毒蝇碱性受体(GenbankNM_000738)、促生长素抑制素SSTR2受体(Genbank NM_001050)、M3毒蝇碱性受体(Genbank NM_000740)。
酵母菌株:
所有酵母菌株都以ATCC 208352的酿酒酵母野生型菌株W303-1a为基础。
基因型:MATa,ade2-1,ura3-1,his3-11,trp1-1,leu2-3,leu2-112,can1-100。
使用了两套不同的酵母菌株。一套来源于YLJ21并利用FUS1基因的启动子表达报道基因,而另一套来源于YSG13并利用了YNL279w基因的启动子。
酵母菌株YLJ21由Ekkehard Leberer提供。
基因型:MATa,ste2::KanR sst2::ura3FOA far1::hisG FUS1::HIS3mfa2::FUS1-lacZ::ura3FOA ade2-1,ura3-1,his3-11,trp1-1,leu2-3,leu2-112,can1-100。
通过已分别整合于HIS3基因座和MFA2基因座的两种报道基因FUS::HIS3和FUS1-lacZ的帮助可检测信息素应答途径的活化。FAR1基因已被hisG重复片段取代,从而使细胞即使在信息素应答途径已被激活的情况下仍能继续生长。为了防止由于Sst2p的GTPase功能造成的G蛋白信号的下调,用URA3基因取代了SST2基因。在所有情况下,通过在含5-氟乳清酸的培养基上选择,再次回收ura3标记物。编码α因子受体的基因STE2已被KanR基因取代。
酵母菌株YSG13制备如下:
基因型:MATa,ste2::KanR sst2::pYNL279w-HIS3 far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 ade2-1,ura3-1,his3-11,trp1-1,leu2-3,leu2-112,can1-100。
菌株构建:
ste2::KanR
为了用卡那霉素抗性基因取代酵母STE2基因,用BamHI和EcoRI切割质粒pLJ51并转化入野生型酵母菌株W303-1a。在YPD+G418培养基上进行选择。
sst2::pYNL279w-HIS3
在另一步骤中,用允许HIS3基因在YNL279w启动子控制下表达的盒子取代酵母SST2基因。为此目的,用BamHI和NotI切割质粒sst2::279LHIS3/pCR-BluntII并进行转化。在SC/Gluc-His+α因子培养基上进行选择。
far1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2
然后用允许与β-半乳糖苷酶融合的Fus1p的136个N末端氨基酸在YNL279w启动子控制下表达的盒子取代FAR1基因。为此目的,用SacII和XhoI切割质粒pBSfar1::pYNL279w-N136FUS1-lacZ::ADE2 w/o并进行转化。在SC/Gluc-Ade培养基上进行选择。
总是用PCR方法检查所有片段在基因组中的正确整合。
将移植体引入YLJ21和YSG13:
从菌株YLJ21和YSG13开始,酵母基因组中酵母G蛋白α-亚基Gpa1的最后5个氨基酸最终被人G蛋白α亚基的最后5个氨基酸取代。为此目的,例如为了构建酵母菌株YEW3,用SacI切割GPA1-C5-Galpha q整合型质粒,并转化入酵母菌株YLJ21。在SC/Gluc-Trp培养基上进行选择。其它的移植体以相同的方式整合。表1列出了各种移植体和来源于此的酵母菌株。
表1:G蛋白移植体
GPA1/GαX移植体 | 代表人G蛋白α亚基 | 5个C末端氨基酸 | FUS1启动子 | YNL279w启动子 |
GPA1 | - | KIGII | YLJ21 | YSG13 |
i1 | t,i1,i2 | DCGLF | YEW11 | YEW25 |
i3 | i3 | ECGLY | YEW7 | YEW21 |
o | o1,o2 | GCGLY | YEW8 | YEW22 |
z | z | YIGLC | YEW12 | YEW26 |
q | q,11 | EYNLV | YEW3 | YEW17 |
14 | 14 | ENFLV | YEW6 | YEW20 |
16 | 15,16 | EINLL | YEW2 | YEW16 |
12 | 12 | DIMLQ | YEW13 | YEW27 |
13 | 13 | QLMLQ | YEW14 | YEW28 |
s | s1,s2 | QYELL | YEW1 | YEW15 |
双报道基因试验:
将克隆入载体p426GPD的人GPCR转化入适当的酵母菌株并在无尿嘧啶且以2%葡萄糖为碳源的SC选择性平板(SC/Gluc-Ura)上30℃保温3天。然后用由此获得的单细胞集落接种2ml SC/Gluc-Ura,过夜培养。第二天,将细胞1∶100稀释于pH6.8的SC/Gluc-Ura-His中。在酵母菌株用FUS1启动子进行报道基因表达的情况下,将2-10mM 3-氨基三唑(3-AT,Sigma)另外添加入所说培养基中。在所有情况下,将90μl稀释的细胞悬浮液吸入96孔微量滴定板的孔中,孔中已有10μl待研究的配体。将平板在30℃振荡或不振荡保温5-24小时。随后在各孔中加入50μl的检测混合液。检测混合液的组成为150μg/ml毛地黄毒苷(Sigma)、300μg/ml氯酚红β-D-吡喃型半乳糖苷(CPRG,Roche)、pH6.7的300mM磷酸钠缓冲液。30℃振荡或不振荡保温2小时后,在分光光度计(Spectramax Plus,Molecular Devices)中通过测定574nm处的吸收值检测β-半乳糖苷酶活性。分析数据并用Graphpad Prism3.0计算机软件绘制剂量应答曲线。所有测量值都是三份平行试样测定值的平均。
实施例2:
单独利用一种报道基因和同时使用两种报道基因之间的比较
用空载体p426GPD或已克隆入p426GPD的人GPCR EDG1和EDG5转化酵母菌株YLJ21。然后将转化后的酵母在2ml SC/Gluc-Ura中30℃培养过夜。第二天,将细胞1∶100稀释于pH6.8且不含有(图3A)或含有2mM 3-AT(图3B)的SC/Gluc-Ura-His中。在所有情况下,将90μl稀释的细胞悬浮液吸入96孔微量滴定板的孔中,孔中已含有10μl鞘氨醇1-磷酸(Biomol)的系列稀释液或作为对照的纯水。将平板在30℃振荡(700rpm)保温23小时。在光度计中于630nm波长处测定由酵母细胞生长所导致的浊度(图3A和B,均为左边的图)。随后在各孔中加入50μl的检测混合液。30℃振荡保温2小时后,在光度计中通过测定574nm处的吸收值检测β-半乳糖苷酶的活性。
图3A左边的图表明,当利用FUS1-HIS作为报道构建体时,不添加3-AT就无可见的剂量应答曲线。即使在不刺激信号转导途径的情况下,FUS1启动子在无组氨酸的培养基上也产生了相当高的背景信号,即,该启动子不受严格调控。相反,如果加入2mM作为His3p的竞争性抑制剂的3-AT,背景信号则被抑制,且当EDG1或EDG5表达时(图3B,左边的图)所检测信号的水平取决于培养基中鞘氨醇1-磷酸的量(Ancellin等,J BiolChem 274,18997-19002(1999))。图3A中右边的曲线图显示LacZ报道基因也导致可接受的剂量应答曲线,但测量窗口非常小。按图3B中右边的曲线图指出的,同时使用HIS3和LacZ使信噪比提高数倍。总之,本实验显示了人GPCR EDG1和EDG5可通过酵母内源Gα亚基Gpa1p与信息素应答途径偶联。
实施例3:
其中人缓激肽B2受体通过Gα移植体与酵母信号转导途径结合的双报道基因试验
用空载体p426GPD或克隆入p426GPD的人缓激肽B2受体转化酵母菌株YLJ21(Gpa1)、YEW1(Gpa1/Gαs)、YEW2(Gpa1/Gα16)和YEW3(Gpa1/Gαq)。在如上所述标准条件下于存在2mM 3-AT时进行此试验。所用的配体是天然激动剂缓激肽(Sigma);保温20小时。图4说明,如果只有Gpa1p可用,缓激肽B2受体几乎根本不能与信息素应答途径结合。相反,当酵母表达Gα移植体Gpa1/Gα16或Gpa1/Gαq时,受体与所说信号转导途径成功结合。Gpa1/Gαq使偶联最有效,这是预期中的,因为人缓激肽B2受体在其天然细胞环境中就与Gαq偶联(Hall,Pharmacol.Ther.56,131-190(1992))。
实施例4:
将双报道基因测定法用于拮抗剂的检测
用空载体p426GPD或克隆入p426GPD的人缓激肽B2受体转化酵母菌株YEW3(Gpa1/Gαq)。测定以与实施例2相似的方式进行。唯一的区别是在含1nM缓激肽激动剂的测试平板各孔中加入了拮抗剂HOE140的稀释液(Sigma;Hall,Gen.Pharmacol.28,1-6(1997))。图5显示增加HOE140的量可以将缓激肽引起的信号抑制到背景水平。因此双报道基因测定法也适于拮抗剂检测。
实施例5:
FUS1启动子和YNL279w启动子之间的比较
用空载体p426GPD或克隆入p426GPD的人缓激肽B2受体转化酵母菌株YEW3(Gpa1/Gαq,FUS启动子)和YEW17(Gpa1/Gαq,YNL279w启动子)。在如上所述标准条件下,对于YEW3的情形而言,在存在2mM3-AT时进行测定,对于YEW17的情形而言,在不存在3-AT时进行测定。在加入检测混合物后,于2小时后及29小时后测定β-半乳糖苷酶的活性。
如图6A所显示的,以及更明显地如图6B所显示的,在使用FUS1启动子的情况中,即使培养基中存在3-AT,受体转化的菌株的背景信号或用空对照载体转化的菌株的背景信号也随着时间显著增加。而在使用YNL279w启动子的情况中,背景信号基本上不随时间改变。3-AT的添加不是必需的。由此可以推断,YNL279w受到了非常严格的调控。这在高流通量测定中被证实特别有利,因为该测量不需要准确的定时,从而有可能更灵活的进行操作。
实施例6:
以多重受体形式(复式)进行试验
用人M1毒蝇碱性受体转化YEW3(Gpa1/Gαq),用促生长素抑制素受体2和EDG5转化YLJ21(Gpa1)。受体均已被克隆入p426GPD。按上述标准方法进行操作。受体一个一个地单独测试或混合测试。混合测试和单独测试使用相同的过夜培养物。它们只以1∶100稀释于pH6.8的SC/Gluc-Ura-His中的形式混合,即,混合物因此总地含有单独测试时3倍的细胞数。图7A意图说明,所有这些受体都已被一个一个单独表达,即,不是在一个细胞中一起表达。与配体氨甲酰胆碱(Sigma;稀释成10-8M至10-2M)、促生长素抑制素-14(Bachem;10-10M至10-4M)和鞘氨醇1-磷酸(Biomol,10-10M至10-4M)一起保温24小时。如图7B所说明的,也可在混合物中检测到激动剂。
实施例7:
β-半乳糖苷酶的两种检测方法的比较
按照惯例,以如下方式进行酵母CPRG试验,即,在受体转化的酵母细胞与配体接触的整个期间内CPRG都存在于培养基中(Brown等,Yeast16,11-22(2000)和WO 99/14344)。图8描述了此方法和本发明所述方法之间的比较。
用克隆入p426GPD的人M1和M3毒蝇碱性受体转化YEW3(Gpa1/Gαq)。如上所述进行过夜培养,然后在两种不同培养基中1∶100稀释至OD600为0.02。在一种情况下(图8A),细胞被稀释于SC/Gluc-Ura-His、2mM 3-AT、0.1mg/ml CPRG、pH7的0.1M磷酸钠缓冲液。在另一情况中,在2mM 3-AT存在的情况下如上所述进行测定(图8B)。用于毒蝇碱性受体的配体是氨甲酰胆碱。对于图8A的数据,试验进行了28小时,然后在光度计上分析测试平板。对于图8B,保温26小时,然后加入检测混合物。2小时后进行测定。如图8所说明的,只在与配体一起保温之后加入CPRG和去污剂(在此案例中是毛地黄皂苷)才显著提高了该试验的性能。此处所述方法的另一优势是,可以排除CPRG在与化学化合物长期保温期间,尤其是筛选期间可能有的相互作用。
Claims (12)
1.用于鉴定能够影响靶分子活性的物质的细胞方法,其中待分析的细胞携带至少一种报道基因且该靶分子的活性影响细胞增殖,该方法包括下列步骤:
a)使至少一种细胞接触待测物质;
b)检测细胞增殖;
c)检测报道基因产物的活性。
2.权利要求1的方法,其中靶分子的活性影响报道基因产物的活性,优选表达。
3.权利要求1的方法,其中靶分子是异源分子,优选异源寡核苷酸、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白质或蛋白质片段。
4.权利要求1的方法,其中报道基因产物是其活性可以根据底物转化来检测的酶。
5.权利要求4的方法,其中在添加待分析物质后延迟添加底物。
6.权利要求5的方法,其中添加待分析物质与添加底物之间的时间间隔相应于所用细胞完成至少一个细胞周期、优选2-24个细胞周期的时间。
7.权利要求1的方法,其中报道基因产物的活性是通过破坏细胞,优选通过与底物一起添加透化或破坏细胞壁的物质来检测的。
8.前述权利要求任一的方法,其中靶分子自身对细胞增殖产生影响。
9.前述权利要求任一的方法,其中靶分子通过干扰直接影响细胞增殖的分子来发挥对细胞增殖的影响。
10.权利要求9的方法,其中靶分子通过与嵌合分子的相互作用来发挥其对细胞增殖的作用。
11.前述权利要求之任一的方法,其中细胞是酵母细胞,优选来自酿酒酵母菌株的细胞。
12.权利要求2-11任一项的方法,其中在一个处理中同时筛选具有不同靶分子的细胞。
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