JP4546827B2 - 物質を同定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、標的分子の活性に影響を与えることができる物質を同定する、細胞を用いる方法に関する。

細胞の標的分子に作用する新規の製薬の開発は、従来、生化学的な機能分析または細胞を用いた機能分析が用いられており、このような機能分析により、様々な推定上の活性物質が研究しようとする標的分子への効果を有するかどうかについて研究することができる。

従来、細胞を用いた分析は、研究しようとする標的分子の活性が細胞増殖への効果を有するような、成長に基づく試験システムに基づき機能する。加えて、標的分子の活性が、「レポーター遺伝子産物」の活性または発現に基づき検出可能であり、定量可能である試験システムが知られている。いずれの分析タイプも、標的分子の活性を調節する新規の活性物質をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）においても同定可能にするが、これら既知の試験システムの不利益は通常、バックグラウンドに対するシグナルの比が比較的低く、そのためそれらの特異性は、特にＨＴＳ様式で用いられると極めて低い。

上述した従来技術の不利益の観点から、本発明の目的は、ＨＴＳ様式での極めて効率的なスクリーニングを可能にする試験システムを提供することである。

本発明によれば、この目的は、少なくとも１つのレポーター遺伝子を有する分析される細胞、および、細胞増殖への効果を有する標的分子の活性を用いて、該標的分子の活性に影響を与えることができる物質を同定するための、細胞を用いる方法によって達成され、本方法は、以下の工程を含む：
ａ．少なくとも１つの細胞と、試験しようとする物質とを接触させる工程、
ｂ．細胞増殖を検出する工程、
ｃ．レポーター遺伝子産物の活性を検出する工程。

細胞増殖の検出と、レポーター遺伝子活性の検出は、必ずしも上記の順番でなくてもよい。

レポーター遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、または、前記細胞に、安定して、または、一時的にトランスフェクトされていてもよい。用語「レポーター遺伝子産物」は、ｍＲＮＡとタンパク質の両方を含む。適切なレポーター遺伝子およびそれらの産物は、有能な熟練者によく知られており、本発明において特に適切なものは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼのような酵素、または、ＧＦＰ、ＢＦＰ、エクオリンのような蛍光タンパク質などである。レポーター遺伝子に適したプロモーターは、特定の試験システムのタイプと標的、および、用いられる細胞型による。好ましくは、レポーター遺伝子は、標的分子が直接的または間接的に共役するシグナル変換経路を介して調節されるプロモーターの制御下である。好ましくは、酵素を生産し、その活性は、外部から加えた基質の変換に基づき検出可能であるレポーター遺伝子である。

本発明の範囲の標的分子は、用いられた細胞の増殖に直接的または間接的な効果を有し得る。これに関連して、標的分子は、この方法で用いられた細胞の増殖に影響を与えることが可能である（従って、活性状態で、直接的に前記細胞を活性化または阻害することが可能である）。標的分子は、例えば構成的に活性であり、試験しようとする物質で阻害されてもよく、または、不活性状態で存在し、試験しようとする物質で活性化されてもよい。しかしながら、好ましい実施形態によれば、標的分子は、活性状態で、単に前記増殖に直接的に影響を与える分子の介在によってのみ、本方法で用いられた細胞の増殖に影響を与える（例えば酵母細胞におけるＦＵＳ１−ＨＩＳ３，下記参照）。原理上、標的分子として、細胞外、膜結合型、または細胞内の全てのタイプの生物学的分子が適切であり、特に好ましくはヒト生体分子、特にタンパク質または核酸であり、これらのなかでも、特に細胞分裂のシグナル変換カスケードの構成要素、特にＧＰＣＲ、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼなどである。

分析しようとする物質が標的分子へ影響を与えることによって、例えば、標的分子同士の相互作用によって、または、それ自体が標的分子の活性または発現への効果を有する分子に影響を与えることにより、該標的分子の活性を促進または阻害することができる。

細胞増殖およびレポーター遺伝子産物の活性は、単に定性的または定量的に検出することができ、様々なタイプの検出が、有能な熟練者に一般的に知られている（例えば、細胞が懸濁液中にある場合は液状培養物の濁度を測定することにより、またはレポーター遺伝子産物の活性の比色測定もしくは発光測定などにより、直接的または間接的に細胞密度を測定すること）。

好ましい実施形態によれば、標的分子の活性は、レポーター遺伝子産物の活性、好ましくはレポーター遺伝子産物の発現に対する作用を有する。前記標的分子は、レポーター遺伝子産物の活性または発現に、直接的に（標的分子そのものが、レポーター遺伝子産物の活性／発現に影響する）、または、間接的に（標的分子は、その標的分子によって活性化された細胞の代謝またはシグナルカスケードを介して、レポーター遺伝子の活性または発現に影響する）作用し得る。

標的分子は、好ましくは異種の分子（すなわち天然に存在しない分子、または、本発明の方法で用いられた細胞で発現された分子）、特に好ましくは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。異種の標的分子は、細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、または、安定してもしくは一時的に、前記細胞にトランスフェクトされていてもよく、標的分子の発現は、構成的でもよいし、または誘導性でもよい。

好ましい実施形態によれば、異種の標的分子は、キメラ分子との相互作用によって本方法で用いられた細胞の増殖に作用する。本発明において特に好ましくは、異種の標的分子がヒト分子であり、このヒト分子は、安定して非ヒト細胞（特に酵母細胞）のゲノムに組み込まれ、異種の分子と相互作用して酵母細胞に固有のシグナル変換カスケードまたは代謝カスケードに統合可能なキメラ分子を介して細胞増殖に影響するような方法である。本発明において特に好ましくは、キメラ分子が、組み換えタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質フラグメントであり、そのアミノ酸配列が、ヒトおよび酵母の部分を含む。本発明の範囲において特に適切には、異種の標的分子としてヒトＧＰＣＲと、キメラＧタンパク質サブユニット（「トランスプラント」，下記参照）との組み合わせであり、原理上あらゆるサブユニットはキメラ形態で存在できる。

基質の変換に基づき活性が測定されるレポーター遺伝子産物を用いた場合、分析しようとする物質の添加の後に遅れて基質を加えることが好都合である。好ましくは、分析し
ようとする物質の添加と、基質の添加との間の時間間隔は、少なくとも本方法で用いられた細胞の１回の細胞周期が完了する時間であり、特に好ましくは、２〜２４回細胞周期が完了する間隔である。酵母細胞を用いる場合、時間間隔は、好ましくは約４〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間、特に２４時間である。

レポーター遺伝子の活性は、好ましくは、細胞を崩壊させることによって、特に好ましくは細胞壁を透過可能にする物質または破壊する物質（好都合には、界面活性剤、または、２種またはそれ以上の界面活性剤の組み合わせ；本発明において特に適切には、ジギトニン、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＣＨＡＰＳまたはＳＤＳ）を加えることによって検出される。特に好ましくは、ジギトニンであり、濃度範囲は１０〜６００、好ましくは２０〜４００、特に好ましくは４０〜６０μｇ／ｍｌであり、および／または、トリトンＸ−１００であり、濃度範囲は０.００５〜０.４、好ましくは０.０１〜０.２容量％である（いずれも最終濃度に基づく）。界面活性剤は、好ましくは、緩衝溶液中で、特に、有能な熟練者に十分によく知られている適切な緩衝液条件で（生理学的緩衝液、中性ｐＨ、等張塩濃度など）、反応混合物に加えられる。

極めて多様な細胞型を本発明の方法で用いることができ、すなわち原理上、原核細胞および真核細胞の両方、植物細胞または動物細胞が適切である。しかしながら、好ましくは真核細胞であり、特に好ましくは哺乳動物細胞または酵母細胞であり、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。

本発明のその他の好ましい実施形態によれば、様々な細胞が用いられ、１回のアプローチまたはプロセスランで同時にスクリーニングされ、前記細胞は、少なくとも標的分子のタイプにおいて互いに異なっている（「マルチプレックス法」）。

特に好ましい実施形態によれば、本発明は、クローニングされたＧタンパク質共役受容体のリガンドとして作用する物質を同定するための、広範囲の有用な方法に関する。本発明の方法は、高感度で安定しているため、ハイスループット分析において、マルチプレックス様式で同時に多数のＧＰＣＲを分析することが可能である。

以下で、代表的な実施形態および図に基づき本発明をさらに説明する。

実施例１：
Ｇタンパク質共役受容体の活性に作用する物質のスクリーニング
製薬産業にとって最も重要な標的分子クラスの一つは、Ｇタンパク質共役受容体である。これまで、このタンパク質ファミリーの多数の代表が、次第にクローニングされており、薬理学的に特徴付けられている。現在全ヒトゲノムが配列解析されたため、近年多数のＧＰＣＲが配列レベルで同定されている。現在、製薬産業の主要な目的は、包括的な物質ライブラリーをスクリーニングすることによってこれら受容体のリガンドを同定することである。遺憾ながら、現在の方法と技術に関して、物質検索の実質的な障害は、このような多数の標的分子に関する前記ライブラリーのスクリーニングに必要な時間とコストの要求である。ＥＰ０ ７０８ ９２２（Ｂ１）は、細胞培養物中で同時に多数のＧＰＣＲをスクリーニングする可能性を検討している。そこで説明されているＧＰＣＲを過剰発現する哺乳動物細胞は、受容体を活性化する物質と接触させると、反応して成長が促進される。細胞が前記物質で活性化される受容体を発現しなくてもその細胞は遅いながらも成長し続けるが、試験システムの感度はそれほど高くはない。その上、この方法は、インキュベート時間が極めて長いため時間がかかり、哺乳動物細胞系であるため高価である。

廉価でＧＰＣＲをスクリーニングする一つの可能性は、酵母に基づく試験システムの使用である。製薬調査においては、時間も極めて重要な要素であるため、本発明の目的は、多数のＧＰＣＲを同時にスクリーニングすることを可能にする酵母系を見出すことであった。ハイスループットスクリーニングにおける使用を可能にするために、本方法は、取り扱いが極めて容易であり、極めて大きい測定ウィンドウを有するべきである。

Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、多様な生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、これらは、これまで知られているなかでも最も重要なタンパク質ファミリーの一つであり、ヒトゲノムにおいて、約１０００種の遺伝子がこの受容体クラスをコードしていると推測されている。ＧＰＣＲは、特徴的な構造を有する：これらは、内在性膜タンパク質であり、αへリックスの形態で細胞膜のリン脂質二重層を７回貫通しており、それ自体が環状のパターンで配置されている。処方箋により現在利用可能な製薬の約５０％が、ＧＰＣＲに結合すると推測される。これは、製薬産業におけるこの受容体クラスの重要性を強調している。前記タンパク質ファミリーの大きさと重要性のために、および、多くのＧＰＣＲにおいて化学結合パートナーがまだわかっていない（オーファンＧＰＣＲ）という事実から見て、この受容体クラスは、今後の新規の薬用物質の検索における適切な標的タンパク質の最も重要な宝庫の一つとなり得ると考えることができる。

全てのＧタンパク質共役受容体は、共通の基本的な原理に従って作用する：細胞外リガンドと結合することにより、受容体タンパク質のコンフォメーション変化が起こり、それにより受容体タンパク質は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）と接触できるようになる。細胞質膜の細胞質側に存在するＧタンパク質は、細胞外シグナルを細胞内部に媒介する。受容体の特異性に依存して、それらは、様々なシグナル変換経路を引き起こすことができ、それらの全ては、第二のメッセンジャー（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ²⁺など）の形成を引き起こし、それにより、細胞内タンパク質の活性化または非活性化を介して細胞中の反応を引き起こす。

ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、３つのサブユニット、α、βおよびγからなる。Ｇタンパク質ヘテロ三量体において、ＧＤＰは、Ｇαサブユニットに結合する。リガンドで活性化された受容体との相互作用により、ＧＤＰがＧＴＰで置き換えられる。それにより生じたコンフォメーション変化により、Ｇタンパク質ヘテロ三量体はαサブユニットとβγ複合体に解離する。活性化αサブユニットとβγ複合体はいずれも、細胞内のエフェクタータンパク質に影響を与えることができる。αサブユニットは、４種の異なるクラス、Ｇαｓ、Ｇαｉ、ＧαｑおよびＧα１２に分類することができる。

ＧＰＣＲは、シグナル変換に関与するＧタンパク質に従って分類され、すなわち、ＧｓファミリーのＧＰＣＲは、Ｇαｓ活性化を介してアデニレートシクラーゼの刺激を媒介し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を増加させる。ＧｉファミリーのＧＰＣＲは、Ｇαｉ活性化を介してアデニレートシクラーゼ阻害を媒介し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を減少させる。ＧｑファミリーのＧＰＣＲは、Ｇαｑの活性化を介して様々なＰＬＣβアイソフォームの刺激を媒介し、膜結合型ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸の加水分解を引き起こし、ジアシルグリセロールとイノシトール三リン酸（ＩＰ₃）を生産する。ＩＰ₃は、細胞内の貯蔵からＣａ²⁺を放出する。Ｇα１２は、ｒｈｏ特異的グアニン−ヌクレオチド交換要素と相互作用する。

ＧＴＰアーゼ活性を有するＧαサブユニットが、結合したＧＴＰを加水分解するまでシグナルは維持される。ＲＧＳ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子）タンパク質のファミリーメンバーは、ＧαサブユニットのＧＴＰアーゼ活性に対する活性化因子として作用することによって、シグナルの持続期間を制御する。このＧタンパク質で制御されたシグナル変換系は、全ての真核性の系に共通であるとみられている。

このようなシグナル系の極めてよく特徴付けられた例は、パン酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の「フェロモン応答経路経路」である。ＭＡＴａ交配型の酵母細胞は、ＳＴＥ２遺伝子によってコードされた受容体を発現する。この受容体は、α因子（他方の交配型（ＭＡＴα）の酵母細胞によって放出されるペプチドフェロモン）と結合することによって活性化される。酵母のヘテロ三量体Ｇタンパク質は、遺伝子産物ＧＰＡ１（Ｇα）、ＳＴＥ４（Ｇβ）およびＳＴＥ１８（Ｇγ）で構成される。Ｇβγ複合体は、Ｓｔｅ２ｐ受容体が活性化された後に放出され、シグナルをマイトジェン活性化タンパク質キナーゼカスケードに伝達する。これにより、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤Ｆａｒ１ｐが活性化され、それにより、細胞周期の停止と、交配プロセスに関与する数々の遺伝子（例えばＦＵＳ１）の転写の誘導が起こる。この経路は、Ｓｓｔ２ｐ（ＲＧＳファミリーメンバー）で脱感作される。他方の交配型（ＭＡＴα）の酵母細胞は、異なる受容体（Ｓｔｅ３ｐ）を発現するため、ＭＡＴａ細胞により放出される他のフェロモン（α因子）に反応する。これとは別に、２種の交配型で用いられたシグナル機構は同一である。

哺乳動物のＧＰＣＲが、酵母のＧタンパク質シグナル系に共役可能であることが何度か実証されている。いくつかの受容体、例えばラットのソマトスタチン２受容体（Ｐｒｉｃｅ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５，６１８８〜６１９５（１９９５年））や、ラットのアデノシンＡ_2a受容体（Ｐｒｉｃｅ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５０，８２９〜８３７（１９９６年））は、酵母のＧαタンパク質Ｇｐａ１ｐと直接的に相互作用可能であるが、それに対して、その他の受容体、例えば成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨＲ）（Ｋａｊｋｏｗｓｋｉ等，Ｊ Ｒｅｃｅｐｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｒｅｓ １７，２９３〜３０３（１９９７年））は、Ｇｐａ１ｐとは適合しない。それでもこれら受容体を共役可能にするために、酵母Ｇαサブユニットを除去することができ、その代わりに、全長哺乳動物Ｇαサブユニットと共に異種の受容体が発現される。その代わりとして、Ｇｐａ１ｐのＣ末端ドメイン（約３分の１のペプチド配列）が哺乳動物Ｇαサブユニットの対応する領域で置換されたハイブリッドＧαサブユニットが用いられてきた；いずれのアプローチに関しても、ＷＯ９５／２１９２５を参照。ハイブリッドまたはその他の改変型、すなわち異種Ｇαサブユニットは、酵母シグナル変換系に共役可能にするために、いくつかの基準を満たす必要がある。最も重要な一つは、活性化ＧＰＣＲの非存在下でシグナルを阻止できるように、前記サブユニットを酵母Ｇβγに効率的に結合可能にすること、一方で、シグナルを変換できるように、前記サブユニットをアゴニストによって活性化された受容体に効果的に結合可能にすることである。Ｃｏｎｋｌｉｎ等，Ｎａｔｕｒｅ ３６３，２７４〜２７６（１９９３年）が、Ｇαｑの５個のＣ末端アミノ酸が対応するＧαｉ配列で置換されたハイブリッド（Ｇαｑｉ５）を初めて説明しており、このハイブリッドは、通常はＧαｉ共役型の受容体がＧαｑシグナル変換経路に再共役することを可能にした。ＷＯ９９／１４３４４、および、Ｂｒｏｗｎ等，Ｙｅａｓｔ １６，１１〜２２（２０００年）では、これと同じアプローチが酵母でも実行できることを実証している。この場合、Ｇｐａ１ｐの５個のＣ末端アミノ酸が、全てのヒトＧαタンパク質の対応するアミノ酸で置換されている。「トランスプラント」と呼ばれるこれらハイブリッドの使用により、多数の哺乳動物ＧＰＣＲを酵母の交配経路に共役させることを可能にする。

本発明で用いられる酵母株は、ＳＳＴ２、ＦＡＲ１、および、細胞の交配型に応じてＳＴＥ２またはＳＴＥ３遺伝子が欠失している。ＳＳＴ２（ＲＧＳタンパク質ファミリーのメンバー）は、シグナルのダウンレギュレーションを防ぐするために欠失している。ＦＡＲ１の欠失は、フェロモン応答経路がスイッチオフされるような条件下でも細胞成長を継続可能にする。ＳＴＥ２またはＳＴＥ３は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に関する不必
要な競合を防ぐためスイッチオフされる。酵母ゲノムにおいて、ＧＰＡ１遺伝子は、上述のトランスプラントで置換されている。天然の遺伝子座でのＧＰＡ１プロモーターの制御下での前記トランスプラントの発現は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の化学量論が保持されることを確実にする。

生物学的な生物の少なくとも１つのＧＰＣＲ依存性シグナル変換経路の作用は、阻害または刺激の方式で改変することができる。化学的な化合物の存在下において、シグナル変換経路依存性の測定可能なシグナルがそれらの非存在下においてよりも弱い場合、その化学的な化合物は阻害作用を有する。このような作用を引き起こす化合物はまた、アンタゴニストとも呼ばれる。一方で、シグナル変換経路依存性の測定可能なシグナルが、前記化学的な化合物の非存在下においてよりも強い場合、その化学的な化合物は刺激作用を有する。このような化合物はまた、アゴニストとも呼ばれる。

遺伝子ＦＵＳ１、ＦＵＳ２のプロモーター（Ｃｉｓｍｏｗｓｋｉ等，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，８７８〜８８３（１９９９年）；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，８５２〜８５３（１９９９年））、および、ＹＮＬ２７９ｗ（ＷＯ０２／４０６６０）の、サッカロミセス・セレビシエにおける機能分析のための使用が説明されている。これにおいて、交配因子によるフェロモン応答経路の刺激に反応して、前記遺伝子の発現が増加している。ここで、これら遺伝子の一つのプロモーター要素が構造遺伝子に機能的に連結している場合、前記構造遺伝子（またはレポーター遺伝子ともいう）の発現は、説明された酵母のシグナル変換経路を介して調節することができる。このようなレポーター遺伝子は通常、刺激されたシグナル変換経路の事象に相応して成分を欠失させた培地中での細胞成長を可能にする内因性の成長マーカー、例えばＨＩＳ３、または、その他の栄養要求性マーカー遺伝子（例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＬＹＳ１またはＴＲＰ１）であるか、または、特定の物質に対する耐性または感受性を付与する遺伝子（例えばＣＹＨ２またはＧ４１８^(R)）である。しかしながら、細胞間の酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）または「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）をコードするレポーター遺伝子、または、分泌酵素、例えばホスファターゼ（ＰＨＯ５）をコードするレポーター遺伝子を用いることも可能である。用いられたレポーターがＣＡＮ１である場合、細胞は、カナバニン含有培地で成長する。異種発現されたＧＰＣＲの活性化因子（アゴニスト）の存在下では、ＣＡＮ１遺伝子が発現され、細胞がカナバニン含有培地で成長できないようになる。阻害剤（アンタゴニスト）を添加することによって、この選択培地において培養物の成長が導かれる。

文献で説明されている酵母ＧＰＣＲ分析は、通常、１種のみのレポーター遺伝子を利用し、主として、ＦＵＳ１プロモーター（ＦＵＳ１−ＨＩＳ３、または、ＦＵＳ１−ｌａｃＺ）の制御下の、ＨＩＳ３またはＬａｃＺ（Ｐｒｉｃｅ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
１５，６１８８〜６１９５（１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５０，８２９〜８３７（１９９６年）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９，２４１３〜２４１８（１９９９年）；Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，４８７〜４９４（１９９７年））である。ＦＵＳ１−ＨＩＳ３が用いられる場合、シグナル変換経路の活性化は、ヒスチジン非含有の液体培地での酵母培養液の濁度として測定される。この発明者等の実験は、１回の成長の読み出しで、液状培養物において約３０〜５０：１のシグナルとバックグラウンドとの比が得られることを実証している（図１ａおよび３を参照）。酵素基質としてクロロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）を用いたβ−ガラクトシダーゼの液体分析では、刺激後、シグナルが、バックグラウンドを上回って約２〜３倍増加することを示している（図１ｂも参照）。さらに測定ウィンドウを増加させるために、酵母細胞において２種のレポーター遺伝子を同時に用いており、これにより２種の測定シグナルが増加するはずである。図１ｃでは、この原理が説明されている。その結果として、この二重のレポーター遺伝子分析は、シグナルとバックグラウンドとの比を約１００〜１５０：１に高める。Ｂｒｏｗｎ等，Ｙｅａｓｔ １６，１１〜２２（２０００年）では、同様の分析を説明している。これにおいても、ＣＰＲＧを基質として用いたβ−ガラクトシダーゼ液体分析で、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３およびＦＵＳ１−ｌａｃＺが同時に利用されている。ここで、ＣＰＲＧは、リガンドで受容体を刺激する期間中全体にわたり加えられる。それに対して、この方法において、ＣＰＲＧは、受容体をリガンドで刺激した後だけに、緩衝溶液中の界面活性剤と共に加えられ、それにより、β−ガラクトシダーゼ測定が顕著に改善される。その一方で、リガンドで誘導された成長の際にＣＰＲＧが存在する場合、その成長は容易に阻害され、一方でＣＰＲＧは、細胞質膜を通過して細胞内部に達することができるが、ただし困難をともなう。いずれの問題も、成長が完了した後のみに細胞質膜を崩壊させることができる界面活性剤と共にＣＰＲＧを加えると回避される。

好ましい実施形態において、本方法は、二重のレポーター遺伝子分析を利用し、一方のレポーターは成長マーカーであり、他方のレポーター遺伝子は、酵素またはＧＦＰである。対数的な事象である成長、および、測定可能な酵素または蛍光タンパク質の（程度の差はあるが）直線的に誘導される発現のこの組み合わせのみが、説明されているシグナル増幅、すなわち大きい測定ウィンドウをもたらす。また、ＥＰ０ ７０８ ９２２（Ｂ１）（アカディア・ファーマシューティカルズ（Ａｃａｄｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））では、受容体の刺激に反応した成長に基づく方法も説明されている。この場合、リガンドで刺激された受容体を発現する細胞のみが、刺激されていない細胞よりも速く成長する（ＥＰ０ ７０８ ９２２（Ｂ１）の図２および図１０を参照）。しかしながら、本明細書で説明される本発明においては、このような刺激されていない酵母細胞は、全く成長しない（列挙された実施例（例えば図３Ｂの左のグラフ）を参照）。ＥＰ０ ７０８ ９２２（Ｂ１）も、測定可能なシグナルとして異種発現された酵素β−ガラクトシダーゼの活性を用いている。しかしながら、これにおいて、ＬａｃＺは構成的に発現されており、すなわち、測定された酵素活性は、リガンドによるシグナル変換経路の刺激に反応して成長した細胞数を測定するためだけのものであり、シグナル変換経路の刺激の強度を測定するためのものではない。それに対して、本明細書で説明された本発明におけるＬａｃＺ発現は、フェロモン応答経路経路で誘導されたプロモーター（例えばＦＵＳ１またはＹＮＬ２７９ｗ）の制御下である。図３Ａは、同数の酵母細胞（左側のグラフ）を用いても、測定可能なβ−ガラクトシダーゼ活性は、添加されたリガンド量、すなわちシグナル変換経路の刺激の強度に依存する（右側のグラフ）ことを説明する。

ＥＰ０ ７０８ ９２２（Ｂ１）によれば（１０頁を参照）、細胞の「増幅」は、「特に受容体でトランスフェクトされていない細胞の成長と比較した、受容体でトランスフェクトされた細胞の成長」を意味し、すなわち受容体でトランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされていない細胞とはいずれも成長可能であるが、ただしトランスフェクトされた細胞は、リガンドで刺激した後より速く成長する。３３頁および４４頁の図はこのことを説明している。説明された細胞系において、発現によって成長を可能にするレポーターコンストラクトは全く存在しない。成長を可能にする唯一の改変は、リガンドで刺激された、過剰発現された受容体である。

しかしながら、好ましい実施形態によれば、二重の選択が行われる：栄養培地はウラシルとヒスチジンを含まず、これらは本発明で用いられる酵母株が生存するのに必要な物質である。我々は、ＵＲＡ３遺伝子を我々の受容体プラスミドに対する選択マーカーとして用いるので、受容体プラスミドが欠失した細胞は、全く成長することができない。

原理上、受容体ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞も、リガンドの存在により刺激されない限り、前記栄養培地では成長することができない。リガンドが結合したときだけ、レポーター遺伝子ＨＩＳ３が発現され、細胞は前記栄養培地で成長できる。

原理上、受容体でトランスフェクトされているがレポーター遺伝子としてＨＩＳ３のような成長マーカーを全く有さない酵母株は、成長において反応を示さない。

説明された方法は、１種の受容体様式、および、複数種の受容体様式（マルチプレックス様式）のいずれにおいても用いることができる。この分析の利点は、複数種の受容体様式で特に重要となる。図１ｃは、これの説明を意図したものである。理論的には、特定の受容体を発現する１種の酵母細胞は、適切なリガンド（化学的な化合物または天然のリガンド）と接触した場合、その他の、刺激に対する反応として無反応である酵母細胞のバックグラウンドより十分に「高く」あるべきである。この方法は多数のＧＰＣＲを同時にスクリーニングすることを可能にするため、これによりハイスループットスクリーニングに対する利点が生じる。特に、製薬産業にとっての重要性が当初より不明確なオーファンＧＰＣＲに関して、本発明において説明された方法は、会社による時間とコストの支出を最小化する。ＧＰＣＲが共役するＧαサブユニットも知られていないため、本発明の方法はまた、多数のトランスプラント株で同時に１またはそれ以上のオーファンＧＰＣＲを試験する可能性も提供する。

図の説明
図１は、複数種の受容体様式における、二重のレポーター遺伝子分析の原理を説明する：図１ａは、アゴニストで誘導された成長の読み出しを示す。図１ｂは、アンタゴニスト（ａｎｇｏｎｉｓｔ）で誘導されたβ−ガラクトシダーゼが媒介する色の読み出しである。最後に、図１ｃは、二重のアゴニストで誘導された成長と、色の読み出しを示す。
図２Ａ〜Ｄは、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターに基づき株を構築するために用いられたプラスミドを示す。
図３は、１種のレポーター遺伝子のみを用いた場合と比較して、二重のレポーター遺伝子分析が酵母液体分析の性能をいかに改善するかを説明する。
図４は、ヒトのブラジキニンＢ２受容体が酵母のシグナル変換経路に結合することを、用いられたＧαトランスプラントの関数としてを示す。コントロールとして空のベクターｐ４２６ＧＰＤが常に用いられた。
図５は、二重のレポーター遺伝子分析が、アンタゴニストのスクリーニングにも使用できることを示す。ここで示された例は、ヒトのブラジキニンＢ２受容体と、空のベクターコントロールである。
図６ＡおよびＢは、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターを用いることによって、酵素基質で２９時間インキュベートした後でも、バックグラウンドシグナルの形成が、ＦＵＳ１プロモーターを用いるよりも明らかに少ないことを示す。
図７は、複数種の受容体様式における分析を実行することを説明する。図７Ａは、いずれの場合においても様々なＧＰＣＲが、別々の酵母株で発現され、それらはいずれも１つの株中に一緒に存在することはないことを説明する。図７Ｂは、マイクロタイタープレートにおける複数種の受容体様式における分析の性能を、１種の受容体様式と比較して実証する。
図８は、リガンドとインキュベートした後に酵素基質ＣＰＲＧを界面活性剤と共に加えると分析の性能が高まることを示す。

材料および方法
プラスミドおよび酵母の遺伝学：
全ての分子生物学的および遺伝学的操作は、標準的な方法に従って行われた（Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ワイリー＆サンズ，ニューヨーク；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），サンディエゴ）。

受容体のための発現コンストラクト：
全ての発現コンストラクトは、エピソームの２μ酵母Ｅ．ｃｏｌｉ シャトルベクターｐ４２６ＧＰＤ（Ｍｕｍｂｅｒｇ等，Ｇｅｎｅ １５６，１１９〜１２２（１９９５年））に基づく。ヒトＧタンパク質共役受容体をコードするｃＤＮＡ配列は、高い構成的発現を酵母細胞で達成するために、このベクターのＧＰＤプロモーターとＣＹＣターミネーターの間にクローニングされている。以下のヒトＧＰＣＲがこのベクターにクローニングされた：ＥＤＧ１受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００１４００）、ＥＤＧ５受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００４２３０）、ブラジキニンＢ２受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿０００６２３）、Ｍ１ムスカリン様受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿０００７３８）、ソマトスタチンＳＳＴＲ２受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００１０５０）、Ｍ３ムスカリン様受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿０００７４０）。

酵母株：
全ての酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ野生株Ｗ３０３−１ａ（ＡＴＣＣ番号２０８３５２で説明されている）に基づく。

遺伝子型：ＭＡＴａ、ａｄｅ２−１、ｕｒａ３−１、ｈｉｓ３−１１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｃａｎ１−１００。

２種の異なる酵母株のセットを用いた。１つのセットは、ＹＬＪ２１から得られ、レポーター遺伝子を発現するためにＦＵＳ１遺伝子のプロモーターを利用し、一方で、他方のセットは、ＹＳＧ１３から得られ、ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターを利用する。

酵母株ＹＬＪ２１は、エックハルト・レバーラー（Ｅｋｋｅｈａｒｄ Ｌｅｂｅｒｅｒ）より提供された。

遺伝子型：ＭＡＴａ、ｓｔｅ２：：ＫａｎＲ ｓｓｔ２：：ｕｒａ３^FOA ｆａｒ１：：ｈｉｓＧ ＦＵＳ１：：ＨＩＳ３ ｍｆａ２：：ＦＵＳ１−ｌａｃＺ：：ｕｒａ３^FOAａｄｅ２−１、ｕｒａ３−１、ｈｉｓ３−１１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｃａｎ１−１００。

フェロモン応答経路の活性化は、２種のレポーター遺伝子ＦＵＳ１：：ＨＩＳ３、および、ＦＵＳ１−ｌａｃＺ（それぞれＨＩＳ３遺伝子座およびＭＦＡ２遺伝子座に組み込まれている）を用いて測定することができる。ＦＡＲ１遺伝子は、ｈｉｓＧリピートで置換されており、それにより細胞は、フェロモン応答経路が活性化されていても成長を継続することができる。ＳＳＴ２遺伝子は、Ｓｓｔ２ｐのＧＴＰアーゼ機能によるＧタンパク質シグナルのダウンレギュレーションを防ぐため、ＵＲＡ３遺伝子で置換された。いずれの場合においても、５−フルオロオロチン酸含有培地で選択することにより、ｕｒａ３マーカーを再度回収した。α因子受容体をコードする遺伝子ＳＴＥ２は、ＫａｎＲ遺伝子で置換されている。

酵母株ＹＳＧ１３を以下のように製造した：
遺伝子型：ＭＡＴａ、ｓｔｅ２：：ＫａｎＲ ｓｓｔ２：：ｐＹＮＬ２７９ｗ−ＨＩＳ３ ｆａｒ１：：ｐＹＮＬ２７９ｗ−Ｎ１３６ＦＵＳ１−ｌａｃＺ：：ＡＤＥ２ ａｄｅ２−１、ｕｒａ３−１、ｈｉｓ３−１１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｃａｎ１−１００。

株の構築：
ｓｔｅ２：：ＫａｎＲ
酵母のＳＴＥ２遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換するために、プラスミドｐＬＪ５１をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、野生型酵母株Ｗ３０３−１ａに形質転換した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８培地で選択を行った。

ｓｓｔ２：：ｐＹＮＬ２７９ｗ−ＨＩＳ３
その他の工程で、酵母ＳＳＴ２遺伝子を、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターの制御下でＨＩＳ３遺伝子発現を可能にするカセットで置換した。この目的のために、プラスミドｓｓｔ２：：２７９ＬＨＩＳ３／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、形質転換した。ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｈｉｓ＋α因子培地で選択を行った。

ｆａｒ１：：ｐＹＮＬ２７９ｗ−Ｎ１３６ＦＵＳ１−ｌａｃＺ：：ＡＤＥ２
次に、ＦＡＲ１遺伝子を、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼに融合した Ｆｕｓ１ｐの１３６個のＮ末端アミノ酸の発現を可能にするカセットで置換した。この目的のために、プラスミドｐＢＳｆａｒ１：：ＹＮＬ２７９ｗ−Ｎ１３６ＦＵＳ１−ｌａｃＺ：：ＡＤＥ２ ｗ／ｏをＳａｃＩＩとＸｈｏＩで切断し、形質転換した。ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ａｄｅ培地で選択を行った。

全てのフラグメントがゲノムに正しく組み込まれていることをＰＣＲで常にチェックした。

トランスプラントのＹＬＪ２１およびＹＳＧ１３への導入：
ＹＬＪ２１株とＹＳＧ１３株から始めて、酵母ゲノム中の酵母Ｇタンパク質のαサブユニットＧｐａ１の最後の５個のアミノ酸を、最終的にヒトのＧタンパク質αサブユニットの最後の５個のアミノ酸で置換した。この目的のために、例えば、酵母株ＹＥＷ３を構築するために、プラスミドＧＰＡ１−Ｃ５−Ｇアルファｑの統合体をＳａｃＩで切断し、酵母株ＹＬＪ２１に形質転換した。ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｔｒｐ培地で選択を行った。その他のトランスプラントを同様の方法で組み込ませた。表１に様々なトランスプラントとそれから得られる酵母株を列挙する。

二重のレポーター遺伝子分析：
ベクターｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトＧＰＣＲを適切な酵母株に形質転換させ、ウラシルを含まず炭素源として２％グルコースを含むＳＣ選択プレート（ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ）で３０℃で３日間インキュベートした。次に、このようにして得られたシングル細胞コロニーを用いて、一晩培養したもの（２ｍｌ）をＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ中に接種させた。次の日、細胞をＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ（ｐＨ６.８）で１：１００に希釈した。レポーター遺伝子発現のＦＵＳ１プロモーターを用いた酵母株の場合、前記培地に２〜１０ｍＭの３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ，シグマ（Ｓｉｇｍａ））をさらに加えた。いずれの場合においても、希釈した細胞懸濁液（９０μｌ）を、予め研究しようとするリガンド（１０μｌ）を含む９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。プレートを、３０℃で５〜２４時間インキュベートした（振盪しながら、または、振盪しないで）。その後、各ウェルに分析ミックス（５０μｌ）を加えた。分析ミックスは、１５０μｇ／ｍｌのジギトニン（シグマ）、３００μｇ／ｍｌのクロロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ，ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、３００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.７）からなる。振盪しながら、または、振盪しないで３０℃で２時間インキュベートした後、β−ガラクトシダーゼ活性を、分光光度計（スペクトラマックス・プラス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ）、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））で、５７４ｎｍでの吸収として測定した。データを分析し、グラフパッド・プリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）３.０コンピュータープログラムを用いて用量応答曲線を描いた。全ての測定は、三連の測定値の平均である。

実施例２：
１種のレポーター遺伝子単独の使用と、２種のレポーター遺伝子の同時の使用との比較
酵母株ＹＬＪ２１を、空のベクターｐ４２６ＧＰＤ、または、ｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトＧＰＣＲ ＥＤＧ１およびＥＤＧ５のいずれかで形質転換した。次に、形質転換酵母を、ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ（２ｍｌ）、３０℃で一晩培養した。次の日、
２ｍＭの３−ＡＴを含まない（図３Ａ）または２ｍＭの３−ＡＴを含む（図３Ｂ）ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ（ｐＨ６.８）培地で、培養液を１：１００に希釈した。いずれの場合においても、希釈した細胞懸濁液（９０μｌ）を、９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェル（それぞれ１０μｌのスフィンゴシン１−リン酸（バイオモル（Ｂｉｏｍｏｌ））の連続希釈液またはコントロールとして純水を予め含む）にピペッティングした。プレートを振盪しながら（７００ｒｐｍ）３０℃で２３時間インキュベートした。酵母細胞の成長から生じた濁度を光度計で６３０ｎｍで測定した（図３ＡおよびＢ，いずれの場合も左側のグラフ）。次に、ウェルあたり５０μｌの分析ミックスを加えた。振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした後、β−ガラクトシダーゼ活性を、光度計で５７４ｎｍでの吸収として測定した。

図３Ａの左側のグラフは、レポーターコンストラクトとしてＦＵＳ１−ＨＩＳを用いた場合、３−ＡＴの添加なしでは用量応答曲線が観察されないことを示す。ＦＵＳ１プロモーターでは、シグナル変換経路の刺激がなくても、すなわちプロモーターが厳密に調節されていなくても、ヒスチジンを含まない培地でかなり高いバックグラウンドシグナルが生じる。それに対して、２ｍＭの３−ＡＴ（Ｈｉｓ３ｐの競合阻害剤）が添加される場合、バックグラウンドシグナルは抑制され、測定されるシグナルのレベルは、ＥＤＧ１またはＥＤＧ５が発現される場合、培地中のスフィンゴシン１−リン酸の量に依存する（Ａｎｃｅｌｌｉｎ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，１８９９７〜１９００２（１９９９年））（図３Ｂ，左側のグラフ）。図３Ａ（右側のグラフ）は、ＬａｃＺレポーター遺伝子も許容できる用量応答曲線を生じるが、測定ウィンドウは極めて小さいことを説明する。図３Ｂ（右側のグラフ）で示されるように、ＨＩＳ３とＬａｃＺを同時に使用することにより、数倍優れたシグナルとバックグラウンドとの比が得られる。総合すれば、この実験は、ヒトＧＰＣＲのＥＤＧ１およびＥＤＧ５は、酵母の内因性ＧαサブユニットＧｐａ１ｐを介して、フェロモン応答経路経路に共役することができることを示す。

実施例３：
Ｇαトランスプラントを介して酵母のシグナル変換経路にヒトのブラジキニンＢ２受容体を結合させることによる、二重のレポーター遺伝子分析
酵母株ＹＬＪ２１（Ｇｐａ１）、ＹＥＷ１（Ｇｐａ１／Ｇαｓ）、ＹＥＷ２（Ｇｐａ１／Ｇα１６）およびＹＥＷ３（Ｇｐａ１／Ｇαｑ）を、空のベクターｐ４２６ＧＰＤ、または、ｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトのブラジキニンＢ２受容体のいずれかで形質転換した。２ｍＭの３−ＡＴの存在下で、上述の標準的な条件下で分析を行った。用いられたリガンドは、天然のアゴニストのブラジキニン（シグマ）であり、２０時間インキュベートした。図４は、ブラジキニンＢ２受容体が、Ｇｐａ１ｐだけが利用可能な場合、ほとんどフェロモン応答経路に結合できないことを説明する。それに対して、酵母がＧαトランスプラントのＧｐａ１／Ｇα１６またはＧｐａ１／Ｇαｑを発現する場合、受容体の前記シグナル変換経路への結合は成功した。Ｇｐａ１／Ｇαｑは、最も効果的な共役を可能にし、これは、ヒトのブラジキニンＢ２受容体が、その天然の細胞環境でＧαｑと共役するためと推測される（Ｈａｌｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５６，１３１〜１９０（１９９２年））。

実施例４：
アンタゴニスト分析での二重のレポーター遺伝子分析の使用
酵母株ＹＥＷ３（Ｇｐａ１／Ｇαｑ）を、空のベクターｐ４２６ＧＰＤ、または、ｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトのブラジキニンＢ２受容体のいずれかで形質転換した。実施例２と同様の方法で分析を行った。ただし、試験プレートの各ウェルは１ｎＭのブラジキニンアゴニストを含み、そこにアンタゴニストＨＯＥ１４０（シグマ；Ｈａｌｌ，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８，１〜６（１９９７年））の希釈液を添加した点で異なる。図５は、ＨＯＥ１４０の量が増加すると、ブラジキニンによって引き起こされたシグナルがバックグラウンドレベルに対して抑制されることを示す。従って、二重のレポーター遺伝子分析も、アンタゴニスト分析に適している。

実施例５：
ＦＵＳ１のプロモーターと、ＹＮＬ２７９ｗのプロモーターとの比較
酵母株ＹＥＷ３（Ｇｐａ１／Ｇαｑ，ＦＵＳプロモーター）と、ＹＥＷ１７（Ｇｐａ１／Ｇαｑ，ＹＮＬ２７９ｗプロモーター）を、空のベクターｐ４２６ＧＰＤ、または、ｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトのブラジキニンＢ２受容体のいずれかで形質転換した。分析は、ＹＥＷ３の場合は２ｍＭの３−ＡＴの存在下で、および、ＹＥＷ１７の場合は３−ＡＴなしで、上述の標準的な条件下で行われた。分析ミックスの添加の後、β−ガラクトシダーゼ活性を、２時間後に測定し、さらに２９時間後に再度測定した。

図６Ａで示されるように、より印象的には図６Ｂで示されるように、受容体で形質転換した株、または、空のコントロールベクターで形質転換した株のバックグラウンドシグナルは、ＦＵＳ１プロモーターの場合、３−ＡＴが培地に含まれていたとしても、時間と共に顕著に増加する。ＹＮＬ２７９ｗプロモーターの場合、バックグラウンドシグナルは、実質的に時間を経ても変化しない。３−ＡＴの添加は必要ではない。このことから、ＹＮＬ２７９ｗは、極めて厳密に調節されると結論付けることができる。このことから、測定時間を正確に定める必要がなく、そのため柔軟な作業が可能となるため、ハイスループット分析において特に有利であることが分かる。

実施例６：
複数種の受容体様式（マルチプレックス様式）における分析の実行
ＹＥＷ３（Ｇｐａ１／Ｇαｑ）を、ヒトのＭ１ムスカリン様受容体で形質転換し、ＹＬＪ２１（Ｇｐａ１）を、ソマトスタチン受容体２およびＥＤＧ５で形質転換した。受容体をｐ４２６ＧＰＤにクローニングした。上述の標準的な方法に従って手順を実行した。受容体を、個々に、または、混合物中のいずれかで試験した。混合物には、個々の試験のために一晩培養したものと同じものを用いた。ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ（ｐＨ６.８）での１：１００希釈でのみそれらを混合した（すなわち混合物は、全体で個々の試験より３倍多い細胞を含む）。図７Ａは、全ての受容体が個々に発現されている、すなわち、１つの細胞で一緒に発現されていないことを説明するために意図されている。以下のリガンド、カルバコール（シグマ；１０^-8Ｍ〜１０^-2Ｍに希釈）、ソマトスタチン−１４（Ｂａｃｈｅｍ；１０^-10Ｍ〜１０^-4Ｍ）、および、スフィンゴシン１−リン酸（バイオモル，１０^-10Ｍ〜１０^-4Ｍ）とのインキュベートを２４時間行った。図７Ｂで説明されるように、アゴニストも、混合物中で検出することができる。

実施例７：
２種のβ−ガラクトシダーゼ検出方法の比較
従来、酵母ＣＰＲＧ分析は、受容体で形質転換された酵母細胞がリガンドと接触している全期間中、ＣＰＲＧが培地に存在するような方法で行われる（Ｂｒｏｗｎ等，Ｙｅａｓｔ １６，１１〜２２（２０００年）、および、ＷＯ９９／１４３４４）。図８は、この方法と、本発明で説明した方法との比較を示す。

ＹＥＷ３（Ｇｐａ１／Ｇαｑ）を、ｐ４２６ＧＰＤにクローニングされたヒトＭ１およびＭ３ムスカリン様受容体で形質転換した。一晩培養したものを説明されたように培養し、次に、２種の異なる培地で、ＯＤ₆₀₀０.０２まで１：１００に希釈した。一方は（図８Ａ）、ＳＣ／Ｇｌｕｃ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ、２ｍＭの３−ＡＴ、０.１ｍｇ／ｍｌのＣＰＲＧ、０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で細胞を希釈した。他方は、上述した通りに２ｍＭの３−ＡＴの存在下で分析を行った（図８Ｂ）。ムスカリン様受容体に関して用いられたリガンドはカルバコールであった。図８Ａの２８時間のデータに関して分析を行い、その後、分析プレートを光度計で分析した。図８Ｂの場合は、２６時間インキュベートし、続いて、分析ミックスを添加した。２時間後に測定した。

図８で説明されるように、ＣＰＲＧと界面活性剤（この場合はジギトニン）の添加により、リガンドとインキュベートした後のみに顕著に分析の性能が改善される。本発明において説明された方法のその他の利点は、化学的な化合物との長期のインキュベート中に、特にスクリーニング中に、ＣＰＲＧの可能な相互作用が除外可能であることである。

複数種の受容体様式における、二重のレポーター遺伝子分析の原理を説明するもので、アゴニストで誘導された成長の読み出しを示す。 複数種の受容体様式における、二重のレポーター遺伝子分析の原理を説明するもので、アンタゴニスト（ａｎｇｏｎｉｓｔ）で誘導されたβ−ガラクトシダーゼが媒介する色の読み出しを示す。 複数種の受容体様式における、二重のレポーター遺伝子分析の原理を説明するもので、二重のアゴニストで誘導された成長と、色の読み出しを示す。 プラスミドｐＬＪ５１を示す。 プラスミドｓｓｔ：：２７９ＬＨＩＳ３／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔIIを示す。 プラスミドｐＢＳｆａｒ１：：ＹＮＬ２７９ｗ−Ｎ１３６ＦＵＳ１−ｌａｃＺ：：ＡＤＥ２ｗ／ｏを示す。 プラスミドＧＰＡ１−Ｃ５−Ｇアルファｑ統合体を示す。 １種のレポーター遺伝子のみを用いた場合と比較して、二重のレポーター遺伝子分析が酵母液体分析の性能をいかに改善するかを説明する。 ヒトのブラジキニンＢ２受容体が酵母のシグナル変換経路に結合することを、用いられたＧαトランスプラントの関数として示す。 二重のレポーター遺伝子分析が、アンタゴニストのスクリーニングにも使用できることを示す。 ＹＮＬ２７９ｗプロモーターを用いることによって、酵素基質で２９時間インキュベートした後でも、バックグラウンドシグナルの形成が、ＦＵＳ１プロモーターを用いるよりも明らかに少ないことを示す。 ＹＮＬ２７９ｗプロモーターを用いることによって、酵素基質で２９時間インキュベートした後でも、バックグラウンドシグナルの形成が、ＦＵＳ１プロモーターを用いるよりも明らかに少ないことを示す。 複数種の受容体様式における分析を実行することを説明するもので、いずれの場合においても様々なＧＰＣＲが、別々の酵母株で発現され、それらはいずれも１つの株中に一緒に存在することはないことを説明する。 マイクロタイタープレートにおける複数種の受容体様式における分析の性能を、１種の受容体様式と比較して実証する。 リガンドとインキュベートした後に酵素基質ＣＰＲＧを界面活性剤と共に加えると分析の性能が高まることを示す。

Claims (11)

1. ２つのレポーター遺伝子を有する分析される酵母細胞、および、細胞増殖への効果を有する標的分子の活性を用いて、該標的分子の活性に影響を与えることができる物質を同定するための、二重のレポーター遺伝子分析の方法であって、
   ａ）少なくとも１つの細胞と、試験しようとする物質とを接触させる工程、
   ｂ）細胞増殖を検出する工程、
   ｃ）レポーター遺伝子産物の活性を検出する工程、
   を含み、
   ここで、１つのレポーター遺伝子は成長マーカーのレポーター遺伝子であり、もう１つのレポーター遺伝子は酵素をコードする遺伝子であって、その活性は基質の変換に基づき検出することができ、この基質は分析しようとする物質の添加の後に遅れて加えられ、そして
   分析しようとする物質の添加と、基質の添加との間の時間間隔は、用いられた細胞が２〜２４回の細胞周期が完了する期間に相当する、
   前記方法。
2. 標的分子の活性は、レポーター遺伝子産物の活性に対する作用を有する、請求項１に記載の方法。
3. 標的分子の活性は、レポーター遺伝子産物の発現に対する作用を有する、請求項２に記載の方法。
4. 標的分子は、異種の分子である、請求項１に記載の方法。
5. レポーター遺伝子産物の活性は、細胞を崩壊させることによって検出される、請求項１に記載の方法。
6. レポーター遺伝子産物の活性は、細胞壁を透過可能にする物質または細胞壁を破壊する物質と一緒に基質を加えることによって検出される、請求項５に記載の方法。
7. 標的分子そのものが、細胞増殖に影響を与える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 標的分子は、細胞増殖に直接的に影響を与える分子の介在によって該増殖に影響を与える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 標的分子は、キメラ分子との相互作用によって細胞増殖にその作用を与える、請求項８に記載の方法。
10. 酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ株からの酵母細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. １回のアプローチで、異なる標的分子を有する細胞を、分析しようとする物質と同時にスクリーニングする、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。

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