KR20050018621A - 바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치 및 바이오어세이 기판 - Google Patents

Abstract

하이브리다이제이션 등의 물질간의 상호 반응 작용이 행해지는 반응영역의 전기장 형성을 컨트롤함으로써, 상기 상호 반응작용의 효율을 높일 수 있다.

바이오 어세이 방법 및 그 방법을 아주 적합하게 실시할 수 있는 바이오 어세이 장치이다. 검출용 물질(D)이 고정 가능하도록 표면 처리가 된 검출표면(S)(S')과, 상기 검출표면(S)(S')에 고정된 상태의 검출용 물질(D)과 청가된 표적물질(T)의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역(R)(R')과, 상기 반응영역(R)(R')에 전위차를 생기게 하여, 그 반응영역(R)(R') 내에 전기장을 형성하는 전기장형성수단(E)을 적어도 구비하는 검출부(1)(10)에 있어서 물질간의 상호반응작용을 검출하는 방법으로서, 상기 전기장형성수단(E)에 의한 전기장형성을 소정 타이밍으로 온/오프하는 단계를 적어도 포함한다.

Description

바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치 및 바이오 어세이 기판 {Bioassay Method, Bioassay Device, and Bioassay Substrate}

본 발명은, 바이오인포매틱스(생명정보과학) 분야에 있어서 특히 유용한 바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치 및 바이오 어세이용 기판에 관한 것이다.

본 발명의 주된 종래기술을 이하에 설명한다.

현재, 마이크로어레이 기술에 의해 소정의 DNA가 미세 배열된, 이른바 DNA 칩 또는 DNA 마이크로어레이(이하, 「DNA 칩」이라고 총칭.)라고 불리우는 바이오 어세이용의 집적기판이, 유전자의 변이 해석, SNPs(1염기 다형) 분석, 유전자 발현 빈도 해석 등에 이용되고 있고, 신약 개발, 임상진단, 약리 제노믹스, 법의학 등의 분야에 있어서 광범위하게 활용되기 시작하고 있다.

이 DNA 칩은, 유리 기판이나 실리콘 기판 위에 다종ㆍ다수의 DNA 올리고 사슬이나 cDNA(상보적인 DNA)등이 집적되어 있기 때문에, 하이브리다이제이션 등의 분자간 상호반응의 망라적 해석이 가능해지는 점이 특징이다.

DNA 칩에 의한 해석수법의 일례를 간결하게 설명하면, 유리 기판이나 실리콘 기판 위에 고상화 된 DNA 프로브에 대해서, 세포, 조직 등으로부터 추출한 mRNA를 역전사 PCR반응 등에 의해 형광 프로브 dNTP를 짜넣으면서 PCR 증폭하고, 상기 기판상에 있어서 하이브리다이제이션을 행하고, 소정의 검출기로 형광측정을 행한다고 하는 수법이다.

여기에서, DNA 칩은 두개의 타입으로 분류할 수 있다. 제1의 타입은, 반도체 노광기술을 응용한 포토리소그래피의 기술을 이용하여, 소정의 기판 위에 직접 올리고 누클레오티드를 합성해 가는 것이며, 미국 애피매트릭스사(Affymetrix사)에 의한 것이 대표적이다(예를 들면, 미국 특허 제5,445,934호 공보 참조). 이 종류의 칩은 집적도는 높지만, 기판상에서의 DNA합성에는 한계가 있어서 몇십 염기 정도의 길이이다.

제2의 타입은, 「스탬퍼드 방식」이라고도 칭해지는 것으로, 끝 분할 핀을 이용하여 미리 준비된 DNA를 기판 위에 분주·고상화해 감으로써 제작되는 것이다(예를 들면, 미국 특허 제5,807,522호 공보 참조). 이 종류의 칩은, 집적도는 전자에 비해서 낮지만, 1kb정도의 DNA 단편을 고상화할 수 있다고 하는 이점이 있다.

또 현재, 프로테인 칩을 포함하는 바이오센서 칩이라고 칭해지는, 얇은 평판 위에 설치된 미소한 검출 표면부위에 소정의 검출용 물질을 고상화하고, 이 검출용 물질에 대해서, 표적물질을 포함하는 용액을 미용량 통수하고, 양 물질의 상호반응을 표면 플라즈몬 공명원리나 수정 발진자 등의 원리를 이용해서 관찰ㆍ분석하는 바이오센서 기술이 진전되어 있고, 항체항원반응이나 호르몬 응답반응 등의 물질간 상호반응의 분석에 있어서의 유용한 기술이 되어 있다.

그렇지만 상기한 종래의 DNA 칩 기술이나 바이오센서 기술에서는, 이차원인 기판의 협소한 검출부에 있어서, DNA 프로브 등의 검출용 누클레오티드 사슬이나 단백질 등을 고상화(고정화)하고, 하이브리다이제이션 반응이나 항원 항체반응 등의 물질간의 상호 반응작용을 진행시킨다고 하는 기술이기 때문에 공간적으로 반응 생성물의 자유도가 제한되고, 또 반응 시에 입체장해가 발생할 가능성도 있다고 하는 반드시 적합하다고는 할 수 없는 반응조건하에서, 오로지 반응 생성물의 브라운 운동에 기초해서 상호반응작용을 진행시킨다고 하는 구성이었다. 이 때문에 종래의 DNA 칩 기술 또는 바이오 센서 기술에서는, 상호반응작용의 효율이 나쁘고, 반응시간이 길다고 하는 기술적 과제가 있었다.

또 기존의 DNA 칩 등에서는, 시료용액은, 기판 위의 소정의 스폿 부위(검출부)에 적하될 뿐이며, 상기 시료용액에 포함되어 있는 표적물질과, 상기 스폿 부위에 고정된 상태의 검출물질의 상대적인 위치결정을 하기 위한 연구는 조금도 강구되지 않고 있었다.

그래서 본 발명에서는, 하이브리다이제이션 등의 물질간의 상호반응작용이 행하여지는 반응영역의 전기장형성을 컨트롤하여, 검출용 물질과 표적물질 사이의 상대적 위치 결정이나 물질구조의 조정을 행함으로써, 상호반응작용의 효율을 향상시키는 것을 가능하게 한 바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치 및 이들 바이오 어세이 방법, 바이오 어세이 장치에 이용되기에 아주 적합한 바이오 어세이 기판을 제공하는 것을 주목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법의 아주 적합한 단계 및 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법의 아주 적합한 실시 형태를 설명하기 위한 플로우 도이다.

도 2는 상기 바이오 어세이 방법 또는 장치의 전압 인가의 온/오프 단계의 실시예를 설명하기 위한 파형도이다.

도 3은 본 발명에 따른 아주 적합한 실시 형태인 바이오 어세이용 기판을 위쪽에서 보았을 때의 외관 사시도이다.

도 4는 기판에 설치된 셀 검출부의 하나를 확대해서 도시하는 외관 사시도이다.

도 5는 상기 셀 검출부의 반응영역의 검출 표면부근을 확대해서 도시하는 도이다.

도 6은 본 발명에 따른 아주 적합한 다른 실시 형태인 바이오 어세이용 기판을 도시하는 도이며, (A)는 기판의 위쪽에서 보았을 때의 평면도, (B)는 (A)도 중의 X부의 확대 평면도이다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위해서, 우선 본원에 있어서는, 이하의 「바이오 어세이 방법」을 제공한다. 또한 본원에 있어서 「바이오 어세이」란, 하이브리다이제이션 등의 물질간의 상호 반응에 근거하는 생화학적 분석을 넓게 의미한다.

본 발명에 따른 「바이오 어세이 방법」은, 검출용 물질이 고정 가능하도록 표면처리가 된 검출 표면과, 상기 검출 표면에 고정된 상태의 검출용 물질과 표적물질의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역과, 상기 반응영역 내에 전위차를 발생시켜서 이 반응영역 내에 전기장을 형성하는 전기장형성수단을 적어도 구비하는 검출부에 있어서 물질간 상호반응작용을 검출하는 방법을 전제로 하는 방법으로서, 상기 전기장형성수단에 의한 전기장형성을 소정 타이밍으로 온/오프 하는 단계를 적어도 포함하는 방법이다.

상기 반응영역에 형성되는 전기장은, 주로 (1)누클레오티드 사슬 등의 검출용 물질, 표적물질을 신장시키는 작용, (2)검출용 물질과 떨어져서 존재하고 있는 표적물질을 전기력선에 따라 전후방향으로 이동시키는 작용, (3)검출용 물질과 표적물질의 상호반응에 의해 얻어진 반응생성물(검출용 물질과 표적물질의 결합체)의 고차 구조를, 형광 표식된 표적물질이나 상기 반응생성물에 특이적으로 결합하는 형광 인터커레이터로부터 발해지는 형광의 판독을 보다 고정밀도로 행할 수 있는 구조로 조정하는 작용 등을 발휘한다.

즉 검출부의 반응영역에 대해서, 아주 적합한 소정의 타이밍으로 소망의 전기장을 형성하거나(인가 온), 전기장을 형성하지 않거나(인가 오프) 함으로써, 상기 (1) 내지 (3)의 작용을 순차 발휘시킬 수 있다.

보다 구체적으로는, 고주파 고전압의 인가에 의해 상기 (1)의 작용을 얻고, 검출용 물질과 표적 물질을 반응시키기 쉬운 구조, 예를 들면 누클레오티드 사슬의 염기 배열이 중층 되어 있지 않은 직쇄상 구조(신장한 구조)로 조정할 수 있다.

계속해서, 직사각형파 전압(펄스상의 직류전압)을 인가함으로써, 보다 상세하게는, 직사각형파 전압을 교대로(즉, +/-) 인가함으로써, 상기 (2)의 작용을 얻고, 반응영역에 유리해서 존재하는 표적물질을, 검출 표면에 고정된 상태로 있는 검출용 물질에 접근시킨다. 이것으로 의해 반응효율(반응기회)이 향상되므로, 반응시간을 단축할 수 있다.

그리고 검출의 단계에 있어서도, 고주파 고전압을 반응영역에 인가함으로써, (3)의 작용을 얻어서 반응영역에 존재하는 반응생성물로부터의 형광 등을 광학적 수단 등의 검출수단에 의해 정확하게 검출할 수 있다.

여기에서, 검출용 물질과 표적물질의 하이브리다이제이션 등의 상호반응을 확실하게 진행시키기 위해서는 물질의 브라운 운동에 오로지 맡길 수 있는 반응영역에 형성된 쪽이 좋다고 생각된다. 그래서 본 발명에서는 일련의 전기장형성단계에 있어서, 상기 반응영역에 전기장을 형성하지 않는 시간을 적극적으로 만들도록 한다. 즉 상기 직사각형파 전압 온에 계속해서 직사각형파 전압 오프의 시간을 둠으로써, 물질간의 상호반응을 촉진시킬 수 있다.

여기에서, 본 발명에 따른 「바이오 어세이 방법」에 있어서는, 검출용 물질 및 표적물질의 종류를 특별히 한정하는 것이 아니다. 또한 「표적물질」은 형광 표식 등의 표식이 붙여져 있는 것, 붙여져 있지 않는 것 쌍방을 포함한다. 「검출용 물질」은 검출 표면에 직접적으로, 또는 링커를 통해서 간접적으로 고상화되어, 형광물질 등에 의해 표식된 표적물질과 특이적인 상호반응작용을 발휘하는 저분자, 고분자 및 생체물질 등을 넓게 포함하고 좁게 해석되지 않는다.

「검출 표면」은, 누클레오티드 사슬 등의 말단을 고정화 할 수 있는 아주 적합한 표면처리가 된 표면 부위를 의미한다. 예를 들면 스트랩트아비딘에 의해 표면처리 되었을 경우에는, 비오틴화 된 누클레오티드 사슬의 고정화에 적합한 검출 표면이 된다.

본 방법은, 본 발명의 목적, 효과에 합치하는 범위에서, 단백질-단백질 사이, 누클레오티드 사슬-누클레오티드 사슬 사이(DNA-DNA, DNA-RNA 쌍방을 포함한다.), 단백질-누클레오티드 사슬(쌍가닥을 포함함)사이 등의 고분자간의 상호 반응, 고분자와 저분자의 상호반응, 저분자간의 상호반응 모두에 적용가능하다.

일례를 들면, 상기 검출용 물질 및 상기 표적물질은 누클레오티드 사슬이며, 상기 상호반응작용이 하이브리다이제이션인 경우에 있어서는, 협소한 반응영역(스폿영역)에서도 하이브리다이제이션 효율을 확실하게 향상시킬 수 있으므로, 반응시간이 짧으면서도 판독 정밀도가 높은 DNA 칩 또는 마이크로어레이 수법을 신규로 제공할 수 있다.

여기에서, 상기 반응영역에 있어서의 물질간 상호반응작용이 하이브리다이제이션의 경우에 있어서의 아주 적합한 바이오 어세이 방법으로서는, (a)상기 검출 표면에 말단부위가 고정된 상태의 검출용 누클레오티드 사슬을 신장시키도록 전기장을 형성하는 단계와, (b)상기 단계 후에 상기 반응영역에 대해서 표적 누클레오티드 사슬을 첨가하는 단계와, (c)상기 단계 후에 상기 반응영역에 전위차를 발생시켜서, 반응영역 중의 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬을 상대적으로 이동시키는 단계와, (d)상기 단계 후에 인가를 오프로 한 상태로 하이브리다이제이션을 행하는 단계를 포함하는 방법이다. 이하, (a) 내지 (d)의 각 단계에 대해서 구체적으로 설명한다.

여기에서, 본원에 있어서 「누클레오티드 사슬」이란, 푸린 또는 피리미딘 염기와 당이 글리코시드 결합된 누클레오시드의 인산 에스테르의 중합체를 의미하고, DNA 프로브를 포함하는 올리고 누클레오티드, 폴리누클레오티드, 푸린 누클레오티드와 피리미딘 누클레오티드가 중합된 DNA(전체 길이 또는 그 단편), 역전사에 의해 얻을 수 있는 cDNA(cDNA 프로브), RNA 등을 넓게 포함한다.

검출 표면에 말단부위가 고정되어야 할 검출용 누클레오티드 사슬(한가닥)은 반드시 직쇄상의 컴포메이션를 취하고 있다고는 할 수 없기 때문에, 상기 (a)단계에 따라, 검출용 누클레오티드 사슬을 전기력선을 따라 직접 사슬모양으로 신장시킨다. 이것에 의해, 반응영역에 대해서 검출용 누클레오티드 사슬의 염기 배열이 노출되고, 상보적인 염기배열과의 수소결합반응을 진행하기 쉬운 상태를 형성할 수 있다.

보다 상세하게는, 인산 이온 등을 구비하는 누클레오티드 사슬의 음전하와 이온화 한 수소원자의 양전하로 구성되는 다수의 분극 벡터로 이루어지는 누클레오티드 사슬이 전계의 인가에 의해 신장되고, 이 때문에 염기끼리 중층하지 않게 되고, 이 결과, 입체장애가 없어지고, 근재하는 표적 누클레오티드와의 하이브리다이제이션 반응이 원활하게 행하여지게 된다.

누클레오티드 사슬이 신장 또는 이동하는 원리를 상세히 설명하면, 누클레오티드 사슬의 골격을 이루는 인산 이온(음전하)와 그 주변에 있는 물이 이온화 한 수소원자(양전하)에 의해 이온 구름을 만들고 있다고 생각되고, 이들 음전하 및 양전하에 의해 생기는 분극 벡터(쌍극자)가, 고주파 고전압의 인가에 의해 전체적으로 한방향을 향하고, 그 결과로서 누클레오티드 사슬이 신장한다고 생각된다. 부가해서 전기력선이 일부에 집중하는 불균일 전계가 인가 되었을 경우, 누클레오티드 사슬은 전기력선이 집중하는 부위를 향해서 이동한다(Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin-ichi Tazawa, Osamu Kurosawa and Masao Washizu:"Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy", IEEE Transaction on industrial Applications, Vol.34, No.1, P75-83(1988) 참조).

계속해서 상기 (a)단계 후에, 전압인가를 온 상태로 한 채이거나, 또는 전압인가를 일단 오프로 한 상태에서, 반응영역의 액상 중에 표적 누클레오티드 사슬을 포함하는 시료용액을 첨가하는 (b)단계를 실행한다.

이 (a)단계에 계속해서 반응영역에 전기장을 형성하고, 반응영역 중의 검출용 누클레오티드 사슬과 누클레오티드 사슬을 상대적으로 이동시키는 상기 (c)단계를 실행하여, 하이브리다이제이션이 진행되기 쉬운 반응환경을 형성한다. 즉 (c)단계에 따르면, 반응영역에 전기장을 형성함으로써, 종래, 오로지 브라운 운동에만 기초하고 있던 양 누클레오티드 사슬간의 반응기회를 현격히 증가시킬 수 있으므로, 반응효율이 높아지고, 검출정밀도를 향상시킬 수 있다.

다음에, (d)단계에서는, 상기 (c)단계 종료 후에, 인가를 오프한 상태를 형성하고, 브라운 운동에 기초하는 하이브리다이제이션을 행하도록 한다. 이 (d)단계에 있어서 인가 오프를 조건으로 한 이유는, 하이브리다이제이션이 상보적인 염기쌍간의 수소결합에 전적으로 맡겨진 반응이기 때문이다.

다음에, 본 발명에서는, 상기 바이오 어세이 방법을 아주 적합하게 실시 할 수 있는 툴로서, 이하의 구성을 구비하는 「하이브리다이제이션 장치」를 제공한다.

즉 본 발명에 따른 바이오 어세이 장치는, 검출용 물질이 고정 가능하도록 표면처리가 된 검출 표면과, 상기 검출 표면에 고정된 상태의 검출용 물질과 표적물질의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역과, 그 반응영역 내에 전위차를 생기게 함으로써, 그 반응영역 내에 전기장형성이 가능한 동시에, 상기 전기장형성을 소정 타이밍으로 온/오프 가능하게 구성된 전기장형성수단을 적어도 구비하는 검출부를 이용한다.

상기 「검출부」는, 검출 표면과 반응영역과 전기장형성수단, 이상 세 가지를 필수 구성으로 하고, 기타의 구성, 구조에 대해서 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 주변에서 구획된 미소한 셀 구조나 채널 구조 등을 기판 위에 형성하고, 이들 구조부분에 상기 필수 구성을 만들어 검출부로 해도 좋다. 기판 위의 검출부의 수는, 목적ㆍ용도에 따라 결정할 수 있고, 기판의 형태는, 직사각형상, 원반형 등의 평판형의 형태를 적당히 선택 결정할 수 있다.

또한 본 발명에서는, 상기 바이오 어세이 방법을 아주 적합하게 실시할 수 있는 툴로서, 이하의 구성을 구비하는 「바이오 어세이 기판」을 제공한다.

본 발명에 따른 「바이오 어세이용 기판」은, 광학적으로 기록정보의 판독이 가능해진 원반형 기판 위에, 적어도 (1)검출용 누클레오티드 사슬의 말단부위가 고정 가능하게 표면 처리가 실시된 검출 표면, (2)상기 검출 표면에 고정된 상태의 검출용 누클레오티드 사슬을 신장시키는 전기장을 형성하는 플러스 마이너스 전극, (3)상기 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬 사이의 하이브리다이제이션 반응의 장소가 되는 반응영역을 구비하는 「검출부」가 설치되어 있다.

이 「검출부」를 가지는 바이오 어세이 기판에서는, 검출 표면에 고정된 검출용 누클레오티드에 전계를 거는 것에 의해, 그 누클레오티드 사슬을 직쇄상으로 신장시킨 후에, 표적 누클레오드 사슬을 포함하는 샘플 용액을, 검출부의 상기 반응영역을 겨냥해서 정확하게 적하하고, 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬 사이의 하이브리다이제이션 반응을 진행시킬 수 있다. 이 결과, 하이브리다이제이션 반응을 단시간으로 효율적으로 행할 수 있다고 하는 유리한 효과를 얻을 수 있다.

상기 효과는, 상술하는 바와 같이, 인산 이온 등을 구비하는 누클레오티드 사슬의 음전하와 이온화 한 수소원자의 양전하로 구성되는 다수의 분극 벡터로 이루어지는 누클레오티드 사슬이 전계의 인가에 의해 신장되고, 염기끼리 중층하지 않게 되는 결과, 반응 시의 입체 장해가 없어지고, 근재하는 표적 누클레오티드와 검출용 누클레오티드의 하이브리다이제이션 반응이 원활하게 행하여지게 됨으로써 초래된다.

여기에서, 누클레오티드 사슬이 신장 또는 이동하는 원리를 다시 설명하면, 누클레오티드 사슬의 골격을 이루는 인산 이온(음전하)과 그 주변에 있는 물이 이온화 한 수소원자(양전하)에 의해 이온 구름을 만들고 있다고 생각되고 이들 음전하 및 양전하에 의해 생기는 분극 벡터(쌍극자)가, 고주파 고전압의 인가에 의해 전체적으로 한방향을 향하고, 그 결과로서, 누클레오티드 사슬이 신장된다고 생각된다. 부가해서, 전기력선이 일부에 집중하는 불균일 전계가 인가 되었을 경우, 누클레오티드 사슬은 전기력선이 집중하는 부위를 향해서 이동한다.

여기에서, 상기 검출 표면에 전기력선이 집중하는 전계를 인가 하면, 결과적으로, 전계에 의해 신장처리(전술)된 누클레오티드 사슬이 그 검출 표면을 향해서 이동하고, 그 말단부위가 검출 표면에 충돌 함으로써, 검출용의 누클레오티드 사슬을 검출 표면에 확실하게 고정할 수 있다.

「반응영역」은, 액상 중에서의 하이브리다이제이션 반응의 장소를 제공할 수 있는 구획된 영역 또는 공간이며, 또한 플러스 마이너스 전극 사이에 전위차가 생김으로써 액상에 전기장이 형성되는 영역이다.

또한 이 반응영역에서는, 한가닥 누클레오티드간의 상호반응, 즉 하이브리다이제이션에 부가해서, 검출용 누클레오티드 사슬로 소망의 쌍가닥 누클레오티드를 형성하고, 그 쌍가닥 누클레오티드와 펩티드(또는 단백질)의 상호반응, 효소응답반응 그 외의 분자간 상호반응도 행하게 할 수 있다. 예를 들면, 상기 쌍가닥 누클레오티드를 이용할 경우는, 전사인자인 호르몬 리셉터 등의 리셉터 분자와 응답배열 DNA부분의 결합 등을 분석할 수 있다.

다음에, 본 발명에 따른 바이오 어세이용 기판에서는, 상기한 「검출부」를, 한벽면에 검출 표면이 형성된 셀 구조를 구비하는 셀 검출부로 하고, 이 셀 검출부를 원반형 기판 위에 복수 배치시킨 형태를 채용할 수 있다. 또한 「셀 검출부」란, 주변의 기판영역과는 구획된 소실모양의 반응영역을 구비하는 부위로 정의한다.

이 「셀 검출부」는, 기판 위의 적당한 위치에 배치하는 것이 가능한데, 위쪽에서 보아서 방사상을 나타내도록 나열해서 배치하면, 기판 위의 공간을 유효하게 이용할 수 있으므로 정보의 집적밀도를 높일 수 있다. 즉 기록정보의 집적량이 많은 (원반형의) DNA 칩을 제공할 수 있다.

또한 셀 검출부는, 서로 콘터미네이션 하지 않도록 구획되어 있으므로, 셀 검출부 단위 또는 그루핑 된 복수의 셀 검출부 단위에, 다른 검출용 누클레오티드 사슬을 고정하고, 검출용 누클레오티드 사슬마다 별개 독립의 조건을 설정하고, 하이브리다이제이션 반응을 진행시킬 수 있다.

예를 들면, 질병발증의 마커 유전자를 기판 위에 그루핑 해서 고정할 수 있다. 이것에 의해 하나의 기판을 이용해서, 동시에 복수의 질병의 발현상황을 확인할 수 있다.

또 Tm 또는 GC 함유율의 차이에 기초하여, 고정화하는 검출용 누클레오티드 사슬을 그루핑 해 두는 것이 가능해진다. 이것에 의해 액티브한 하이브리다이제이션 반응을 얻을 수 있는 버퍼 조성, 농도 등의 반응조건, 세정조건, 적하하는 샘플 용액 농도 등을, 검출용 누클레오티드 사슬의 성질에 따라서 꼼꼼하게 선택하는 것이 가능해지므로, 해석작업에 있어서 가짜양성 또는 가짜음성이 나타내어질 위험성을 현격히 감소시킬 수 있다.

다음에, 본 발명에 따른 바이오 어세이용 기판에서는, 상기 검출부의 반응영역을, 원반형 기판 위에 방사상으로 연설된 줄기홈(groove) 내에 형성 또는 배치하고, 그 줄기홈의 내벽면에는, 상기 검출 표면을 배치한다고 하는 구성도 채용할 수 있다.

또한, 기판에 형성되는 「줄기홈」이란, 줄무늬 모양으로 연설된 가늘고 긴 마이크로 채널 구조를 의미하고, 이 줄기홈을 구비하는 바이오 어세이용 기판이 속하는 하나의 분야는, 원반형의 마이크로 채널 어레이라고 말할 수 있다. 이하, 반응영역이 줄기홈 내에 설치되어 있는 구성의 검출부를, 상기 「셀 검출부」를 따라서 편의상 「줄기홈 검출부」라고 칭하기로 한다.

이 「줄기홈 검출부」를 채용했을 경우는, 모세관 환경을 이용한 액체이송이나, 원반형의 기판을 소정 방법으로 회전시킴으로써 생기는 원심력을 살린 액체이송방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 샘플 용액이나 반응 후에 액티브하게 결합하지 않은 여분의 표적물질을 제거하기 위한 세정액 등을, 기판 중심영역에서 줄기홈 내(즉 반응영역)에, 원활하면서도 확실하게 액체이송 하는 것이 가능해진다.

또한 줄기홈 검출부의 경우라도, 상기 줄기홈 단위 또는 그루핑 된 복수의 줄기홈 단위에, 다른 검출용 누클레오티드 사슬을 고정할 수 있다.

이상 설명한 바이오 어세이용 기판에 있어서, 상기 검출 표면부위의 위치정보와 회전동기정보를 제공하는 수단을 구비한 경우, 상기 위치정보와 회전동기정보에 근거하여, 검출용 누클레오티드 함유 용액 및 표적 누클레오티드 함유 용액을,소정의 반응영역에 정확하게 추종시켜서 적하할 수 있다.

상기 수단은, 상기 기판 위에 설치된 워블링(wobbling) 또는 어드레스 피트에 의한 것으로 할 수 있다. 또한, 「워블링」이란, 디스크위의 물리적인 번지(어드레스)의 정보를 미리 디스크 위에 기록하기 위해서, 유저에 의한 데이터를 기록하는 그룹(안내홈)을 트랙의 중심에 대해서 약간 좌우로 사행시키는 것이다. 통상, 트래킹 서보 대역보다 높은 주파수에 대해서, 사소한 주파수의 편향(Deviation)을 가지는 FM변조가 행하여져, 정현파 변조신호 진폭을 그룹 반경방향 변위로서 기판 위에 새긴다.

이상 설명한 바이오 어세이용 기판 위에 설치된 상기 반응영역에 대해서는, 실온과 반응에 적합한 온도 사이에서, 겔, 졸의 가역 상변화가 일어날 수 있는 물질(「상변화 물질」이라고 칭함)을 충전하는 것도 가능하다. 상변화 물질의 일례로서는, 아가로스 겔을 들 수 있다.

이 수단으로는, 상변화 물질을 고온하에서 상기 상변화 물질을 졸화 하고, 이 상태로 전압을 인가해서 DNA 등의 누클레오티드 사슬을 배열한 후에, 온도를 저하시켜서 겔화 하고, 다시 계속해서 하이브리다이제이션 시에는, 반응에 적합한 온도 조건에서 졸화하는 단계를 실행할 수 있고, 하이브리다이제이션 시에 있어서 상기 상변화 물질을 겔 상태로 유지해 두면, DNA 등의 누클레오티드 사슬을 신장시킨 상태로 하이브리다이제이션시킬 수 있으므로 바람직하다. 또한, 상기 상변화 물질이 겔화 한 상태일 때에는, 표적 누클레오티드 사슬을 포함하는 시료용액을 검출부에 적하했을 때에, 하이브리다이제이션이 잘 진행되지 않을 우려가 있으므로, 전기영동의 경우와 같이, 적하 포인트에 세로방향의 홈을 미리 형성해 두고, 이 홈 안에 시료용액을 적하해도 좋다.

본 발명에 있어서, 표적 누클레오티드 사슬은, 형광색소로 표식 하는 수단이나, 인터커레이터(intercalator)를 이용하는 수단 모두 채용할 수 있다. 「인터커레이터」는, 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬의 염기간의 수소결합 중에 삽입되도록, 하이브리다이제이션 한 쌍가닥 누클레오티드 사슬에 혼입된다. 이것에 의해, 장파장측에 형광파장이 시프트 하고, 또한 형광강도와 쌍가닥 누클레오티드 사슬에 혼입된 인터커레이터의 양과의 사이에는 상관관계가 있으므로, 이 상관관계에 근거하여 정량적인 검출이 가능해진다. 이상과 같이, 본 발명은, DNA 칩이나 바이오 센서 칩에 관련되는 신규기술을 제공한다고 하는 기술적 의의를 가지고 있다.

또한 본 발명은, 유전자의 변이 해석, SNPs(1염기 다형) 분석, 유전자 발현 빈도 해석 등에 이용할 수 있는 신규의 바이오 어세이용 기판을, 신약 개발, 임상진단, 약리 제노믹스, 법의학 등의 관련 산업계에 제공한다고 하는 기술적 의의를 가지고 있다.

이하, 첨부도면에 근거하여, 본 발명의 아주 적합한 실시 형태에 대해서 설명한다.

도 1(A) 내지 (F)는, 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법의 아주 적합한 단계 및 본 발명에 따른 바이오 어세이 장치의 아주 적합한 실시 형태를 설명하기 위한 플로우 도, 도 2는 상기 방법 또는 상기 장치에 있어서 실시되는 전압인가의 온/오프 단계의 일실시예를 설명하기 위한 파형도이다.

또한 이하, 본 발명에 관하여, 검출용 물질과 표적물질이 쌍방 한가닥의 누클레오티드 사슬이며, 상호반응작용이 하이브리다이제이션인 경우를 대표예로서 설명한다. 또 이 설명을 근거로 하여, 검출용 물질과 표적물질이 누클레오티드 사슬로 한정되는 것은 아니고, 또한 본 발명의 대상이 되는 상호반응작용이 하이브리다이제이션으로 한정되는 것은 아니다.

우선, 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법 또는 장치는, 도 1 중에 부호(D)로 도시된 검출용 물질이 고정 가능하도록 표면 처리가 실시된 검출 표면(S)과, 이 검출 표면(S)에 고정된 상태의 검출용 물질(D)과 첨가된 표적 물질(T)의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역(R)과, 이 반응영역(R) 내에 전위차를 생기게 해서, 그 반응영역(R) 내에 전위차를 생기게 하는 전기장형성수단(E)으로서 기능하는 플러스 전극(E1), 마이너스 전극(E2)를 적어도 구비하는 검출부(1)를 이용하는 것을 전제로 하고 있다. 또한 부호(2)는, 상기 검출부(1)를 구비하는 기판의 일부를 나타내고 있고, 부호(V)는 플러스 전극(E1), 마이너스 전극(E2)에 전력을 가하는 전원이다.

도 1(A)은, 상기 검출 표면(S)에 대해서, 한가닥의 검출용 누클레오티드 사슬(예를 들면, DNA 프로브)(D1)의 말단부위가 고정되어 있는 상태를 간결하게 도시하고 있다. 이 상태에서는, 검출용 누클레오티드 사슬(D1)의 고차 구조는 직쇄상이 아니고, 예를 들면, 도 1(A)과 같이 사슬이 서로 얽히는 중층모양의 형태를 취하고 있는 경우가 많다. 이 때문에, 모든 염기배열이 반응영역(R)에 노출되어 있다고 할 수 없기 때문에, 반응영역(R)에 뒤에 첨가되는 표적 누클레오티드 사슬(T)과의 효율적인 하이브리다이제이션은 얻기 어려운 상태에 있다고 생각된다.

그래서 본 발명에서는, 플러스 전극(E1)과 마이너스 전극(E2) 사이에 있는 반응영역(R)의 액상(염 용액 등)에 고주파 고전압을 인가해서, 반응영역(R) 중에 전위차를 생기게 하여 전기장(전계)을 형성한다. 이 전기장은, 검출용 누클레오티드 사슬(D1)을 전계에 따라 직쇄상(직선상)으로 신장시키는 작용을 발휘한다. 이 결과, 검출용 누클레오티드 사슬(D1)이 신장된 상태(부호(D2)로 도시함)가 되어, 검출용 누클레오티드 사슬(D1)의 염기배열이 액상에 노출된다(도 1(B) 참조).

다음에, 고주파 고전압의 인가를 오프하거나, 또는 인가를 온한 상태로, 소정구조의 노즐(3)로 정확하게 반응영역(R)에 표적물질(T)(표적 누클레오티드 사슬(T1))을 포함하는 시료용액을 첨가한다. 표적 누클레오티드 사슬(T1)은, 첨가 당초, 도 1(C)에 도시되어 있는 바와 같이, 반드시 직쇄상은 아니지만, 고주파 전압이 인가 된 액상에서는, 도 1(D)에 도시되어 있는 바와 같이, 직쇄상으로 신장된 상태(부호(T2)로 도시함)가 되고, 마찬가지로 직쇄상으로 된 검출용 누클레오티드 사슬(D2)과 상보사슬을 형성하기 쉬운 상태가 된다.

다음에, 직사각형파 전압의 인가의 온/오프를 수회 반복함으로써, 양 누클레오티드 사슬(D2, T2)을 단계적으로 접근시키거나, 또는 표적 누클레오티드 사슬을 전후로 이동시키거나, 나아가서는 반응의 타이밍을 조정하거나 한다.

직사각형파 전압의 인가를 오프하는 이유는, 직쇄상의 표적 누클레오티드 사슬(T2)과 직쇄상의 검출용 누클레오티드 사슬(D2) 사이의 상보사슬 형성반응, 즉 하이브리다이제이션을, 오로지 브라운 운동에 맡겨서 진행시키기 위해서이다. 또한 도 1(E)은 양 사슬(D2, T2)의 상보적인 염기배열부분이 수소결합해서 쌍가닥이 된 상태의 반응생성물(D2+T2)을 간략하게 나타내고 있다.

또한 본 발명에서는, 검출용 누클레오티드 사슬(D1)(D2)과 상보적인 염기배열을 가지는 표적 누클레오티드 사슬(T1)(T2)의 검출을 행할 목적 이외에, 상기 단계를 이용해서 목적으로 하는 쌍가닥 누클레오티드 사슬(DNA)을 제작하고, 전사인자 등의 특정한 단백질과 상기 쌍가닥 누클레오티드 사슬(DNA) 중의 특정 반응 배열부분과의 상호반응작용을 검출하는 방법, 또한 이 방법을 이용한 내분비 교란물질의 탐색, 검정 등에 전개해도 좋다.

도 1(F)은, 광학적 수단(4)에 근거해서, 표식(예를 들면 형광 표식) 된 표적누클레오티드 사슬(T2)을 검출, 판독하는 단계를 나타내고 있고, 본 발명에 있어서는, 표식방법은 좁게 한정되지 않는다. 예를 들면 형광 인터커레이터를 이용해도 좋다. 형광 인터커레이터는, 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 표적 누클레오티드 사슬(T)의 염기간의 수소결합 중에 삽입되도록, 하이브리다이제이션한 쌍가닥 누클레오티드 사슬에 혼입된다. 이것에 의해 장파장측에 형광파장이 시프트하고, 또한 형광강도와 쌍가닥 DNA에 혼입된 형광 인터커레이터의 양 사이의 상관관계에 근거하여 정량적인 검출이 가능해진다. 형광 인터커레이터에 이용되는 형광색소로서는, POPO-1이나 TOTO-3 등을 생각할 수 있다.

검출단계에 있어서는, 고주파 고전압을 인가함으로써, 반응영역(R)에 형성되어 있는 반응생성물(2중사슬 누클레오티드 사슬)의 고차 구조를 중층이 없는 구조로 조정함으로써, 광학적 수단(4)에 의해 정확하게 검출할 수 있다.

계속해서, 도 2에 근거하여, 인가 온/오프 단계의 일실시예에 대해서 설명한다. 또한 이 실시예는, 도 1(C) 이후의 단계에 대응하고 있다.

<스텝 a>

고주파 고전압의 인가에 의해 형성되는 전계하에 누클레오티드 사슬을 두는 것에 의해, 그 누클레오티드 사슬의 유도분극을 꾀하고, 이것에 의해 누클레오티드 사슬을 신장시킨다. 그래서 본 스텝 a에서는, 고주파 고전압을 인가 함으로써, 표적 누클레오티드 사슬(T1)을 신장시키고, 마찬가지로 검출용 누클레오티드 사슬(D1)에 대해서도 신장시킨다(도 1(C), 도 1(D)에 도시된 상태를 참조).

또한 상기 고주파 고전압은, 1×10⁶V/m, 약 1MHz 부근이 최적조건이라고 생각된다(Masao Washizu and Osamu Kurosawa:"Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures", IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26, No.26, p.1165-1172(1990) 참조).

<스텝 b>

양 누클레오티드 사슬(D2, T2)이 상대적으로 이동하여 접근했다고 생각되는 타이밍으로, 전압의 인가를 오프 하고, 오로지 브라운 운동에 근거해서 하이브리다이제이션을 진행시킨다(도 1(E)에 도시된 상태를 참조).

<스텝 c>

+방향으로 직사각형파 전압의 인가를 온 하고, 여전히 미접근 상태에 있는 표적 누클레오티드 사슬(T2)을 쿨롱력으로 이동시킴으로써, 검출용 누클레오티드 사슬(D2)과의 하이브리다이제이션에 적합한 위치로 한다(도 1(D)의 상태로부터 도 1(E)의 상태로 이행하는 과정을 참조).

<스텝 d>

다시 전압의 인가를 오프 하고, 오로지 브라운 운동에 근거해서 하이브리다이제이션을 진행시킨다(도 1(E)의 상태를 참조).

<스텝 e>

다음에, -방향으로 직사각형파 전압의 인가를 온 하고, 여전히 미접근 상태에 있는 표적 누클레오티드 사슬(T2)의 이동을 행한다(도 1(D)의 상태로부터 도 1(E)의 상태로 이행하는 과정을 참조).

<스텝 f>

다시 전압의 인가를 오프 하고, 오로지 브라운 운동에 근거해서 하이브리다이제이션을 진행시킨다(도 1(E)에 도시된 상태를 참조).

<스텝 g>

다시 +방향으로 고직사각형파 전압의 인가를 온 하고, 여전히 미접근 상태에 있는 표적 누클레오티드 사슬(T2)의 이동을 행한다(도 1(D)의 상태로부터 도 1(E) 의 상태로 이행하는 과정을 참조).

<스텝 h>

다시 전압의 인가를 오프 하고, 오로지 브라운 운동에 근거해서 하이브리다이제이션을 진행시킨다(도 1(E)에 도시된 상태를 참조).

<스텝 i>

다시 -방향으로 직사각형파 전압의 인가를 온 하고, 여전히 미접근 상태에 있는 표적 누클레오티드 사슬(T2)의 이동을 행한다(도 1(D)의 상태로부터 도 1(E)의 상태로 이행하는 과정을 참조).

<스텝 j>

다시 전압의 인가를 오프로 하고, 오로지 브라운 운동에 근거해서 하이브리다이제이션을 진행시킨다(도 1(E)에 도시된 상태를 참조).

<스텝 k>

하이브리다이제이션에 의한 반응생성물인 쌍가닥 누클레오티드 사슬(D2+T2)을, 고주파 고전압 하에서 신장시켜서 형광 판독에 건다(도 1(F)을 참조).

또한 이상 설명한 직사각형파 전압 등의 인가 온/오프의 단계는, 취급하는 반응생성물의 종류에 따라 적합한 단계, 타이밍을 선택, 결정할 수 있는 것으로, 상기 단계, 타이밍으로 한정되지 않는다. 또 목적에 따라, 주파수, 전압의 크기도 적당히 결정할 수 있다.

계속해서, 본 발명에서 채용할 수 있는 바이오 어세이용 기판 및 그 기판에 관련되는 바이오 어세이 장치에 대해서 설명한다.

도 3은 소정 구성의 검출부가 다수 배치 된 바이오 어세이용 기판의 외관 사시도, 도 4는 상기 기판에 설치된 「검출부」의 적합한 실시 형태의 확대 외관도이다. 또한 본 발명에서 채용할 수 있는 기판은 도시된 형태로 한정되지 않는다.

우선, 도 3에 도시된 바이오 어세이용 기판(2)(이하, 「기판(2)」라고 약칭)은, CD, DVD, MD 등의 광정보 기록매체에 이용되는 원반기판(디스크)에 채용되는 기재로 형성되어 있다. 즉 기판(2)은 광학적으로 기록정보의 판독이 가능하게 되어 있다.

상기 기재는, 석영 유리나 실리콘, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 등의 원반형으로 성형 가능한 합성 수지, 바람직하게는 사출 성형 가능한 합성 수지에 의해 원반형으로 형성되어 있다. 또한 저렴한 합성 수지 기판을 이용함으로써, 종래 사용되고 었던 유리 칩에 비해서 낮은 운행 비용을 실현할 수 있다. 기판(2)의 중심에는, 기판을 회전할 경우에 시용되는 스핀들 고정용 구멍(도시하지 않고)이 형성되는 경우도 있다.

이 기판(2)의 한 쪽 표면에는, 반사막인 두께 40nm 정도의 알루미늄 증착층이 형성되어 있고, 그 층은 반사막으로서 기능하고 있다. 이 반사막은, 굴절율 1.5이상의 기반 단체로부터의 표면반사 4%이상으로 한다. 이 반사막의 상층에는, 투명한 유리나 투명수지 등으로 이루어지는 광투과층이 성막 되어 있다.

또한 기재가 고반사율의 재료인 경우에는, 기재 표면자체가 반사면으로서 기능하므로 상기 반사막은 형성하지 않아도 상관없다. 금속막 등의 고반사율막을 형성하면 형광 표식된 표적물질의 형광강도를, 감도가 뛰어나게 검출할 수 있다. 이상 설명한 기판(2)의 재질이나 층구조는, 후술하는 기판(20)(도 6 참조)에 있어서도 동일하다.

상기 광투과층에는, 기판(2) 중심의 주변 영역이 위쪽에서 보아서 방사상으로 연장되도록 검출부(1)가 다수 배치되어 있다. 도 4는 이 셀 검출부(1)의 하나를 확대해서 도시하는 외관 사시도이다. 또한 이하의 검출부(1)에 따른 설명은, 검출용 물질과 표적물질이 모두 한가닥의 누클레오티드 사슬인 경우를 대표예로 하는 하지만, 검출부(1)의 대상반응물질을 이것으로 한정하는 취지가 아니다.

여기에서 검출부(1)에는, 부호(D)로 나타내는 검출용 누클레오티드 사슬의 말단부위를 고정할 수 있도록 표면처리가 실시되어 있는 검출 표면(S)과, 그 검출 표면(S)에 미리 고정된 상기 검출용 누클레오티드 사슬(D)을 신장시키는 전기장을 형성하기 위한 플러스 전극(E1) 및 마이너스 전극(E2)과, 상기 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 표적 누클레오티드 사슬(T) 사이의 하이브리다이제이션 반응의 장소가 되는 반응영역(R)을 구비하고 있다. 여기에서는, 반응영역(R)은, 윗쪽으로 개구하는 위쪽에서 보아서 직사각형모양의 셀, 예를 들면, 깊이 1㎛, 길이 100㎛, 폭 50μ의 셀로서 형성되어 있는 있지만, 도시된 형상, 사이즈로 한정되지 않는다.

검출 표면(S)은, 마이너스 전극(E2)측의 반응영역(R)측에 대향하는 내벽면 부위에 형성되어 있다. 이 검출 표면(S)은, 검출용 누클레오티드 사슬(D)의 말단이 커플링 반응 등의 화학결합에 의해 고정되도록 표면처리되어 있다.

즉 검출 표면(S)은, DNA 프로브 등의 검출용 누클레오티드 사슬(D)의 미리 가공된 말단부위를 고정화 하는 데 아주 접합한 표면처리가 되어 있으면 좋은 것이며 좁게 한정되지 않는다. 일례를 들면, 스트렙트아비딘에 의해 표면처리된 검출 표면(S)의 경우에는, 비오틴화 된 누클레오티드 사슬 말단의 고정화에 적합하다.

여기에서, 검출 표면(S)에 대한 검출용 누클레오티드 사슬을 고정하기 위한 적합한 방법을 설명하면, 반응영역(R)에 불균일 전계를 인가함으로써, 그 전계의 작용으로 얻어진(반응영역(R)에 유리하고 있는 상태의) 검출용 누클레오티드 사슬이, 상기 전기력선이 집중하는 검출 표면(S) 부분을 향해서 이동하고, 그 말단부위가 검출 표면(S)에 충돌하게 된다. 이것에 의해 그 누클레오티드 사슬을 검출 표면(S)에 확실하게 고정할 수 있다. 이 방법을 아주 적합하게 실행하기 위해서, 마이너스 전극(E2)은, 도 4에 도시하는 바와 같이 빗 모양으로 한다. 또한 도 4의 부호(V)는, 플러스 전극(E1), 마이너스 전극(E2)에 전력을 가하는 전원이다.

여기에서, 도 4중의 부호(4)는, 시료용액(5)을 적하하는 노즐의 선단부를 나타내고 있다. 노즐(4)은, 기판(2)으로부터 제공되는 위치정보와 회전동기정보에 근거하여, 검출용 누클레오티드 사슬(D)을 함유하는 시료용액(5) 및 표적 누클레오티드 사슬(T)을 함유하는 시료용액(5')을, 반응영역(R) 위치에 정확하게 추종해서 적하하는 구성으로 되어 있다.

적하수단으로서는, 잉크젯 프린팅 방법을 아주 적합하게 채용할 수 있다. 그 이유는, 소정의 반응영역(R) 부위에 정확하게 추종하고, 미소방울을 정확하게 적하할 수 있기 때문이다(후술하는 기판(20)에서도 동일).

「잉크젯 프린팅법」은, 잉크젯 프린터에서 이용되는 노즐을 응용하는 방법으로서, 전기를 이용해서 잉크젯 프린터와 같이 프린터 헤드로부터 기판에 검출용 물질을 분사하여 고정하는 방법이다. 이 방법에는, 압전식 잉크젯법, 버블젯(등록상표)법, 초음파젯법이 있다.

압전식 잉크젯법은, 압전체에 펄스를 인가 할 때 마다에 의해 생기는 변위의 압력에 의해 액적을 날리는 방법이다. 버블젯(등록상표)법은 열 방식이며, 노즐 중의 히터를 뜨겁게 하여 발생시킨 기포의 압력에 의해 액적을 날리는 방식이다. 노즐 내에 히터가 되는 실리콘 기판을 메워넣고, 약 300℃/s로 제어해서 똑같은 기포를 만들어 액적을 밀어낸다. 그렇지만 고온에 액체가 노출되게 되기 때문에, 생체물질시료에 이용할 때는 주의를 요한다. 초음파 젯법은, 초음파 빔과 액체의 자유면에 쏘여 국소적으로 압력을 줌으로써 그 개소로부터 작은 방울을 방출시키는 방식이다. 노즐을 필요로 하지 않고, 고속으로 직경 약 1㎛의 작은 방울을 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 「잉크젯 프린팅법」으로서, 「압전식 잉크제팅법」을 아주 적합하게 채용할 수 있다. 인가 하는 펄스의 형상을 바꿈으로써, 액적(미소방울)의 사이즈를 제어할 수 있으므로, 해석 정밀도 향상에 아주 적합하다. 액적표면의 곡률반경이 작을 때는 액적을 작게 하고, 액적의 곡률반경이 클 때는 액적을 크게 할 수 있다. 또한 펄스를 급격하게 마이너스 방향으로 변화시킴으로써 액적 표면을 안쪽으로 잡아 당겨 곡률반경을 작게 하는 것도 가능하다.

여기에서, 상기 반응영역(R)에 적하된 검출용 누클레오티드 사슬(D)의 대부분은, 염기가 중층된 상태로 검출 표면(S)에 고정되어 있으므로(도 1(A) 참조), 뒤에서 적하된 표적 누클레오티드 사슬(T)과의 하이브리다이제이션 시에는 입체장애의 문제 등이 발생하고 반응효율이 좋지 않다.

그래서 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법에 근거해서, 검출부(1)에 배치 된 상기 플러스 마이너스 전극(E1, E2)에 전력을 가하여 반응영역(R)에 전위차를 생기게 함으로써, 반응영역(R)에 저류되어 있는 액상(염 용액)에 전기장을 형성하고, 그 전기장의 전계의 방향에 따라 검출용 누클레오티드 사슬(D) 및 표적 누클레오티드 사슬이 직쇄상(직선상)으로 신장하는 작용을 얻는다.

직쇄상이 된 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 예를 들면 형광 색소 등에 의해 표식된 표적 누클레오티드 사슬(T)과의 염기간의 수소결합(상보 결합)은, 입체장해 등이 적어지므로, 상보성이 있는 염기배열끼리가 접근하기 쉬워지고, 효율적으로 진행하게 된다.

즉 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 상기 표적 누클레오티드 사슬(T)의 하이브리다이제이션 반응이 효율적으로 진행된다고 하는 결과를 얻을 수 있다. 이 결과, 하이브리다이제이션의 반응 시간이 단축되는 동시에, 판독 시에 있어서 의양성 또는 가짜음성을 나타낼 확률도 감소한다고 하는 바람직한 결과를 얻을 수 있다.

여기에서 도 5는, 검출부(1)의 반응영역(R)의 검출 표면(S) 부근을 확대해서 도시하는 모식도이다. 이 도 5에서는, 검출 표면(S)에 그 말단부위가 고정된 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 그 검출용 누클레오티드 사슬(D)의 염기배열과 상보성이 있는 염기배열을 구비하는 표적 누클레오티드 사슬(T)이 하이브리다이제이션하여, 2중사슬을 형성하고 있는 상태가 모식적으로 나타내어져 있다.

반응영역(R)(후술하는 반응영역(R')에 대해서도 동일)에 대해서는, 실온과 반응에 적합한 온도 사이에서, 겔, 졸의 가역 상변화가 일어날 수 있는 아가로스 겔 등의 상변화 물질(도시하지 않음)을 충전하는 것도 가능하다. 이 실시 형태에서는, 상기 상변화 물질을 고온하에서 상기 상변화 물질을 졸화하고, 이 상태에서 전압을 인가해서 DNA 등의 누클레오티드 사슬을 배열한 후에, 온도를 저하시켜서 겔화하고, 다시 계속해서 하이브리다이제이션 시에는, 반응에 적합한 온도 조건에서 졸화하는 단계를 행할 수 있다고 하는 이점이 있다. 또 하이브리다이제이션 시에 있어서 상기 상변화 물질을 겔 상태로 유지해 두면, DNA 등의 누클레오티드 사슬을 신장시킨 상태로 하이브리다이제이션 시킬 수 있으므로 바람직하다.

또한 상기 상변화 물질이 겔화 한 상태일 때에는, 표적 누클레오티드 사슬(T)을 포함하는 시료용액(5')을 검출부(1)에 적하했을 때에, 하이브리다이제이션의 진행이 잘 되지 않을 우려가 있기 때문에, 전기영동의 경우와 같이, 적하 포인트에 세로방향의 홈을 미리 형성해 두고, 이 홈 안에 시료용액을 적하해도 좋다.

여기에서, 표적 누클레오티드 사슬(T)은 형광색소로 표식 해도 좋고, 인터커레이터를 이용해도 좋다. 인터커레이터는 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 표적 누클레오티드 사슬(T)의 염기간의 수소결합 중에 삽입되도록, 하이브리다이제이션한 쌍가닥 누클레오티드 사슬에 혼입된다. 이것에 의해, 장파장측에 형광파장이 시프트하고, 또한 형광강도와 쌍가닥 DNA에 혼입된 인터커레이터의 양과의 사이의 상관관계에 근거해서 정량적인 검출이 가능해진다. 인터커레이터로서 이용하는 형광색소로서는, POPO-1이나 TOTO-3 등을 생각할 수 있다.

이것은, 예를 들면, 소정의 세포 등으로부터 추출된 시료용액(5') 중에, 특정한 질병이 일어나면 발현되는 것이 알려져 있는 마커 유전자를 포함하는 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 상보성을 가지는 표적 누클레오티드 사슬이 존재한다고 하는 사실을 인식할 수 있고, 그 결과, 상기 세포에는 상기 질병이 발생되어 있는 것이 예측되게 된다.

또한 기판정보의 판독은, 기판(2)에 레이저광(예를 들면 청색 레이저광)을 조사해서 각 반응영역(R)을 여기 시켜 형광강도의 크기를 검출기(도시하지 않음)에 의해 검출하여, 검출용 누클레오티드 사슬(D)과 표식된 표적 누클레오티드 사슬 사이의 결합반응상황을 판단한다. 마지막으로, 각 반응영역(R)에 대한 형광강도를, A/D 변환해서 결합반응비율을 컴퓨터(C)의 화면에 분포표시 함으로써 시각화한다(후술의 기판(20)에서도 동일).

다음에, 도 6을 참조하여, 본 발명에서 이용할 수 있는 기판의 제2 실시예에 대해서 설명한다. 도 6(A)은 제2 실시예인 기판(20)의 위쪽에서 볼때의 평면도, 도 6(B)은 도 6(A) 중의 X부의 확대 평면도이다.

도 6에 부호 (20)으로 도시된 기판은 줄기홈 검출부(10)를 구비한다. 이 검출부(10)는 반응영역(R')이 원반형 기판 위에 방사상으로 연장되는 줄기홈모양으로 형성되고, 그 줄기홈을 형성하는 길이방향의 한 쪽의 내벽면(V)에는, 상기 검출부 (1)의 검출 표면(S)과 동일한 구성을 구비하는 검출 표면(S')가, 소정간격으로 배치 되어 있다. 또 검출표면(S')이 형성된 각 부위에는, 반응영역(R')을 사이에 두도록 플러그 마이너스 전극(E3, E4)이 대향 설치되어 있다(도 5(B)참조). 또한 줄기홈 검출부(10)는, 셀모양의 상기 검출부(1)가 줄기홈 내에 배열된 구성이라고도 말할 수 있다.

플러스 전극(E3, E3…)은, 공통전극화 할 수 있고, 마찬가지로, 전극(E4, E4…)에 대해서도 공통전극화 할 수 있다. 즉 반응영역(R')을 사이로 두고 대향하도록 공통전극인 플러스 전극(E3)과 마이너스 전극(E4)을 병설 할 수 있다. 이 구성에서는, 바늘모양의 프로브를 플러스 전극(E3)과 마이너스 전극(E4)에 윗쪽에서 눌러 댐으로써 전력을 가할 수 있다.

반응영역(R')은, 각 줄기홈 내에 배열 형성한 피트(도시하지 않음)에 형성해도 좋다. 이 피트 내의 반응영역에 미소방울을 적하 함으로써, 거의 동일한 스폿 사이즈를 실현하고, 재현성의 좋은 형광강도검출을 실현할 수 있다.

또한 상기 구성의 줄기홈 검출부(10)를 채용했을 경우는, 모세관현상을 이용한 액체이송이나, 원반형의 기판을 소정 방법으로 회전시킴으로써 생기는 원심력을 살린 액체이송 수단도 이용할 수 있다.

구체적으로는, 기판(20)의 중앙부에 액류부(21)를 설치하고, 이 액류부(21)에, 시료용액(5)(5')(도 4 참조)이나 반응 후에 액티브하게 결합하지 않은 여분의 표적물질을 제거하기 위한 세정액 등을 주입하고 기판(20)을 회전시킴으로써, 기판 중심영역에서 줄기홈 내(즉 반응영역(R'))로, 원활하면서도 확실하게 액체이송 할 수 있다.

상기 기판(2)의 검출부(1) 또는 기판(20)에 설치된 줄기홈 검출부(10)의 어느 경우라도, 검출부 단위 또는 그루핑 된 복수의 검출부 단위에, 다른 검출용 물질(D)을 고정할 수 있다.

여기에서, 기판(2)(20)의 위치정보 및 회전동기정보에 대해서 간결하게 설명해 두기로 한다. 기판(2)(20)의 회전방향에는, 미리 광 디스크 마스터링 프로세스에 의해 형성된 다수의 어드레스 피트가 형성되어 있다. 기판(2)(2O)을 광디스크로서 생각했을 경우, 적하검출위치인 반응영역(R)(R')을 유저 데이터 영역으로 생각하고, 다른 영역은 샘플서보방식 등에 의해 동기피트를 배열하는 동시에 트래킹 서보로서도 이용하고, 또한 직후에 어드레스부(디스크상의 지리적인 번지)를 삽입 함으로써 위치정보를 준다.

어드레스부는 선두 패턴인 섹터 마크로부터 시작되고, 실제로 회전하고 있는 디스크의 회전위상을 주는 VFO(Variable Frequency Oscillater)와 어드레스 데이터의 개시위치를 주는 어드레스 마크와 트랙과 섹터의 넘버가 들어간 ID(Identifier) 등이 조합되어 이루어진다.

상기 구성의 기판(2)(20)을 이용해서 바이오 어세이를 행하기 위해서는, 적어도 다음 수단 및 기구를 구비하는 장치를 사용하는 것이 아주 바람직하다. 즉 상기 기판(2)(20)을 회전가능하게 유지하는 기판회전수단과, 이 기판회전수단에 의해 상기 기판(2)(20)을 회전시키면서 검출용 누클레오티드 사슬 함유 용액(5) 및 표적 누클레오티드 사슬 함유 용액(5')을 반응영역(R)(R')에 대해서 소정의 단계, 타이밍으로 적하하는 적하수단과, 그 적하수단(의 노즐)과 기판(2)(20) 사이의 거리를 일정하게 유지하기 위한 포커스 서보 기구와, 기판(2)(20)으로부터 제공되는 위치정보와 회전동기정보에 근거하여, 상기 용액(5, 5')의 적하를 기판(2)(26)의 반응영역(R)(R')에 추종시키는 트랙킹 서보 기구를 적어도 구비하고 있는 장치(도시하지 않음)이다.

또한 상기 어드레스 피트를 이용하는 대신에 트랙 위에 워블링을 형성하고, 위치에 따른 클록정보를 갖게 하도록 워블링의 사행을 조절하여 디스크상의 위치정보를 취득해서 어드레싱을 행하도록 해도 좋다. 동시에, 워블링 주파수 성분을 이용함으로써 트래킹 서보를 행할 수 있다. 또한 어드레스 피트와 워블링을 맞춰서 형성함으로써, 보다 고정밀도의 어드레싱 및 트래킹 서보가 가능해진다.

이상 설명한 기판(2, 20) 및 이것들을 이용하는 바이오 어세이 장치를 채용하면, 이미 기술한 본 발명에 따른 바이오 어세이 방법을 아주 적합하게 실시할 수 있다.

특히, 상술한 바이오 어세이 기판에 따르면 다음과 같은 특유한 효과를 얻을 수 있다.

즉 종래의 DNA 칩 기술에서는 그 DNA 칩 자체의 집적수, 집적밀도가 적었기 때문에, 한번의 어세이로 달성할 수 있는 해석량이 충분하다고는 말할 수 없고, 검출용 물질의 종류와 수, 나아가서는 그 기판상에 있어서의 배치나눔(그루핑)을, 유저가 자유롭게 설정하는 것이 곤란했다.

또한 종래의 DNA 칩에서는, 기판표면에 미리 고정되어 검출용으로서 이용되는 누클레오티드 사슬은, 반드시 직쇄상으로 유지되어 있는 것은 아니기 때문에, 입체장애 등에 의해 표적 누클레오티드와의 하이브리다이제이션 반응의 정밀도에 편차가 있고, 반응에도 장시간을 필요로 하고 있었다.

나아가서는 Tm(융점) 또는 GC 함유율이 일치하지 않고 있는 DNA 프로브가 2차원의 평면적인 확장을 가지는 기판 표면상에 검출용 물질이 배열된 구성 종래의 DNA 칩에 있어서는, 동일한 하이브리다이제이션 조건, 세정조건에 노출되서 가짜양성 또는 가짜음성을 나타낼 위험성이 높다고 하는 문제가 있었다.

이것과 비교해서 본 발명에 따른 바이오 어세이 기판에 따르면, 다음과 같은 뛰어난 효과를 얻을 수 있다.

(1)본 발명에 따른 바이오 어세이용 기판은, 다량ㆍ다수의 검출부를 형성할 수 있으므로 정보의 집적량이 많다.

(2)검출부의 검출 표면에 고정된 검출용 누클레오티드에 전계를 거는 것에 의해, 그 누클레오티드 사슬을 직쇄상으로 신장시키고 나서, 표적 누클레오티 사슬을 포함하는 샘플 용액을, 검출부의 상기 반응영역을 겨냥해서 정확하게 적하하여, 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬 사이의 하이브리다이제이션 반응을 진행시키는 구성이므로, 하이브리다이제이션 반응을 단시간으로 효율적으로 행할 수 있다.

(3)검출부 단위 또는 그루핑 된 검출부 단위로, 최적의 반응조건 등을 선택해서 어세이를 행할 수 있으므로, 가짜양성, 가짜음성의 결과의 발생율을 현격히 감소시킬 수 있다. 따라서, 상기 바이오 어세이용 기판에 따르면, 망라적, 효율적인 동시에 고정밀도의 해석을 행할 수 있고, 기록정보당의 비용도 저렴하다.

(4)본 발명에 따른 바이오 어세이용 기판은, DNA 칩이나 바이오 센서 칩으로서 특히 유용하다. 또한 신규구조를 구비하는 원반형의 마이크로 채널 어레이를 제공할 수 있다. 본 기판을 DNA 칩으로서 이용할 경우는, 유전자의 변이 해석, SNPs(1염기 다형) 분석, 유전자 발현 빈도 해석 등에 이용할 수 있고, 신약 개발, 임상진단, 약리 제노믹스, 법의학 기타 분야에 있어서 광범위하게 활용할 수 있다.

본 발명은, 다음과 같은 특유한 효과가 있다.

(1)본 발명에 따른 바이오 어세이 방법 또는 바이오 어세이 장치에서는, 검출부에 설치된 반응영역의 전기장형성의 타이밍을 컨트롤 함으로써, 상기 반응영역에 있어서의 검출용 물질과 표적물질의 상호반응작용의 반응효율을 향상시킬 수 있고, 반응의 타이밍을 제어할 수 있다.

(2)DNA 칩이나 바이오 센서 칩에 근거하는 바이오 어세이 방법에 특히 유용하며, 유전자의 변이 해석, SNPs(1염기 다형) 분석, 유전자 발현 빈도 해석 등에 이용할 수 있고, 신약 개발, 임상진단, 약리 제노믹스, 법의학 기타 분야에 있어서 광범위하게 활용할 수 있고, 나아가서는, 항원항체반응의 검사, 내분비 교란물질의 검정 등에 이용할 수 있다.

Claims (14)

1. 검출용 물질이 고정 가능하도록 표면처리가 된 검출 표면과,

   상기 검출 표면에 고정된 상태의 검출용 물질과 표적물질의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역과,

   상기 반응영역 내에 전위차를 생기게 하고, 그 반응영역 내에 전기장을 형성하는 전기장형성수단을 적어도 구비하는 검출부에 있어서 물질간의 상호반응작용을 검출하는 방법으로서,

   상기 전기장형성수단에 의한 전기장형성을 소정 타이밍으로 온/오프 하는 단계를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 어세이 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 검출용 물질 및 상기 표적물질은 누클레오티드 사슬이며, 상기 상호반응작용이 하이브리다이제이션인 것을 특징으로 하는 바이오 에세이 방법.
3. 제2항에 있어서,

   상기 검출 표면에 말단부위가 고정된 상태의 검출용 누클레오티드 사슬을 신장시키도록 전기장을 형성하는 단계와,

   상기 단계 후에 상기 반응영역에 대해서 표적 누클레오티드 사슬을 첨가하는 단계와,

   상기 단계 후에 상기 반응영역에 전기장을 형성하고, 반응영역 중의 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티드 사슬을 상대적으로 이동시키는 단계와,

   상기 단계 후에 인가를 오프로 한 상태로 하이브리다이제이션을 행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 어세이 방법.
4. 검출용 물질이 고정 가능하도록 표면처리가 된 검출 표면과,

   상기 검출 표면에 고정된 상태의 검출용 물질과 표적물질의 상호반응작용의 장소를 제공하는 반응영역과,

   상기 반응영역 내에 전위차를 생기게 함으로써, 그 반응영역 내에 전기장형성이 가능한 동시에, 상기 전기장형성을 소정 타이밍으로 온/오프 가능하게 구성된 전기장형성수단을 적어도 구비하는 검출부를 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오 어세이 장치.
5. 광학적으로 기록정보의 판독이 가능해진 원반형 기판 위에,

   적어도 다음의 (1) 내지 (3)을 구비하는 검출부가 설치된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.

   (1)검출용 누클레오티드 사슬의 말단부위가 고정 가능하게 표면처리가 된 검출 표면,

   (2)상기 검출 표면에 고정된 상태의 상기 검출용 누클레오티드 사슬을 신장시키는 전기장을 형성하는 플러스 마이너스 전극,

   (3)상기 검출용 누클레오티드 사슬과 표적 누클레오티 사슬 사이의 하이브리다이제이션 반응의 장소가 되는 반응영역.
6. 제5항에 있어서,

   상기 검출부는, 상기 검출 표면이 한벽면에 형성된 셀 검출부로서, 그 셀 검출부가 상기 원반형 기판 위에 복수 배치된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
7. 제3항에 있어서,

   상기 셀 검출부는, 상기 원반형 기판 위에, 위쪽에서 보아서 방사상을 나타내도록 배치된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
8. 제7항에 있어서,

   상기 셀 검출부 단위 또는 그루핑 된 복수의 셀 검출부 단위에, 다른 검출용 누클레오티드 사슬이 고정된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
9. 제5항에 있어서,

   상기 검출부의 반응영역은, 원반형 기판 위에 방사상으로 연설된 줄기홈 내에 설치되고, 그 줄기홈의 내벽면에는 상기 검출 표면이 배치된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
10. 제9항에 있어서,

    상기 줄기홈 단위 또는 그루핑 된 복수의 줄기홈 단위에, 다른 검출용 누클레오티드 사슬이 고정된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
11. 제5항에 있어서,

    상기 검출표면부위의 위치정보와 회전동기정보를 제공하는 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
12. 제11항에 있어서,

    상기 수단은, 상기 기판 위에 설치된 워블링 또는 어드레스 피트에 의한 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
13. 제5항에 있어서,

    상기 반응영역에 대해서, 실온과 반응에 적합한 온도 사이에서, 겔, 졸의 가역 상변화가 일어날 수 있는 물질을 충전한 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.
14. 제5항에 있어서,

    인터커레이터를 이용해서 상기 하이브리다이제이션 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오 어세이용 기판.