KR20040105710A - 정제된 사이토킨 억제인자 - Google Patents

정제된 사이토킨 억제인자 Download PDF

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KR20040105710A
KR20040105710A KR10-2004-7012023A KR20047012023A KR20040105710A KR 20040105710 A KR20040105710 A KR 20040105710A KR 20047012023 A KR20047012023 A KR 20047012023A KR 20040105710 A KR20040105710 A KR 20040105710A
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KR10-2004-7012023A
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수브라마니언 이예르
윌리엄 엘. 존슨
랜스 엉구엔
스티븐 씨. 로스
루예 싱
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아르키온 라이프 사이언씨즈 엘엘씨
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Abstract

염증촉진성 사이토킨인 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 RNA 전사를 억제하는 능력을 비롯한 일정한 특징을 갖는 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자 (CIF)를 포함하는 조성물이 개시된다. 사이토킨 억제인자를 실질적으로 정제하는 방법 및 그러한 조성물을 사용하여 동물의 면역계를 조절하는 방법도 개시된다.

Description

정제된 사이토킨 억제인자 {Purified Cytokine Inhibitory Factor}
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은, 2002년 2월 11일에 출원된, 발명의 명칭이 "고도 정제 사이토킨 억제인자 및 이의 사용 방법"인 미국 가출원 제60/356,038호를 35 미국법 (U.S.C.) 제119(e)조하에 우선권 주장한다. 상기 미국 가출원 제60/356,038호의 전체 공개내용은 본 명세서에 참고로 인용된다.
보조효소, 보조인자, 비타민 및 그 밖의 것들과 같은 생체 인자는 생물학적 전환 과정에서 중요한 역할을 한다. 이들은 전세포 (whole cell)에서 소량 (1 x 10-5내지 1 x 10-6)으로 생성되는 것이 보통이다. 그러나, 이러한 생체 인자의 존재를 측정한 후, 이를 정상적 세포로부터 단리 및 정제하는 것은 어려운 일이다.
과면역된 (hyperimmunized) 난(卵)이 개발되었고 이는 과생성된 항체 및 미국 특허 제6,420,337호에 기재된 바와 같이 특정한 생체 인자들을 포함하는 것으로 나타났다. 난 속에 존재하는 생체 인자가 무엇인지 정확하게 결정하는 것은, 과면역 과정으로 용이하게 될 것같은 어려운 것이다. 과면역은 표적 동물 내로 폴리발런트 세균성 항원을 주입하여 수행한다. 이들 과면역된 동물로부터 얻은 난에서 발견된 생체 인자의 양은 증가한 것으로 발견되었으나, 단지 1 단위의 양만이 증가했을 뿐이다. 따라서, 과면역된 난 중의 생체 인자의 적가량이 이렇게 작기 때문에, 생체인자의 위치화 (locating) 및 그 뒤의 정제가 어려워진다. 이와 같이, 이러한 생체 인자를 인식, 단리, 정제 또는 이와 달리 제조하기 위한 효과적인 방법이 필요하다.
사이토킨
정상적인 면역계는 균형 상태하에 있어서, 염증촉진성 (proinflammatory)과 항염증성의 세포 및 분자들이 숙주 조직을 파괴하지 않으면서도 정상적인 숙주 면역 방어를 촉진하도록 조심스럽게 조절되어 있다. 이런 조심스런 조절 균형이 일단 교란되면, 비특이적 자극 및 활성화로 인하여, 증가된 양의 강력한 파괴적 면역 및 염증 분자가 생성 및 분비될 수 있다. 따라서, 잘못된 생체 상황에서 염증촉진성 사이토킨의 과다 생성 또는 사이토킨의 생성은 특히, 말라리아, 패혈증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 암 및 AIDS와 같은 다양한 질병에서의 사망률 및 병리학과 연관되어 있다.
사이토킨은 특이적 세포 리셉터에 결합하여 자가분비 (autocrine)/주변분비(paracrine) 방식으로 작용하는 다능성 폴리펩티드이다. 이들의 분비는 면역 반응의 지속기간 및 강도를 결정하는 데 중요하다. 예를 들면, 마우스에서 CD4+T헬퍼 (Th) 클론의 다양한 하위집합은 Th1 및 Th2 사이토킨으로 전통적으로 설명되었던 것을 분비한다. Th1은 인터루킨-2 (IL-2) 및 인터페론-γ(IFN-γ)를 생성하여 세포 면역 반응을 촉진한다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 생성하여 면역글로불린 분비 세포의 활성화를 뒷받침한다. 염증 과정 도중에 IL-1β, IL-2, IL-6 및 종양괴사인자 알파 (TNF-α)와 같은 사이토킨이 염증 위치에서 분비된다. 이들 사이토킨은 다면발현 효과를 가지며, 염증에 수반되는 광범위한 증상을 매개한다.
카켁틴으로도 알려진, 중요한 사이토킨인 TNF-α는 157 아미노산으로 이루어진 17 kD 단백질이며, 단핵구 및 활성화된 대식세포에 의해 주로 생성된다. TNF-α는 종양파괴 (tumoricidal) 활성뿐만 아니라 대부분의 주요한 기관계에 대해 다양한 생리적 영향을 주는 것으로 밝혀져 있다. 중추신경계에서 TNF-α는 발열, 식욕부진, 및 뇌하수체 호르몬 분비의 변화에 관여한다. 심혈관계에서 TNF-α는 쇼크, 급성 호흡 곤란 및 모세혈관 누출 증후군 (응혈촉진 (procoagulation))에서 기능한다. TNF-α는 신장에서의 급성 요세관 괴사 및 신장염, 및 위장관계에서의 허혈, 결장염 및 간괴사의 진행에 일조한다. 또한, 이는 염증 과정에 관여하는 중요한 사이토킨이다.
염증 상태는 복합적인 병적 과정에 의해 발생하며, 여기는 몇 가지 중요한 분자가 관여한다. 예를 들면, TNF-α, IL-1β, 인터루킨-2 (IL-2) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)가 염증을 발생시키는 데 있어서 주요한 기여자들이다. 염증은 류마티스성 관절염, 패혈성 관절염 및 소아 골관절염 등의 질병 상태를 초래할 수 있다.
TNF-α는 염증 자극제에 반응하는 T 세포에 의하여 주로 생성된다. TNF-α는 염증 및 면역 기능의 강력한 주변분비 내분비 매개인자이며 내피세포 기능을 조절한다. 예를 들면, TNF-α는 활발한 류마티스성 관절염의 환자로부터 얻은 혈청 및 윤활액 중에서 고농도로 검출될 수 있으며, 류마티스성 관절염의 발병에 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
IL-1β는 광범위한 생체 경로에 관여하며, 현저하게 강력한 분자로서, 세포 당 하나 또는 둘 정도의 적은 리셉터를 자극함으로써 그의 영향을 유도할 수 있다. IL-1β는 신호전달제로서, 매우 낮은 농도, 심지어 펨토몰 범위에서도 효과적이다. IL-1β는 처음에, 발열의 유도, 림프구 반응의 확대 및 급성기 (acute-phase) 반응의 자극으로 주목받았다. 감염에 대한 염증 반응의 유도는 IL-1β에 의한 신호전달에 크게 기인한다.
또다른 T-세포 유래 사이토킨인 IL-2는 여러 세포에서 증식, 분화, 기능의 활성화를 유도한다. 예를 들면, IL-2는 T- 및 B-세포 증식 및 분화, B 세포의 면역글로불린 분비, NK 세포 증식 및 활성, 및 여타 사이토킨의 생성을 촉진한다. 또한, IL-2는 면역 세포 증식 및 번식에 수반되는 수많은 염증 과정에서 중요한 기능을 한다.
프로스타글란딘 E 2 (PGE 2 )
프로스타글란딘 E2(PGE2)는 체내의 많은 세포에서 두루 발견되는 1차 프로스타글란딘이다. 이는 주된 아라키돈산염 대사산물이며, 체온, 통증, 면역억제, 및 염증에 관련된 기관의 일반적 상태뿐만 아니라 혈관 삼투 포텐셜을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. PGE2는 만성 염증 질환 상태의 염증 경로에서의 주요한 구성성분이다.
여러 가지 효소가 PGE2의 생성을 책임지며, 수 개의 동일한 효소가 다른 프로스타글란딘, 트롬복산 및 염증 매개인자를 생성한다. 예를 들면, PGE2는 클로로옥시게나제 COX-1 및 COX-2 각각의 구성적 발현형 (constitutively expressed form)과 유도형 둘 모두에 의하여 생성된다. COX-2는 세포가 특정한 미토겐 (예를 들면 LPS) 또는 사이토킨 (IL-1)에 노출되면 급격하게 상향조절되어, 사이토킨 산호전달과 PGE2생성을 연결시킨다.
TNF-α, IL-1β, IL-2 및 PGE2는 주요한 염증 조절인자이기 때문에, 이들은 염증 발생 과정에서 결정적인 역할을 한다.
지질다당질 (LPS) 유사체
광범위한 지질다당질 (LPS) 유사체가 시험관내 및 생체내에서 사이토킨 발현을 방해한다. 예를 들면, 고체 지질 나노입자 (SLN)는 쥐의 복막 대식세포와 인큐베이션하면, IL-6 생성의 농도 의존적 감소를 일으킨다. 그러나, TNF-α 및 IL-12는 억제되지 않는다. 합성 지질 A 유사체인 SDZ MRL 953은, 암환자 20인에게 SDZ MRL 953의 투여량을 단계적으로 증가시키면서 정맥내 처리한 후 내독소를 정맥내 적용한 연구에서 밝혀진 바로는, 내독성 쇼크 및 세균 감염을 막는다. 지질 A 유사체로 예비처리하면, TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-6, 및 G-CSF의 분비가 현저히 감소했는데, 이는 위험한 상태의 환자들에게 SDZ MRL 953을 예비처리하는 것이 그램음성 패혈증의 합병증을 방지하는 데 도움이 될 수 있음을 의미한다.
LPS에 의한 TNF-α의 생성 유도는 대식세포에서, 및 인간의 단핵구 및 단핵구성 U937 세포에서 억제될 수 있다. 단당질 지질 A 유사체인 DY9973은 U937 세포에서 TNF-α 및 IL-1β mRNA의 LPS-유도 발현을 억제한다. 반면에, DY-9973은 U937 세포에서 IL-1β 유도 TNF-α 생성은 억제하지 않는다. 따라서, DY-9973과 같은 단당질 지질 A 유도체는 대식세포의 LPS-유도 활성화를 억제하고 LPS의 치명적 독성을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 초기 내독성 내성은 비독성 LPS 유도체인 일인산 지질 A (MPL)에 의하여 LPS 감염에 대응하여 유도된다.
지질 유사체외에도 LPS에 대한 항체가 LPS 감염에 대해 보호하는 중화제로서 기능하다. 지질 A에 대한 모노클론 항체는, 다양한 그램음성 세균의 지질 A 및 LPS가 쥐의 복막 대식세포에서 TNF-α (36-67 %) 및 IL-1 (30-98 %)를 유도할 수 있는 능력을 억제한다. 또한, 이 MAb는 마우스에서 지질 A-유도 TNF-α를 억제한다 (87 %).
또한, LPS 유사체는 사이토킨 발현을 상향조절한다. 상이한 지질 A 유사체 (DT-5416a)는 쥐의 대식세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 GM-CSF를 유도한다. 더욱이, DT-5416a는 전사 (transcriptional) 향상을 통해 세포 내의 다양한 사이토킨의 생성을 향상시킨다.
과면역된 난
닭 (갤러스 도메스티쿠스 (gallus domesticus)), 칠면조 및 오리와 같은 조류 클래스의 여러 종은 조류 질환을 일으키는 면역원에 대해서뿐만 아니라 다른 면역원에 대하여도 혈액 및 난 내에서 항체를 생성한다. 예를 들면, 문헌 (LeBacq-Verheyden et al., Immunology 27: 683 (974)) 및 (Leslie, G.A., et al., J. Med. 130: 1337 (1969))은 닭의 면역글로불린을 정량적으로 분석했다. 문헌 (Polson et al., Immunological Communications 9:495-514 (1980))은 암닭을 여러 단백질 및 단백질의 천연 혼합물에 대하여 면역시키고, 난황에서 IgY 항체를 검출했다. 문헌 (Fertel et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028:1033 (1981))은 암닭을 프로스타글란딘에 대하여 면역시키고 난황에서 항체를 검출하였다. 문헌 (Jensenius et al., Journal of Immunological Methods 46:63-68 (1981))은 면역진단학에 사용하기 위한 난황 IgG를 단리하는 방법을 제공한다. 문헌 (Polson et al., Immunological Communications 9: 475-493 (1980))은 다양한 식물 바이러스로 면역시킨 암닭의 난황으로부터 단리된 항체를 기재한다.
미국 특허 제4,357,272호는 과면역된 암닭의 난황으로부터의 항체의 단리를 개시한다. 항체 반응은 식물 바이러스로부터 유래된 면역원, 인간 IgG, 파상풍 항독소, 뱀 항뱀독소 및 세라메바 (Serameba)의 반복된 주입에 의하여 유발되었다.
미국 특허 제4,550,019호는 분자 또는 입자 중량이 30,000 이상인 면역원으로 과면역하여 암닭에서 유발된 항체를 난황으로부터 단리하는 것을 개시한다. 닭을 과면역하는 데 사용된 면역원은 식물 바이러스, 인간 면역글로불린, 파상풍 독소, 및 뱀독 중에서 선택되었다.
미국 특허 제4,748,018호는 상응하는 항원에 대해 면역된 조류의 난으로부터 얻은 정제 항원을 비경구 투여하는 것을 포함하며, 포유동물이 난에 대한 면역성을 획득하는, 포유류의 수동 면역 방법을 개시한다.
미국 특허 제5,722,999호는 과면역된 난 및(또는) 젖 또는 이의 분획물을 피검자에게 투여함으로써 피검자에게서 만성 위장 장애 또는 비스테로이드성 항염증 의약 유도 (NSAID-유도) 위장 손상을 예방, 억제 또는 경감시키는 방법을 개시한다.
미국 특허 제6,420,337호는 면역원성 혼합물로 과면역된 조류의 난으로부터 단리한 생체 인자를 개시한다. 이 생체 인자를 정제하여 서열분석하여, 특정한 염증촉진성 사이토킨을 활성화시키는 것으로 결정되었기 때문에, 사이토킨 활성화 인자로 명명된다.
유럽 특허 출원 제99967649.7호는 면역원성 혼합물로 과면역된 조류의 난으로부터 역시 얻어진 항염증성 조성물을 개시한다. 항염증성 조성물은 난으로부터 부분적으로 정제되었으며, 염증을 치료 및 예방하는 데 효과적인 것으로 보인다.
오메가-3 및 -6 지방산 (난황에서 자연 발견될 수 있음)과 같은 불포화 지방산는 항염증 과정에서 중요한 기능을 하는 것으로 보고된 바 있다. 최근들어, 많은 연구자들이 오메가-3 및 -6 지방산이 풍부한 생선 오일의 항염증 효과에 대해집중되었었다. 이들 연구들은 실제로, 오메가 지방산이 관절염 예방에 효과적임을 보여준다. 그러나, 이 연구들은 염증촉진성 사이토킨 또는 사이토킨 일반에 대한 오메가 지방산의 영향의 어떠한 증거도 기술하거나 제공하지 못했다.
오메가 지방산의 몇가지 특징은, 이들이 물에 부분적으로 용해될 수 있고, 210-230 nm에서 최대 흡광도를 가지며, 그 구조가 장쇄 지방산의 구조이기 때문에 융점은 보통 매우 낮다 (-49 ℃ 내지 13.4 ℃)는 점이다.
난황 인지질은 염증촉진성 사이토킨 및(또는) PGE2의 합성을 억제하는 것으로 문헌에 보고된 바는 없었다. 또한, 난황이 염증촉진성 사이토킨 및(또는) PGE2의 합성을 억제하기 위해 지질다당질 (LPS)에 대한 경쟁자로서 기능할 수 있는 임의의 공지된 지질다당질 유사체 (LPS 유사체)를 함유한다고 보고된 바도 없었다.
본 발명의 중점은 난에서 자연적으로 발생하며 염증촉진성 사이토킨 및(또는) PGE2의 합성을 억제하는 능력을 가지는 신규 인자를 본 발명자들이 발견했다는 점에 있다.
<발명의 요약>
본 발명은, 사이토킨 억제인자가 분자량이 6,000 Da 미만이고 조류 난의 난황의 지질 분획물에 자연적으로 존재하며, 파장 205 nm에서 최대 UV 흡광도를 가지고, 비단백성 물질이며, 융점이 약 39 ℃ 내지 42 ℃이고, 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 RNA 전사를 억제하는 것인, 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 난황의 수불용성 분획물 (WIF)을 수용성 분획물 (WSF)로부터 분리하고, 이 수불용성 분획물을 중성 지질 분획물 및 극성 지질 분획물로 분리하고, 고성능 액체크로마토그래피에 의하여 극성 지질 분획물을 사이토킨 억제인자 분획물로 정제하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 정제된 사이토킨 억제인자에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 사이토킨 억제인자를 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 동물 면역계의 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명은 면역계를 조절하기 위한 생체 인자 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자, 이의 정제 방법 및 이를 면역계 조절, 특히 염증을 경감시키는 방향으로의 조절에 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 PL-100 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 시험관내 분석에서 TNF-α 및 IL-β의 LPS 자극의 영향을 보여주는 디지탈화된 이미지이다.
도 3은 시험관내 분석에서 LPS 자극된 TNF-α 및 IL-β의 억제에 대한 과면역 난 지질의 영향을 보여주는 디지탈화된 이미지이다.
도 4는 시험관내 연구에서 LPS 자극된 IL-2에 대한 과면역 난 지질의 아세톤 추출물 및 에탄올 추출물의 영향을 보여주는 디지탈화된 이미지이다.
도 5는 시험관내 분석에서 LPS 자극된 TNF-α 및 IL-1β에 대한 과면역 난 지질의 에탄올 추출물의 HPLC 정제 분획물의 영향을 보여주는 디지탈화된 이미지이다.
도 6은 콜라겐 유도 관절염 래트 모델 연구에서 콜라겐 유도 관절염에 대한 과면역 난황 및 탈지 난황의 영향을 보여준다.
본 발명은 일반적으로, 신규 사이토킨 억제인자 (CIF), 사이토킨 억제인자 (CIF)를 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 사용하여 면역계를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 정제된 CIF를 포함하는 조성물을 포함하고(거나) 본 발명의 조성물을 CIF를 포함하는 천연 식품일 수 있으며, 바람직하게는 선별 과정에 의하거나 풍부한 분획물의 제조에 의하는 등에 의해, CIF의 존재가 풍부한 천연 식품 또는 그 분획물을 포함한다. 이러한 천연 식품으로는 CIF가 풍분한 과면역 난제품의 분획물을 비롯한 과면역 난제품이 포함된다. 본 발명자들은 신규한 CIF는 종양괴사인자 알파, 인터루킨-2 (IL-2) 및 인터루킨-1β의 발현을 억제하며 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 합성을 하향조절함을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 CIF는 이들 사이토킨의 발현 및 이들 사이토킨을 생성하거나 그에 의해 영향을 받는 세포를 조절함으로써 면역계 일반을 조절 (즉, 레귤레이션)하는 데 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-2가 염증촉진성 사이토킨인 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명의 CIF는, 이에 제한되지는 않으나 일반적으로 관절염, 더 구체적으로는 류마티스성 관절염, 패혈성 관절염 및 소아 골관절염을 비롯한, 면역 반응 및 염증촉진성 사이토킨에 대해 반응하는 세포의 억제가 필요한 상태의 치료에 유용하다. 기대할 수 있는 바와 같이, CIF는 또한, 대부분의 염증 상태 또는 반응의 치료 및(또는) 예방에 유용한데, 그러한 대부분의 염증 상태 또는 반응이 TNF-α, IL-1β 및(또는) IL-2와 이러저러한 점에서 관련되어 있기 때문이다.
본 발명의 CIF는 과면역된 난제품에서 생성 및(또는) 향상된 성분이다. 산란동물에, 바람직하게는 주입에 의하여, 투여되어 면역 반응을 유도하고 본 발명의 사이토킨 억제인자를 함유한 과면역 난제품을 생성하는 바람직한 면역원 혼합물은 특정한 사이토킨을 활성화함으로써 또는 특정 사이토킨을 유도하는 인자의 생성을 유도함으로써 면역계를 조절하는 것으로 알려진 특이적 면역원을 함유할 필요는 없다. 따라서, 폴리발런트 백신에 대해 면역된 동물로부터 얻어진 과면역 난제품에서 사이토킨 억제인자를 발견한 것은 놀라운 것이며, 이 인자는 피검자에게 투여된 경우 면역계를 조절하는 데에 효과적인 것으로 기대된다.
특정한 특성이 이 신규 사이토킨 억제인자에 관하여 결정되었다 (실시예 3 참조). 우선, 사이토킨 억제인자 (CIF)는 난황의 지질 부분에 위치한다. 따라서, CIF는 지질 분획물에 배치되기 때문에 비단백성이다. 난의 지질 부분에 대한 기본적 지식을 통하여, CIF는 크기가 6000 Da 미만인 것으로 결정되었다. 이 신규 인자의 흡광도도 연구하였으며, CIF의 최대 파장 흡광도는 205 nm에서 나타나는 것으로 결정되었다. 융점은 약 39 ℃ 내지 42 ℃ 범위 내인 것으로 발견되었다. 마지막으로, 상기에 암시되고 본 출원을 통하여 매우 상세하게 설명된 바와 같이, CIF는 특정한 사이토킨을 억제한다. 특히, CIF는 적어도 다음의 염증촉진성 사이토킨을 억제한다: 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2). 마지막으로, 본 발명의 실질적으로 정제된 CIF는 또한, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생합성도 억제한다.
본 발명 이전에는 산란동물의 과면역이, 동물의 면역계 세포의 분화 및 사이토킨 생성을 조절할 수 있으며 상기한 특징을 가지는 본 발명의 신규한 사이토킨 억제인자를 생성시킨다는 것이 알려져 있지 않았다. 본 발명자들이 아는 바로는, 본 발명의 이전에는 본 출원에 기재된 사이토킨 억제인자 (CIF)가 확인되거나 정제되거나 특징분석된 바 없었다.
정의
특별한 언급이 없다면, 다음의 정의가 본 출원 전반에 걸쳐 적용된다.
용어 "과면역"이란, 하나 이상의 면역원 (예컨대, 항원)에 노출되어 면역 반응이 상승되어 자연적인 비노출 상태 이상으로 유지되는 것을 의미한다.
용어 "면역원"이란, 면역 관용 (immunological tolerance) 보다는 체액 항체 및(또는) 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 의미한다. 이 용어는 면역 반응을 자극할 뿐만 아니라 그 생성물, 예를 들면 항체와 반응할 수 있는 능력을 뜻한다.
용어 "조합적 유래 면역원"은 조합적 합성 방식으로 면역원 중에서 분자 다원성을 발생시키는 방법을 가리킨다.
용어 "생물공학적 면역원"이란, 유전자 클로닝 기술 및 유전자 조작 또는 화학 합성을 통하여 얻어진 면역원을 가리킨다.
용어 "유전자 백신"이란 면역 반응을 유발할 수 있으며 재조합 기술에 의해 일반적으로 생성되는 핵산 백신을 가리킨다.
용어 "난" 또는 "난제품"은 각기 임의의 전란 (whole egg) (식탁용, 과면역또는 그 반대) 또는 이로부터 유래된 어떠한 제품 또는 분획물을 의미한다.
용어 "식탁용 난" 또는 "식탁용 난제품"은 각기 과면역 상태에서 유지되지 않은 산란동물로부터 얻어진 전란 또는 이로부터 유래된 임의의 제품 또는 분획물을 의미한다.
용어 "과면역 난" 또는 "과면역 난제품"은 각각 난으로부터 얻어진, 전란 또는 이로부터 유래된 임의의 제품 또는 분획물을 의미한다.
용어 "사이토킨 억제인자" 또는 "CIF"는 임의의 정제 상태 (예를 들면, 난의 성분, 난의 실질적으로 정제된 지질 분획물, 또는 난의 고도 정제된 지질 분획물 을 포함)의 본 발명의 생체 인자를 가리키는 데 일반적으로 사용되며, 사이토킨 억제인자에 대해 본 출원에서 기재한 생화학적, 물리적, 구조적 및(또는) 기능적 특성 (예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는다.
용어 "실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자"란, 실시예 2에 기재된 수준 이상으로 정제된 사이토킨 억제인자를 의미한다.
용어 "정상초과 수준 (supranormal level)"이란 과면역 상태에서 유지되지 않은 산란동물의 난에서 발견된 것을 초과하는 수준을 의미한다.
용어 "면역조절 난" 또는 "면역조절 난제품"이란 본 출원에 개시된 사이토킨 억제인자를 함유하는 난 또는 난 분획물을 의미한다.
용어 "면역 반응"이란 세포-매개 또는 세포성 면역 반응 (즉, T 림프구, B 림프구 및 대식세포를 비롯한 면역계의 세포에 의하여 매개되는 면역 반응) 및(또는) 체액성 면역 반응 (즉, 항체에 의하여 매개되는 면역 반응)을 일반적으로 가리킨다.
용어 "동물"은, 동물계에 속하는 모든 종을 의미한다. 본 발명에 따라 면역시키기에 바람직한 동물로는 닭, 칠면조 및 오리를 포함하나 이에 제한되지 않는 척추동물 클래스인 조류에 속하는 임의의 동물이 있다. 본 발명에 따라 치료하기에 바람직한 동물로는, 영장류, 설치류, 가축 및 애완동물로 제한되지 않으나 이를 포함하는, 척추동물 클래스인 조류 및 포유동물에 속하는 동물이 포함된다. 가축에는 소비되는 포유동물 또는 유용한 생성물을 생산하는 것 (예를 들면, 울 생산을 위한 양)이 있다. 질병 또는 상태로부터 보호할 바람직한 포유동물로는, 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 양, 소, 말 및 돼지가 있으며 인간이 특히 바람직하다.
용어 "표적 동물"은 면역원성 혼합물이 투여되는 동물이다.
용어 "피검자 동물"이란 정제된 CIF을 함유하는 조성물 또는 표적 동물에 의해 생성된 CIF 풍부 난 또는 난제품을 비롯한 본 발명의 CIF-함유 조성물이 투여되는 동물이다. 피검자 동물은 환자로도 언급될 수 있다.
본 발명의 CIF와 관련한 구절인 "생물학적으로 활성의" 또는 "생물학적 활성"이란 CIF의 임의의 기능 활성 및 전형적으로는 자연 발생 CIF의 기능 활성을 가리킨다. 특히, CIF의 생물학적 활성을 언급하는 것은 바람직하게는 CIF가 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1β (IL-1β) 및(또는) 인터루킨-2 (IL-2)를 포함하는 사이토킨의 발현을 하향조절 (억제, 경감, 저하, 억압)하는 능력을 의미한다. 본 출원에 상세히 설명된 자연 발생 CIF가 TNF-α, IL-1β 및 IL-2 각각의 발현을하향조절할 수 있음이 주목된다. CIF 생물학적 활성은 또한, 프로스타글란딘 E2의 발현을 하향조절 (억제, 저하, 억압)하는 능력을 포함할 수 있다. CIF의 생물학적 활성은 또한, CIF가 리셉터, 단백질, DNA, 탄수화물 부분 또는 지질 부분에 결합하는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이런 능력은 상기한 생물학적 활성을 낳거나 그에 기여한다.
용어 "최대 파장 흡광도"는 개별 파장에 대한 다른 능력을 반영하는 화합물의 UV 및 가시광선 영역에서의 전자기선의 흡광도를 가리킨다. 방사선의 흡수는 저에너지 오비탈의 전자가 고에너지 오비탈로 들뜨게 될 때 방사선 빔으로부터 에너지 감소 (subtraction)에 의해 일어난다. 흡광도는 방사선의 파장과 화합물의 구조에 따라 달라진다. 최고 흡수 파장은 시험 화합물의 최대 파장 흡광도이다.
용어 "조절하다" 또는 이 용어의 파생어는 '변화시키다', '통제하다', 또는 '한 상태에서 다른 상태로 변경하다'라는 의미이며, 어떠한 측정가능한 특징에서의 측정가능하거나 관찰가능한 증가 또는 감소 및(또는) 한 특징에서 또다른 상이한 특징으로의 변화를 포함한다.
구절 "제약상 허용되는 담체"란 본 발명의 조성물을 적합한 시험관내, 생체외 또는 생체내 위치로 투여하는 데 사용하기에 적합한, 제약상 허용되는 부형제, 제제 (formulation) 및(또는) 제약상 허용되는 운반 비히클을 가리킨다. 제약상 허용되는 담체로 인하여 본 발명의 조성물은 사용되기에 적합한 임의의 형태 (액제, 에어로졸제 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 겔 및 과립제에 제한되지는 않으나, 이를 포함함)로 제조/제공될 수 있게 된다. 일부 제약상 허용되는 담체로는 세포, 막, 지질 제제 (환자에게 투여시에 그 위치에서 (in situ) 고체나 겔을 형성하는 액제를 포함), 항체 제제, 식품 (예를 들면, 식용에 적합한 임의의 제품 또는 제제) 및 재조합 바이러스가 포함된다. 또한, 바람직한 담체는 생분해성 (즉, 생부식성)이다.
"제약상 허용되는 부형제"로는, 조성물을 세포로 운반하거나 운반을 도와주지만 특이적으로 표적화하지는 않는 부형제 또는 제제 (본 출원에서는 비표적화 담체로도 언급됨)가 포함된다. 제약상 허용되는 부형제의 예로는 물, 인산 완충 염수, 링거스 용액, 덱스트로스 용액, 혈청-함유 용액, 행크스 용액, 그외 생리적으로 균형화된 수용액, 오일, 에스테르 및 글리콜이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 수성 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 향상시키는 등에 의하여 피투약자의 생리 상태에 접근하는 데에 필요한 적합한 보조 물질을 함유할 수 있다. 적합한 보조 물질로는 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 락트산나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 인산 완충액, 트리스 완충액 및 중탄산염 완충액 제조에 사용되는 다른 물질이 포함된다. 또한, 보조 물질로는 티메로살, - 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올 등의 보존제가 포함될 수 있다.
"조절 방출형 (controlled release) 비히클"은 환자 또는 배양물 내로 본 발명의 조성물을 조절된 방식으로 방출할 수 있는 제약상 허용되는 담체의 한 유형이다. 조절 방출형 제제는 조절 방출형 비히클 중에 본 발명의 화합물 (예를 들면, CIF 조성물, 항체 또는 모방체)을 포함한다. 적합한 조절 방출형 비이클에는, 생체적합성 중합체, 다른 중합체 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 미립자, 농축괴 제제, 삼투 펌프, 분산 디바이스, 리포솜, 지질구 (liposphere) 및 경피 운반계가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
"제약상 허용되는 운반 비히클"은 본 발명의 조성물을 표적 위치로 운반할 수 있는 제약상 허용되는 담체이다. 바람직하게는, 제약상 허용되는 운반 비히클은 조성물을 표적 위치로 표적화 (즉, 방향지시, 선택적으로 운반)할 수 있다. "표적 위치"란 조성물을 운반하길 원하는 환자 체내의 위치를 가리킨다. 예를 들면, 표적 위치는, 인공 및 천연 지질-함유 운반 비히클 (예를 들면, 리포솜), 항체, 바이러스 벡터 또는 리보자임을 비롯한 그외 운반 비히클을 사용하여 직접적 주입 또는 운반에 의하여 표적화되는 임의의 세포 또는 조직일 수 있다. 천연 지질-함유 운반 비히클에는 세포 및 세포막이 있다. 인공 지질-함유 운반 비히클에는 리포솜 및 미셀이 있다.
용어 "투여하다"란 물질을 피검자에게 제공 (예를 들면 물질을 피검자에게 도입)하는 임의의 방법을 의미하며, 생체내 또는 생체외 투여를 포함한다. 생체내 투여의 방법으로는 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 심장내 투여, 동맥내 투여 (예를 들면, 목동맥내), 피하 투여, 경피 운반, 기관내 투여, 피하 투여, 관절내 투여, 뇌실내 투여, 흡입 (예를 들면, 에어로졸), 뇌내, 비내, 경구, 안내, 폐 투여, 카테터의 삽관, 좌제에 의해, 및 조직으로의 직접 주입이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료 이점"이란, 반드시 특정한 질병 또는 상태를 위한 치유를 가리키는 것이라기보다는 바람직하게는, 그 질병 또는 상태의 완화, 질병 또는 상태의 제거, 질병 또는 상태에 수반되는 증상의 경감, 일차 질병 또는 상태의 발생으로부터 초래되는 속발병이나 상태의 예방 또는 완화 및(또는) 질병 또는 상태의 예방을 포함할 수 있는 결과를 포괄하는 것이다.
질병 또는 상태와 관련하여 용어 "보호"란, 질병의 증상을 경감, 질병의 발병을 경감 및(또는) 질병의 증세를 경감함을 가리킨다. 환자 또는 피검자의 보호란, 본 발명의 조성물이 환자에게 투여되었을 때 질병의 발병을 예방하고(거나) 질병 증상, 신호 또는 원인을 치유 또는 완화하는 능력을 가리킨다. 이와 같이, 환자를 질병으로부터 보호하는 것은 질병의 발병을 예방하는 것 (예방적 치료) 및 질병을 가진 환자를 치료하는 것 (치료) 둘 다를 포함한다.
용어 "예방"이란 질병의 진행을 경감 및(또는) 제거하거나 질병의 시작을 제거하는 것 (예방적 치료)을 의미한다.
용어 "치료"란 장애의 증상 (통증 포함) 및(또는) 장애의 병적 기원의 시작을 지연, 경감, 또는 완전 예방하거나 또는 증상이 존재한다면 증상을 개선하거나 완전히 제거하는 것을 의미한다. 예를 들면, CIF 조성물은 인간 및 그외 동물에게서 관절염의 증상을 억제함으로써뿐만 아니라, 예방제와 같이 작용하여 피투약자에게서 관절염의 존재를 방해함으로써 관절염을 치료한다.
용어 "질병"이란 포유동물의 정상적 건강에서의 일탈을 가리키며, 질병 증상이 존재하는 상태 및 일탈 (예컨대, 감염, 유전자 돌연변이, 유전자 결함 등)이 발생하였으나 아직 증상이 만연된 것은 아닌 상태를 포함한다.
단수로 표현된 경우(용어 "a" 또는 "an")에도 그러한 것 하나 이상을 가리킬 수 있다. 즉, 단수 표현과 '하나 또는 그 이상' 및 '하나 이상'은 본 명세서에서는 서로 바꾸어 사용할 수 있다.
용어 "포함하는 (comprising)", "포함하는 (including)" 및 "가지는 (having)"은 서로 바꾸어 사용할 수 있다.
과면역
본 발명의 조성물은 과면역 난으로부터 정제된 것이 바람직하지만, 사이토킨 억제인자가 식탁용 난으로부터 정제될 수 있다고도 생각된다. 산란동물로 하여금 상승된 면역 상태가 되게 하여 이로부터 생성된 과면역 난 또는 난제품을 피검자에게 투여할 수 있게 하는 데 사용되는 바람직한 방법에 관한 상세한 설명이 미국 특허 제5,772,99호 (여기에 언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입됨)에 개시되어 있다. 간략하게 설명하면, CIF 정제에서 사용하기 위하여 또는 피검자에게 투여하기 위한 CIF-풍부 식품의 제조를 위하여 산란동물을 상승된 면역 상태로 되게 하는 데 사용되는 방법의 예는 다음과 같다. 그러한 방법은 향상된 CIF 생성을 선택 또는 스크리닝하기 위해 상기한 바와 같이 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 일반적으로, 과면역 방법은
1. 하나 또는 그 이상의 항원을 선택하는 단계,
2. 1차 면역에 의하여 산란동물에서 면역 반응을 유발시키는 단계,
3. 과면역 상태를 유도 및 유지하기에 적절한 투여량의 항원의 추가 백신을 투여하는 단계,
4. 과면역 상태로 유지된 산란동물로부터 난을 수집 및 가공하여 과면역 난 제품을 생성하는 단계를 포함한다.
1 단계: 임의의 항원 또는 항원 조합물이 사용될 수 있다. 항원은 세균성, 바이러스성, 원생동물성, 진균성, 세포성 또는 그외 산란동물의 면역계가 반응할 임의의 물질일 수 있다. 이 단계에서 결정적인 점은 항원(들)이 산란동물에게서 면역 및 과면역 상태를 유도할 수 있어야 한다는 것이다. 바람직한 백신은 PL-100 백신으로 불리는, 폴리발런트 세균성 항원의 혼합물이다. PL-100 백신 중에 포함되는 세균은 미국 특허 제5,772,999호의 표 1에 열거되어 있다.
2 단계: 백신은 죽은 백신이거나 또는 살아있는 독성완화 백신일 수 있으며, 면역 반응을 유발하는 임의의 방법에 의하여 투여될 수 있다. 근육내 주입을 통하여 항원을 투여함으로써 면역화가 수행되는 것이 바람직하다. 조류에 주입하기 위한 바람직한 근육은 가슴 근육이다. 투여량은 바람직하게는 항원(들) 백신 0.5 내지 5 밀리그램이다. 사용될 수 있는 그외 투여 방법에는 정맥내 주입, 복강내 주입, 직장 좌제 또는 경구 투여가 포함된다. DNA 기술이 과면역 과정에 사용되는 경우에는 훨씬 더 적은 양, 일반적으로 1 내지 10 마이크로그램이 필요하다. 백신이 산란동물에게서 면역 반응을 유발하였는가를 면역학 분야의 숙련자에게 알려진 많은 방법을 통하여 결정할 수 있다. 이들의 예에는, 효소-결합 면역흡착분석법 (ELISA), 자극항원에 대한 항체의 존재 시험, 및 숙주로부터의 면역 세포가 항원에 반응하는 능력을 평가하도록 고안된 시험이 포함된다. 일반적으로, 백신으로 면역화한 후 난 항체의 출현은 면역 반응을 지시하는 것이다. 면역 반응을 유도하는데 필요한 항원의 최소 투여량은, 사용되는 항원(들)의 종류 및 숙주로서 사용되는 산란동물의 종류를 비롯하여, 사용된 백신접종 방법에 따라 달라진다.
단계 3: 과면역 상태는 바람직하게는, 고정된 시간 간격을 두고 적절한 투여량을 반복하여 추가 (booster) 투여함으로써 유도 및 유지된다. 시간 간격은 6 개월 이상의 기간에 걸쳐 2 주 간격인 것이 바람직하다. 그러나, 추가 투여가 면역 관용을 초래하지 않는 것이 필수적이다. 다른 과면역 유지 방법 또는 예를 들면, 1차 면역화의 경우는 근육내 주입하고 추가 주입의 경우는 정맥내 주입하는 것과 같은 방법의 조합을 사용할 수 있다. 또다른 방법에는, 마이크로캡슐화 항원과 액체 항원을 동시 투여하거나, 1차 면역화의 경우 근육내 주입하고 추가 투여는 마이크로캡슐화 수단에 의해 경구 투여 또는 비경구 투여하는 것이 포함된다. 1차 및 과면역의 여러 조합이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다.
단계 4: 과면역 난은 피검자에게의 투여를 위해 또는 정제를 위해 여러 가지 방식으로 가공될 수 있다. 그러한 것으로는, 과면역 난제품을 실질적으로 그 자체로 (예를 들면 캡슐 안에) 포함하는 조성물의 제조, 및 과면역 난제품을 피검자에게 투여하기 위한 식품으로의 혼입, 또는 이 명세서에 다른 곳에 기재한 바와 같이 사이토킨 억제인자를 위한 정제 프로토콜을 따르는 것이 포함된다.
사이토킨 억제인자의 정제
본 발명의 사이토킨 억제인자는 용매 추출 및 정상상 (normal-phase) HPLC 크로마토그래피를 사용하여 난으로부터 분리 및 실질적으로 정제할 수 있다 (실시예 1 및 2 참조). 시험관내 사이토킨 발현 연구 및 생분석 데이타는 모두, 생물학적으로 활성인 사이토킨 억제인자의 정제를 입증하였다.
바람직하게는, 난황 지질을 용매 추출을 사용하여 과면역 난으로부터 추출한다. 그 다음, 인지질 분획물을 선택적 용매 추출법을 통해 중성 지질 분획물과 분리한다. 인지질 분획물은 다수의 면역 조절인자 (modulator)를 함유하며, 시험관내에서 TNF-α, IL-1β, IL-2 및 PGE2등의 염증촉진성 분자를 억제한다.
본 발명의 사이토킨 억제인자는 과면역 난황의 인지질 분획물 내에 분포한다. 사이토킨 자극제 지질다당질 (LPS)로 처리한 세포내에서 mRNA 전자의 비교 분석에 의해 밝혀진 바로는, 인지질 분획물은 사이토킨 mRNA를 억제하며, 그 활성은 사이토킨 억제인자의 작용에 기인한 것이다.
단핵구는 정상적인 증식 상태에서 최소한의 TNF-α 및 IL-1β을 생성한다. 그러나, 세포 사이토킨 mRNA의 발현은 LPS로 처리함으로써 더 높은 수준으로 유도된다. 아래 실시예에 제시한 바와 같이, LPS에 의해 세포가 자극되어 사이토킨 발현이 향상되었다. 향상된 사이토킨 발현은 그 후, 과면역 난황 인지질 분획물에 의하여 억제되었다. 여분의 LPS가 세포로부터 제거되었고, 결과적으로, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA는 난황 인지질 분획물에 의해 세포로부터 일소되었다. 따라서, 이 인지질 분획물은 하나 이상의 사이토킨 억제인자를 포함하는 것이다. 아래 제공된 결과는 난황 인지질 분획물이 LPS와 반응하지 않는다는 것과 그의 효과가 LPS에 의한 사이토킨 발현의 유도를 중화한다는 것을 입증한다. 난황 인지질 분획물은 사이토킨 mRNA의 전사를 특이적으로 억제한다.
하기 실시예에 구체적으로 기재된 바와 같이, 단핵구 (인간 및 마우스)에서 염증촉진성 조절인자의 LPS 유도를 통해 4가지의 염증촉진성 조절인자인 TNF-α, IL-1β, IL-2 및 PGE2를 시험하였다. mRNA 수준에서의 사이토킨 발현 및 단백질 수준에서의 PGE2생성을 측정하였다. 난황 인지질 분획물은 TNF-α, IL-1β, IL-2 및 PGE2를 억제하였다.
난황 인지질 분획물의 추출
바람직하게는, 본 발명의 사이토킨 억제인자는 과면역 조류로부터 얻은 전란, 난황, 난황의 지질 분획물 중 하나로부터 실질적으로 정제된다. 정제 과정에서, 난황은 사실상 용매 추출된다. 용매 추출은 난황 자체 또는 예를 들어 분무 건조된 난황과 같은 난황의 임의의 다른 형태에 적용될 수 있다. 상이한 용매들이 이 목적으로 사용될 수 있다. 헥산과 같은 비극성 용매는 난황의 중성 지질 또는 난황의 지질 분획물을 제거하는 데에 유용하다. 실질적으로, 메탄올 및 에탄올과 같은 극성 용매는 인지질 분획물을 추출하는 데에 유용하다. 이와 다르게는, 아세톤 및 클로로포름과 같은 여러 가지 용매가 여러 추출 방법에 적절하다. 다양한 용매가 공정의 최적화 및 요건, 대형화 및 적용가능한 조절에 따라서 정제 응용법을 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 사이토킨 억제인자의 단리 및 정제의 또다른 이점은 초임계 유체 추출 (SFE)을 통하는 것이다. SFE는 트리글리세라이드 및 콜레스테롤과 같은 중성 지질을 포함하는 중성 지질 분획물을 난황 지질로부터 제거한다. 중성 지질은 전체 난황 지질의 대략 70 %를 차지한다. 예를 들면, 초임계 이산화탄소 추출은 인지질 분획물의 기능성을 손상시키지 않으면서도 대부분의 콜레스테롤 및 지방을 난황으로부터 제거하기 위한 효과적인 방법일 수 있다. 인지질은 SFE 동안 이산화탄소에 의해 제거되지 않으며, 이산화탄소는 에멀젼화 성질을 유지하는 데에 유익할 수 있다. 그러나, 인지질은 프로판과 같은 다른 용매에 의해 추출될 수 있다.
투여
다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 CIF를 정제된 형태, 재조합체, 화학 합성된 형태, 실질적으로 정제된 형태, 또는 임의의 다른 풍부한 형태로 포함할 수 있다. 투여 목적을 위하여, CIF는 임의의 적합한 형태로, 임의의 적합한 제약상 허용되는 담체와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 제약상 허용되는 담체에는, 상기한 바와 같은 제약상 허용되는 부형제, 조절 방출형 비히클 및 제약상 허용되는 운반 비히클이 포함된다. 조성물은 운반에 적합한 임의의 형태일 수 있으며, 그러한 형태로는 액제, 에어로졸제, 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 겔 및 과립제가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 비경구 투여에 특히 적합한 CIF 제제에는 멸균 수성 또는 비수성 용액제, 현탁제 또는 에멀젼제가 포함된다. 비수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주입가능한 유기 에스테르이다.
고체 투여 형태에서, CIF 단백질은 수크로오스, 락토오스 또는 전분과 같은 불활성 희석제 하나 이상과 함께 부가혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 통상적인 관행이 그런 것처럼, 불활성 희석제 이외의 추가적 물질을 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우에, 투여 형태는 완충제, pH-민감성 중합체 또는 식품 및 의약품 산업에서 조성물을 캡슐화하는 때 통상적으로 사용되는 임의의 다른 서방 (slow-releasing) 캡슐화제 (즉, 조절 방출형 (controlled release) 비히클) 또는 임의의 다른 조절 방출형 제제를 포함할 수 있다. 또한, 정제 및 환제는 장용 코팅 (enteric coating)을 하여 제조할 수도 있다.
경구 투여용 사이토킨 억제인자의 액체 투여 형태에는, 제약 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는, 제약상 허용되는 에멀젼제, 용액제, 현탁제, 시럽제 및 엘릭실제가 포함된다. 불활성 희석제 이외에도, 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 및 감미제를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 조성물은 식품의 형태이다. 이 양태에서, 한 측면에서는 면역조절 난 또는 그의 임의의 CIF 풍부 분획물이 영양 보충물 내로 합체된다. 영양 보충물로 혼입될 난 또는 그 분획물을 제조하는 바람직한 한 방법은 난을 분말로 건조하는 것을 수반한다. 난의 건조를 위한 다양한 방법이 공지되어 있으나, 분무 건조가 바람직한 방법이다. 난을 분무 건조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 이러한 건조 난 분말은 단지 평범한 난 분말로서 섭취될 수 있거나, 예를 들어 단백질 분말, 활력 증강 음료 (power building drinks), 단백질 보충물 및 임의의 다른 운동가-관련 (athlete-associated) 영양 제품 형태로 음료 내로 혼입될 수 있다. 또한 난 분말은 구운 혼합식품 (bake mixes), 파워 바, 사탕, 쿠키 등에 사용될 수 있다. 난 가공의 다른 예에는 오멜렛 만들기, 난을 연하게 또는 딱딱하게 삶기, 난을 굽기 등이 있고, 또는 필요하다면 난을 날알로 먹거나 액체 난으로서가공할 수 있다. 본 발명의 면역조절 난제품의 바람직한 분획물로는 액체 난황, 분말화된 난황 및(또는) 상기 과면역된 난제품의 지질 분획물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 세포 배양물로 (예컨대, 사이토킨 분석에서) 또는 환자에게 임의의 적합한 방법에 의하여 운반 (즉, 투여)될 수 있다. 그러한 방법의 선택은 투여 또는 운반되는 화합물의 유형 (즉, 정제된 분획물, 단백질, 핵산, 모방체), 운반 방식 (즉, 시험관내, 생체내, 생체외) 및 화합물 또는 조성물의 투여/운반에 의하여 달성하려는 목표에 따라서 달라질 것이다. 본 발명에 따르면, 효과적인 투여 프로토콜 (즉, 효과적인 방식으로 조성물을 투여하는 것)은 적합한 용량 변수 및 원하는 위치 (즉, 원하는 세포)로 화합물의 운반 및(또는) 피검자에게서 면역 반응의 조절을 가져오는 투여 방식을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 임의의 수단에 의하여 피검 동물에게 투여되어, 피검 동물의 면역계를 조절한다.
투여 경로는, 생체내, 시험관내 및 생체외 경로가 포함된다. 생체내 경로에는 경구, 비내, 기관내 주입, 흡입, 경피, 직장, 카테터의 삽관, 좌제에 의해, 조직으로의 직접 주입, 및 비경구 경로가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 비경구 경로에는 피하, 피내, 정맥내, 근육내 및 복강내 경로가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서는, 본 발명의 CIF 분획물, 단백질, 항체, 모방체 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 비경구 경로로 투여한다. 정맥내, 복강내, 피내, 피하 및 근육내 투여는 당분야에서 표준적인 방법을 사용하여수행할 수 있다. 에어로졸 (흡입) 운반도 당분야에 표준적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189: 11277-11281, 1992를 참조. 이 문헌은 본 명세서에 언급됨으로써 그 전체가 도입됨). 다른 양태에서는 본 발명의 CIF 분획물을 포함하는 조성물이 경구 투여된다. 경구 운반은 본 발명의 치료 조성물을 동물의 창자 내의 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체와 복합체화함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 CIF 분획물은 특히 소화 효소에 대해 내성이 있기 때문에, 그러한 담체가 결정적인 것은 아닐 수 있다. 그러한 담체의 예로는 당업계에 공지된 것과 같은 플라스틱 캡슐 또는 정제가 있다. 경구 경로는 상기한 바와 같은 제약상 허용되는 담체의 사용을 포함할 수 있다. 생체외 (ex vivo)란, 재조합 분자가 그후 형질감염된 세포에 의해 발현되도록 하는 상태에서, 환자로부터 떼어낸 세포군을 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 분자로 형질감염시키고 형질감염된 세포를 환자에게 되돌려주는 것과 같이, 환자의 외부에서 조절 단계의 일부를 수행하는 것을 가리킨다. 숙주 세포의 배양물로의 조성물 투여의 시험관내 및 생체외 경로는 형질감염, 형질전환, 전기천공, 미세주입, 리포펙션 (lipofection), 흡착, 프로토플라스트 융합, 단백질 운반제의 사용, 이온 운반제의 사용, 세포 투과성화를 위한 세정제의 사용, 및 배양물 중에서 화합물을 표적 세포와 단순히 혼합하는 것 (예를 들면, 합하는 것)에 제한되지 않으나 이들을 포함하는 방법에 의하여 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역조절 난 또는 그 분획물을 가공하여, 이후에 피검 동물에 투여될 수 있는 과면역 난제품을 생성할 수 있다. 한 양태에서, 투여는 피검 동물에게 직접 난 또는 그 유래물을 먹임으로써 일어난다. 난은 비독성이며 안전한 천연 식품 성분임을 인식하는 것이 중요하다. 이와 유사하게, 다른 양태에서는, 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자를 이후 동물에게 투여될 수 있는 방식으로 제조 (예를 들면, 제제화)하는 것이 바람직하다.
면역계의 조절에 관해서라면, 본 발명의 조성물은 사이토킨 (즉, TNF-α, IL-1β, IL-2 및(또는) PGE2) 발현의 억제, 바람직하게는 사이토킨 억제와 면역 조절에 있어 면역적으로 효과적인 양으로 피검자에게 투여하는 것이 바람직하다. 치료의 지속기간 및 강도는 특정 피검자 및 피검자의 상태, 그 상태의 현존 여부, 현존하는 경우 피검자의 상태의 진전에 따라 달라질 것이다. 또한, 조성물은 상태 및 상태의 증상을 치료 및(또는) 예방하는 임의의 양으로 제공된다.
예를 들면, 면역조절 난 또는 이로부터 제조된 제품을 투여하는 경우에, 상태의 특정한 환경에 따라서, 하루에 과면역 전란 1 개 미만 내지 수 개 (또는 과면역 전란1 미만 내지 수 개와의 등가량을 포함하는 과면역 난제품)의 양을 피검자에게 투여할 수 있다. 더 강력한 분획물을 본 명세서에 기재된 방법 및 당분야에 공지된 다른 방법에 의하여 분리 및 농축할 수 있다. 피검자에게로 면역조절 난 또는 난제품의 투여와 관련하여, 피검자에게 제공되는 과면역 난 또는 난제품의 바람직한 용량 범위는 피검자 체중 1 kg당 100 mg 내지 10 g인 것으로 결정되었다.
실질적으로 정제된 CIF, 재조합 CIF 및(또는) 화학적 합성 CIF를 비롯한 본발명의 단리된 사이토킨 억제인자와 관련하여, 실질적으로 정제된 조성물의 바람직한 용량 범위는 피검자 체중 1 kg당 1 ng 내지 400 mg인 것으로 결정되었다. 바람직한 양태에서, 바람직한 용량 범위는 피검자 체중 1 kg 당 약 0.01 mg 내지 약 100 mg이다. 또다른 양태에서, 단백질 또는 항체는 환자 체중 1 kg당 약 0.1 :g 내지 약 10 mg, 바람직하게는 환자 체중 1 kg당 약 0.1 :g 내지 약 100 :g의 양으로 투여된다.
환자에게 투여되는 용량의 개수는 투여의 목표 (예를 들면, 염증 상태의 정도 및 개별 환자의 치료에 대한 반응)에 따라 달라진다는 것은 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 따라서, 적합한 용량 개수가, 동물에게서 면역 반응을 조절하거나, 또는 염증촉진성 사이토킨 (TNF-α, IL-1β 및 IL-2)의 하향조절 및(또는) PGE2의 하향조절에 의해 치료 또는 예방될 것으로 기대되는 질병 또는 상태를 조절하는 데에 필요한 임의의 개수를 포함한다는 것은 본 발명의 범위내이다. 효과적인 생체내 용량 변수는 당업계에 표준적인 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, 생존율 측정, 부작용 (즉, 독성), 세포성 및 체액성 면역 반응 효과의 측정 및(또는) 그러한 면역 반응 효과에 관련된 상태에 대한 효과 등을 포함한다.
본 발명의 한 양태는 동물에게서 면역 반응을 조절하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이 양태는 본 발명의 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자를 포함하는, 본 명세서에서 상기한 바와 같은 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 양태에서, 조성물은 본 명세서에서 상기 기재한 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이 양태에서는 본 발명의 조성물은 면역계의 국소 또는 전신 자극제로서 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 국소 및 전신 세균 감염을 예방 및(또는) 치료할 수 있으며, 일반적인 항암제로서 사용될 수 있다. 또한, 조직 특이적 항체와 같은 특이적 운반 시약으로 태그 (tag)되어, 정맥내 경로를 통하여 세균 감염 또는 암 형성의 특이적 위치로 운반할 수 있다. 또한, 조성물은 시판되는 특이적 리포솜 또는 운반 비히클과 혼합하여 세포의 세포막 및 핵막을 통과하여 조성물을 운반함으로써 RNA 수준에서 TNF-α, IL-1β 및(또는) IL-2 발현의 억제를 용이하게 할 수도 있다. 바람직한 경로 및 용량을 포함하여, 투여의 적합한 방식은 상기 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 TNF-α, IL-1β, IL-2 및(또는) PGE2의 발현을 증가시킴으로써 면역 반응을 조절하기에 적합한 경로와 용량으로 동물에게 투여한다.
본 발명의 이로운 성질은 본 발명을 예시하는 다음 실시예를 참조하여 발견할 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
<실시예 1>
PL-100 난황 지질의 분획물
1,300 ml 초순수 (ultrapure) 수(水) 중의 빙초산 (0.44 ml), 아세트산나트륨 (3.06 g) 및 염화나트륨 (5.26 g)을 용해시킴으로써 제조한 완충액을 사용하여, PL-100 난을 탈지하였다. 완충액은 pH 값이 약 5.0이었다. 난 재료 (100 g 분무-건조 난 또는 200 ml 보통 난 (shell egg))를 완충액에 첨가하고, 난 혼합물을 24,000 rpm에서 5 분간 실온에서 블렌딩하여 더 균질화하였다. 균질화된 난 혼합물을 4 시간 동안 4 ℃에서 교반하여 최대 용해도가 가능하게 하였다. 카프릴산 (15 ml)을 난 혼합물에 첨가하고, 24,000 rpm에서 3 분간 실온에서 블렌딩하여 균질화하였다. 그 다음, 난 혼합물을 2 시간 동안 실온에 방치하여 상분리가 일어나게 하였다. 이어서, 면상 침전물 (flocculate) 및 거품을 수성상과 혼합하고 2,190 x g에서 10 분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상층물을 40 마이크론 다공도 여과지를 사용하여 여과하고, 여액을 동결건조하였다. 지질과 수불용성 단백질이 함유된 펠렛은 추가의 지질 추출을 위하여 수집하였다. 이 분획물을 수불용성 분획물 (WIF)로 명명한다.
원료로서 상기 산성 추출 방법으로부터 얻은 수불용성 분획물 (WIF) 또는 액체 난황으로부터 난 지질을 추출할 수 있다. 난 지질의 용매 추출을 위하여, 액체 난황 또는 WIF 펠렛 800 g을 밀폐된 병 중에서 아세톤 1,000 ml와 혼합하였다. 트리글리세라이드 및 콜레스테롤과 같은 중성 지질을 아세톤으로 3 회, 3 분동안 24,000 rpm에서 격렬하게 혼합 또는 블렌딩하여 추출하였다. 아세톤 추출물을 40 마이크론 와트만 폴드 여과지를 통하여 여과하였다. 아세톤 중에 용해되지 않은 입자의 잔류물/아세톤 추출의 여과지로부터의 잔류물을 1,000 ml 메탄올 중에 추가 혼합하였고, 극성 지질 및 사이토킨 억제인자를 3 분 마다 3 회 추출하였다. 메탄올을 50 ℃ 34475 N/m2(5 파운드/in2(PSI))의 감압하에서 회전 증발기를 사용하여 증발에 의하여 제거하였다. 추출물 중에 미량의 메탄올 및 물은 동결건조에 의하여 제거되었다. 건조된 메탄올 추출물을 황색 페이스트로서 -20 ℃에서 보관하였다. 장래의 사용을 위하여, 메탄올 추출물 분획물은 메탄올, 에탄올, 염화메틸렌 및 클로로포름에 용해될 수 있고 부분적으로 물에 용해될 수 있다. 이와 다르게는, 상기한 방법에 따른, 난 지질의 추출에 메탄올 대신에 에탄올이 사용될 수 있다.
난의 성분들을 여러 용매 중의 용해도에 따라 분리할 수 있다. 난황은 약 62 %의 지질과 30 %의 단백질을 함유한다. 지질 부분 중 중성 지질은 대부분이 트리글리세롤이며, 전체 지질의 상당 부분이고, 전체 지질의 대략 65 %를 차지한다. 중성 지질은 비극성이며, 헥산 또는 벤젠과 같은 탄화수소 용매 중에 잘 용해된다. 그러나, 이들은 더 극성인 용매 중에서는 매우 불용성이다.
반대로, 인지질은 전체 지질의 약 30 %, 또는 전체 난황 질량의 18 %를 차지한다. 인지질은 콜린 또는 에탄올아민 분자가 인산에 에스테르화된 결과 매우 극성이기 때문에, 메탄올 및 에탄올과 같은 극성 용매에 의해 용이하게 추출된다.
액체 난황 및 건조 난황 분말 둘다에서 인지질 추출물의 수율은 용매 추출에 의해 난황 질량의 약 10 %이었다 (표 1 참조). 아세톤은 중간정도의 극성을 가지므로 중성 지질과 함께 인지질 일부를 추출할 수 있기 때문에, 아세톤 추출 과정에서 인지질 일부가 추출되어 폐기되었다. 인지질의 수율은 헥산과 같은 비극성 용매를 사용하여 중성 지질을 추출함으로써 증가될 수 있다.
난 지질의 메탄올 추출물
난황1 인지질의 수율 (%)2
PL-100 분무 건조 전란 3.3
PL-100 분무 건조 난황 8.0
SPAFAS3분무 건조 난황 10.4
PL-100 보통 전란 4.8
PL-100 보통 난황 12.4
1 전란 및 난황은 각기 34 % 및 51 % 건조 질량을 포함한다.
2 보통 난의 메탄올 추출물의 수율은 전체 보통 난의 건조 질량으로 계산되었다.
3 SPAFAS 난은 비면역 난이다.
<실시예 2>
HPLC 정제
실시예 1에 기재된 추출 방법으로부터의 극성 또는 인지질 추출물은 정상상 HPLC를 사용하여 CIF 분획물로 더 정제될 수 있다. HPLC 크로마토그램 (도 1 참조)은 인지질 분획물로부터의 분획물 5 개를 보여주었다. 5 개의 분획물 중, 2 개의 분획물은 시험관내 TNF-α 및 IL-1β 발현을 억제하는 데에 특히 효과적이었다.
HPLC 분리는 아메리크롬 (Americhrome) HPLC 시스템에서 정상상 HPLC 컬럼 (25 x 2.12 cm Zorbax PRO 1/150 CN)으로 수행하였다. 4 가지 용매가 분리에 사용되었다. 용매 A는 0.05 % 에탄올 중의 99.5 % 헵탄이었고, 용매 B는 6 % 에탄올 중의 94 % 헵탄, 용매 C는 10 % 에탄올 중의 90 % 헵탄, 용매 D는 100 % 에탄올이었다.
분리를 위하여, 인지질 추출물 약 4.0 내지 4.5 g을 용매 A 150 ml에 용해시키고, 0.2 ㎛ 다공도 막을 통하여 여과하여 미용해 물질을 제거하였다. 투명한 황색 용액이 얻어졌다.
이어서, 이 투명한 황색 용액을 HPLC를 사용하여 분리하였다. 컬럼의 단계 구배는 용매 A (0 - 2 분), 용매 B (2.01 - 18.0 분), 용매 C (18.01 - 30.0 분), 용매 D (30.01 - 40.0 분) 및 용매 A (40.01 - 60.0 분)이었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 이로부터 5 개의 분획물을 수집하였다. 검출 파장은 254 nm이었고, 분획 1 (F1) 및 5 (F5)는 최고의 검출 판독결과를 나타냈다. HPLC 분리는 여러 회 주입에 걸쳐 수행되었고, 분획물 풀을 수집하였다. 용매는 회전 증발기를 사용하여 증발에 의하여 제거하였다.
상기한 HPLC 분리는 사이토킨 억제인자 (CIF)의 순도를 증가시켰다. 각각의 분획물은 황색을 띄나 그 농도는 달랐다. 도 1의 크로마토그램은 인지질 분획물의 대부분의 물질이 분획물 1 (F1) 및 5 (F5)로 분리된 반면, 분획물 2 - 4 (F2, F3, 및 F4)는 더 잘 정제된 물질임을 보여준다.
<실시예 3>
사이토킨 억제인자의 특징분석
위 실시예 2에 기재된 수준으로 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자 (CIF)를 구체적인 특징을 결정하기 위하여 더 특징를 분석하였다. 간단히 말하면, 다음의 기본 연구가 수행되었고, 관련 특징이 결정되었다.
실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자의 최대 파장은 시마드쯔 (Shimadzu) HPLC 다이오드 어레이 검출기에 장착된 분광기에 의하여 측정하였고 205 nm로 결정되었다.
실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자 (CIF)의 융점은 냉각 CIF를 증가하는 따뜻한 수조에 넣음으로써 육안 관찰에 의하여 측정하였는데, 39 ℃ 내지 42 ℃의 범위 내인 것으로 결정되었다.
실질적으로 정제된 CIF의 분자량은 현재의 연구 데이타로서 평가되었다. 난황의 인지질 분획물에서 화합물 대부분은 작은 분자 (200 - 6,000 달톤)인 것으로 당분야에 공지되어 있다.
실질적으로 정제된 CIF 분획물의 용해도는 실온에서 1.0 ml 용매 중에 100 mg CIF를 첨가하여 측정하였다. 용해도는 육안 관찰을 통해 검사하였다.
마지막으로, 단백질은 메탄올, 에탄올 및(또는) 클로로포름 중에는 용해되지 않으므로, CIF는 단백질일 수 없는 것으로 결정되었다.
<실시예 4>
시험관내 사이토킨 억제
사이토킨 억제 분석은 인간 단핵구인 THP1과 인큐베이션한 후, RT-PCR법에 의하여 사이토킨 mRNA의 발현을 측정하여 수행하였다. 전체 분석은 4 단계, 즉, 사이토킨 억제, RNA 추출, cDNA 합성 및 PCR 반응을 포함한다.
시험관내에서 사이토킨 억제: 사이토킨 억제 분석을 위해, THP1 세포를 약 1 x 105세포의 농도로 10 ml RPMI 1640 배지 중에서 LPS (대략 0.2 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션하여 세포 중의 사이토킨을 유도하였다. 또한, 세포를 난황 지질 분획물 (5 ㎍/ml)과 37 ℃에서 4 시간 동안 동시에 인큐베이션하였다. 세포를 수거하고트리졸 (GIBCO BRL) 750 ml과 혼합하였다.
RNA 추출: 실온에서 10 분 동안 세포 혼합물을 인큐베이션한 후, 클로로포름 250 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 추가로 20 초 동안 손으로 격렬하게 흔들었다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 놓아둔 후, 5 분 동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 상부의 투명한 수성층을 조심스럽게 새 마이크로원심분리 튜브 내로 분리해 내고, 이소프로필 알코올 500 ㎕를 첨가하였다. 이 RNA 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한 후, 실온에서 12,000 x g로 원심분리하였다. RNA를 함유하는 펠렛을 냉각 70 % 에틸 알코올 1.0 ml로 세척한 후, 실온에서 5 분 동안 12,000 x g로 원심분리하였다. RNA를 멸균 증류수 (RNase가 없음) 40 ㎕ 중에 용해하고, 볼텍스로 온화하게 혼합하고, 뚜껑을 연 채로 65 ℃에서 인큐베이션하여 남은 70 % 에탄올을 증발시켰다. 표준 RNA로서 Hind III 효소로 소화된 λ DNA를 사용하고, 1 x TBE 러닝 완충액 중의 1 % 아가로오스 겔 상에 1.0 ㎕를 로딩함으로써 RNA의 양을 검사하였다. 마지막으로, RNA를 1 x TBE 완충액 100 ml 중의 10 ㎕ 골드 핵산 겔 염료 (Molecular Probes)을 사용하여 20 분 동안 염색하고, 겔을 UV 하에서 가시화하였다.
cDNA 합성: RNA 샘플 10 ㎕ 및 올리고 dT 프라이머 1.0 ㎕를 PCR 튜브에 첨가하였다. RNA를 10 분 동안 65 ℃에서 인큐베이션한 후, PCR 기계내에서 2 분간 실온에서 인큐베이션하였다. PCR 튜브를 원심분리하여 샘플을 바닥으로 가라앉히고, 이 튜브에 마스터 믹스 8 ㎕를 첨가하였다. 마스터 믹스는 RNase 억제제 1.0 ㎕, 5 x RT 완충액 4 ㎕, 100 mM dNTP 1.0 ㎕, 80 mM 피로인산나트륨 1.0 ㎕, 및1.0 ㎕ AMV 역전사효소를 함유하였다. 튜브를 PCR 기계내에서 1 시간 동안 42 ℃에서 인큐베이션한 후, 2 분 동안 95 ℃에서 인큐베이션하였다. 튜브를 간단히 스피닝한 후, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1.0 ㎕ 및 페놀-클로로포름 20 ㎕를 첨가하였고, 샘플을 볼텍스로 혼합한 후, 2-3 분간 스피닝하였다. 상부의 수성층을 분리하여 새 튜브 (약 18 ㎕)로 옮기고, 아세트산 암모늄 20 ㎕ 및 이소프로판올 125 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 볼텍스로 10 초간 교반하고 드라이아이스/에탄올 슬러시 (-20 ℃) 중에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 실온에서 10 분 동안 12,000 x g로 튜브를 스피닝하고, 상층물을 폐기하고, 펠렛을 70 % 에틸 알코올 1 ml로 세척하였다. RNA 혼합물을 실온에서 5 분 동안 12,000 x g으로 스피닝하고 에탄올을 제거하였다.
PCR 반응: GAPDH 프라이머를 처음에 사용하여, cDNA 수준이 모든 샘플에서 동일하게 되도록 했다. PCR 반응 혼합물 100 ㎕는 10 x PCR 완충액 (Gibco BRL, MgCl2없음), 2.5 μM dNTP (Gibco BRL), MgCl23.0 ㎕, 각각 사이토킨에 맞춰진 프라이머 2.0 ml, Taq DNA 중합효소 1.0 ㎕ 및 PCR 멸균수 63 ㎕를 함유했다. cDNA 1.0 ㎕ 및 멸균 증류수 4.0 ㎕를 각 PCR 튜브에 첨가하였다. PCR 반응을 표준 방법에 맞춰 설정하였다.
PCR이 일단 끝나면, 클로로포름 50 ㎕를 각 튜브에 첨가하였다. 뚜껑을 단단히 닫고 볼텍스하고 1 분간 12,000 x g로 원심분리했다. 위쪽 수성층을 라벨부착된 새 튜브로 옮겼다. 그 후, 각 샘플 15 ㎕를 1 x TBE 러닝 완충액 중의 1.5 %아가로오스 겔에 적용하고 사이토킨 DNA를 대조구로서 100 bp 표준 래더와 함께 겔에 러닝시켰다. 겔을 1 x TBE 완충액 100 ml 중의 10 ㎕ 골드 핵산 겔 염료 (Molecular Probes)을 사용하여 20 분 동안 염색하고, UV 검출기 하에서 가시화하였다.
결과
LPS는 인간 단핵구를 자극하여 TNF-α 및 IL-1β를 생성한다 (6). 이 결과는 우리 연구와 일치한다. LPS는 THP1 세포가 두 사이토킨을 발현하도록 유도하였다 (도 2). TNF-α에 대한 최대 유도는 약 0.2 mg/ml 배지에서이었다. 고농도의 LPS는 불량한 유도를 나타냈으며, 배양 배지 중의 저농도도 마찬가지였다. LPS는 매우 낮은 농도에서 (0.008 mg/ml) IL-1β를 유도할 수 있었는데, 이는 IL-1β가 LPS 유도에 더 민감한 사이토킨임을 지시한다.
LPS 유도 분석을 사용함으로써, 인간 단핵구의 TNF-α, IL-1β 및 IL-2의 발현이 난황 인지질 분획물에 의하여 억제되는 것으로 결정되었다. 세포 TNF-α 및 IL-1β는 세포를 0.2 mg/ml LPS 및 난황 인지질 분획물과 인큐베이션했을 때 완전한 억제를 나타냈다 (도 3). 또한, 사이토킨 억제는 난황 인지질 분획물에 의한 특이적인 억제를 확인하기 위해 변형된 분석에 의하여 결정되었다. 이 분석에서, 세포를 0.2 mg/ml LPS와 인큐베이션하여, TNF-α 및 IL-1β를 유도하였다. 2 시간 인큐베이션한 후, 배지 중의 LPS를 세포를 세척함으로서 제거하였다. 그 후, 세포를 난황 인지질 분획물과 2 시간 이상 인큐베이션하였다. 일관되게, TNF-α 및 IL-1β 모두 완전히 억제되었다. 반대로, 세포를 LPS와 2 시간 동안 인큐베이션하였으나, 추가의 난황 인지질 분획물이 없었던 경우에는 그 후 TNF-α 및 IL-1β의 높은 발현을 나타냈다.
<실시예 5>
IL-2 억제
또다른 염증촉진성 사이토킨인 IL-2도 난황 지질 분획물에 의해 억제되는 것으로 발견되었다. IL-2는 아세톤 추출물 및 에탄올 추출물 모두에 의하여 부분적으로 억제되었다 (도 4). 중성 지질의 불순한 조성 때문에, 아세톤 추출물은 용매 추출시에 일정 부분의 인지질 분획물과 혼합될 수 있었다. 동일한 결정방법에 의할 때, 난황 인지질 분획물은 세포의 IL-6, IL-12 및 TGFb의 발현에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
<실시예 6>
PGE2생합성의 억제
마우스 단핵구 대식세포에서 난황 지질 분획물의 PGE2생합성 억제에 대한 효과
실험
여러 세포 형태가 COX-1와 COX-2 둘다를 발현할 수 있으나, 나머지는 둘 중 하나를 발현한다. 이 분석에 사용되는 RAW 264.7 세포는 시클로옥시게나제의 이소형을 둘 다 발현한다 (우리 실험실에서 면역형광분석으로 입증). 분석은 RAW 264.7 세포 단층의 유사분열 (LPS) 자극을 통하여 COX-2의 밤새 유도와 함께 시작하였다. 이어서, 세포 단층을 시험 물질 (예를 들면, 인도메타신)에 37 ℃에서 30 분 동안 노출시킨 후, 아라키돈산의 외인성 원료를 계에 제공하였다. (PGE2특이적 신테타제이외에) COX1 및 COX2도 외인성 아라키돈산을 PGE2로 전환시켰다. 그 후, 배양 배지 중의 프로스타글란딘 E2를 시판되는 EIA 시스템으로 정량하였다. 배양 배지 단독으로부터 회수한 것에 비하여 시험 물질이 함유된 배양 배지로부터 더 적은 PGE2가 회수된 경우 그 상태는 억제로 라벨표시하였다. PGE2생합성의 억제가 이 분석에서 발생하는 구체적인 메카니즘은 추론할 수 없으며, 더 연구가 필요하다.
분석 방법: DMEM 배지 중의 5 x 106세포를 접종하고, 37 ℃, 5 % CO2인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 1일에 접종된 세포의 증식 약 24 시간에 (통상 90 내지 100 % 전면배양 (confluence)), 증식 배지는 무균적으로 경사분리하여 폐기하였다. 멸균 PBSA 10 ml를 피펫으로 비증식 표면에 대고 플라스크 내로 조심스럽게 첨가하였고, 이들 세포를 2 회 세척하였다. LPS (2 ng/ml)을 함유하는 DMEM 10 ml를 시험 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 37 ℃, 5 % CO2인큐베이터에 16 시간 동안 밤새 두었다.
최초의 LPS 노출 16 시간 후, 증식 배지를 무균적으로 제거하고 (흡입) 폐기하였다. 멸균 PBSA 10 ml를 피펫으로 비증식 표면에 대고 플라스크 내로 조심스럽게 첨가하였고, 이들 세포를 2 회 세척하였다. 세포를 PBSA 2 ml, 양성 대조구 약물 2 ml, 또는 난황 지질 샘플 (1.0 mg/ml) 2 ml가 존재하에 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 30 분 인큐베이션한 후, 300 μM 아라키돈산 222 ㎕를 각 플라스크에 첨가하였다. 세포를 30 μM 아라키돈산의 존재하에 37 ℃에서 15 분간 더 인큐베이션하였다. 15 분간 인큐베이션 후, 1 mg/ml 인도메타신 50 ㎕를 플라스크의 내용물에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플라스크로부터 모든 유체를 적절히 라벨표시된 폴리프로필렌 튜브 내에 수집하였다.
프로스타글란딘 E2를 시판중인 ELISA 키트 (Amersham RPN222)를 사용하여 실온에서 표준 프로토콜에 따라서 분석하였다.
결과
이 모델에서 PGE2생합성은 인도메타신, 아스피린 및 이부프로펜과 같은 여러 NSAID에 의해 억제되었다 (데이타는 제시하지 않음). 이들 3 개의 NSAID는 COX-1 및 COX-2의 두 효소에 대한 비선택된 억제제인 것으로 보고된 바 있었다. 이들은 비특이적 의약품으로서 고려되며, 대부분의 경우에 환자를 치료하기 위한 임상 응용시 부작용을 유발했다.
우리 연구에서는, 세포의 PGE2생합성이 난황 분획물에 의해 상이한 수준에서 억제되었다 (표 2). 조물질 경우, 난황은 전란보다는 PGE2생합성에 대한 더 강한 억제를 보였다. 그러나, 난황 및 전란의 억제능은 지질 분획물과 비교할 때 상대적으로 더 낮았다 (평균 17 %). 난황 지질의 아세톤 추출물 및 메탄올 추출물은 PGE2생합성을 각기 31 % 및 54 %까지 억제하였다. 반대로, 단백질 풍부 분획물,수용성 단백질 (여액) 및 수불용성 단백질 (잔류물)은 세포의 PGE2생합성에 대한 억제를 보이지 않았다. PGE2생합성에 대한 난황의 활성 억제제는 인지질 부분에 위치하는 것으로 생각되며, 활성 성분은 수불용성이고 비펩티드형 분자일 수 있다. 이 분자는 사이토킨 발현을 억제하는 활성 성분과 상이한 분자일 수 있다. 난황 인지질 분획물을 상이한 염증촉진성 분자를 억제하는 다수의 조절인자를 갖는 것으로 보인다.
PL-100 난 분획물에 의한 시험관내 PGE2생합성의 억제
분획 분무 건조 난 새(fresh) 난 평균
전란 난황 전란 난황
출발 난 -3 30 21 18 17
여액 -5 -2 13 -6 0
아세톤 추출물 16 82 -19 43 31
메탄올 추출물 48 61 55 52 54
잔류물 -11 12 -21 0 -6
1. n=5
2. 숫자는 시험관내 PGE2생합성의 억제의 %를 나타냄
3. 시험된 세포 배양물 중의 난 분획물의 농도는 1.0 mg/ml 배지이었다.
<실시예 7>
콜라겐-유도 관절염 모델
래트의 콜라겐-유도 관절염 모델에서 PL-100 난황의 항염증 효과의 측정
실험
래트에서 콜라겐-유도 관절염을 유도 및 평가하는 방법은 문헌 (Trentham,et al. 1977 (8))에 의해 개발된 프로토콜에 따랐다. PL-100 난황 및 탈지 분획물을 래트에서 2형 콜라겐 유도 관절염의 개시전에 7 일 동안 래트에게 먹였고, 유도 후 16 일 동안 먹였다. 총 30 마리의 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley)(VAF+) 암컷 래트 (6 - 8 주령, 125 g)를 찰스 리버 (Charles River)-VAF+로부터 얻었다. 래트 3개의 군 (1 군 당 10 마리)을 시험했다. 이들은 대조구 (물 급식), 난황 5 % 용액 3.5 ml, 및 5 % 탈지 난황 분획물 3.5 ml였다. 래트에게 샘플을 이틀에 한번씩 먹였다. 제2 일 용액을 사용할 때까지 4 ℃에 보관하였다. 2 일 후에, 과량의 용액을 폐기하였다. 내피 면역화 10 일후에 시작하여 그 후 21일까지 매일 쥐 발 홍반 (0 - 4+) 및 발 부종 (0 - 4+)에 대해 임상 평가했다 (블라인드 방식). 21 일에, 모든 쥐를 죽이고 채혈하였다.
결과
과면역 난황은 콜라겐-유도 관절염의 모델에서 시험된 쥐의 약 40 % 발 홍반 및 발 부종을 억제하였다 (도 6). 난황 분획물과 비교하면, 탈지 난황 및 대조구 샘플은 발생한 병변에 대해 아무런 효과도 나타내지 않았다. 이 실험은 염증 억제에 대한 특이적 효과를 보이는 시험 연구에서 난황 지질군이 결여되었으나, 간접적인 결과는 난황 인지질 분획물이 항염증 성분을 함유하였음을 보여주었다.
본 발명이 구체적 양태와 관련하여 예시 및 설명되었으나, 본 발명이 설명한 세부사항으로 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명으로부터 벗어나지 않고도 청구의 범위의 범위 및 그와 동등한 범위 내에서 세부적인 점에서 여러 가지 변형이 이루어질 수 있다.

Claims (34)

  1. 사이토킨 억제인자가
    a) 분자량이 6,000 Da 미만이고,
    b) 조류 난의 난황의 지질 분획물에 자연적으로 존재하며,
    c) 205 nm에서 최대 파장 흡광도를 가지고,
    d) 비단백성 물질이며,
    e) 융점이 약 39 ℃ 내지 42 ℃이고,
    f) 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 RNA 전사를 억제하는 것인, 실질적으로 정제된 사이토킨 억제인자를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이토킨 억제인자가 클로로포름, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 용매 중에서 가용성인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이토킨 억제인자 100 mg이 용매 1.0 밀리리터 중에 가용성인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 사이토킨 억제인자가 아세톤, DMSO, 헥산, 디에틸 에테르, 식물성 오일 및 물로 이루어진 군에서 선택된 용매 중에 불용성인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 사이토킨 억제인자가 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생합성을 억제하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사이토킨 억제인자가 관절염 치료에 있어서 항염증 효과를 가지는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제약상 허용되는 담체가 물, 인산 완충 염수, 링거스 용액, 덱스트로스 용액, 혈청-함유 용액, 행크스 용액, 다른 생리적으로 균형화된 수용액, 오일, 에스테르, 글리콜, 생체적합성 중합체, 중합체 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 미립자, 농축괴 제제, 삼투 펌프, 분산 디바이스, 리포솜, 지질구 (liposphere), 세포 및 세포막으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제약상 허용되는 담체는 상기한 사이토킨 억제인자가 풍부한 것으로 선택된 과면역 난제품인 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 제약상 허용되는 담체가 과면역 난제품의 적어도 한분획물로 제조된 식품이며, 상기한 분획물이 상기한 과면역 난제품에 비하여 풍부한 양의 상기한 사이토킨 억제인자를 포함하는 것인 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기한 제약상 허용되는 담체가 과면역 난제품의 분획물을 포함하며, 이 분획물이 상기한 과면역 난제품에 비하여 풍부한 양의 상기한 사이토킨 억제인자를 포함하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기한 분획물이 상기한 과면역 난제품의 액체 난황, 난황 분말 및 수불용성 분획물로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  13. 제7항에 있어서, 상기한 조성물이 액제, 에어로졸제, 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 겔제 및 과립제로 이루어진 군에서 선택된 형태인 조성물.
  14. 제7항에 있어서, 상기한 제약상 허용되는 담체가 조절 방출형 제제를 포함하는 것인 조성물.
  15. a) 난황의 수용성 분획물 (WSF)로부터 수불용성 분획물 (WIF)을 분리하고,
    b) 이 수불용성 분획물을 중성 지질 분획물 및 극성 지질 분획물로 분리하고,
    c) 고성능 액체크로마토그래피에 의하여 극성 지질 분획물을 사이토킨 억제인자 분획물로 정제하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 정제된 사이토킨 억제인자.
  16. 제15항에 있어서, 단계 b)의 중성 지질 분획물이 아세톤 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매를 사용하여 추출된 것인 정제된 사이토킨 억제인자.
  17. 제15항에 있어서, 단계 b)의 극성 지질 분획물이 에탄올, 클로로포름, 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매를 사용하여 추출된 것인 정제된 사이토킨 억제인자.
  18. a) 난을 수불용성 분획물 (WIF)과 수용성 분획물 (WSF)로 분리하고,
    b) 상기 수불용성 분획물로부터 극성 지질 분획물을 추출하고,
    c) 고성능 액체크로마토그래피에 의하여 상기 극성 지질 분획물을 사이토킨 억제인자 분획물로 정제하는 것을 포함하는,
    난황 및 난백을 포함하는 조류의 난으로부터 사이토킨 억제인자를 정제하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 난의 수불용성 분획물로부터 중성 지질 분획물을 추출하는 것을 더 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 단계 b)가 초임계 유체 추출에 의하여 수행되는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 난백으로부터 난황을 분리하는 것을 더 포함하며, 단계 a)에서 난황이 수불용성 분획물 (WIF)과 수용성 분획물 (WSF)로 분리되는 방법.
  22. 제1항의 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물의 사이토킨 발현의 억제 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 사이토킨이 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2)로 이루어진 군에서 선택된 염증촉진성 사이토킨을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제약상 허용되는 담체가 물, 인산 완충 염수, 링거스 용액, 덱스트로스 용액, 혈청-함유 용액, 행크스 용액, 다른 생리적으로 균형화된 수용액, 오일, 에스테르, 글리콜, 생체적합성 중합체, 중합체 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 미립자, 농축괴 제제, 삼투 펌프, 분산 디바이스, 리포솜, 지질구, 세포 및 세포막으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 경구, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 운반, 기관내 투여, 흡입, 카테터 삽관, 좌제, 및 조직내로의 직접 주입으로 이루어진 군에서 선택된 경로에 의하여 투여되는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 상기 동물의 체중 1 kg당 상기 사이토킨 억제인자 약 1 ng 내지 약 400 mg의 용량으로 투여되는 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 동물의 세포에 의한 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-6 (IL-6)의 발현을 억제하는 것인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 동물의 세포에 의한 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 합성을 하향조절하는 것인 방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 방법.
  31. 사이토킨 억제인자가
    a) 분자량이 6,000 Da 미만이고,
    b) 조류 난의 난황의 지질 분획물에 자연적으로 존재하며,
    c) 205 nm에서 최대 파장 흡광도를 가지고,
    d) 비단백성 물질이며,
    e) 융점이 약 39 ℃ 내지 42 ℃이고,
    f) 종양괴사인자 알파 (TNF-α), 인터루킨-1-베타 (IL-1β) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 RNA 전사를 억제하는 것인, 사이토킨 억제인자를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 면역계의 조절 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조성물이 경구, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 운반, 기관내 투여, 흡입, 카테터 삽관, 좌제, 및 조직내로의 직접 주입으로 이루어진 군에서 선택된 경로에 의하여 투여되는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 조성물이 상기한 사이토킨 억제인자를 함유하는 식품을 포함하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 관절염 증상의 경감, 관절염에 수반되는 염증의 경감 및 관절염의 예방으로 이루어진 군에서 선택된 결과를 생성하는 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10471100B2 (en) 2006-09-29 2019-11-12 4Life Patents, Llc Nanofraction immune modulators, preparations and compositions including the same, and associated methods
US9028882B2 (en) 2005-05-02 2015-05-12 4Life Patents, Llc Nutraceutical gels
PL2848258T3 (pl) * 2005-10-26 2018-06-29 Novartis Ag Leczenie rodzinnej gorączki śródziemnomorskiej przeciwciałami przeciwko IL-1beta
US9107901B2 (en) * 2010-01-19 2015-08-18 Robert E. Coifman Immunotherapy compositions and methods of treatment
EP2986145A1 (de) * 2013-04-12 2016-02-24 Werner Ch. Nawrocki Verfahren zur herstellung einer eiölzusammensetzung
US10632158B2 (en) 2016-06-23 2020-04-28 IgY Nutrition Use of a hyperimmune egg product to prevent and treat dysbiosis
MX2019009554A (es) 2017-02-13 2020-01-30 Us Agriculture Producto de huevo hiperinmunizado para el tratamiento de enteritis necrotica en aves de corral.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4357272A (en) 1978-03-22 1982-11-02 The South African Inventions Development Corporation Recovering purified antibodies from egg yolk
US4550019A (en) 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
US4748018A (en) 1984-02-07 1988-05-31 Stolle Research & Development Corp. Method of passive immunization of mammals using avian antibody
PT769054E (pt) * 1994-07-05 2000-11-30 Steeno Res Group A S Imunoreguladores
US5772999A (en) 1996-07-30 1998-06-30 Dcv Biologics, L.P. Method of preventing, countering, or reducing NSAID-induced gastrointestinal damage by administering milk or egg products from hyperimmunized animals
JP3342007B2 (ja) * 1997-11-20 2002-11-05 郁男 山科 低分子ヘパリン修飾体及び皮膚潰瘍治療剤
WO2000043019A2 (en) 1999-01-19 2000-07-27 Dcv Inc Egg anti-inflammatory composition and method of treating and preventing inflammation
DE60018426T2 (de) 1999-07-23 2006-05-11 Arkion Life Sciences Llc., Wilmington Hochgereinigter cytokin-aktivierender faktor und verfahren zu seiner verwendung

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Publication number Publication date
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