JPH05502214A - 駆虫用非生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 駆虫用非生ワクチン 発明の分野 本発明は、ワクチン、特に動物用の駆虫用の非生ワクチンに関する。また、本発 明は、動物の治療方法に関する。

発明の背景 胃腸回虫（線虫）は、′ＮＭ及び人間において発見される寄生虫であり、また様 々な病気の原因である。胃腸回虫、特にオステルタギア・サーカムシンクタ（Ｏ ｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｃｉｒｃｕ＋ｗｃｉｎｃｔａ）の侵入は、特にオーストラ リアの冬季雨降地域及び世界中のその他のこれに類する気候の地域で、寄生虫に まる病気及び牧羊産業における生産性の低下の主要な原因となっている。１９６ ０年代以降化学薬品の飲薬がこの胃腸回虫制御のために広範囲に使用されてきて いるが、結果としては、現在では飲薬に対する抵抗力を有する寄生虫が広範囲に 繁殖しており、この産業の生存可能性を脅カルでいる。効果的な駆虫ワクチンの 開発は、産業保全のための少ない代替方法の一つであると考えられている。

従来の技術者が駆虫ワクチンを開発してきているが、これらは、実用面において 満足できるものではないことが証明されている。このようなワクチンの１は、１ ９６８年７月３０日に与えられた米国特許第３，３９５．２１８号（シルバーマ ン）に記載されている。この発明では、感染線虫の第三期幼虫を水溶性の培養基 で組織親和期へ試験管培養し、その後に幼虫を除去し、使用した水溶性の培養基 を凍結乾燥することによって生成される非生ワクチンの製剤が説明されている。

同様に、】９７７年６月２２日に与えられた英国特許明細書１５８０５３９では 、合成培養基において培養された感染性のテリンチネラ・スビラリス（Ｔｒｉｎ ｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ）又はハエモンカス・コントルクス（Ｈａ ｅ＋５ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）いずれかの幼虫によって排出／分泌 された代ｊ１１抗原の製剤が説明されている。これらの抗原は、７．５ｐｉｒａ ｌｉｓ及び鴫乳動物のその他の駆虫に対する経口ワクチンとして有用であると主 張されている。

バイオテクノロジー・オーストラリア・ビーティヮイ・リミテッドにＪるＰＣＴ 出ＩＩ　（ＰＣＴ／ＡＵ８５１００２８２号、国際公表１０８６１０２８３９号 ）は、哺乳動物又は鳥類に寄生しない線虫種の懸濁、均等化又は抽出からなるワ クチンを記載している。この製剤は、哺乳動物及び鳥類に寄生する線虫種に対す るワクチン注射に有用であると主張されている。

これらの製剤は多くの興なった組織を含むものであり、従って抗原的に複雑であ る（アンダース、ハワード・アンド・ミッチェル、１９８２年）ということは現 在ではよく知られていることである。この従来技術による製剤に存在する多くの 抗原のうちで非常に少数のものだけが寄生予防免疫反応を促進できる可能性があ る一方、その多くは、概して駆虫の生存並びに／又は病気の原因となる病理学的 な病変の仲介及び生成の可能性を高めるものとなり得る、瑣末な又は寄生前の免 疫反応を誘発する。従って、このような混合物から生成されたワクチンは、その 後の攻撃侵入からの宿主を保護できないばかりが、ましてや効能のあるワクチン たり得ない。

数年来、回虫寄生に存在する特定の生理化学的特性と一致し、かつ宿主たる動物 を再侵入から保護する反応を誘発する固有の蛋白質又は蛋白質群の確認に向けて 多大な努力がなされてきた。トリコストロンギラス・コルブリフォルミス（Ｔｒ ｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｍｂｒｉｒｏｒｓｉｓ）の第三期幼虫 から抽出されたデスオキシコール酸ナトリウムに溶解する４１キロダルトン、ト ロンボミオシン−分子様体は、免疫処理後のモルモットにおいて４３ないし５１ ％の予防率を発揮することが示されている（オダネル、ディニーン、ウェイグラ ンド、レト、ワークマイスター・アンド・ワード、１９８９年）、この分子に関 して出願がなされた国際特許出Ｈｗ０８９１００１６３号では、ヒツジ及びその 他の一乳動物も、この４１キロダルトンの分子によって免疫処理されたときには 、寄生回虫の侵入から保護され得るという請求がなされている。最近の報告では 、脱皮した前記トリコストロンギラス・コルブリフォルミスの第三期幼虫の９４ キロダルトンの排出−分泌産物がモルモットについて平均４６％の予防レベルを 生ずることが主張されている（オダネル、ディニーン、ウェイグランド、レト、 ドフエイド、グランド・アンド・ワード、１９８９年）。但し、この後出の分子 のヒツジ及びその他の動物の予防能力は知られていない。

ＰＯＴ出！ｆｉ１０８８１００８３５号（マン、Ｅ、Ａ、）では、前記ハエモン カス・コントルクスの腸マイクロビリ（ｉｎｔθ５ｔｉｎａｌ　５ｉｃｒｏｖｉ ｌｌｉ）のプラズマ膜から分離培養された蛋白質の二重線（ＨｌｌｏＤ）が記載 されている。旧１００は、約１１０キロダルトンの分子量を有し、またこの素材 は、動物にＨＩＩＯＤの成分又は旧００Ｄの蛋白質二重線全部を注射したときに 、ハエモンコシスに対して少年を保護すると主張されている。

但しこれらの報告すべてにおいて、各製剤において観察される保護は限界である 。すべての場合において、これらの分子は、当初粗性寄生虫製剤が分析されると きには最も卓越した蛋白質成分であると認められる。その他の寄生虫成分も存在 することは明かであって、これらの成分には、寄生虫製剤の主要成分の一部では ないが、免疫学的耐性が通常の感染によって誘発される場合における自然発生的 な宿主−寄生虫関係において通常観察されるものと同様のほぼ絶対的な保護を提 供する重要な役割を演するものが含まれている。後者の場合には、宿主は一連の 寄生虫蛋白質にさらされている可能性があり、従って、寄生虫が成長及び発達す るに応じて反応する。

従って、罹病性のある動物と比較して抵抗力のある動物の免疫構造にまって個別 に確認される寄生虫抗原を確認する必要性がある。これらの抗原は、予防抗原で あり、ヒツジ、畜生及びその他の家畜における線虫寄生感染に対するワクチンの 基礎を形成するものでなければならない。

よって、効果的な駆虫ワクチンの提供が本発明の目的である。

兄五五！監 本発明は、獣医学希釈剤又はその運搬体とともに、線形動物門、線虫綱、円形線 虫目に属する胃腸内線虫稽から抽出される５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される 約３１キロダルトンの分子量の免疫学上効果的な量の蛋白抗原からなる駆虫用非 生ワクチンの１様式を提供する。

種は、前記オステルタギア・サーカムシンクタ、前記ハエモンカス・コントルク ス及び前記トリコストロンギラス・コルブリフォルミスからなるグループから選 択されることが望ましい。

さらに種は、前記オステルタギア・サーカムシンクタであることが望ましい。

さらに種は、前記オステルタギア・サーカムシンクタの第３幼虫期であることが 望兼しい。

抗原は、前記オステルタギア・サーカムシンクタの排出、分泌又は代謝産物であ ることが望ましい。

さらに、抗原は、前記オステルタギア・サーカムシンクタの細胞内、体細胞及び 展性抽出物であることが望ましい。

実施例では、抗原は、アルキル・フェノール・エトキシレート、特にイソ−オク チルフェノール・エトキシレートである。

さらに、抗原は、六炭糖のフェノール／硫酸評価分析によって測定される５ない し１５％の糖成分を含むことが望ましい。

さらに、糖成分は、ＧＧ−質量分光測光法によって測定されるイノシトール、マ ンノース、ガラクｉ・−ス及びヘキソースアミンがら構成されることが望ましい 。

さらに、ワクチンは、アジュバント、特にサポニンから構成されることが望まし い。

選択的な様式において、本発明は、上記のワクチンの効果的な投与量を投薬し、 これによって免疫反応を引き出すことによって線虫寄生の発生に対する反婁動物 の治療方法を提供する。

反椙動物はヒツジであることが望ましい。本発明のワクチンは、反婁動物におい て最も高い経済的価値を有するが、その他の咄乳動物においても有用である。

前記ワクチンの少投与量の投薬からなる手段が望ましい。

投与レベルは、前記抗原又はその個別成分の４００μｇを下回るレベルが望まし い。

本発明に町る多くの異なった分子から構成される蛋白質抗ぶの分子量は、約３１ キロダルトンである。分子量の好適な測定方法は、１０％の硫酸ナトリウム・ド デシル（ＳＤＳ）と混合されたポリアクリルアミド・ゲルを使用するラエムリ（ １９７０年）の方法である。この技術は、±１０００ダルトンの一貫した結果を 提供することが判明しているが、分子量が２０００ダルトン以上の変化を示す可 能性があることが理解されるべきである。ゲル分別研究において、蛋白質抗原が 蛋白質の二重線であり得るとの証拠がある。蛋白質抗原の用語は、広範囲に使用 されており、かかる用語は、ゲル分別の成分として糖蛋白質を含む。

本発明の蛋白質抗原は、約３１キロダルトンの同様の分子量を有する蛋白質の混 合物によって構成されていると考えられている。かがる蛋白質は、二次元的５Ｄ Ｓ−ポリアクリルイミド・ゲル電気泳動によって異なった外見ｐ１値を有する少 なくとも１０個の成分に分別できる。

本発明によるワクチンは、非経口的手段又は経口的手段によって投薬できる。

さらに、ワクチンは、前記オステルタギア・サーカムシンクタ、前記ハエモンヵ ス・コントルクス、トリコストロンギラス・コルブリフォルミス及びその他の線 虫橿から構成されるグループから得られる分子に町って構成されることが望まし い。前記蛋白質抗原に関連しないその他の分子も、反餐動物における予防免疫反 応を誘発でき、またこのようなその他の分子と蛋白質抗原又はその成分からなる カフテール・ワクチンも有効なワクチンとなり得る見込みがある。

本発明は、実施例においてさらに説明される。

区亘Ω！皇旦且」 添付される図面は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノプロット（ｉｍｌｕｎｏｂｌｏ ｔ）プロファイルの複製（図１ないし５及び８）、免疫染色がなされた駆虫部分 の顕微鏡写真（図６及び７）、ヒツジのＥＬＩＳＡ抗体反応（図９）及び免疫ヒ ツジと対照ヒツジとの間の糞中の非排出の比較（図１．０）である。

図１は、前記オステルタギア・サーカムシンクタの第三期感染幼虫及び成虫のト ライトンＸ−１００超音波処理物の蛋白質及び抗原プロファイルを表している。

蛋白質プロファイル（レーンＡ及びＣ）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にクーマシ ー・ブリラント・ブルー（Ｃｏｏ＊ａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌａｎｔ　Ｂｌｕｅ） の染色によって現れている。抗原プロファイル（レーンＢ及びＤ）は、イムノプ ロット技術（材料及び手段の項参照）によって前記オステルタギア・サーカムシ ンクタの感染を受けたヒツジから集めた血清を使用して表されている。左余白の 数字は、千単位で表示された分子量基準である。

図２は、実験的に感染させた抵抗力のあるヒツジ（レーンＡ及びＢ）、感染した 罹病性のあるヒツジ（レーンＣ及びＤ）及び感染していない駆虫のついていない ヒツジ（レーンＥ及びＦ）からの血清を使用した前記オステルタギア・サーカム シンクタの第三期（レーンＢ、　Ｄ及びＦ）及び成虫（レーンＡ、Ｃ及びＥ）か らのトライトンＸ−１００超音波処理物における抗原のイムノプロット識別を表 している。抵抗力のめるヒツジからの血清によって現れた第三期幼虫抽出物から の強く斑点のついた３　１　ｋＤａ分子（矢印）に留意されたい。左余白の数字 は、千単位で表示された分子量基準である。

図３は、クーマシー・ブリラント・ブルーで染色した後の、１０％（レーンＡ） 及び１５％（レーンＢ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける前記オステルタギア°サ ーカムシンクタ第三期幼虫の３１キロダルトン（ｋＤａ）蛋白質抗原（ＯＣ３１ ）のプロファイルを表している６　１５％ゲルでの分離後のこの蛋白質の二重線 の外観に留意されたい。蛋白質の二重線は、特異性０Ｃ３１ウサギ抗血清（レー ンＣ）を使用したイムノプロットによって現れる非常に密接に結合する抗原性帯 からなる。分子基準は、（ｋＤａ）で示されている。

図４は、イムノプロ・ント技術によって検出される実験的な感染後の抵抗力のあ るヒツジにおける３　１　ｋＤａ蛋白質抗原（ＯＣ３１，）に対する抗体の出現 を表している。

図５は、イムノプロット技術によって検出される前記オステルタギア・サーカム シンクタ第三期幼虫のトライトンＸ−１００抽出物における０Ｃ３１分子の抗原 性における蛋白質分解酵素Ｋ又は過ヨウ素酸塩酸化処理の効果を表している。各 処置の左側のレーンは、それぞれの処置を行わない場合の抽出物である。

図６は、間接的な蛍光による抗体染色技術を使用した蛋白質抗原ＯＣ３１の局在 を表している。前記オステルタギア・サーカムシンクタの第三期幼虫の横径部分 は、０Ｃ３１に対して特異性ウサギ抗血清に反応し、超過した抗体を除去するた めにこれを洗浄し、その後に反応は、フルオレスセインと結合した抗ウサギ免疫 グロブリン抗血清に−って検出される。イメージは、共焦イメージング・システ ムによるレーザー走査顕微鏡を使用して得られたものである。フルオレスセイン の中間的な位置に注目されたい。目盛りは３μｍである。

図７は、免疫電子顕微鏡写真を使用した、蛋白質抗原ＯＣ３１の局在を表してい る。

ａ、０Ｃ３１特異性ウサギ抗血清及び蛋白質Ａゴールド・ラベル共役によって反 応した蔚咽頭部分からとった第三期オステルタギア・サーカムシンクタの横径部 分。食道の三放線のルーメン及び濃く染色された分泌器官に注目されたい。目盛 りは３μｍである。

ｂ、　濃く染色された分泌小器官（矢印）１個の高倍率拡大図。目盛りは３μｍ である。

図８は、前記トリコストロンギラス・コルブリフォルミス（レーンＢ）及び前記 ハエモンカス・コントルクス（レーンＣ）の第三期幼虫のトライトンＸ−１００ 抽出物に存在するが、トクソカラ・カニメ（Ｔｏｘｏｃａｒａ　ｃａｎｉｓ）　 （レーンＤ）の第二期幼虫には存在しない、第三期オステルタギア・サーカムシ ンクタ（レーンＡ）の優勢な３１ｋＤａ分子ＯＣ３１（矢印）を示した、抵抗力 のあるヒツジ血清において探査され、かつ蛋白質Ｑｉ２５Ｊ（アマ−ジャム）を 使用して発育したイムノプロットの自発放射能写真を表している。

図９は、免疫ヒツジと対照ヒツジとの間のＥＬＩ　ＳＡ抗体反応を表している。

図１０は、免疫ヒツジと対照ヒツジとの間の糞中の線虫卵排出量を表してし）る 。

扛粁及ｌ工ｎ ａ、ＩＦ生虫素材 この研究に使用される前記オステルタギアーサーカムシンクタ菌株は、１９８４ 年からハミルトン所在のリージョナル・ベテリナリー・ラボラトリ−（Ｒｅｇｉ ｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において保管されて いたものである。これは、ウェスタン・ビクトリアで飼育された、自然感染を受 けたヒツジから取得したものである。生きた約６００匹の前記オステルタギア・ サーカムシンクタ雌雄成虫が剖検でこのヒツジから回収され、手術によって駆虫 のなｔ）状態のヒツジの皺胃に移植された。寄生虫のライフサイクルは、４か月 毎に駆虫のいない子羊による新鮮な伝染性幼虫（Ｌ３）の連続的な継代接種によ って維持された。寄生虫素材の生産に使用された子羊すべては、高架のワイヤー 底の檻を使用した駆虫のいない環境の室内で誕生し、かつ飼育されたものである 。子羊は、生後３−６か月の時点で食道挿管法によって、前記オステルタギア・ サーカムシンクタＬ３の感染を受けている。線虫卵の生産において、雄子羊は、 −日おきに約５０，０００個のＬ３の投与を３回行って感染している。プレパテ ントの期間（ｐｒｅ−ｐａｔｅｎｔ　ｐｅｒｉｏｄ）後の線虫非回収のために糞 が回収された。、Ｌ３は、卵の前止及び約１０日間における試験管内での幼虫の 培養後に取得されてたものである（デンハム、１９６９年）。前記オステルタギ ア・サーカムシンクタ成虫は、感染の約１０日後に剖検されたこれらの動物の粘 ｊｌｌＩ掻爬から回収されたものである。第四期（Ｌ４）及び第五期（Ｌ５）の 幼虫は、前記オステルタギア・サーカムシンクタＬ３約６００．０ＣＩＯ個の投 与を１回行って感染し、感染のそれぞれ５ないし１０日後、及び１５ないし２０ 日後に剖検された雌少年の皺胃消化物から得られたものである（バーリック、１ ９５６年）。

ｈ、　抗原の抽出 抽出緩衝剤は、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、フェニルメチルスルファニル弗化物 （シグマ、アメリカ合衆国）２ｍＭ、ＥＤＴＡ（シグマ、アメリカ合衆国）１、 ｍＭ、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルチチルクロローメチル°ケトン（シ グマ、アメリカ合衆国）５０μｇ　／　ｍ　ｌ及び２−ｐ−トシル−し−リジン ・クロロメチル・ケトン（シグマ、アメリカ合衆国）２５μｓ／ｍｌ（クラーク 、フィリップ・アンド・パークハウス、１９８２年、シンプソン、ジエームズ・ アンド・シャー、１９８３年）を含むｐＨ８，０のトリス−塩酸１０ｍＭであっ た。界面活性剤は、以下の濃度で個別に加えられた。双性イオンーエンピゲン（ Ｅｗｐｉｇｅｎ）　Ｂ　Ｂ　−Ａ　Ｕ　（１％　ｖ／ｖ）　（アルフライト・ア ンド・ウィルソン、オーストラリア）及び３−３−コラミドプロピル−ジメチル アンモニア−１−プロパン−スルフォネート（ＣＨＡ　Ｐ　Ｓ　）　（０，２５ ％　ｗ／ｖ）　（シグマ、アメリカ合衆国）：陰イオン−デスオキシコレート・ ナトリウム（１％　ｗ／ｖ）（シグマ、アメリカ合衆国）、Ｎ−ラウロイルサル コシン（１％　Ｗ／Ｖ）（シグマ・　アメリカ合衆国）及び硫酸ドデシル・ナト リウム（ＳＤＳ）（１％　ｖ／ｖ）　（Ｂ　Ｄ　Ｈケミカルズ、英国）；陽イオ ン−臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）（０，５Ｗ／Ｖ）（シグマ 、アメリカ合衆国）、並びに非イオン−トライトンＸ−１００（１％Ｖ／Ｖ）　 （イソ−オクチルフェノールエトキシレート［１０ユニ・ント１）〔トライトン は、ローム°アンド・八−ス・カンパニーの商標である１（ボーリンガ−・マン ハイム、西ドイツ）及びノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０（０，２０％　 ｖ／ｖ）（シグマ、アメリカ合衆国）（ブリッチャード、クロウフォード、デユ ース・アンド・ペンテ、１９８５年）。幼虫（１０，０００）又は蝙虫成虫（１ ００）は、ｐＨ７，４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＭで３回洗浄し 、適切な界面活性剤が含まれている抽出緩衝剤０．５ｍｌを加える。前記オステ ルタギア・サーカムシンクタの対照超音波処理物には、界面活性剤を含めない。

部分標本を顕微鏡で横歪したときに４０％を超える駆虫が破壊された場合には、 ２１μｍの較差で、それぞれ３０秒間摂氏４度の温度で１０ないし１５回サンプ ルを超音波処理した。その後超音波処理物を、摂氏４にの温度で１晩放置し、３ ０秒間渦動し、また１０．０００ｇで３分間遠心分離する。それぞれの上澄みの 蛋白質容量が、基準として牛血清蛋白素（ＢＳＡ）を使用したブラッドフォード の手段（１９７６年）によって決定された。

Ｃ９ゲル電気泳動及びイムノプロット工程蛋白質容量（２５μｇ／ウェル）にお いて標準化されたサンプルは、ラエムリ（１９７０年）の不連続緩衝システムを 使用して、１．５ｍｍ、１０％（又は１５％）ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において電気泳動させた。８０ｍＡの一定の電流での３． ５時間の電気泳動の後、ゲルは、６８：２５ニアの割合の水：イソプロピルアル コール：酢酸（Ｖ／Ｖ）中で０．２５％クーマシー・ブリラント・ブルーＲ−２ ５０（ＢＤＨケミカルズ、英国）によって染色されるか、又はトウビン、ステー ヒリン・アンド・ゴートン（１９７９年）の緩衝剤（ｌ／２に希釈されている） を使用して６０ボルトで３時間トランス−プロット・セル（パイオーラド・ラボ ラトリーズ、アメリカ合衆国）中で０．４５％ｍニトロセルロース膜（シュレイ バー及びジュール、西トイ゛ソ）（こおいて電気プロ・ントを受けている。その 後に、ニトロセルロース族は、最初に、２０分間、トリス＊＊生理食塩水中でト つイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０）　（シグマ、アメリカ合衆国）（バッチイ ガ−、ニューホール・アンド・ジ′ヨーンズ、１９８２年）０．０５％を含む５ ％のスキム・ミルクでブロックすることによって免疫染色されている。ヒツジの 血清、抗体親和的に精製されたウサギの抗ヒツジ免疫グロブリン（カークガード ・アンド・ベリー・ラボラトリーズ・インク、アメリカ合衆国）及び過酸化酵素 結合したウサギの抗ヒツジ免疫グロブリン（パイオーラド・ラボラトリーズ、ア メリカ合衆国）は、ブロッキング緩衝剤中で適切に希釈され、かつ連続的に摂氏 ３７度の温度で２時間プロットによって培養される。プロットは各培養後、ブロ ッキングミＳ剤を１０分ごとに４回交換して洗浄され、４−クロロ−１−ナフト ール（シグマ、アメリカ合衆国）によって発現される（ホークス、ナイデイ・ア ンド・ゴートン、１９８２年）。必要な場合には、プロットは、過ヨウ素酸１０ ｍＭ（ＢＤＨケミカルズ、英国）（ウッドワード、ヤング・アンド・ブラツドグ ・ンド、１９８５年）又はＰＢＳ中に１００μｓ　／　ｍの濃度のトリチラチウ ム・アルブン（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕ寵ａｌｂｕ■）蛋白質分解酵素ｋ（蛋白 質分解酵素タイプ　ＸＩ、シグマ、アメリカ合衆国）のいずれかで、ブロック段 階の前に摂氏３７度の温度で２４時間処理される。

二次元的電気泳動は、オファレル（１９７５年）の手段で実行された。第一次元 において、ｐＨ５ないし７及びｐＨ７ないし９の両性電解質の１対１の混合物を 使用して、ガラス管内で等電点電気泳動が実行された（ファーマシ乙つツブサラ 、スウェーデン）。１３％アクリルアミド・スラブ・ゲルを使用した５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥが第二次元について使用暴れた。ゲルは、５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール及 び１０％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．０５％ｖ／ｖクーマシー・ブルーＲ２５０にお いて２００分間置及び定着がなされ、５％メタノール及び７％酢酸で脱色され、 その後に放射能写真撮影前に真空状態で乾燥された。

ｄ、　ゲルの銀染色 ときには、電気泳動ゲルを、モリセー（１９８１年）の手段で銀染色した。簡単 に説明すると、ゲルを、Ｈ２Ｏ中で濯し、メタノール５０％（酢酸１０％固定剤 ）に３分間置く。メタノール５冗／＃酸７％溶液に５分間浸した後に、ゲルを、 １０％グルタルアルデヒドで３０分間処理する。Ｈ２Ｏでさらに洗浄した（３０ 分間）後に、ゲルを、新鮮な０．１％ＡｇＮ０ｓＪ液に３０分間浸し、その後に Ｈ２Ｏで１回、また現偉溶４（３％Ｎａ２ＣＯｇ、０，０５％ホルマリン）で２ 回濯する。その後にゲルを、必要な染色強度が得られるまで現像溶液で染色する 。反応停止は、クエン酸（現像８Ｉｌｏｏｍｌあたり５ｍ１）を２．３Ｍ加える ことによって行った。

ｅ、　オステルタギア・サーカムシンクタ蛋白質抗原０Ｃ３１の精製蛋白質抗原 ０Ｃ３１は、１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での予備的電気泳動によって精製さ れた。簡単に説明すると、幼虫溶解質を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した 。蛋白質抗原０Ｃ３１を含むゲル帯が摘出され、室温で１０時間ＰＰＢＳ中おい て培養することによって、蛋白質を抽出した。蛋白質含量及び３１　ｋＤａ抽出 物の純度は、別の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で再び電気泳動された後にクーマシー ・ブルー及び銀染色することによって評価した。

ｒ、　ヒツジ血清 前記オステルタギアーサーカムシンクタによって単一細菌感染したヒツジからの 血清は、前記のように前記オステルタギア・サーカムシンクタに対して抵抗力の あるもの又は罹病性のあるものとして特別に飼育された２２頭から回収されたも のである（リフキン・アンド・ヤン、１９８４年）。簡単に説明すると、これら の動物は、蝙虫のない状態で室内で誕生し、かつ飼育され、生後６か月の時点で 、試験管中の顕微鏡的全血培養テスト（リフキン・アンド・ヤン、１９８４年） における粗製Ｌ３オステルタギア・サーカムシンクタ抗原製剤に対するリンパ球 胚子発生反応について評価分析を受ける。その後にこれらの動物は、合計６０， ０００個のＬ３　オステルタギア・サーカムシンクタの感染を受けた。線虫卵排 出量が感染の３−ｓ間抜から測定され、成虫体合計を、感染の１０週間後の死後 に回収した。２２頭のヒツジのうち１１頭が、高リンパ球胚子発生率（Ｓ、１． ＞２．０１、低平均卵数（糞１ｇ当たり卵数＞２００）及び低酸虫体合計（＞３ ０Ｃ）を有していたことに２つ「抵抗力がある」ものとして指定された。「罹病 性がある」ものとして指定された残りの１１頭のヒツジは、低リンパ球胚子発生 率（Ｓ、１．＞１．２）、高平均卵１１ｉ（ｊ［１μ当たり卵数＞　１，５００ ）及び高酸虫体合計（＞１，０００）を有していた（ヤン・アンド・リフキン、 １９８６年）。陰対照物において、蛎虫のない感染していない生後６か月のヒツ ジ９頭から血清を取得し、かつ集めた。血液サンプルすべては、シリコン皮膜バ キュテーナー・チューブ（ベクトン・デイキンソン、アメリカ合衆国）において 回収され、凝塊からの分離後に、血清を摂氏２０度の温度で貯蔵した。

ｇ、ＦＰＬＣプロファイリング 精製された蛋白質抗原０Ｃ３１、約３００ｍｇを、トリス１００ｍＭ（ｐＨ８゜ ０）中で、１％ｖ／ｖ　ＳＤＳ、ＤＴＴＩ　ＯｍＭが介在する中で６００分間置 ５８度まで還元される。周囲温度まで冷却した時点で、ヨードアセトアミドを最 終的な濃度が２２ｍＭになるまで加え、かつカルボキシアミドメチル化を室温で １５分間続けた。１ないし２％（ｗ／ｗ）まで蛋白酵素を加え、混合物を、アセ トン体積１０中で摂氏−２０度の温度で（１８時間）沈澱した（アリスター、Ｂ ＤＨ）。球形になった素材は、酸−エタノールを２回交換して洗浄し、またエタ ノールで１回洗浄する。球粒は空気乾燥して、かつ適切な緩衝剤で溶解する。ト リプシン消化物の場合には、ＣＯ３１球粒は、１％ｖ／ｖ　トリメチルアミン（ ｐＨ８，０）２００μｍで溶解し、さらに７μｇのトリプシン（ウオーシントン 、フリーホールド、アメリカ合衆国）を加える。消化が摂氏３７度の温度で１夜 中に生ずる。キモトリプシン消化物は、０．１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯｓｐＨ７，８（ ＣＯ２）２００μ及びキモトリプシン１０μｇ（ウオーシントン）を加えること によって調合され、蛋白質分解を摂氏３７度の温度で４時間にわたって行った。

消化停止は、摂氏−２０度で貯槽に町って行った。

続いて生ずるペプチドは、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア）が主張した有機／ 水性勾配を使用して、逆相クロマトグラフィーによって分離した。完全な消化物 は、主として４６分間適用されるｐＨ４，０のアンモニウム蟻酸塩（Ｃ０２）１ ５ないし２０ｍＭにおける０−９２，５％ｖ／ｖアセトニトリル（ＡｃＮ）勾配 によって、Ｐｒｏ　ＰＲＣ：　５／１０　ＣＩ／ｃ８逆相カラム（ファーマシア ）上で溶解した。

溶出は２１４μｍで測定された。

ｈ、　免疫蛍光ラベリング Ｌ３　オステルタギア・サーカムシンクタの厚さ５ないし１０νｍの低温槽部分 を、アルコール洗浄されたスライド上に封入し、かつアセトンに５分間浸すこと によって固着した。摂氏３７度の温度で５分間乾燥した後に、この部分を、湿度 調節がなされた箱の中で、摂氏３７度の温度で１時間、ウサギの抗０Ｃ３１抗血 清５０μｌで培養した。この部分は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）で ３回洗浄し、１／１０に希釈された蛍光抗ウサギ免疫グロブリン（ウェルカムＰ ／Ｌ、ベラケンハム）５０μｍで、摂氏３７度の温度で３０分間培養し、レーザ ーシャープＩＺ　Ｒ，Ｃ−５００スキャニング・マイクロスコープ（バイオ・ラ ド・ラボラトリーズ・ビティワイ・リミテッド、オックスフォードシアー、英国 ）による検査のためにＰＢＳ−グリセロール（１対９）に封入する前に、ＰＢＳ で再び洗浄した。

ｉ、　免疫電子顕微鏡検査 Ｌ３　オステルタギア・サーカムシンクタは、２％バラホルムアルテヒド及び０ ．５％グルダルアルデヒドにおいて固着し、連続的なアルコール濃度（３０，５ ０，７５，９５及び１００％）で脱水しく３ないし５分間）、かつＬＲホワイト 脂削（ティムズ、１９８６年）で浸潤した（室温で２時間）。切片（６０％ｍ） は、回転性超薄切片法（レイシャートーニング、オーストラリア）によってダイ アモンド刀で切断されており、標本は、フオームバー膜の金（４００メツシユ） グリッド（バイオ・ラド・ラボラトリーズ・ビーティワイ・リミテッド、オック スフォードシアー）上に拾い上げられる。切片は、室温で、３０％ｍにつき、ウ サギの抗０Ｃ３１抗血清（１１５希釈液）で培養し、洗浄し、その後に再び金ラ ベル蛋白質Ａ（シグマ・ケミカル・カンパニー、アメリカ合衆国）５ｎｍの１／ ２０希釈液で５分間培養し、その後にＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒドで １０分間、飽和した水溶性酢酸ウラニルで５分間、また最後にクエン酸鉛によっ て３分間連続的に処理する。そして、切片を、１．２ＭＮａＯＨ及び水で洗浄し 、乾燥し、かつ電子ｇＪ微鏡で検査する（ジョエルＪＥＭ　１００５、日本国） 。

結−一一里 った　に　っ　た　口・・ 抽出緩衝剤へ界面活性剤を添加した結果、通常、界面活性剤なしで抽出された超 音波処理物と比してＬ３及び成虫の前記オステルタギア・サーカムシンクタから の蛋白質の収量は高い（表１）。Ｌ４（ｐ＜０．０１）及び成虫（ｐ＜０．０２ ５＞からの同一の抽出条件のもとて最も高い蛋白質収量を示した界面活性剤は、 トライトンＸ−１００であった。同様に、ＣＨＡＰ、Ｎ−ラウロイルサルコシン 及びＣＴＡＢによるＬ３及び成虫の前記オステルタギア・サーカムシンクタの超 音波処理物からの蛋白質の抽出も、トライトンＸ−１００を下回る効果を示した （データは示されていない）ａ前記オステルタギア・サーカムシンクタのＬ３（ 図１、レーンＡ）及び成虫（図１、レーンＣ）のトライトンＸ−１００超音波処 理物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、寄生虫のこれらの二通りのライフサイク ル段階において蛋白質プロファイルのいくつかの差異が発見された。しかしなが ら、感染ヒツジの前記オステルタギア・サーカムシンクタから集めた血清を使用 したイムノプロット分析によって、Ｌ３（図１、レーンＢ）において認識される 抗原が成虫（図１、レーンＤ）の抽出物において認識される抗原を上回ることが 発見された。

「　′　の　ヒツジか　の　に　って　れて免疫学及び寄生生学の両方のパラメ ーターから本寄生虫に対して抵抗力を有すると確認されているヒツジの血清によ って区別されて確認される前記オステルタギア・サーカムシンクタ抗ぶが存在す るか否かを決定するために、Ｌ３　オステルタギア・サーカムシンクタのトライ トンＸ−１００抽出物中の抗原が、抵抗力のあるヒツジ１１頭及び罹病性のある ヒツジ１１頭からの血清によって探査された。

Ｌ３抽出物からの３１キロダルトン（ｋＤａ）の主要な抗原性帯が、抵抗力のあ るヒツジの１１の血清のうち８個における抗体によって確認された（図２、レー ンｂ）。

Ｓ染抜数回出血している、実験的に感染を受けた抵抗力のある動物において、３ １　ｋＤａ抗厚帯に対する抗体は、早くて感染の３２日後に血清中に出現し、か つ少なくとも感染の７０日後兼で生存した（図３）。他方、罹病性のあるヒツジ の１１の血清のうちこの抗原帯に反応したのは２個だけであり、反応の強度はは るかに弱く、また抵抗力のあるヒツジの血清と比べて、感染の７０日後の死後も こ動物力蔦ら取得した血清によって検出された（図２、レーンＤ）。この３１　 ｋＤａＦＡ原帯は、駆虫のない感染していないヒツジから集めた血清には反応し なかったく図２、レーンＦ）。

表」一 様々な界面活性剤を使用して抽出した 前記オステルタギア・サーカムシンクタからの蛋白質収量界面活性剤　感染を受 けた幼虫　成　虫（ｕｇ／ｕｌ）　（ｕｇ／ｕｌ） トライトンＸ−１０００，５７＋、　０．１６’　０．６９　±０．２］ｌエン ビゲンＢＢ−ＡＵ　０．２２±０．１７　０．４９±０．１５デスオキシコレー ト・ナトリウム　０．１８±０．２５　０．１６±０．１９ノニデツト　Ｐ−４ ００，４０±０．１２　０．４９±０．２１ＳＤＳ　Ｏ，１０±０．１１　０． ６０±０．１６界面活性剤なし　０．１】±０．０７　０．０９±０．１２２値 ＋　＞０．０１　＞０．０２５ ＊は、７回の実験からのデータの±標準偏差を意味する。

上は、４回の実験からのデータの士標準偏差を意味する。

十　平方平均の分析を使用して統計的分析を行った。

ユニ瓦ｍｌん先住ユニ １０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける３　１　ｋＤａ抗原素材は、非常に広し）帯状 であり、また時折特定の実験において密接に結合した二１ｌＩｌの形状を有する 。この素材の二重奇形横様の確認は、１５％アクリルアミドを含む溶解度の高ｕ ）Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　ＡＧＥゲルにおいて幼虫抽出物を分離し、かつ分離した蛋 白質をクーマシー°ブルーで染色するか又は上帯及び下帯におけるニトロセルロ ース膜上で電子プロットした後にヒツジの抗血清によって蛋白質を探査すること によって得られた（ｒ：Ｍ４）。

還元し、かつＳ−カルボキシルメチル化した蛋白質のトリブチイック消化物のＦ ＰＬＣプロファイルは、２個の帯が密接に関連していることを確認するものであ る。

蛋白質の二重線である０Ｃ３１は、炭水化物の銀染料（これは、糖蛋白質である ことが望ましい）によって容品に染色できる。但し、０Ｃ３１の糖容量は、六炭 糖におけるフェノール／硫酸評価分析によって示される分子複合体合計の５なし １し１５％にすぎない。ＧＣ質量の分光測光法による分析によって、炭水化物成 分中のイノシトール、マンノース、ガラクトース及びヘキソースアミン残基の存 在が確認された。さらに、ボーリンガ−のグリカーゼ（ｇ　Ｉｙｃａｎ）検出キ ット（ボーリンガ−・マンハイム、西ドイツ）によって、グリカーゼ検出キット がイムノプロットにおいて使用されたときに、グリカーゼの存在が発見された。

蛋白質分解酵素Ｋ及び過ヨウ素酸塩酸化処置のいずれも、ペプチドによって通常 与えられるもの以外のエビトドピック（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）構造の存在を示唆す る０Ｃ３１の免疫学的活動を破壊するものではなかった（図５）。

Ｌ３製剤における検出とは別に、蛋白質二重線ＯＣ３１抗原は、前記オステルタ ギア・サーカムシンクタのＬ４、Ｌ５及び成虫のトライトンＸ−１００超音波処 理物においては発見されていない（図２、レーンＡ）。

前記オステルタギア・サーカムシンクタの感染を受けたヒツジの血清によって探 査されたＬ３　オステルタギア・サーカムシンクタの抽出物は、前記オステルタ ギア°サーカムシンクタの成虫のものよりもより免疫反応が高ム１（図１）。こ れらの発見とは対照的に、メイラエル、メージ・アンド・オグリビー（１９８， ３年）は、幼虫段階と比較して、ニボストロンギラス・ブチシリエンシス（Ｎｉ ｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）成虫が、免疫血清に よって確認される最も多量の抗原を有していると報告している。パークハウス・ アンド・クラーク（１９８３年）も、Ｌ３において主要な抗原のいくつかを、ま た多くの抗原をＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓの免疫沈澱物に発見 している。従って、線虫によって引き出される優勢抗体反応が段階特異的であり 、また最も免疫的な８階は線虫によって興なるように思われる。

ユΩユ上立亙五 蛋白質抗原０Ｃ３Ｌの内部分布は、ウサギの抗０Ｃ３１抗体及び蛍光抗ウサギ免 疫グロブリンによって免疫染色されたＬ３　オステルタギア・サーカムシンクタ の低温槽部分において観察された。内皮及び皮下層の両方が非蛍光部であり、容 易に見ることができた（図６）。蛍光の原因である構造をさらに定義するために 、Ｌ３　オステルタギア・サーカムシンクタの連続的な部分を、免疫染色後に電 子顕微鏡で検査した。電子緻密金粒子の特異沈着が、幼虫の前咽頭部分から採集 された横縁部分の「分泌器官」においてみられた（図７）。普通のウサギの血清 にさらされていたし３　前記オステルタギア・サーカムシンクタのこれに類する 部分においては、金粒子は検出されなかった。

分泌器官に対する免疫金ラベルの内部的な位置は、特異性の高いものであり、か つ繁殖可能なものである。０Ｃ３１の生物的な機能は知られていないが、食道腸 における分泌器官は、食道の口径を通じて排出を行うと考えられる（リー、１９ ６８年、１９７０年）。分泌器官における０Ｃ３１の位置測定によってさらに、 これらの分子が幼虫によって排出／分泌され得ると示唆される。Ｌ３　オステル タギア・サーカムシンクタの代謝ラベリング及び排出／分泌材料の免疫沈澱分析 によって、０Ｃ３１がおそらく排出／分泌産物であろうとの証拠が提供された。

生きた蝙虫によって分泌されるその他の低分子量の抗原について記述がある（ラ イトオウラーズ・アンド・リカルド、１９８８年）。

αΩ旦土ｎ厘ゑ崖 蛋白質抗原０Ｃ３１がＬ３　オステルタギア・サーカムシンクタ独特のものであ るか否かを決定するために、その他の線虫種の感染幼虫段階のトライトンＸ−１ ００抽出物が前記オステルタギア・サーカムシンクタにまる感染を受けた抵抗力 のあるヒツジの血清で探査された。図８は、抵抗力のあるヒツジの血清によって 探査され、かつ蛋白質ＧＩ２ＳＪ（アマーシマム）を使用して発育されたイムノ プロットの放射能写真であり、優勢な３１　ｋＤａ帯が前記トリコストロンギラ ス・コルブリフォルミス（レーンＢ）及び前記ハエモンカス・コントルクス（レ ーンＣ）の第三期幼虫のトライトンＸ−１００抽出物に存在するが、前記トクソ カラ・カニメの第二期幼虫（レーンＤ）においてはっきりと示されていない、第 三期オステルタギア°サーカムシンクタ（レーンＡ）の分子群（矢印）であるこ とを示している。

０Ｃ３１抗原（図８、レーンＡ）は、前記トリコストロンギラス・コルブリフォ ルミス（図８、レーンＢ）及び前記ハエモンカス・コントルタス（図８、レーン Ｃ）の感染性幼虫の抽出物に存在するが、前記トクソカラ・カニメ（図８、レー ンＤ）には存在しないことが判明した。特異性のあるウサギの抗０Ｃ３１血清に おいても同様の結果が得られた。寄生線虫の特定の種に誹る特定の免疫反応の刺 激がその他の線虫種による感染から宿主を保護し得ることが立証されている。例 えば、ブランチヤード・アンド・ウェスコツト（１９８５年）は、前記オステル タギア・サーカムシンクタによる事前感染が少年の前記ハエモンカス・コントル クス感染に対する抵抗性を向上することを最近になって示している。これらの所 見が非特異構造の刺激によるとすることが可能である一方、０Ｃ３１は、ヒツジ のその他の胃腸線虫種に対する予防免疫反応に関与する重要な交叉反応又は共通 性を有する抗原であると言っても良い。ミルナー、ビール・アンド・オーワット （１９８７年）は、前記トリコストロンギラス・コルブリフォルミスと前記オス テルタギア・サーカムシンクタの抗原との間には著しい相同関係が有り得ること を指摘し、検出される蛋白質の過半数が各種に町って共有されていると述べてい るが、有意義な比較を行うための特定の抗原を特別に認識していない。

の　ン ａ、実験計画法 誕生時点から駆虫のない環境の室内で飼育された生後６か月の少年１１頭を、蛋 白質抗原０Ｃ３１に対する前免疫ＥＬＩＳＡ力価に基づいてそれぞれ処置群（Ｎ ＝８）及び対照群（Ｎ＝５）に無作偽抽出した。

処理群は、キルＡアジュバント（ハークロス・インターナショナル・ケミカルズ 、オーストラリア）中の精製された蛋白質抗ｆｆ０ｃ３１．１００μｇで、第１ 回の皮下注射を受ける。同一の増強注射を３週間後に、またその後ＩＪ間おきの 開度で２ｉ１Ｎにわたって行う。各免疫及び増強注射は、ｐＨ７，４のりン酸Ｉ １１生理食塩水１０ｍＭ中に２５０ｕｇ／ｍｌのキルＡを含み、最終的な容量２ ｍｌとなる０Ｃ３１，１００％ｇからなる。対照動物は、精製されｔ二蛋白質抗 ［０Ｃ３１のみを除いて同一の免疫及び増強注射の養生を受けた。

対照群及び処理群両方は、当初の免疫注射の６週間後（第３回及び最終の増強免 疫から１週間後）から１日おきにＬ３　前記オステルタギア・サーカムシンクタ １４．０００個の投与を３回受けて（１頬当たり幼虫合計的４２．０００個）感 染する。

ｂ、　糞中の卵カウント 糞中の卵カウント（ＦＥＣ）は、ギプソン（１９６５年）が述べた定量浮揚手段 を使用して行われた。簡単に述べると、糞サンプルを毎朝各動物から回収する。

、２．０ｇのサンプルを、１０ｍ１の水と入念に混合し、Ｓ分間放置する。

その後に８０ｍ１になるまで飽和食塩水（ＮａＣｉ　Ｓ、Ｇ、１．２０）を加え る。懸濁液を入念に攪拌し、その後に部分標本をマクマスター卵カウント用スラ イドに移す。

Ｃ０血液サンプルの採集 ヒツジからの血液サンプルを、免疫処理開始前、並びにその後に実験日において 各免疫注射前、また免疫処理の１０週間後における剖検までその後１週間ごとに 採集した。

ｄ、　イムノプロット及び酵素関連免疫吸収剤評価分析（ＥＬＩＳＡ）イムノプ ロット工程は前述の通りである。簡単に述べると、Ｌ３　オステルタギア・サー カムシンクタのトライトンＸ−１００超音波処理物を、ナトリウム・ドデシル・ スルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ラエムｌ）、１９７０年 ）によって溶解し、かつトウビン等＜１９７９年）が述べたように電気泳動によ ってニトロセルロース・ペーパー（シュレウシャー・ジュール、西ドイツ）上に 移動する。ブロック及び洗浄緩衝剤は、トリス緩衝生理食塩水中のトウィーン２ ０（ミズーリー州、シグマ・ケミカル・カンパニー１０．０５％を含む脱脂粉乳 ５％からなり、また４−クロロ−１−ナフトール（ミズーリー州、シグマ・ケミ カル・カンパニー）を使用して色素現像を行った（ホークス等、１９８２年）。

ＥＬＩＳＡは、室温での１時間の培養に町って、ＰＨ９，６、炭酸塩−重炭酸塩 緩衝剤中の精製された０Ｃ３１抗原１０μｓ／ｍ１（０，５ｇｇ／ウェル）でコ ートした平底マイクロタイター（■１ｃｒｏｔｉｔｒｅ）・トレー（イミュンノ ン、ダイナチク・ラボラトリーズ）を使用して行われた。１％の牛血清アルブミ ンを含むｐＨ７，４、ＰＢＳにおいて１対５００に希釈されたヒツジ抗血清（シ グマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリー州）を加えた。２時間にわたる室温で の培養後に、トウィーン２０．０．０５％を含むＰＢＳでトレーを３回洗浄した 。

その後に結合ヒツジ○Ｃ３１抗体がＨＰＲＯと結合したウサギの抗ヒツジ免疫グ ロブリン（キレクガード・アンド・べり−・ラボラトリーズ・インク、アメリカ 合衆国）に反応し、またこれを室温で２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄し、続 いて希釈水で３回洗浄した後に、ＡＢＴＳ色素現像基質を加え（１００ｕｌ／ウ エル）、色素反応が室温で１時間おいた後に現れた。酵素基質反応の産物の吸光 度（ＯＤ）は、自動マイクロＥＬＩＳＡ測定器（モデル：ＭＲ６８０、ダイナチ ク・ラボラトリーズ）で４５０ｎｍと測定された。感染を受けていないヒツジの 血清が、各試験トレーの陰性対照として使用された。

ｅ、　リンパ球胚子発生指数 対照ヒツジ及びワクチン注射を受けたヒツジの精製された０Ｃ３１抗原に対する リンパ球胚子発生反応は、リフキン・アンド・ヤン（１９８４年）が述べた試験 管内顕微鏡的全血リンパ球培養試験において評価分析された。簡単に述べると、 血液サンプル０．２ｍｌを各ヒツジから採集し、直ちに無１１ＨＥＰＥ　Ｓ　（ ２５ｍＭ）を緩衝剤としたＲＰＭＩ　１６４０培養基２．４ｍｌに、４％の熱活 性化された子牛の胎児の血清、１００ｕｎｉｔｓ／驕Ｉペニシリン・ナトリウム 及び１００ｇ／ｍ１ｒｉｔ酸ストレプトマイシンを加えたものに加える。

希釈全血の部分標本０．１　ｍ　ｌを、丸底マイクロテスト・プレー１−（Ａ／ Ｓナンク、ナンシオン、デンマーク）に施与する。糸状物質、抗原及び単純借地 （対照物）２５μｌを３通りのウェルに加えた。プレートをホリブロビレンのテ ープ（ダイナチク）でシールし、マイクロプレート・シェーカーで１５秒間湯合 し、細胞を４日後に収穫するまで摂氏３７度の温度で培養する。各培養基は、収 穫前１６時間にわたって、３　、７　ｋＢｑのトリチウム化されたサイミゾイン （ＲＰＭＩ　１６４０．２５μｌにおいて施与される特定活性度１８５ギガ・ベ クレル）を受ける。その後に培養液を、マルチプル・セル・ハーベスタ−（フロ ー・ラボ）を使用してグラス・ファイバー・フィルター・ペーパー・ディスク上 で混合し、かつ収穫する。赤血球溶解（蒸留水で１５秒間）、漂白（Ｈ２Ｏ２で １０秒間）、脱水（メタノールで１０秒間）及び乾燥（大気中で２０秒間）を行 った後にフィルター・ベーパー・ディスクを摂氏６０度のオーブンで１０ないし １５分間乾燥した。最後に、各ディスクをトルエン基シンチレーシ３ン液２ｍｌ に浸し、液体シンチレーション分光光度計で測定した。

ｆ、　蝙虫合計数カウント 駆虫合計数の計算において、死後に、幽門括約筋の真下にある十二指腸をクラン プで押さえつけた後で皺胃を解剖した。皺胃の大きい方の湾曲にメスを入れて水 平に切開した。内容物をｐＨ７，２のＰＢＳで洗浄し、粘膜掻爬とともに採取し た。混合洗浄剤と掻爬を濃縮し、懸濁液が透明になるまで６００ｍ１スクリユー ・トップ・ジャー（蓋に３１７μｍの篩を挿入する）中で補充及び振動を繰り返 すことによってこれを清浄した。成虫を個別に取り出し、解剖顕微鏡を使用して 計算した。掻爬後の皺胃のペプシン消化を、未成虫の数を決定するために行った 。ペプシン消化は、２％のＭＣＩ及び１．６％のペプシンを含むＰＢＳ（シグマ ・ケミカル・カンパニー、アメリカ合衆国ミズーリー州）中で、摂氏４２度で３ 時間、開票に振動を与えることによって行った。

未成虫は、３８μｍの篩を通じて洗浄することによって皺胃消化物から採取した 。

ｇ、　組織病理学 対照ヒツジ及びワクチン接種ヒツジの皺胃から、ホルマリン固定され、パラフィ ンで封埋された組織を剖検で取得し、ヘマトキシリン及びエオシンｆＨ＆Ｅ）で 染色し、かつ光５ｇ１Ｗ鏡検査によって検査した。

結−−−！ 免詮１辻Ｉと４価 ワクチン接種ヒツジ及び対照ヒツジにおける液素性０Ｃ３１抗体レベルは、実験 過程を通じたＥＬＩＳＡ及びイムノプロット分析によって監視された。細胞仲介 免疫反応は、周辺リンパ球刺激指数を使用して評価分析した。、ｗ生虫感染過程 の評価は、実験開始後２８日目から剖検前日まで毎日真中の卵カウントを監視す ることによって決定した。剖検後に、駆虫合計数カウントを行った。

０Ｃ３１で免疫したヒツジのＥＬＩＳＡＭ体反応が図９に示されている。０Ｃ３ １抗体レベルの向上は、早くてワクチン接種ヒツジへの第１回免疫投与の２週間 後に検出された。対照動物と比較して、０Ｃ３１抗体力価は、ワクチン接種ヒツ ジにおいて着実に上昇し、実験期間中、高いレベルで維持された。実験過程中に ワクチン接種ヒツジがら採取された血清において探査されたイムノプロットは、 第１回補強免疫の４日後に０Ｃ３１抗体の出現を示し、かつ確認した。対照動物 において、実験過程中イムノプロットにおいて検出された０Ｃ３１抗体はなかっ た。

０Ｃ３１抗原による免疫処理は、試験管内全血リンパ球培養評価分析によって検 出されるとおり、顕著かつ特異的な周辺リンパ球の細胞仲介反応を生じた（表２ ）。

感染前免疫プログラム中に増強された反応は、感染後も依然顕著であったが、実 験終了までには次第に減少した。Ｈ＆Ｅ部分の検査によって、対照動物と比較し て、ワクチン接種動物において膨張性陰窩中に幼虫が多く存在し、これらの幼虫 が好酸球によって囲まれていた。ワクチン接種動物からのＨ＆Ｅ部分において、 固有層中のリンパ球及び粘膜下組織中の水腫及び分子層の大きな浸潤が観察され た。

表２− Ｌ３　オステルタギア・サーカムシンクタのタンパク質抗Ｊｊ［０Ｃ３１によっ て免疫されたワクチン接種ヒツジ及び対照ヒツジの細胞仲介反応検査時期　グル ープ井　陽ヒツジ数　ＩＭ：３１抗ｆｆｌ　Ｐ値十による刺激１指数 範　囲　平均値 免疫前　ＣＯ１５０，７５−０，８６０，８０＞０．０５（ＯＥＩ）　Ｖ　Ｏ／ ６　０．６７−０．９９　０．８２感染前　ＣＯ１５０，３５−１，１４０，６ ５（３２日）　Ｖ　５／６　０．９６−９．０４　３．２８　＜０．０］感染後 　Ｃ１１５０，６２−２，７０１，３２（７０日）　Ｖ　４／６　１．４５−６ ．００　３．２５　＜０．０１死後　ＣＯ１５０，３０−０，９７０，７０４７ ７Ｂ）　Ｖ　２／６　０．８４−３．６４　２．０５　＜０．０１＊　陽刺激指 数は、２以上と定義される。

＋　統計的分析は、平方平均の分割（時間毎の動物分割）分析を使用して行った 。

処理は、無作偽抽出的に６頭の動物に配分され、残りの動物は対照物となった。

＃　Ｃ＝対照：Ｖ＋ワクチン接種 １虫茸 免疫ヒツジの糞中の卵排出量は、対照ヒツジのものをはるかに下回るもの（Ｐ＜ ０．０５）であった（図１．０）。同様に、駆虫数合計も、表３に示すとおり、 対照動物からのものまりも免疫動物からのものの方がはるかに少なかったＣＰ＜ ０．００５）。

１旦 死後の時点でのワクチン接種ヒツジ及び対照ヒツジの皺胃中の前記オステルタギ ア・サーカムシンクタ成虫体グループ　自由度井　平均値　範囲　Ｐ値１対　照 ＋　４　６０４７　３８６０−９９００ワクチン　５　２５５５　１１７５−３ ６４７　Ｐ＜０．００５＋　対照ヒツジ１頭についての成虫数は、計算不可能で あった。

＊ｌｏｇ変換のもとであっても、平方平均の正常度及び等質性について必要な仮 定が満足できるものでなかったため、平方平均分析ではなく、ピットマン無作偽 化テストを使用して統計的分析を行った。

＃　自由度 これらの実験は、投薬後の免疫反応が、本発明によるワクチンについて非常に低 いレベルであることを示している。このワクチンがこのように効能がある理由は 知られていないが、活性素材の比較的純粋な分層を使用し、これによってブロッ ク効果を回避した結果ではないがと思われる。

本発明の精神及び目的の範囲内での修正は、当業者によって容易に遂行できるも のであるため、本発明が上記に例示として記載された特定の実ｙ＆態様に限定さ れるものでばないことが理解されるべきである。

Ｌユニ上スス アンダース、Ｒ−Ｆ、　ハワード、Ｒ−Ｊ・アンド・ミツチェル、Ｇ−Ｆ、１９ ８２年６　（ユノロジー・　・パースーイン　・　ン　エ　ションズ（ｂＬ北注 ｕ゛゛）、Ｓ・コーエンーアンド・Ｋ、Ｓ・ワレン、エディターズ、ブラックウ ェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、オ・ンクスフォード、２８ ページ。

バッチイガ−１Ｂ、ニューホール、Ｗ−Ｊ・アンド・ジョーンズ、Ｒ−Ｂ、１９ ８２年。　・イ々ユノ　・　−・ソズ　５ＪＬ（蓮）：２９７ブランチヤード、 Ｊ−Ｌ・アンド・ウニスコツト、Ｒ−８，１９８５年。ムＬ」よΔ社、五１工［ ：２１３６ ブラッドフォード、Ｍ−Ｍ、１９７６年。　・バ　（ムｍｌ」Ｌ匹’ｔｕｕ　１ ２Ｌ）　：　２４８ クラーク、Ｎ−Ｗ−Ｔ、フィリップ、Ｍ・アンド・バークツ＼ウス、Ｒ−￥・Ｅ 、１９８２年。バｌＪ」乙【二止　ｚ立旦（Ｌ立上ＪＬ」２ＪＷ）：　２７デン ハム、Ｄ−Ａ、１９６９年。正立ニルー之二　土旦（、Ｌ」怪シ１１仕り）＝２ ９ギプソン、Ｔ−Ｅ、１９６５年。マニュアル・オ　・ノ（−シ　ロジカＪし・ テ　ニュｕ（”’）。ミニストリー・オブ・アゲＩノカルチャー・フィッシャリ ーズ・アンド・フード・セントラル・ベテｊノナＩノー・ラボラトリ−、ウェイ ブリッジ、イングランドホークス、Ｒ−Ｅ、　ナイディ、Ｅ・アンド・ゴートン 、Ｊ、１９８２年。ヱ±に二匹ヱヱユム　上上旦（紐厄、ｌ血止１ｍ、　ｎ１ｌ ）　’　＋　４２バーリツク、Ｈｌ　１９５６年。　“　、乙Ｌｆｆｌスラエム ン「八　Ｎ−Ｋ、１９７０年。土ヱ土二二　２ｉｌ（雁−ムエ）：６８０リー、 Ｄ−Ｌ、１９６８年。正二エニエ　、Ｌｉ±」己（ム」々ｄ■虹ｕ）’　９リー 、Ｄ−Ｌ、１９７０年。−イシュ−・７ン’・セルｆ＝（’　Ｚ）＝２２５ ライトオウラーズ、Ｍ−Ｗ・アンド・リカルド、Ｍ−Ｄ、１９８８年。二之之上 ＸＬ２Ｓ　１旦（ム」Ｌ肢り社９ｆｌ）：１２３マイツエルズ、Ｒ−Ｍ、メージ 、Ｍ・アンド・オグリビー、Ｂ−Ｍ、１９８３年。

乙ｌ五ｌ旦乏二　生旦（ｈ紅皿す社ｆｆ）１０７ミルナー、Ａ−Ｒ、ビール、Ｊ −Ａ、オーワット、Ａ、１９８７年。匹旦上上二ｍ１Ａｆｌ（’　、Ｑ）＋６１ ５ モリセー、Ｊ−８１１９８１年。アナル・バイオ　ム　１上７　（Ｍｄ」ｈ血聾 １１７）＝３０７ オダネル・Ｉ−Ｊ、ディニーン、Ｊ−Ｋ、ワグランド、Ｂ−Ｍ、レト、Ｓ、ワー クマイスター、Ｊ−Ａ・アンド・ワード、Ｃ−Ｗ、１９８９年。ＬＩＬＬユエム 」社ＪＪｄ−Ｗ　”　９３ オダネル・■・Ｊ、ディニーン、Ｊ−Ｋ、ワグランド、Ｂ−Ｍ、レト、Ｓ、ドフ エイト、Ｔ−Ａ−Ａ、グランド、Ｗ−Ｍ・アンド・ワード、Ｃ−Ｗ、１９８９年 。

、１２　’　７９３ オファレル、Ｐ−Ｈ，１９７１５年。　・バ　・　裏旦豆（ＱＪＬＬｃ山二址Ｉ 。

２ｗ）　：　４００７ パークハウス、Ｒ−間・Ｅ・アンド・クラーク、Ｎ−Ｗ−７，１，９８３年ａ　 −Ｅル・パ　オ　・バージ　ル　旦（、’　、　’　ｊＪ）：３１９ブリッチマ −ド、Ｄ−１、クロウフォード、Ｃ−Ｒ、デユース、ｉＲ・アンド・ベーンケ、 Ｊ−Ｍ、１９８５年。バージ　・イミュル　ユ（’、−１組凹１１）：５７６ リフキン、Ｇ−Ｇ・アンド・ヤン、Ｗ−Ｋ、１９８４年。イミュノジエニツク。

ロー　・　ウ・　・コゝ　ロー　・　・工ゝ　°パー９−　°　イ　°バーーニ ーー・１　ア　ゝ　・　・パーζ＝Ｘ二１に２二１（ム剋凪ｌ■注ｉ−― °　）、Ｊ−Ｋ・ディニーン・アンド・Ｐ−Ｍ・アウターリッジ、Ｐ−Ｍ、エデ ィターズ、オーストラリアン・ウール・コーポレーション・アンドＣ３ｒＲＯデ イビジヨン・オブ・アニマル・ヘルス、オーストラリア、３０ページ シンプソン、Ａ−Ｊ−Ｇ、ジエームズ、Ｓ−Ｌ・アンド・シ〒−１Ａ、１９８３ 年。ム１１山Ｂ４１：５９１ ティムズ、Ｂ−Ｇ、１９８６年。ム、去工廊吐４１１１：２６７トウビン、Ｈ− Ｔ、ステーヘリン、Ｔ・アンド・ゴートン、Ｊ、１９７９年、肚１ｊｌＡ、　ｕ 　：　４３５０ ウツドワード、間・Ｐ、ヤング、Ｗ−Ｗ、ジュニア・アンド・ブラッドグツド、 Ｒ−Ａ、１９８５年。　・　々ユ　・　−・・　：Ｌｆｉ、（７ｆｉ）：１４３ ヤン、Ｗ−Ｋ・アンド・リフキン、Ｇ−Ｇ、１９８８年。　口ゝ−イ゛　・オ　 ・ザ・シラ　スス・イン　−ナショ　し・コン　レス・オ　・バージ　ロジニ（ Ｐ　”　”　）、Ｍ・ Ｊ°ハウエル、エディター、オーストラリアン・アカデミ−・オブ・サイエンス 、キャンベラ、２６２ページ ダラテク・ビーティワイ・リミテッド、弁理士デーピッド・Ｖ・ギプソンによる 、１９９０年７月１７日 ＬＡＲＶＡＥ　ＷＯＲＭＳ ＡＢ　ＣＤ Ｗ （Ｋｄ） ＢＣＤＥＦ ０ＡＹＳ　ＰＯＳＴ・　ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ　ＰＥＲＩＯ ＤＡＴＥＫ　０ＸＩＤＡＴＩＯＮ ＧＨＩＪ ＡＢ　Ｑ　Ｄ ＡＢＳＯＲＢＡＮＣＥ（４５０ｎｍ） ＥＧＧＳ　ＰＥＲＧＲＡＭ　ＦＡＥＣＥＳ国際調査報告 ［τπ伍ＩＮＩ工階仏Ｔ工見都スに五既ＰゴごｌｒＷＥＲＲＡＴＸｃｍＬ　ＡＰ ＰＬＩＣＡＴＩＧＪ　１０．　ＰＣＴ　ＡＩＪ　６ひわＱＦＡＮＥＸ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　線形動物門、線虫網、円形線虫目に属する胃腸内線虫種から抽出されるＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって決定される約３１キロダルトンの分子量を有する蛋白質抗 原ＯＣ３１からなる動物用の非生ワクチン。 ２　抗原がオステルタギア・サーカムシンクタ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｃｉｒ ｃｕｍｃｉｎｃｔａ）の排出／分泌及び代謝産物である、請求項１記載のワクチ ン。 ３　抗原が前記オステルタギア・サーカムシンクタの細胞内、体細胞及び膜性抽 出物である、請求項１記載のワクチン。 ４　抗原が前記オステルタギア・サーカムシンクタの第三期感染幼虫から、界面 活性剤を伴って又は界面活性剤を伴わないで、トライトンＸ−１００抽出によっ て生産される、請求項２又は３のいずれかに記載するワクチン。 ５　抗原がハエモンカス・コントータス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓ）の排出／分泌及び代謝産物である、請求項１記載のワクチン。 ６　抗原が前記ハエモンカス・コントータスの細胞内、体細胞及び膜性抽出物で ある、請求項１記載のワクチン。 ７　抗原が前記ハエモンカス・コントータスの第三期感染幼虫から、トライトン Ｘ−１００抽出又は界面活性剤を伴った又は界面活性剤を伴わない抽出によって 生産される、請求項１記載のワクチン。 ８　抗原がトリコストロンギラス・コルブリフオルムス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏ ｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の排出／分泌及び代謝産物である 、請求項１記載のワクチン。 ９　抗原が前記トリコストロンギラス・コルブリフォルムスの細胞内、体細胞及 び膜性抽出物である、請求項１記載のワクチン。 １０　抗原が前記トリコストロンギラス・コルブリフォルムスの第三期感染幼虫 から、トライトンＸ−１００抽出又は界面活性剤を伴った又は界面活性剤を伴わ ない抽出によって生産される、請求項１記載のワクチン。 １１　さらにアジュバントを備えた請求項１ないし１０のいずれか一に記載する ワクチン。 １２　請求項１ないし１１に記載するワクチンの効果的な投薬量を投与すること による動物の治療方法。