JPH06508602A - ワクチン同定のための試薬および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン固定のための試薬および方法 技術分野 本発明は、ワクチンの候補体を同定しスクリーニングする試薬および方法に関す る。同定およびスクリーニングは、インビボインキュベーターで、病原菌を破壊 または減弱するスクリーニング試薬として用いられる生体物質の効能による。

さらに特定すれば、本発明は、さらされた（　ｅｘｐｏｓｅｄ）天然宿主から得 られる細胞、血清、またはそれらの画分に関し、ここで、これらの物質が受動的 に動物のインキュベーターに提供される場合に、病原菌の回収可能な移植片が防 御効果を評価するために用いられる。本方法は、抗イヌ糸状虫ワクチンとして有 用な活性のある病原菌を決定するために、例示的に用いられる。

ｌｌｌ挟 置下の本発明で提供される一般方法は、ワクチンでの使用のための適切な免疫原 を得るためのものであり、イヌおよび他の哺乳類に対するイヌ糸状束の感染に特 異的に用いられる。

この感染は線虫Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓによりもたらされる。

故に、この感染の性質およびり、　１ｍｍ１Ｎｓ寄生虫の生活周期に関する予備 的な考察が、背景となる文献の再検討および本発明の記載の両方に対して役立ち 得る。この寄生虫の成虫形態はかなり大きく（雄は体長１２−２０ｃｍ、幅０． ７−０．９ｍｍであり；雌は体長２５−２５−３ｌ　幅１．０−１．３ｍｍであ る）、そしてこれらはイヌの心臓および肺動脈に選択的に存在する。性的に成熟 した成虫は、交尾後に体長３００μｌ１幅７μ園のミクロフィラリアを幼虫とし て産む。これらはイヌの循環系で毛細血管床を通り抜け、血液ｌ■ｌあたりミク ロマイラリア１ｏ３−ｉｏ５個体の濃度で循環する。イヌへの感染を示す方法に 、循環しているミクロフィラリアを検出するものがある。

イヌが昆虫のいない環境に維持されれば、寄生虫の生活周期は発達し得ない。し かし、ミクロフィラリアが、感染イヌの血を吸う雌の蚊によって摂取されると、 蚊の中で次の発達（もちろん、数を増やす訳ではない）が起こる。ミクロフィラ リアは２つの幼虫齢（ｓｔａｇｅ）　（ＬｌおよびＬ２）を経て、体長約１．１ ＋ｕ＋の成熟した第３齢幼虫（Ｌ３）になる。次いで、蚊が刺すことにより、そ の幼虫はイヌに戻される。従って、最初の感染の原因となるのはこのＬ３齢であ る。感染後３日間程でＬ３は脱皮して第４幼虫（Ｌ４）齢となり、次いで第５齢 すなわち未成熟の成虫になる。この未成熟の成虫は心臓または肺動脈に移動し、 そこで成熟し、再び幼虫を産む。従って、その成虫は血液中でミクロフィラリア を産むことになる。イヌにおけるイヌ糸状束の「潜在」感染は、そこにミクロフ ィラリア血症はみられないが、成虫のイヌ糸状束の存在が、胸郭検査によって決 定付けられ得るということで定義される。

イヌへのイヌ糸状束感染の抑制には、化学的予防法が用いられているが、イヌ個 体群のこの寄生虫に対する実用的な免疫処置に用いる効果的なワクチンは得られ ていない。さらに、一般に寄生虫によってもたらされる感染症に対するワクチン の活性成分として用いられるための、適切な免疫原を決定する一般的な方法は見 つけられていない。本発明は、これらの問題の両方に対する解決を提供する。

ワクチン成分を得る方法への一般的なアプローチに関して、動物宿主に注入した 時に抗体を生じる、病原菌の種々の成分の能力は、有効なワクチンとしての性質 を示すこれらの成分の能力として決定的ではないことがよく理解されている。多 くの物質が免疫原性であり、イムノアッセイで免疫された抗原と反応する能力に ついて陽性であるという結果を示す一方で、感染に対して宿主を防御しない血清 を生成する。インビトロアッセイで病原菌を中和する抗体は、インビボでの抗原 投与に対してより一層防御するとみなされる。従って、「免疫処置」から、ある いは候補となるワクチンをスクリーニングする病原菌による感染から単に得られ た「免疫」血清を用いても、防御免疫原を同定するのに充分な特異性は提供され ない。他方で、感染を決定的に防御できる免疫動物由来の血液の血清または他の 成分は、抗体、細胞、または抗原あるいは病原菌と反応し得る他の因子を含有す ることが確信されている。これらの物質は抗原投与に対して防御する応答を行う 。

はとんどの感染症では、特に寄生虫感染のような長（複雑な発達過程を有する感 染症では、スクリーニング試薬として用いるための、さらされた動物由来の血清 またはＴ細胞の防御効果を実証するのは困難である。まず第１に、抗原投与に対 する防御の実証は繁雑である。なぜなら、例えば、血清の抗体成分がスクリーン として用いられ得ることが示され得る前に、宿主動物はまず病原菌を投与されな ければならず、防御されることを示されなければならない。このような状況下で 、「防御」を定義することは、しばしば複雑である。第２に、たとえ抗原投与に 対する防御効果が示されたとしても、防御が免疫系のどの成分によるものである かははっきりしない。

この防御効果は、抗体、細胞、免疫系の媒介物、あるいはこれらの組合せにより 生じ得る。従って、この方法は、スクリーニング試薬を得るために時折用いられ るが、長時間を消費するため、防御成分を同定できない。

血液成分を得、それらの防御効果を立証する、より有用な方法では、病原菌を含 む移植拡散チャンバーを利用している。

これは、Ｇｒｉｅｖｅ、Ｒ，Ｂ、、ら−による、Ａｍ　Ｊ　Ｔｒｏ　ｅｄ　（１ ９８ｇ）３９：３７３−３７９、およびＡｂｒａｈａｍ、　Ｄ、、らによる、Ｊ 　Ｐａｒａｓｉｔ（１９８ｇ）　７４：２７５−２８２に記載されている。これ らの論文のうちの第１の論文では、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｉ圀ａｄｉｔｓ感 染に免疫されたイヌに、感染幼虫を含む拡散チャンバーを供給した。次いで、チ ャンバー内の幼虫を前記の免疫処置の効果に対して評価し得た。

これに関して第２の論文では、Ｄ、　１ｉＩＩｉｔｉｓ第３齢幼虫を含む拡散チ ャンバーをマウスに供給した。これらの幼虫での効果は、前記のＬ３の注入によ り引き起こされたと推定される、マウスに存在し得る免疫性を決定するために用 いられた。従って、これらの論文の分脈では、病原菌を含む拡散チャンバーの使 用により、ある程度直接的に投与した、活性のある免疫処置プロトコルの有効性 の一般的な評価は得られるが、標的宿主の血流の選抜画分の受身移入した、防御 効果の評価は得られない。

本発明の一般的な方法は、特に以下のようにイヌのイヌ糸状束感染の分脈の中で 例示される。それは、病気を病気として同定する方法であって、寄生虫の感染が 複雑であるため、予防接種のための候補となる免疫原の選択が非常に困難である 。ＬＬＵｗｉｉにより以前感染したまたは現在感染中のイヌは再感染され得るの で、天然に与尤られた免疫があることは確認され得ない（Ｇｒｉｅｖｅ、　Ｒ， Ｂ、　、ら、Ｅ　ｉｄｅｍｉｏｌｏ　ｔｃ　Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８３）　ｉ： ２２０−２４６）　。しかし、この文献はまた、防御的な免疫応答が天然に生じ たという証拠があることも報告している。

この証拠には、感染したイヌの中の成熟した寄生虫の個体群に見かけ上限度があ ることが明記されている。

さらに、防御免疫は人工的に誘発され得る。Ｗｏｎｇ、　Ｍ、Ｍ、、ら、■Ｌカ Ｄ咀江は（１９７４）　３５：４６５−４７４では、放射線弱毒化感染幼虫を用 いてイヌの免疫を報告している。イヌは抗原投与によって種々の程度で防御され る。Ｂｌａｉｒ、　Ｌ、Ｓ、、らは、Ｆｉｆｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｃａｎ　ｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｉｏ　、カナダ、トロント（１９ ８２年８月）の中で、イヌに感染させ、化学療法により第４幼虫齢でその感染を 終結させることにより、免疫処置が成功したことを報告している。

Ｇｒｉｅｖｅ、Ｒ，Ｂ、、は、Ｐｒｏｃ　Ｈｅａｒｔｖｏｒｍ　Ｓ　ｔａ　（１ ９８９）、ｐｐ、１８７−１９０で、イヌ中のイヌ糸状虫に対するワクチンの製 造の試みの現状を再検討した。この報告は、不活性の拡散チャンバーに移植した 感染幼虫の使用を要約している。その内容は、イヌおよびマウスの両方において 、宿主から細胞および／または血清を流入させ、チャンバーから寄生虫物質を流 出させることにより、接種プロトコルの有効性を評価するということである。感 染幼虫での免疫処置を用いることにより、引続き行われる抗原投与に対する防御 に部分的に有効であることが示された。

イヌ糸状虫ワクチンを発見する別のアプローチでは、Ｌ１＋１ｍ１ｔｔｓの感染 齢での主要な抗原を同定することが試みられている。Ｐｈ１ｌｉｌ）ｐ、Ｍ、、 らは、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８６）　Ｈ６：２６２１−２６２７で、Ｄ、 　ｌｍ１ｉｔｉｓの第３齢幼虫の３５ｋｄの主要な表面抗原を報告している。こ の抗原は、潜在性の実験り、　Ｊ■ｍ１ｔｉｓ感染を行ったイヌ由来の血清また は放射線照射した第３齢幼虫により免疫化されたイヌ由来の血清で免疫沈降でき る。さらに、このグループ　（Ｄａｖｉｓ、Ｔ、　Ｂ、　、ら、Ａｂｓｔｒａｃ ｔ　４０４，３７ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ａｍ、　Ｓｏｅ、　 Ｔｒａｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、　（１９８８））　は、Ｌ４齢の、分子量が１ ５０ｋｄ、　５２ｋｄ、および２５ｋｄの３つの主要な表面タンパク質を報告し た。２５ｋｄの分子は、Ｌ４齢に特有なものであると思われた。

Ｉｂｒａｈ［ｍ、　Ｍ、Ｓ、、らは、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９Ｂ９）　９９ ：８９−９７で、１２５Ｉで標識したり、　ｉｍ＋ｚｉｔｉｓ　Ｌ３ｓを用いて 、寄生虫を発生させることにより、３５ｋｄおよび６ｋｄの成分が培地に流し出 されていることを示した。さらに彼らは、免疫を与えられたウサギおよび感染し たイヌ由来の抗体は３５ｋｄ成分で免疫沈降し、６ｋｄ成分で免疫沈降しないこ とを示した。

５ｃｏｔｔ、　Ａ、　Ｌ、　、らは、ｘｃｔａ二江妊１岨（１９９０＞　４７： ３３９−３５３で、放射線標識法および５ＤＳ−ＰＡＧＥ＋Ｃよって、Ｄ、　ロ を土ｕ）Ｌ２．　Ｌ３、およびＬ４の表面結合分子の特性付けにつ（１て報告し た。それらはヨウ素標識したＬ２齢およびＬ３齢からの抽出物中（こ、３５ｋｄ および６ｋｄの主要な標識された成分があること力（わ力）つた。

この時、ラクトパーオキシダーゼ触媒標識は、見かけの分子量が６６ｋｄ、　４ ８ｋｄ、　２５ｋｄ、　１６．５ｋｄ、および１２ｋｄの成分を表した。

Ｌ４の表面結合分子のヨウ素標識により、見力）けの分子量力τ５７ｋｄ、４０ ｋｄ、２５ｋｄ、１２ｋｄ、および１０ｋｄの分子力（得られた。この時、ラク トパーオキシダーゼ触媒標識は、さら１こ４５ｋｄ、４３ｋｄ。

および３ｋｄの別のバンドを示した。しかし、これら：よ、特性付けられていな い血清源を用いて、または血清の同定を行わずに同定を行った。

一般に寄生虫に対するワクチンを得るための（也のアプローチは、中和する抗体 の製造に集中する。例え＋ｒ％Ｔａｎｎｅｒ、　Ｍ、　。

ら（Ｔｒａｎｓ　Ｒｏ　Ｓａｃ　Ｔｒｏ　Ｍｅｄ　Ｈ（１９８１）　７５：１７ ３−１７４）およびＳｉ＋ｌ、　Ｂ、に、Ｌ、ら（（ｉｂｉｄ、璽１９８２）　 ７６：３６２−３７０）　ｉこよる両者のインビトロ研究、およびＰａｒａｂ、 　Ｐ、Ｂ、、ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８８）　６４：１６９−１７４による インビボ研究で番よ、Ｄｉ　ｅｔａｌｏｎｅｍａ　（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌ ｏｎｅｍａ）　ｖｉｔｅａｅまたＣよＬＩＬＬｕ註ｎム由来のフィシ１ノアのＬ ３を殺すには、抗体は単独でまた＋［也の免疫成分と共１こ効果を発することが 示されている。さらに、叙坦記旦眩ｕｔａＵ」■への受動免疫は、免疫ラットま たはヒトから正常マウスに移入される（Ｓｈｅｒ、　Ａ、ら、ｂ■１１１彊、（ １９７５）　７０：３４７−３５７；　Ｊｖｏ、Ｊ、ら、Ａｍ　Ｊ　Ｔｒｏ　Ｍ ｅｄ　（１９８９）　［：５５３−５６２）。これらのいずれの研究でも、病原 菌は候補となる防御成分で処理したので、インビボインキュベーターに移植した 病原菌の回収および評価は行っていない。

ｌ帆旦皿示 本発明は、ワクチンに含まれる適切な免疫原の同定のための一般的な方法論と、 特にイヌにおいてイヌ糸状束感染を抑制するのに有用である本方法を用いて同定 される免疫原とを提供する。一般的な方法論は、インビボインキュベーター動物 において、病原菌を減弱または破壊させる血清または細胞の能力によって、候補 となる抗原を検出または結合するために用いる血清または細胞の防御性質を実証 することによる。

この時、宿主として不適切であれば、その宿主は病原菌の拡散チャンバー移植片 を含有する。

従って、１つの局面では、本発明は、病原菌に対するワクチンに含まれる免疫原 を同定するのに有用な試薬に関する。

この試薬は細胞、抗血清、またはこれらの両分を含有しており、これらの物質は 、インビボモデルで病原菌を供与、破壊、または減弱する能力によって、病原菌 に対して防御できることが示されている。この時、宿主として不適切であれば、 病原菌を含む拡散チャンバーで移植される。本方法は、もちろん、拡散チャンバ ーに保持されるのに充分な大きさの病原菌別の局面では、本発明は、これらの試 薬を用いる方法に関し、それによって、免疫原の考えられ得る種々の供給源にお いて、候補となるワクチンをスクリーニングすることができる。これらの免疫原 の供給源は、病原菌の抽出物または分画抽出物、または病原菌から得られるＤＮ Ａ発現ライブラリーであり得る。本発明はまた、この試薬の投与によって、宿主 に受動免疫を供与する方法に関する。

他の局面では、本発明は、イヌ糸状虫感染および、特に、ｐ＝ロコエロのＬ３お よびＬ４幼虫齢の成分に、本発明の試薬および方法を用いることに関する。上記 の成分は３９ｋｄの分子量を有する。防御性の免疫血清細胞または画分と独占的 に反応することで立証された別の成分も開示されている。

さらに別の局面では、本発明によって、標的宿主において免疫原の防御効果を短 時間で検定し得る検定法を提供することにより、候補となる免疫原を評価するこ とができる。免疫を与えられた宿主に直接病原菌を投与し、感染の結果を評価す るのに数カ月を費やす代わりに、宿主から採血し、拡散チャンバーを含む実験宿 主において、血液の成分または血清をより直接的に検定し得る。このことにより 、病原菌の天然に生じた成分と、合成ペプチド、炭水化物、および糖タンパク質 の成分との両者のスクリーニングを早く行うことができる。

Ａｉ空ｉ星星説里 図２は、イヌ血清で免疫反応したり、　ｆｍｍｉｔΔタンパク質の、免疫処置後 の種々の時点（日）でのウェスタンプロットを示す。

図３は、ｏ、ｉｍｔｇｉＮｓのＬ４幼虫がら抽出した５−３５メチオニン標識タ ンパク質、およびコントロールおよび免疫血清と反応させた５−３５メチオニン 標識タンパク質の、免疫処置後の種々の時点での５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す 。

図４は、図３と同様の設定で分析したタンパク質の結果を示す。但し、幼虫の表 面タンパク質はｌ−１２５で標識する。

図５は、図３と同様の設定で分析したタンパク質の結果を示す。但し、幼虫の表 面タンパク質はビオチンを用いて標識する。

図６は、Ｌ３からＬ４に遷移し、その後３−４日間Ｌ４内に維持されることで特 性付けられる、排泄／分泌物質に存在するタンパク質の分析の結果を示す。

及胛囚！見履謙 本発明の方法では、モデル宿主の活性応答を用いて、免疫処置プロトコルを評価 するために用いられてきたモデル系統を利用し、天然の標的宿主中で発生し、実 験動物系統に受身移入された特定の免疫試薬の防御能力を、実験で確かめたり、 立証したりしない。従って、本方法は、試薬自体がワクチン候補体を同定し、か つ評価するのに有用である場合に、適切な試薬を同定するために用いられるわけ ではない。イヌ糸状虫に用いられるような活性のある免疫処置モデルは、上で引 用したＧｒｉｅｖｅおよびＡｂｒａｈａｍの１９８８年の論文に記載されている 。

このモデルでは、病原菌である第３齢幼虫は、まず以下のようにして得られた。

しく支）山］を、合衆国国立衛生研究所の米国一日本共同メディカルサイエンス プログラムを通じて得られた感染を一旦通した寄生虫に感染したイヌの中で維持 した。

口め胆ｕ１１０の蚊のリバプール（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）　（ブラックアイ系統 ）を、人工の摂取装置を用いて、ミクロフィラリア血症の血液を摂取させること により、寄生虫に感染させた。この装置は、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、　Ｌ、Ｌ、、ら によって、助」」恒■（１９６４）２４：４０７−４１９に記載されている。感 染から１５日後、蚊を冷却麻酔し、そして９５％エタノールに浸漬し、次いで、 ｐＨ７，２の、０゜０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中に１％塩化ベンザルコニウム を含んだ溶液で３分間洗浄することで、表面を消毒した。蚊をＰＢＳで３回洗浄 し、培地で満たした漏斗の中の６０メツシユのスクリーンを通してインキュベー トして（培地はＡｂｒａｈａｍ、　Ｄ、らの、Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔｏ＋　（１９ ｇ？）　７３：３７？−３８３に記載されている）、幼虫をインキュベート後に ９０分間採集した。

次いで、回収したＬ３幼虫を拡散チャンバーに置き、皮下に移植する。イヌへの 移植用としては、チャンバーは５．０μ箇の親水性のデュラポア（Ｄｕｒａｐｏ ｒｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ）で密閉した２つの１４ｍｍルシートリング（Ｌｕｃｉｔｅ　ｒｉｎｇｓ） からなる。幼虫をルシートリングの一方にある穴を通して挿入し、次いでナイロ ン糸で閉じる。イヌに麻酔をかけ、頚の背側の皮膚に皮下のう状腔を形成する。

チャンバーをのう状腔の中に移植し、傷を縫合によって閉じる。

マウスへの移植では、類似のチャンバーを用いて、これを腰部のを椎の側面に形 成した皮下のう状腔に移植する。チャンバーは、中に含む幼虫を評価するため、 所望の時間で除去され得る。

種々の設計のチャンバーが用いられ得、拡散膜の有孔性は病原菌の性質および内 部の拡散の性質に基づく所望の限定によって選択され得る。

スクリーニング試薬の調製または標的動物宿主由来のサンプルの評価を行うため のモデルの使用では、拡散チャンバーは免疫が活性化されない不適切な宿主中に インビボで保持され得、そして防御免疫を与え得ると考えられる血清または他の 成分の一部は不適切な宿主に投与される。病原菌の破壊または減弱が見られたと しても、免疫原をスクリーニングする本発明の方法の使用では、一部は保持され る。例えば、モデルとしてイヌを用いる場合には、例えば０．５ｍｌの血清が、 拡散チャンバーと一緒にのう状腔の中にその血清を配することによって投与され る。マウスの場合には、チャンバーが少なくなることなく類似の量で用いられる 。病原菌を含むチャンバーは、血清または他の成分の防御効果を評価するのに充 分な時間、適切な位置で保持され得る。この時間は、感染の性質および試験サン プルの防御能力によって決定される。

所要実験時間が経過した後、チャンバーを除去し、病原菌を取り戻す。天然の標 的宿主から受身移入した成分の防御能力は、病原菌で見られるいずれの有害な効 果によっても評価される。これらの効果は、特に限定されないが、例えば、死滅 、発育不全、正常な形態の変化、適度な代謝における改変、インビトロ培養での 成熟不全、および好適な標的宿主への感染の失敗を包含し得る。

次いで、評価の間保持されているサンプルの画分を、候補となる免疫原をスクリ ーニングするために用いる。候補となる抗原で、確認された成分の複合体化を生 じるいずれの技術も用いられ得る。例えば、病原菌の抽出物は種々のクロマトグ ラフ法を用いて分析される。このクロマトグラフ法は、ゲル濾過クロマトグラフ ィー、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、 アフィニティークロマトグラフィーなどを用いるサイズ分別法を包含する。次い で、全抽出物または分画抽出物を、防御成分を用いて反応効果を試験する。血清 が防御成分である場合、複合体が形成される。その成分が抗原に対するレセプタ ーを有する細胞前画分であれば、その抗原は結合される。その複合体を回収し、 免疫原を複合体から回収する。

粗抽出物に本方法を適用する場合には、防御性を有する血清または細胞は、免疫 反応性成分を単離するために、クロマトグラフ法でアフィニティーリガンドとし て用いられ得る。

あるいは、上記のように、抽出物をまず分画し、そして防御細胞または血清を用 いて、適切な両分を複合体化することによって同定し得る。

別のアプローチでは、防御性を有する細胞または血清は、感染齢または後齢の病 原菌から調製されたｃＤＮＡライブラリー（これは発現ベクターで構築されてい る）に対するスクリーニング試薬として用いられ得る。通常使用され、かつ便利 なこのようなライブラリーは、Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、、　およびＤａｖｉｓ、 　Ｒ。

Ｗ、により、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８３）　 ８０：１１９４−１１９８に記載されているλｇｔｌｌである。この発現ライブ ラリーをプレートし、防御性を有する細胞または血清でスクリーニングして、免 疫反応性成分を生成するコロニーを同定する。次いで、陽性のコロニーを精製し 、発現ベクターでのｅＤＮＡ挿入断片を回収し、配列決定を行い、コードされた タンパク質を同定する。

本発明の試薬を用いて免疫原を発現するものとして同定されたｃＤＮＡ挿入断片 は、ワクチンとして有用なタンパク質を生産するために、より好ましい一般的な 発現系にリガンド結合し得る。あるいは、挿入断片は、以下のような生存組換え 体キャリアである発現系にリガンド結合し得る：シンドピスウイルス、ワクシニ アウィルスまたは（也のポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス 、サルモネラまたはミクロバクテリア（Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）。次いで 、これらの病原菌は、その場での免疫原の発生により、標的宿主を免疫するため に用いられ得る。

本発明のワクチンは、ワクチンの性質、および疾患および患者の性質に見合った 方法で投与される。組換えにより産生じた免疫原または天然の免疫原がタンパク 質として投与される場合、それらの免疫原は、注入または宿主への他の身体投与 に用いられるために、一般的な賦形剤とともに処方される。

注入に加えて、処方物は、他の投与方法用に調製され得る。

これらの投与方法としては、粘膜を経由するまたは皮膚を経由する血流への供給 を包含する。免疫原が病原菌における組換えＤＮＡ発現系の形で投与される場合 、投与は、典型的には注入または病原菌を通常投与する他の様式によって行われ る。

病原菌が動物モデルで好都合に用いられ得るようないずれの疾患に対しても、適 切な免疫原を発見するために、前述のアプローチが用いられる。一般に、このよ うな疾患は、拡散チャンバーに保持されるのに充分な大きさの生物体によりもた らされる。従って、一般的に、本方法は、以下の他のフィラリア線虫によっても たらされる疾患を含む種々の寄生虫病に対して用いられ得る：例えば、Ｄｉ　ｅ ｔａｌｏｎｅｍａ　肚■」胚、　Ｑ注射１空咀ｕｓｔｒｅ　ｔｏｃｅｒｃａ、　 Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、　Ｂ、　ｍａｌａｙｌ、　Ｍａｎ ｓｏｎｅｌｌａ　ｏｚｚａｒｄｉ、　Ｌｏａｌｏａ、および０．　ｖｏｌｖｕｌ ｕｓ。

本方法が用いられ得る他の病原性生物体には、ｆｉｄｅｓ　ｓｐｐ、、　江匹旺 旦ｕｓ　ｓｐｐ、、　Ｈａｅｗ＋ｏｎｃｈｕｓ　ｓｐｐ、、　江Ｒ■■仔旺杜ｕ ｓｐｐ、　、　虹江ｎ■ｈｓｐｐ、　、　堕姐虹ｎ５ｐｐ、　、　■」１に■ｌ ｕｓ　ｓｐｐ、、　Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ　ｓｐｐ、、　Ｃｙａｔｈｏｓｔｏ ｍｉｎａｅ　（ウマの小円虫（ｓｍａｌｌ　ｓｔｒｏｎｇｙｌｅｓ　ｏｆ　ｈｏ ｒｓｅｓ））　、０ｅｓｏ　ｈａ　ｏｓｔ　ｕ　ｓｐｐ。

、　ｍ　０Ｖｉｎａ、　■ｕ七ｌ匡ｕＳｐｐ−、ｍ　Ｓ［１１Ｂｕｎｏｓｔｏｍ ｕｍ　ｓｐｐ、、　ｌＪ、上旺コ１競ｓｐｐ、、ｅｌｕ　ｏｓｔｒｏｎ　ｕｓ　 ａｂｓｔｒｕｓｕｓ、回虫目（Ａｓｃａｒｉｄｓ）の線虫、ＲＢ遅１吐ｎ鉦江… ｎ。

Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｓｐｐ、、　Ａｎ　ｏｓｔｒｏｎ　ｕｓ　ｓｐｐ、、勤オ 匡公１ｕｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓが挙げられる。本方法を用いることで、チャ ンバーの中に包み込まれた形態の同定のために、適切であれば、病原菌の感染齢 が測定される。プロトコルは、細胞または血清のような、標的動物由来の成分の 防御効果を発揮するために必要とされる時間を考慮して、調整される。

本発明の試薬を用いて、Ｄ、　ロ１１０に結合する数種の免疫原が得られた。こ のような免疫原の工種は、６６ｋｄ、　６５ｋｄ、　５９ｋｄ、　３９ｋｄ、　 ３３ｋｄ、２３／２４ｋｄ、　２２／２０．５ｋｄ、および１４ｋｄの分子量を 有する。前述のタンパク質は、Ｌ３幼虫および／またはＬ４幼虫により生産され る。これらのタンパク質をコードするＤＮＡは、これらの幼虫齢の５ＲＮＡから 調製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから、本発明の試薬で発現をスクリーニング することによって回収され得る。次いで、適切なｃＤＮＡ挿入断片は、実用的な 量のタンパク質を生産する適切な発現系で組換え免疫原を生産するために用いら れ得るか、またはワクシニアウィルス系のように、その場で免疫原を発生する組 換え系統にリガンド結合され得る。

以下に述べる実施例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない 。

実】１１［ のための　゛の　。

４頭のイヌを化学的に短縮された感染により免疫性を与え、２頭のイヌを化学的 に処理したコントロールとして用いた。これらのイヌは、室内の蚊の存在しない 個別のケージに温度２２℃、湿度４０−６５％で飼育した。最初の免疫処置後５ ３２日目には、上述のように、各イヌは５つの拡散チャンバー内に含有された１ ００個体のＬ３のり、　１已」幼虫を投与された。チャンバーへの移植と付随し て、５０個体のＬ３を皮下に注入し、予想されるｐｒｅ−ｐａｔｅｎｔ期間を越 えて、その感染が進行することが認められた。感染抗原投与を拡散チャンバー内 の１００個体の幼虫、および皮下に注入した３０個体のＬ３により５８８日繰り 返した。血清は、最初の免疫処置後５５４．５８８，６０２．および６４２日目 を含む多数の時間に、免疫性を与えたイヌから収集された。なお、この最初の免 疫処置後５５４．５８８．６０２．および６４２日目は、最初の抗原投与後２２ ．５６．７？、および１１７日目に相当する。血清の単離は免疫グロブリンおよ び可溶性因子の根源を供給するが、細胞の単離は供給しない。抗体レベルは、Ｌ ３およびＬ４の表面抗原を、間接蛍光抗体法を用いて、そして、Ｌ３およびＬ４ 可溶化抗原および排泄−分泌抗原の画分をＧｒｉｅｖｅら（１９９８）（上述） に記載された間接ＥＬＩＳＡ法により測定した。血清をプールし、実施例２に記 載したように、マウスインキュベーター内で防御効果に重要な因子として確認し た。

ヱクｎズｆｌ乏 皮下のう状腔は生後おおよそ１０週齢の雄の１ａｌｂ／ＣＢＹＪマウス内に形成 され、上記記載の拡散チャンバー内に注入された２０個体のＬ３を、試験された 表記の防御血清０．５ｗ＋１と一緒に、こののう状腔内に移植した。血清サンプ ルを、将来の使用のために維持した。拡散チャンバーが２週間または３週間後に 再生した。チャンバー中の生存幼虫を計数して、氷酢酸中に入れ、次に５％グリ セリンを含有する７０％エタノール中に入れた。グリセリン中に幼虫を残すため にエタノールを蒸発させた。幼虫は、マツ牛ントッシュコンピューターのマック メージャーイメージアナリシス　システム（Ｍａｃｍｅａｓｕｒｅ　ｉｍａｇｅ 　ａｎａｌｙｓｔｓ　ｓｙｓｔｅｍ）の投影像を使用することにより測定した。

３群を使用した：実験１は、実施例１に記載の３つの収集時（５６，７７、１１ ７日目）における個々のイヌからの等しい割り当ての血清を使用した。実験２お よび実験３は、最初の免疫投与後１１７日目の免疫イヌからの血清のみを使用し た。コントロールの血清は全ての場合に使用したが、この血清は、実験２では１ ２個体の未実験のイヌからプールしたものであり、実験３では個々のイヌからプ ールしたものであった。これらの群には、血清を全く受けないコントロールもま た含めた。

実験１においては、注入後２週間目にチャンバーが再生した。

免疫イヌからの血清を与えられたマウスからの、チャンバー内の幼虫の生存率は 、正常なイヌの血清を与えられたマウスからのものより低かったが、その差異は 統計上有意ではなかった。さらに、各々の場合における各幼虫の体長には差異は 見られなかった。

実験２および実験３においては、感染後３週間目にチャンバーが再生した。幼虫 の再生における有為な差異が、正常なイヌからの血清を与えられたものと免疫イ ヌからの血清を与えられたものとの間で、約３４−３３％あった。幼虫の体長も また、免疫イヌからの血清を与えられたチャンバーの方が有意に短かった。

実１己１１ 坑１【ど１定 Ｌ３およびＬ４幼虫の粗抽出物を次のように調製した：全ての手法は、４℃ある いは氷上で行われる。寄生虫を収集し、緩衝液（ＰＢＳｌｏ、　１％Ｔｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１００）で２回洗浄し、その後抽出緩衝液（０，０５Ｍ　Ｔｒｌｓ／Ｈ ＣＩ、　ｐＨ６，Ｉｌ；　２％ＣＨＡＰＳＯ；　１ｍＭ　ＰＭＳＦ；　１■Ｍ　 ＥＤＴＡ：　１　ｍｇ／ｌ　ｏイべ７°ｆン：　１簡ｇ／ｌ　へ°７°スタイン ）で２回洗浄　した。

（ＣＨＡＰＳＯのかわりに、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，５％ＣＴ ＡＢ、　２％ＤＯＣあるいは２％５ＤＳ１５％２−ＭＥ／８Ｍ尿素を含有する他 の洗浄剤を使用し得る。） 寄生虫はさらに１０．０００−２０，０００個体の寄生虫（〜ｓｏｏμｇ）に対 し２５０〜５００μｍ使用して、各々１分間隔で１分間、５回ホモジナイズした 。この溶液を別のチューブに移し、ホモジナイザーをきれいな１００−２５０μ ｌの抽出緩衝液で洗浄し、ホモジェネートとこの洗浄液を集める。このチューブ を４時間−一晩の間振とうさせて、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。上 澄み液を採取し、沈澱物を抽出緩衝液で１度洗浄し、所望するなら追加した抽出 液を取っておく。抽出物の集められた総量は１ｍｌよりも少なく、使用したＬ４ 幼虫あたり約２０ｎｇのタンパク質が溶解している。

Ｌ３に対する手法は、洗浄緩衝液が洗浄剤を含まないＰＢＳであること以外は同 様である。

抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、マウスモデルで防御すること を示す血清の部分を試験した。実施例２に記載した幼虫の成長を妨げることを示 すプールされたイヌの血清が、ウェスタンプロットで免疫反応物質として使用さ れたときの結果を図１に示した。図１に示された３９ｋｄバンドは、電気泳動に ２次元を加えられたとき４５ｋｄバンドから分離される。この４５ｋｄのタンパ ク質は、特殊な抗原に反応しない。このように、血清は、Ｌ４幼虫齢に存在する ３９ｋｄのタンパク質に特に免疫反応性を有する。このタンパク質は約５のｐＩ を有する。コントロールの血清は、このタンパク質に免疫反応性を示さない。３ ９ｋｄの分子に対する反応性は免疫イヌに存在するが、コントロールのイヌには 存在しない。ミクロフィラリア感染または、非ミクロフィラリア感染によるイヌ 由来の血清には、この分子は認められない。

さらに、６６ｋｄ、２４／２３ｋｄ、および１４ｋｄに存在するバンドを図２に 示した。

幼虫齢と関係するタンパク質は、　５−３５メチオニンを用いて代謝的に標識化 されたか、または抽出する前に、表面を１−１２５またはピオチンを用いて標識 された。５−３５メチオニンを用いて標識するために、放射性標識されたアミノ 酸を、Ａｂｒａｈａｍ。

Ｄ、ら、Ｌ上■１月ユ引−（１９８７）ｌｆｉ：　３７７−３８３の方法に従っ て、４８時間後の寄生生物の培養系に加えた。＋−１ｚｓを用いて標識するため に、Ｍｏｋ、　Ｍ、ら、Ｍｏｌ　ｃ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓ　ｔｏ　（１ ９８８）ｕ：１７３−１８２の方法を用いた。ビオチン化するために、Ａｌｖａ ｒｅｚ、　Ｒ，Ｍ、ら、慰１ｅｃ　ｏｃ　ｅｌＰａｒａｓｉｔｏｌ（１９８９） ３３：１８３−１９０の方法を変更したものを用いた。変更した手法においては 、Ｎｌｌ５−長鎖ピオチンをピオチン自体の代わりに用いた。

このように、幸運にも有効である免疫血清により免疫強化されたこれらのプレ標 識されたタンパク質を用いて、追加の同定を成し得た。これらの結果を図３．４ および図５に示す。

図３に示すように、追加の候補体が矢印で示した５９ｋｄおよび１６ｋｄに見ら れる。放射性活性のあるヨード−標識された物質は、３５、８−３４．５ｋｄの 高分子量標本とともに候補体を約３３ｋｄに示している。これは、免疫イヌの全 部ではなく何頭かに、３４５日目日目めて存在し、６４２日目０で残存した。追 加のバンドが１４．５ｋに存在した。これは、図４に示されている。

図５は、増強された化学発光分析で、タンパク質をビオチン化によって標識した 時の結果を示す。６５．３ｋｄに表れた一時的なバンドは、免疫イヌの４個体の うちの３個体に認められた。

さらに、３９ｋｄのタンパク質に同様の反応を示す最初の免疫イヌの血清（例え ば、図３に示した１４２日目０免疫血清）の受身移入は、埋め込まれた幼虫を殺 すことに効果をもたらし得た：健全な幼虫の回収は、コントロールが６５．８％ であるに対し、免疫血清の場合は５８．３％だけであった。

要約すると、下記の抗原候補体を得た：３９ｋｄのタンパク質は、全ての免疫イ ヌ由来の血清と反応するが、未実験の群由来の血清とは反応しない。ウェスタン プロットで存在することが示されたタンパク質は、Ｌ４可溶化抗原および可溶化 したＬ４幼虫沈澱物から得た。そして、外見上より少ない程度であるが、Ｌ３に 存在していることが示されている。このタンパク質は成虫のり、　ロ１工堕およ びミクロフェラリアには明らかに欠けている。５ｃｏｔｔ、　Ａ、　Ｌ、ら、ｍ ｍ旦（１９９０）（上述）によって記載されたｐ３５タンパク質と異なったタン パク質であることは明白であり、比較的酸性でありおよそ５のｐ＋を有する。

１４ｋｄの免疫原を、ウェスタンプロット、および５−３５とヨード−標識され た組成物を用いた免疫沈降を用いて、免疫イヌ血清により検出する。このタンパ ク質は免疫イヌ血清により検出されるが、コントロールの血清によっては検出さ れない。

検出された追加のタンパク質は、６６ｋｄおよび２３／２４ｋｄにある。

寄生症の防御抗原となる他の可能性の根源は、寄生生物の多様な齢に関係する排 泄／分泌産物である。

Ｌ３と５４間の変態は、次のようにして採取する多くのタンパク質の排泄／分泌 を伴う：幼虫を２５０−４００個体／ｍｌで飼育し、４８時間で洗浄し、さらに ４日間飼育する。次に、寄生虫を沈澱させ、上澄みを集める。これを、０．４５ μ園フイルターを通して濾過し、プロテアーゼ阻害剤をＬ４の可溶化物に加えた 。ＢＳを濃縮し、次に、１０ｋｄ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１ ０および／またはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０）を用いて超濾過することにより緩 衝液を交換する。最終の緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含むｐＨ６，８の０． ０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩである。収量は、幼虫あたり約５ｎｇであり得る。

最終容量は、ひんばんに１５０−２５０μｌである。ＤＩＬＥＸと言われるこの 抽出物は、５−３５メチオニンにより代謝的に標識された幼虫を用いて調整され 、イヌ由来の免疫およびコントロール血清に対する反応を試験した。免疫処置後 ５５４日目０得られた免疫血清については実施例３で述べた。

この免疫血清と反応する免疫沈降は、図６に示すように、２２７２Ｇ、　５ｋｄ および１４．３ｋｄで得られた。図６におｔ）て、第１ツ１１１こは分子量標準 を、第２列には免疫イヌ由来の免疫沈降を、第３列にはコントロールのイヌ由来 の免疫沈降を、第４夕１こＣよ数珠状（ｂｅａｄ）コントロールを、第５列にＩ ｎＩＬＥＸ自身を示している。

実ｍ先 口　るＤ４１１ＩｌｉｔｉＳ　としてコードされたｃＤＮＡおよび°　の λｇｔｌｌからの派生物である、λＺａｐＨ中のゲノムおよびｃＤＮＡ発現ライ ブラリー（Ｓｈｏｒｔ、　Ｊ、Ｍ、ら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ（ １９８ｇ）１６：７５８３−７６００）は、全ゲノムＤＮＡ、　あるＩ、ＮまＬ ４また（まＬ３幼虫齢の個別のｍ　ＲＮ　Ａから、標準的手法（Ｓｈｏｒｔ　Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）Ａ ｕｓｕｂｅｌ、Ｍ、Ｆ、ら編）を用（Ａて調製した。免疫イヌ血清からプールさ れたこれらのライブラリーをスクリーニングすることが、候補体抗原を含むクロ ーンの同定を可能にする。免疫血清により免疫反応性があるとして同定されたク ローンは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの根源を供給する。このタンパ ク質は、Ｌｃ９Ｕｉ内で融合タンパク質として好都合に生産され得る。

爽立且工 ＧＳＴ　ム　ンパク　の ＤＮＡ挿入断片を、ＥｃｏＲＩで消化することによってλＺａｐ　Ｉ　Ｉファー ジから回収し、アガロースゲル電気泳動を用いて精製する。

精製ＤＮＡを発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘにリガンド結合する。このベクターは 、プラスミドがＬｃ９Ｕｉで発現されるとき、ＤＮＡ挿入断片によってコードさ れたタンパク質がグルタチオン−５−）ランスフェラーゼを有する融合タンパク 質を生産するものである。この手法は、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、Ｂ、、ら、Ｇｅｎｅ 　（１９８ｇ）　６７：３ｌ−４０１＝詳細に記載されている。ＤＮＡ挿入断片 を含むプラスミドをＬｃｏｌｔに形質転換し、得られた形質転換体をｌ　ＰＴＧ の存在下で増殖させる。誘導した融合タンパク質を、５ｓｉｔｈら（上述）によ って記載された、グルタチオンビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィ ーによって、溶菌液から精製する。

爽立且工 エエ囚免疫処Ｉ あらゆる種々の発現系由来の組換えペプチドを、特異的に反応する血液成分を得 る目的で、イヌに免疫を与えるために用いる。組換え抗体を、アジユバントを用 いであるいは用いずに、皮下経路、筋肉内径路、皮内経路、または静脈内経路に より、イヌに投与した。単純あるいは複合免疫処置を施した後、血液を、定めら れた静脈穿刺によってイヌから採集した。血清を、凝集した血液から採集し、そ のまま用いるか、または使用前に凍結保存する。白血球を、密度勾配遠心分離に よって抗凝集処理した血液から採集し、そのまま用いるか、または液体窒素中に 貯蔵して１℃／分で凍結させることにより保存する。

ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩｏ、　５８ ＦＩＧ、　６ 国際調査報告 ｂ＋＋ｅｍｅｄ＊−＾−ｍｏｔｈｅｓ　−、ＫＡ１１１２／＋１１＋８４・フロ ントページの続き （７２）発明者　フランク、グレン アメリカ合衆国　コロラド　８０５２４　フォート　コリンズ、アポッツフォー ド　ロード　３０２４ （７２）発明者　ミカーグリーブ、マルシアアメリカ合衆国　コロラド　８０５ ５０　ウィンザー、インディアン　トレイル　ドライブ１０１３ （７２）発明者　力ルペッパー、ジャニス　エイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０２２０ス　アルトス、ナンバー３．ガ ピランストリート５２５

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．感染症に対するワクチンとして候補となる成分をスクリーニングするための 有用な試薬であって、さらされた天然の宿主から得られる細胞、血清、またはこ れらの少なくとも１つの面分を含有し、そして、拡散膜内に閉じ込めた病原菌を 移植した動物に、該細胞、血清、または画分を供給すること、および該病原菌の 破壊あるいは減弱を観察することによって該細胞、血清、または画分が、該病原 菌を破壊あるいは減弱することを示す、試薬。
2. ２．前記動物がマウスである、請求項１に記載の試薬。
3. ３．前基病原菌が線虫である、請求項ｉに記載の試薬。
4. ４．前記線虫がｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　ｉｍｍｉｔｉｓである、請求項３に記 載の試薬。
5. ５．前記Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓがＬ３またはＬ４の幼虫齢である、請求項４に記載 の試薬。
6. ６．感染を防御するワクチンとして有用な免疫原をスクリーニングする方法であ って、 候補となる免疫原の根源に、該免疫原と該試薬との間で複合体化が起こる条件下 で、請求項１に記載の試薬を接触させる工程、および複合体化した免疫原を回収 する工程を包含する、方法。
7. ７．前記複合体から前記免疫原を回収する工程をさらに包含する、請求項６に記 載の方法。
8. ８．前記候補となる免疫原の根源が、病原菌からの抽出物を含有する、請求項６ に記載の方法。
9. ９．前記抽出物が画分に分けられている、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記候補となる免疫原の根源が、病原菌から得られた発現ライブラリーで ある、請求項６に記載の方法。
11. １１．前記発現ライブラリーが、λｇｔ１１またはλ５ｇｔｌｌ由来物にクロー ン化される、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記候補となる免疫原の根源が、合成ペプチドまたはグリコペプチドを含 有する、請求項６に記載の方法。
13. １３．前記病原菌が線虫である、請求項６に記載の方法。
14. １４．前記線虫がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓである、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記病原菌がＬ３またはＬ４の幼虫齢である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．感染症に対するワクチンとして候補となる成分をスクリーンするのに有用 な試薬を同定する方法であって、さらされた天然の宿主から得られる細胞、血清 、またはこれらの少なくとも１つの画分を、拡散膜内に閉じ込めた病原菌を移植 した動物に供給する工程、および該病原菌の該破壊あるいは該減弱を観察する工 程を包含する、方法。
17. １７．前記病原菌が線虫である、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記線虫がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓである、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記病原菌がＬ３またはＬ４の幼虫齢である、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．請求項１６に記載の方法によって同定される感染に対する防御に有用な物 質の組成物。
21. ２１．活性な構成要素として、請求項６に記載の方法によって同定される免疫原 を含有する、感染に対する防御に有用なワクチン。
22. ２２．前記免疫原が６６ｋｄ、６５ｋｄ、５９ｋｄ、３９ｋｄ、３３ｋｄ、２３ ／２４ｋｄ、２２／２０．５ｋｄ、および１４ｋｄからなる群から選択される分 子量を有する、請求項２０に記載のワクチン。
23. ２３．動物宿主に受動免疫を与える方法であって、与える免疫に対して有効な量 の請求項１に記載の試薬を該宿主に投与する工程を包含する、方法。
24. ２４．イヌ糸状虫感染に対する宿主を防御するための有効な免疫原であって、 精製および単離された型であり、そして３９ｋｄの分子量、約５のｐｌを有し、 および、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓのＬ３またはＬ４齢の抽出物から入手可能な免疫原 。
25. ２５．イヌ糸状虫に対するイヌの免疫処理のための薬剤組成物であって、 Ｌ３またはＬ４齢のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓから入手可能であり、３９ｋｄの分子量 、および約５のｐｌを有する成分を含有する、組成物。
26. ２６．イヌにイヌ糸状虫に対する免疫性を与える方法であって、 イヌ糸状虫感染に対し該被験体を防御するのに有効な請求項２１に記載の組成物 を、その処置に必要な量でイヌの被験体に投与する工程を包含する、方法。
27. ２７．イヌ糸状虫に対するイヌの免疫処理のための薬剤組成物であって、 請求項６に記載の方法によって、Ｌ３またはＬ４齢のＤ．ｉｍｍｉｔｉｓから同 定された免疫原を含有する、組成物。