KR20040102012A - 항체 어셈블리 단위를 보유하는 나노구조 - Google Patents

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KR20040102012A
KR20040102012A KR10-2004-7013093A KR20047013093A KR20040102012A KR 20040102012 A KR20040102012 A KR 20040102012A KR 20047013093 A KR20047013093 A KR 20047013093A KR 20040102012 A KR20040102012 A KR 20040102012A
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Abstract

나노구조는 항체 어셈블리 단위인 적어도 한가지 종류의 어셈블리 단위를 보유하는데, 여기서 적어도 2개의 결합 요소, 1개의 구조 요소 또는 1개의 기능 요소는 항체 또는 항체 단편이다. 항체 어셈블리 단위는 1가지 이상 종류의 항체 요소를 보유한다. 또한, 항체 어셈블리 단위는 비-항체 구조, 기능 또는 결합 요소를 보유한다. 이런 나노구조는 단계적 어셈블리 방법을 이용하여 적절하게 만들 수 있다. 적어도 하나의 결합되지 않은 결합 요소를 보유하는 나노구조 중간물질은 복수의 서로 다른 결합 요소를 보유하는 어셈블리 단위와 접촉시킨다. 어셈블리 단위의 어떤 결합 요소도 자신 또는 동일 어셈블리 단위의 다른 결합 요소와 상호작용할 수 없다. 하지만, 어셈블리 단위의 결합 요소중 하나는 나노구조 중간물질의 결합되지 않은 결합 요소와 상호작용하여 어셈블리 단위가 나노구조 중간물질에 비-공유 결합됨으로써, 후속 사이클에 사용되는 새로운 나노구조 중간물질을 형성할 수 있다. 결합되지 않은 어셈블리 단위는 제거하고, 사이클은 충분한 회수동안 반복하여 나노구조를 형성한다. 적어도 한 사이클에서 어셈블리 단위는 항체 어셈블리 단위이다.

Description

항체 어셈블리 단위를 보유하는 나노구조{NANOSTRUCTURES CONTAINING ANTIBODY ASSEMBLY UNITS}
나노구조는 나노메터(1-100㎚)범위의 한 개이상의 특징적인 크기를 가지는 개별 성분으로 된 구조를 말한다. 나노메터 범위의 물리적인 크기를 가지는 성분으로 된 구조를 어셈블리하는 경우에 유익한 점에 대해서는 지난 40년간 논의되어왔었다. 이와 같은 구조의 장점들이 처음으로 Feynman(1959, There's Plenty of Room at the Bottom, An Invitation to Enter a New Field of Physics (lecture), December 29,1959, American Physical Society, California Institute of Technology, reprinted in Engineering and Science, February 1960, CaliforniaInstitute of Technology, Pasadena, CA)에 의해 제기되었고, Drexler(1986, Engines of Creation, Garden City, N. Y.: Anchor Press/Doubleday)에 의해 상당히 확장되었다. 이들 과학자들은 매우 작은 특징적인 크기를 가지는 구조를 만들면 상당한 유용성이 있을 것으로 생각하였다. 나노기술의 가능한 응용 부분이 확산되고 있기 때문에, 사회에 기대되는 충격은 상당하다. (e.g., 2000, Nanotechnology Research Directions: IWGNWorkshop Report; Vision for Nanotechnology R & D in the Next Decade; eds. M. C. Roco, R. S. Williams and P. Alivisatos, Kluwer Academic Publishers). 전자 광학 성분; 의료 센서; 신물질; 생체적합성 장치; 나노전자 및 나노회로; 컴퓨터 기술 등을 포함한 나노장치의 방대한 응용분야가 있을 것으로 기대된다.
나노구조의 물리적 화학적 기여도는 이것을 구성하는 빌딩 블록에 달려있다. 예를 들면, 이들 빌딩블럭의 크기, 이들이 결합할 때 각도가 나노구조의 성질을 결정하는데 중요한 역학을 하고, 기능 요소가 어디에 자리잡느냐에 따라 달라진다. 나노구조에는 다양한 형태의 물질이 이용될 수 있는 예를 제공하는데, 이용될 수 있는 물질에는 DNA(US Patents Nos. 5,468,851, 5,948, 897 and 6,072, 044; WO 01/00876), 박테리오파아지 T-이븐 꼬리 섬유(US Patents Nos. 5,864, 013 and 5,877, 279 and WO 00/77196), 사람 엘라스틴 및 다른 섬유 단백질상에 모델이 되는 자가-배열 펩티드(US Patent No. 5,969, 106), 인위적인 펩티드 인지 서열(US Patent No. 5,712, 366)등이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 나노구조의 가망 응용분야를 모두 충족시키는데 요구되는 다양성을 제공할 수 있는 새로운 추가적인 빌딩블럭을 계속적으로 요구된다. 동일한 빌딩블럭을 포함하는 동형 나노구조와 다른 종류의 빌딩블럭과 복합시킨 이형 나노구조에 이용될 수 있는 추가 빌딩블럭을 본 출원에서 제공한다.
본 발명의 요약
본 발명은 복수 종류의 어셈블리 단위로부터 형성된 나노구조를 제시한다. 캡핑 단위와 같은 일부를 제외하고, 이들 어셈블리 단위는 복수의 서로 다른 결합 요소로 구성된다. 본 발명의 나노구조는 적어도 한가지 종류의 어셈블리 단위를 포함하는데, 여기서 적어도 하나의 결합, 구조 또는 기능 요소는 항체 또는 항체 단편으로 구성된다. 항체 어셈블리 단위는 한가지이상의 항체 또는 항체 단편 요소를 보유하고, 이에 더하여 항체 어셈블리 단위는 다른 비-항체 구조 기능 결합 요소를 보유할 수도 있다.
본 발명의 나노구조는 단계적 어셈블리 방법(staged assembly method)을 이용하여 적절하게 만들 수 있다. 이 방법에서, 적어도 한 개의 결합안된 결합 요소로 구성된 나노구조 중간물질은 상이한 다수의 결합 요소로 구성된 어셈블리 단위와 접촉할 수 있다; 여기서,
(i) 상이한 다수의 결합 요소중 어느 것도 자신 또는 다수 결합 요소와는 상호작용하지 않으며;
(ii) 나노구조 중개물질의 단일 미결합된 결합 요소와 상기 다수 구조의 단일 결합 요소는 상보적인 결합 요소이다.
결과적으로, 어셈블리 단위는 나노구조 중간물질에 비-공유 결합되어 후속 사이클에 사용되는 새로운 나노구조 중간물질을 형성한다. 이후, 결합되지 않은 어셈블리 단위는 제거하고, 이런 과정은 충분한 회수동안 반복하여 나노구조를 형성한다. 본 발명의 방법에서, 적어도 한 사이클에서 어셈블리 단위는 항체 어셈블리 단위로 구성된다.
본 발명은 나노구조의 구성에 사용하기 위하여 항체 또는 항체 단편 어셈블리 단위를 보유하는 나노구조의 어셈블리 방법 및 항체 또는 항체 어셈블리 단위를 보유하는 나노구조에 관한다.
도 1은 이디오토프/항-이디오토프 Fab-Fab 상호작용의 다이어그램이다. 상기 다이어그램은 이디오토프/항-이디오토프 상호작용(pdb entry 1CIC)을 통하여 상호작용하는 2개의 Fab 단편의 α-탄소 흔적을 보여준다. 굵은 선은 중쇄를 나타내고 가는 선은 Fab 단편의 경쇄를 나타낸다. 이디오토프/항-이디오토프 단백질 결합 상호작용은 상보성 결정 영역(CDR)에 포함된 중쇄의 루프 사이에서 발생한다. 이런 경우에, Fab간의 결합은 거의 선형의 결합을 유도한다.
도 2는 다이어바디(pdb entry1LMK)(상부) 및 단쇄 Fv(scFv) 항체(pdb entry 2APA)(하부)의 α-탄소 흔적의 3차원 구조를 나타내는 도면이다. 단량체 scFv 구조(하부)에서, 굵은 선은 중쇄를 나타내고, 가는 선은 경쇄를 나타낸다. 하지만, 이량체 다이어바디 구조(상부)에서 굵은 선은 한 scFv의 중쇄와 경쇄 모두를 나타내고, 가는 선은 다른 scFv의 중쇄와 경쇄 모두를 나타낸다. 좀더 긴 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 중쇄 가변 도메인을 보유하는 scFv 구조체는 안정한 단량체를 형성한다. 좀더 짧은 링커를 보유하는 구조체는 제 2 scFv 분자와 결합하여 도시된 2가 다이어바디를 형성한다. 주목할 점은 양 구조 내에 포함된 면역글로불린 폴드가 매우 유사하다는 점이다. scFv와 다이어바디, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편은 어셈블리 단위의 설계를 위한 기본 요소로 사용될 수 있다.
도 3은 단쇄 Fv 단편(scFv)의 다이어그램이다. 다이어그램의 상측은 VH-링커-VL scFv 단편 사이의 단량체, 이량체[다이어바디(diabody)], 삼량체[트라이어바디(triabody)], 사량체[테트라바디(tetrabody)] 결합을 보여준다. 다이어그램의 하측은 VL-링커-VH scFv 단편 사이의 이런 결합을 보여준다. scFv 도메인간 이들 결합은 VH와 VL 단위를 연결하는 펩티드 링커의 길이에 좌우된다. 좀더 긴 펩티드 링커(12-15개 잔기)는 단량체 형성을 유도하고, 좀더 짧은 링커(0-5개 잔기)는 다량체 구조를 유도한다. VH와 VL 유전자의 연쇄 순서 역시 생성된 scFv 단백질의 다량체 형성, 활성, 안정성에 영향을 준다. 이런 유형의 재조합 항체는 IgG로부터 유래되는 가장 작은 기능 항원 결합 존재중 하나이고, 어셈블리 단위 제조에서 구조와 결합 요소로 사용될 수 있다.
도 4(A-B)는 2가지 다이어바디 단위, Unit 1(A)과 Unit 2(B) 및 이들의 연관된 유전자의 다이어그램이다. Unit 1은 A x B 다이어바디인데, 여기서 A의 VH와 VL 도메인은 라이소자임 동위원소 항체(D1.3)를 정의하고 B의 VH와 VL 도메인은 바이러스 중화 이디오토픽 항체(730.1.4)를 정의한다. 원하는 다이어바디 산물의 정제를 촉진하기 위하여, VHA와 VLB를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하고 VHB와 VLA를 인코드하는 유전자는 이를 보유하지 않는다. Unit 2는 B' x A' 다이어바디인데, 여기서 B'의 VH와 VL 도메인은 바이러스 중화 이디오토픽 항체(409.5.3)를 정의하고 A'의 VH와 VL 도메인은 라이소자임 동위원소 항체(E5.2)를 정의한다. 원하는 다이어바디 산물의 정제를 촉진하기 위하여, VHB'와 VLA'를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하고 VHA'와 VLB'를 인코드하는 유전자는 이를 보유하지 않는다.
도 5는 원형 IgG1(Protein Data Bank (pdb) entrylIGY)의 α-탄소 흔적을 나타내는 도면이다(Harris et al.,1998, Crystallographic structure of an intactIgG1 monoclonal antibody, J. Mol. Biol. 275 (5): 861-72)(Protein Data Bank (pdb)에 관하여 아래의 문헌을 참조한다: Berman et al., 2000, The Protein Data Bank, Nucl. Acids Res. 235-42; Saqi et al., 1994, PdbMotif-a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl. Biosci. 10 (5): 545-46). 굵은 선은 중쇄를 나타내고, 가는 선은 경쇄를 나타낸다. Fab 단편의 Fv와 CH1 도메인 및 Fc 단편의 CH2와 CH3 도메인은 표지한다. 회색 화살촉으로 표시된 볼-스틱 모델링은 이황화 시스테인 결합을 나타낸다. 이황화 가교 상호작용의 클러스터는 Fab와 Fc 단편 사이에 위치된 유연성 힌지 영역에서 발생한다. 이들 상호작용은 이량체화(dimerization)를 보조하고 면역글로불린에서 이런 고도 유연성 영역의 구조적 일체성을 제공한다. 도면은 프로그램 SETOR(Evans, 1993, SETOR: Hardware lighted three- dimensional solid model representations of macromolecules, J. Mol. Graphics, 11: 134-38)로 만들었다.
도 6은 어셈블리 단위의 설계에서 구조 요소로 사용될 수 있는 Fab 단편(pdb entry1 CIC)의 α-탄소 흔적을 나타내는 도면이다. 굵은 선은 중쇄를 나타내고, 가는 선은 경쇄를 나타낸다. 중쇄(VH와 CH1) 및 경쇄(VL과 CL)의 도메인은 표지한다. 가변 도메인과 불변 도메인을 연결하는 유연성 Fab "엘보우" 또는 벤드 영역을 또한 표시한다. 벤드의 Fab 각도는 동일한 항체 종의 구성원 사이에서도 매우 가변적이다(127-176ㅀ).
도 7은 1가, 2가, 단일특이적, 이중특이적 항체를 비롯한 다양한 IgG의 개요도이다. 단일 세포주로부터 유래된 IgG는 동질성 IgG이다. 따라서, 결과의 IgG는 2가-단일특이적 항체이다. 하이브리드 하이브리도마, 예를 들면 콰드로마(quadroma)는 융합 세포주로부터 생성된다. 하이브리드 하이브리도마에 의해 생산된 IgG는 이질성 2가-이중특이적(예, 이질성-F(ab')2) IgG와 동질성 2가-단일특이적(예, F (ab')2) IgG의 혼합물이다. 따라서, 하이브리드 하이브리도마 헤테로이량체는 2가-이중특이적 F(ab')2의 공급원이 된다. 원형 IgG 분자, 결합 유도체 또는 이의 결합 단편은 어셈블리 단위의 설계를 위한 기본 요소로 사용될 수 있다.
도 8은 프로테아제에 제한적 노출 직후에 성분 단편, F(ab')2와 Fc로 절단되는 IgG 분자의 개요도이다. 여러 이황화-결합 상호작용을 보유하는 힌지 영역은 Fab 단편의 이량체화를 유지하는데 도움을 준다. 후속으로, F(ab')를 환원 조건에 노출시키면, 단편간 힌지 이황화 가교 상호작용이 파괴되고 단량체 Fab가 산출된다. IgG의 개별 기능 단편(예, Fab 단편)은 화학적 가교-결합으로 2가-이중특이적 이질성 F(ab')2를 만드는 것과 같이 어셈블리 단위의 설계에서 특정 용도로 분리할 수 있다.
도 9(A-D). 다양한 특이성을 보유하는 항원-결합 단편의 이량체화를 조장하도록 개발된 이량체화 모티프. 루이신 지퍼 모티프(연장된 타원체로 묘사됨), 예를 들면 Jun-Fos 또는 GCN4(Kostelny et al., 1992, Formationof a bispecific antibody by the use of leucine zippers, J. Immunol.148(5) : 1547-53; de Kruif et al., 1996, Leucine zipper, dimerized bivalent and bispecific scFvantibodies from a semi-synthetic antibody phage display library, J. Biol. Chem. 271 (13): 7630-34), 또는 4개-나선 번들 모티프((C)와 (D)에서 직사각형으로 묘사됨), 예를 들면 Rop(Pack et al., 1993, Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density fermentation of Escherichia coli, Biotechnology (NY) 11 (11): 1271-77; Muller et al., 1998, A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett. 432 (1-2): 45-49)를 이용하여 항원-결합 다량체의 안정적인 이량체화를 촉진할 수 있다. 이들 이량체화된 항원-결합 다량체는 어셈블리 단위 제조에서 구조와 결합 요소로 사용될 수 있다.
도 10은 ROP 단백질, 4개 나선 번들의 다이어그램이다.
도 11은 어셈블리 단위의 단계적 어셈블리를 나타낸다. 실제, 단계적 어셈블리에 있는 각 단계는 대규모로 나란한 방식으로 실행한다. 단계1에서, 개시단위는 고형 기질에 고정시킨다. 여기에서 설명하는 본 발명의 구체예에서, 개신 단위는 단일 결합 요소이다. 단계 2에서, 제 2 어셈블리 단위가 첨가된다. 제 2 단위는 두 개의 비-상보적인 결합 요소를 가지고 있고, 이 단위는 용액에서 자체 연합되지 않는다. 제 2 어셈블리상에 결합 요소중 하나는 개시 단위에 있는 결합 요소에 상보적이다. 비-결합된 어셈블리 단위는 각 단계에서 씻어낸다(나타내지 않음).
배양이후, 개시 단위에 제 2 어셈블리 단위가 결합하여, 두 개 어셈블리 단위로 구성된 나노구조 중간물질을 만든다. 단계 3에서, 제 3 어셈블리를 첨가한다. 이 단위는 나노구조 중간물질상에 쌍을 이루지 않은 결합 요소에만 상보적인 두 개비-상보 결합 요소를 가진다. 이 단위에도 기능 단위("F3")가 포함된다.
"F4" 기능 요소를 가지는 제4 결합 단위와 "F5" 기능 요소를 가지는 제 5 어셈블리 단위를 단계 4와 5에 단계 2와 3의 것과 정확하게 유사한 방식으로 각각 첨가한다. 각 경우에, 결합 요소들을 선택하여 한번에 한 단위이상 추가되지 않도록 하고, 또한 이는 이미 지정된 위치에 기능 단위를 매우 잘 조절하여 어셈블리되도로록 한다.
도 12. 서브어셈블리로부터 나노구조 생성. 나노구조는 연속하여 서브어셈블리를 첨가하여 만들 수 있는데, 상기 도 2에서 설명한 것과 같이 개별 요소들을 추가하는데 이용된 것과 유사한 단계를 이용한다. 화살표는 커지는 나노구조에 서브어셈블리를 추가한다는 것을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기(inorganic) 요소의 추가를 설명하는 다이어그램이다. 단계 1에서, 개시 단위가 고형 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위는 개시 단위에 특이적으로 결합되고, 단계 3에서, 추가 어셈블리 단위는 어셈블리로 만들어지고 있는 나노구조에 결합된다. 이와 같은 어셈블리 단위는 특정 무기 요소에 특이적인 조작된(engineered) 결합 부위를 포함한다. 단계 4에서, 무기 요소(빗금친 타원)을 구조에 첨가하고, 조작된 결합 부위에 결합시킨다. 단계 5에서 제 2 형태의 무기 요소에 특이성을 가지도록 조작된 결합 부위를 가지는 또 다른 어셈블리 단위를 첨가하고, 제 2 무기 요소(빗금친 다이아몬드)를 단계 6에서 첨가한다.
도 14는 이중특이적인 어셈블리 단위와 이차원 나노구조를 만들기 위한 한개 테트라 특이적 어셈블리를 이용할 수 있는 11 단계 어셈블리를 나타내는 다이아그램이다.
도 15(A-B)는 서브어셈블리로써 나노구조 중간물질을 이용하는 단계적으로 생성된 어셈블리의 다이어그램이다. 단계 1-3에서, 나노구조 중간물질이 만들어지고, 두 개 결합 요소들이 캡씌워지고, 고형 기질로부터 나노구조 중간물질이 방출된다. 단계 5에서, 단계 3의 나노구조 중간물질을 고유 서브어셈블리인 어셈블리 중간물질(단계 4에서 도시된 바와 같이 고형 기질에 부착됨)에 첨가된다.
도 16은 전형적인 입방체 나노구조의 단계적 어셈블리에 이용되는 32 단계의 순서 다이어그램이다. 입방체 나노구조는 처리된 다이어바디와 트라이어바디 단편으로부터 구조 요소를 포함하는 어셈블리 단위로부터 조립된다. 어셈블리 단위의 결합 요소는 다이어바디 또는 트라이어바디의 다중특이적 결합 도메인이다. 7개의 상보성 결합쌍이 이용된다: A와 A', B와 B', C와 C', D와 D', E와 E', F와 F', G와 G'. 넘버링(1-32)은 각 단계동안 추가되는 어셈블리 단위를 표시한다.
정의: 본 명세서에서 용어는 당분야의 통상적인 의미와 일치한다. 하지만, 명확하게 하기 위하여, 당분야의 통상적인 의미와 상이한 경우에 아래의 정의를 따른다.
항체 어셈블리 단위: 적어도 하나의 결합 요소, 구조 요소 또는 기능 요소가 항체, 항체 단편 또는 이들의 결합 유도체인 어셈블리 단위. 항체, 결합 유도체 또는 결합 단편은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 이들의 아종을 비롯한 임의 종류의 면역글로불린 분자이다.
항체 단편: 에피토프에 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체의 일부분. 항체 단편의 예에는 Fab 또는 F(ab')2항체 단편, 단쇄 항체 단편(scFv), 이중특이적 IgG, 키메라 IgG 또는 이중특이적 이형이량체 F(ab')2항체 단편, 다이어바디 또는 다량체 scFv 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
어셈블리 단위(Assembly Unit):어셈블리 단위는 구조 요소, 결합 요소, 기능 요소들로 구성된 원자 또는 분자 집합체이다. 바람직하게는 어셈블리 단위는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 단일 단위로 나노구조에 첨가한다. 어셈블리 단위에는 두 개 이상의 서브-어셈블리 단위를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에는 한 개 이상의 구조 요소를 포함할 수 있고, 나아가 한 개 이상의 기능 요소 및 한 개 이상의 결합 요소를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에 기능 요소를 포함하는 경우에, 기능 요소는 특정 구체예에 따르면 결합 요소 또는 구조 요소내에 부착 또는 결합된다. 이와 같은 구조 요소 및 한 개 또는 다수의 비-상호작용을 하는 결합 요소를 포함하는 어셈블리 단위는 특정 구체예에서는 구조적으로 딱딱하고, 잘 정의된 인지 및 결합 성질을 가질 수 있다.
어셈블리 단위, 개시물질(Assembly Unit, Initiator): 개시물질 어셈블리 단위는 본 발명의 단계적으로 생성되는 어셈블리 방법에 따라 형성되는 나노구조에 결합되는 제 1 어셈블리 단위이다. 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 단계적로 생성되는 공정에 제 1 단계로써 고형 기질 또는 다른 매트릭스에 부착될 수 있다.개시물질 어셈블리 단위는 "개시 단위("initiator unit")로 한다.
결합 단편, 결합 유도체(Binding Fragment, Binding Derivative): 항체 또는 항체 단편의 결합 유도체는 결합 유도체가 유래된 항체, 항체 단편, 단쇄 항체 단편(scFv) 등의 결합 특이성을 보이는 유도체이다. 항체 또는 항체 단편의 결합 단편은 결합 단편이 유래된 항체, 항체 단편, 단쇄 항체 단편(scFv) 등의 결합 특이성을 보이는 단편이다.
상향식(Bottom-up): 구조(나노구조)의 상향식(Bottom-up) 어셈블리는 자가-어셈블리 또는 단계적 어셈블리를 이용하여 서브구조를 결합시켜 구조를 만드는 것이다.
캡핑 단위(Capping Unit): 캡핑 단위는 적어도 한 개 결합요소를 포함하는 어셈블리 단위이다. 캡핑 단위가 일단 나노구조에 결합된 후에는 캡핑 단위와 상호작용을 통하여 나노구조내로 추가적인 어셈블리 단위가 결합할 수 없다.
유도체(Derivative): 본 발명의 사용되는 목적 단백질, 예를 들면 항체의 유도체는 기능적 등가 분자를 제공하는 치환, 부가 또는 결실로 서열을 변화시켜 만들 수 있다. 뉴클레오티드 코딩서열의 축중으로 인하여, 목적 단백질을 인코드하는 유전자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코드하는 다른 DNA 서열이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 여기에는 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열이 포함하는데, 이들 서열은 서열 내에서 실질적으로 등가의 아미노산 잔기를 인코드하는 상이한 코돈으로의 치환에 의해 침묵 변화된다.
유사하게, 목적 단백질의 유도체에는 변형된 서열을 보유하는 목적 단백질의아미노산 서열의 전체 또는 일부를 일차 아미노산 서열로 보유하는 유도체가 포함되는데, 여기서 기능적 등가 아미노산 잔기는 서열 내에서 침묵 변화를 결과하는 잔기로 대체된다. 가령, 서열 내에서 하나이상의 아미노산 잔기가 기능적 등가물로 작용하는 유사 극성의 다른 아미노산으로 치환되어 침묵 변화를 결과될 수 있다. 서열 내에서 아미노산에 대한 치환체는 상기 아미노산이 속하는 종류의 다른 구성원에서 선택된다. 가령, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등이다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등이다. 양성 전하된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 등이다. 음성 전하된(산성) 아미노산은 아스파라긴산과 글루탐산 등이다.
대안으로, 항체의 유도체 또는 유사체는 목적 항체와 실질적으로 상동한 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는 분자(예, 다양한 구체예에서, 동일한 크기의 아미노산 서열에서 또는 당분야에 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램으로 정렬된 서열과 비교하여 적어도 60%, 70%, 0%, 90%, 95% 동일성) 또는 인코딩 핵산이 높은 엄밀도 또는 중간 엄밀도하에 목적 단백질을 인코드하는 서열과 혼성화될 수 있는 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 높은 또는 중간 엄밀도 조건은 당분야에 공지되어 있다.
제 1 어셈블리 단위, 제 1 요소(First Assembly Unit, First Element): 명확하게 하기 위하여, 어셈블리 단위 또는 요소는 "제 1"또는 "제 2"와 같은 표지를 이용하여 표시한다. 이는 표지를 위한 것이며, 나노구조 내에서 참조된 어셈블리단위 또는 요소의 위치를 지시하지 않는다.
기능 요소(Functional Element): 기능 요소는 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성질을 나타내는 부분으로, 나노구조내에 정의된 위치에 특이적인 공유 또는 비-공유 상호작용을 통하여 만들어 질 수 있다. 또는, 기능 요소를 이용하여 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성물을 가지는 부분을 부착 부위에 제공한다. 기능을 하는 요소에는 펩티드, 단백질(효소), 단백질 도메인, 소분자, 무기( inorganic) 나노입자, 원자, 원자 덩어리, 자성 나노입자, 광자 나노입자, 전자 나노입자 또는 방사능 활성 분자, 크로포포어, 형광단, 화학발광 분자와 같은 마커등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 기능을 하는 원자들을 교차-연결 선형 1차원 나노구조에 이용하여 2차원 또는 3차원 나노구조를 만든다.
결합 요소(Joining Element): 결합 요소는 단위에 결합 성질을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분인데, 예를 들면, 결합 도메인, 합텐, 항원, 펩티드, PNA, DNA, RNA, 아프타머(aptamer), 폴리머 또는 다른 부분 또는 이들의 복합물이 포함되는데, 이들은 다른 결합 요소들과 특이적, 비-공유 상호작용을 할 수 있다.
결합 요소, 상보적: 상보적 결합 요소는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 서로간에 상호작용할 수 있는 두가지 결합 요소들이다.
결합 요소, 비-상보적: 비-상보적인 결합 요소들은 서로간에 특이적인 상호작용을 하지 않거나 서로간에 특이적인 상호작용 경향이 없는 두 개 결합 요소이다.
결합쌍: 결합쌍은 2개의 상보적인 결합 요소들을 말한다.
나노물질(Nanomaterial): 나노물질은 나노구조 입자의 결정, 부분 결정 또는 비결정 어셈블리를 구성되는 물질이다.
나노입자(Nanoparticle): 나노입자는 나노메터(1-1000㎚) 범위 직경을 만들기 위해 원자 또는 분자가 서로 결합된 결합체를 말한다. 입자는 동형 또는 이형일 수 있다. 단일 결정 도메인을 포함하는 나노입자를 나노결정(nanocrystals)이라고도 한다.
나노구조(Nanostructure) 또는 나노장치(Nanodevice): 나노구조 또는 나노장치는 구조적, 기능적, 결합 요소와 같은 어셈블리 단위를 포함하는 원자 또는 분자 집합체인데, 요소들은 나노메터 범위의 적어도 한가지 특징적인 길이(크기)를 가지는데, 서로에 대해 어셈블리 단위의 위치는 정의된 기하학에 의해 정해진다. 나노구조 또는 나노장치에는 이에 부착된 기능치환체가 있어 특정 기능성을 제공한다.
나노구조 중간물질(Nanostructure intermediate): 나노구조 중간물질은 추가 어셈블리 단위가 첨가되는 나노구조의 어셈블리하는 동안에 만들어지는 중간 서브구조이다. 최종 단계에서, 중간 생성물 및 나노구조는 동일하다.
비-공유 상호작용, 특이적(Non-covalent Interaction, Specific): 특이적인 비-공유 상호작용은 예를 들면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간 물질간에 일어나는 상호작용을 말한다.
단백질(Protein): 본원에서, "단백질"은 일반적으로 펩티드, 폴리펩티드, 다수의 아미노산으로 구성된 단백질을 말하고, 임의 최소 아미노산 수를 부여하지는 않는다.
제거(Removing): 비-결합된 어셈블리 단위를 제거는 물리적으로 제거되는 여부에 관계없이 나노구조 생장에 추가적으로 관여할 수 없는 경우에 실시한다.
자가-어셈블리(Self-assembly): 자가 어셈블리는 순서에 맞는 구조로 요소들이 자발적으로 조직화되는 것을 말한다. 자동 어셈블리라고도 한다.
나노구조의 단계적 어셈블리(Staged Assembly of a Nanostructure): 나노구조의 단계적 어셈블리는 나노구조의 어셈블리 과정을 말하는 것으로, 이때 일련의 어셈블리 단위가 미리-정해진 순서로 첨가되는데, 고형 매트릭스 또는 기질상에 일반적으로 고정된 개시 단위를 시작으로 한다. 각 단계로 나노구조 중간물질이라고도 하는 중간 서브 구조가 만들어지고, 추가 어셈블리 단위가 첨가된다. 어셈블리 단계는 (i) 연결 단계, 즉, 어셈블리 단위가 개시 단위에 연결되어나 또는 다음에 첨가되는 그 다음 어셈블리 단위를 포함하는 용액에 개시 단위 또는 나노구조 중간물질이 부착된 매트릭스 또는 기질을 배양함으로써 나노구조 중간물질에 연결된다; (ii) 제거 단계 또는 세척 단계, 이 단계는 중간 구조 또는 완성된 나노구조로부터 과량의 어셈블리 단위를 제거한다. 단계 (i)과 (ii)를 반복하여, 모든 어셈블리 단위가 원하는 모양의 나노구조가 될 때 까지 결합되는 과정으로 형성된 단계적으로 만들어진 어셈블리를 지속한다. 어셈블리 단위는 개시 단위 또는 특이적, 비-공유 결합을 통하여 나노구조 중간물질에 결합한다. 나노구조 중간물질의 예정된 위치에만 부착될 수 있는 어셈블리 단위의 결합 요소를 선택한다. 어셈블리 단위, 구조 요소, 결합 요소, 기능 요소의 상대적인 위치등에 대한 기하학 및 어셈블리 단위가 나노구조로 첨가되는 순서들을 모두 계획하여, 기능 단위가 구조에서 상대적으로이미 예정된 위치에 가도록 하여, 완전하게 어셈블리된 나노구조가 원하는 기능을 하도록 한다.
구조 요소: 구조 요소는 결합 요소간에 구조적 또는 기하학적 연결을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분으로 인접하는 어셈블리 단위에 기하학적 연결을 제공한다. 구조 요소들은 나노구조의 일부가 되는 구조적 프레임 워크를 제공한다.
서브어셈블리(Subassembly): 서브어셈블리는 서로 결합된 다중 어셈블리 단위로 구성된 원자 또는 원자 단위로, 전체로 어셈블리 중간물질(가령 나노구조 중간물질)로 통째로 첨가될 수 있다. 본 발명의 많은 구체예에서, 구조 요소들이 어셈블리 단위에 기능 요소들을 지원할 수도 있다.
하향식(Top-down): 구조(나노구조)의 하향식 어셈블리는 석판술(lithographic techniques)을 이용하여 더 큰 거대 구조를 처리함으로써 나노구조를 만드는 것이다.
항체 어셈블리 단위
본 발명은 나노구조의 생산에 사용될 수 있는 새로운 종류의 어셈블리 단위를 제시한다. 이들 "항체 어셈블리 단위"는 항체 또는 항체 단편인 적어도 하나의 결합, 구조 또는 기능 요소를 보유한다. 이에 더하여, 상기 어셈블리 단위는 구조 요소 및/또는 다른 결합과 기능 요소를 포함할 수 있다.
키메라 항체와 항체 단편
본 발명은 키메라 항체 또는 항체 단편을 포함하는 어셈블리 단위를 이용하는 나노구조의 단계적 어셈블리를 제시한다. 융합 또는 키메라 단백질 산물(이질성단백질(상이한 단백질) 서열에 펩티드 결합을 통하여 결합된 원하는 단백질(예, IgG), 단편, 유사체 또는 유도체를 포함)의 생산. 이런 키메라 단백질 산물은 적절한 개방 틀에 당분야에 공지된 방법으로 원하는 아미노산 서열을 인코드하는 적절한 핵산 서열을 서로 결찰시키고, 당분야에 공지된 방법으로 키메라 산물을 발현시켜 만들 수 있다. 대안으로, 이런 키메라 산물은 합성 기술, 예를 들면 펩티드 합성장치를 이용하여 만들 수도 있다.
IgG 및 이의 결합 유도체 또는 결합 단편, 예를 들면 IgG, Fab, scFv, (scFv)2, (scFv)3의 3차원 구조는 밝혀졌다(Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9 A resolution, J. Mol. Biol. 264(1): 137-51; Ban et al., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 (5): 1604-08; Perisic et al., 1994, Crystal structure of a diabody, a bivalent antibody fragment, Structure 2 (12): 1217-26; Harris et al., 1998, Crystallographic structure of an intact IgGl monoclonal antibody, J. Mol. Biol. 275 (5): 861-72; Pei et al., 1997, The 2.0-A resolution crystal structure of a trimeric antibody fragment with noncognate VH-VL domain pairs shows a rearrangement of VH CDR3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (18): 9637-42). 적절하게는, 각 IgG-유래된 항체 단편은 적어도 하나의 일가와 단일특이적 상보성 결정 영역(CDR) 또는 결합 요소를 보유한다. 적절하게는, CDR은 고도 특이적 분자간 상호작용이 단백질 성분간에 발생할 수 있는 각 구조에 포함된 위치이다.
재조합 조작된 항체는 나노구조의 단계적-어셈블리에 대한 어셈블리 단위의 구성에 사용되는 기준을 충족하고 이런 나노구조를 제조하는데 이용되는 결합 구조의 바람직한 공급원이다. 이런 재조합 항체 결합 도메인은 구조적으로 특성화되어 있을 뿐만 아니라 어셈블리 단위 추가에 요구되는 내재된 결합 특이성(결합 요소)를 갖는다.
가령, 재조합 조작된 성분의 공지된 3차원 구조는 항체 단편에 신규한 결합, 구조 또는 기능 특성을 공여하는 펩티드의 삽입(가령, 표면 루프의 위치에서)을 가능하게 하는 항체 단편에 구조 변화의 설계를 위한 가이드 역할을 할 수 있다. 게다가, 라이브러리부터 설계되거나 구조되거나 선택될 수 있는 극히 다양한 분자간 특성, 예를 들면 항체와 특이적 에피토프에 수반되는 분자간 특성이 존재한다. 재조합 항체 기술에서 진보는 본 발명에 따라 구조 요소와 결합 요소의 공급원으로 사용될 수 있는 다가, 다중특이적, 다중기능적 항체의 창조를 가능하게 하였다(Chaudhary et al., 1989, A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin, Nature 339 (6223): 394-97; Neuberger et al. 1984, Recombinant antibodies possessing novel effector functions, Nature 312 (5995): 604-08; Wallace et al., 2001, Exogenous antigen targeted to FcgammaRI on myeloid cells is presented in association with MHC class I, J. Immunol. Methods 248 (1-2):183-94). 이런 다가, 다중특이적, 다중기능적 항체는 본 발명의 나노구조의 제조에 사용되는 어셈블리 단위의 구성을 위한 기능기의 추가로 변화시킬 수 있다.
항체 결합 요소
항원-항체 상호작용을 보이는 결합 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 결합 요소는 항체, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편으로부터 유래되고, 결합쌍의 형성에 이용되는 항원-항체 상호작용을 보인다. 구조 정보가 다양한 항체-항원 복합체에 이용가능하다. 이런 구조 정보는 본 발명의 방법에 따른 나노구조의 제조를 위한 결합 요소를 설계하는데 이용될 수 있다. 항체의 가변 도메인은 항원 표저고가 특이적으로 상호작용하도록 설계된다. 이들의 구조와 안정성은 당분야에 특성화되어 있고, 항체와 항체 결합 단편은 당분야에 공지된 방법으로 조작할 수 있다. 결과적으로, 항체의 가변 도메인은 나노구조 어셈블리 단위로 사용되는 결합 요소로 높은 잠재력을 지닌 분자이다. 이런 요소는 어셈블리 단위와 개시물질 또는 나노구조 중간물질 사이의 특이적 결합 상호작용의 기초를 제공한다.
항체-항원의 결합은 매우 특이적인 것으로 알려져 있다(Davies et al., 1990, Antibody-antigen complexes, Ann. Rev. Biochem. 59: 439-73; Mian et al., 1991, Structure, function and properties of antibody binding sites, J. Mol. Biol. 217(1) : 133-51; Wilson et al., 1994, Antibody-antigen interactions: new structures and new conformational changes, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 (6): 857-67; Davies et al., 1996, Interactions of protein antigens with antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1) : 7-12). 이런 높은 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정부위, 즉 에피토프 또는 합텐간 높은 상보성과 상관하는 것으로 밝혀졌다. 이런 상보성은 상보성 결정 영역(CDR)으로 정의되는 항체 결정 표면 및 항원 결정 표면에 의해 정의되고, 하나의 감퇴는 다른 하나의 돌출로 채워진다. 또한, 상보성은 이온 결합을 형성하는 물리적, 화학적 특성, 예를 들면 반대 전하 측쇄 상호작용을 보인다. CDR과 항원 결정 표면간 발생하는 특이성은 한가지 유형 또는 한 쌍의 비-상보성 결합 요소 상호작용을 정의할 수 있다.
소수성 상호작용을 형성하는 많은 방향족 측쇄 잔기가 이들 항체-항원 상호작용에 존재한다. 일부 항원-항체 복합체간 상보성은 물 분자가 인터페이스로부터 접근이 배제될 만큼 정확하다. 삽입과 결식을 비롯한 CDR 루프 내에서 잔기의 구조적, 화학적 다양성과 함께, 이런 특징은 서로 다른 항체의 리간드 결합의 특이성과 다양성을 가능하게 한다(Winter et al., 1991, Man-made antibodies, Nature 349 (6307): 293-99; Davies et al., 1996, Interactions of protein antigens with antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1) : 7-12); Wedemayer et al., 1997, Structural insights into the evolution of an antibody combining site, Science 276 (5319): 1665-69). 서로 다른 항체에 의한 리간드 결합의 이런 공지된 특이성과 다양성은 본 발명의 방법에 따라 나노구조를 구축하는데 사용되는 결합 요소를 설계하는데 이용될 수 이TEk.
본 발명의 방법에 사용되는 항체 또는 이의 일부는 다중특이적(하나이상의 리간드에 결합 친화성을 보인다) 또는 단일특이적(하나의 리간드에 결합 친화성을 보인다)이다. 일반적으로, 항체는 10-1내지 10-4nM 범위 또는 그 이상의 결합 친화성을 보인다(Padlan, 1994, Anatomy of the antibody molecule, Mol. Immunol. 31 (3): 169-217).
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 3가지 초변이 영역, CDR이 삽입된 "골격" 영역으로 구성된다. Fv 단편은 6개 가변 루프 영역(VL 사슬로부터 3개와 VH 사슬로부터 3개)를 보유한다. 가변 사슬에 포함된 이들 각 변이 폴리펩티드 루프 영역은 잔기 서열과 길이에서 차이를 보인다. 이런 영역에서 잔기는 초변이 상보성-결정 영역(CDR), 또는 비-초변이 또는 골격 영역으로 지정된다(Wu et al., 1970, An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity, J. Exp. Med 132 (2): 211-50; Wu et al., 1975, Similarities among hypervariable segments of immunoglobulin chains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (12): 5107-10; Wu et al., 1993, Length distribution of CDRH3 in antibodies, Proteins 16(1) :1-7). 골격 영역과 CDR의 정도는 정확하게 정의된다(참조: Kabat et al., 1983, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services).
이들 가변 루프 영역은 항체의 항원-인식 부위를 거의 완전하게 정의한다. CDR3(CDR3-L과 CDR3-H)은 항체-항원 인식 상호작용에서 가장 중요하고 서열과 형태에서 가장 가변적이다. 항원 결합에 대한 VL과 VH 사슬의 CDR 루프로부터 기여는 상대적으로 일정하다. 항원과 복합된 항체의 구조 분석에서 상호작용 표면 영역의 대략 41-44%가 경쇄에 의해 기여되고 중쇄는 56-59% 기여하는 것으로 확인되었다(Davies et al., 1990, Antibody-antigen complexes, Annu. Rev. Biochem. 59: 439-73). 항원과 상호작용하는 잔기의 전체 개수는 상대적으로 적다. 항체-항원 복합체의 구조 분석에서 평균적으로 15개의 항체 잔기가 항원과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, CDR 루프 내에서 다른 잔기가 부가적인 항체-항원 상호작용을 제공하고 항체 결합 부위 구조를 유지시키는 구조적 역할을 제공할 수도 있다(Davies et al., 1990, Antibody-antigen complexes, Annu. Rev. Biochem. 59: 439-73; Wilson and Stanfield, 1994, Antibody-antigen interactions: new structures and new confonnational changes, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 (6): 857-67; Davies and Cohen, 1996, Interactions of protein antigens with antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1) : 7-12).
재조합 조작된 항체, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편으로 구성되는 결합 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 결합 요소는 재조합 조작된 항체, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편으로 구성된다. 당분야에 공지된 다가, 다중특이적 및/또는 다중기능적인 재조합 조작된 항체는 다수 존재하는데, 이들은 나노구조의 단계적 어셈블리의 어셈블리 단위의 설계에 결합 요소로서 적합하다. 이런 어셈블리 단위는 원하는 나노구조를 제조하기 위한 본 발명의 방법에서 변형되지 않거나 본원에서 밝힌 바와 같이 변형될 수 있다.
결합 요소로 이용되는 재조합 조작된 항체, 결합 유도체 또는 이의 결합 단편의 일부 예는 아래와 같다:
(i) 하이브리드 하이브리도마 또는 콰드로마(quadroma(특정 이중특이성 항체, 즉 2가지 상이한 Fab 결합 분절을 갖는 항체 분자를 생산하는 세포주)로부터 유래된 면역글로불린을 비롯한 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 또는 이들의 아종;
(ii) Fv, scFv, Fab와 같은 다가, 다중특이적 항체(Ban, et al., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5): 1604-08, Freund et al., 1994, Structural and dynamic properties of the Fv fragment and the single-chain Fv fragment of an antibody in solution investigated by heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy, Biochemistry 33(11) : 3296-303; Boulot et al., 1990, Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the bacterially expressed Fv from the monoclonal anti-lysozyme antibody D1.3 and of its complex with the antigen, lysozyme, J. Mol. Biol. 213 (4): 617-19; Padlan, 1994, Anatomy of the antibody molecule, Mol.hnmunol. 31 (3): 169-217);
(iii) 부가된 기능이 존재하거나 존재하지 않는 2가, 3가, 모노-, 바이-, 또는 트리-특이적 항체, 예를 들면 하이브리드 하이브리도마로부터 유래된 IgG, F(ab')2, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이질성-F(ab')2, Fab-scFv 융합체 또는 F(ab')2-scFv 융합체(Milstein and Cuello, 1983, Hybrid hybridomas and their use inimmunohistochemistry, Nature 305 (5934): 537-40; Neuberger et al., 1984, Recombinant antibodies possessing novel effector functions, Nature 312 (5995): 604-08; Weiner, 1992, Bispecific IgG and IL-2 therapy of asyngeneic B-cell lymphoma in immunocompetent mice, Int. J. Cancer Suppl. 7: 63-66, Holliger and Winter, 1993, Engineering bispecific antibodies, Curr. Opin. Biotechnol. 4(4) : 446-49; Dolezal et al., 1995, Escherichia coli expression of a bifunctional Fab-peptide epitope reagent for the rapid diagnosis of HIV-1 and HIV-2,hnmunotechnology 1 (3-4): 197-209; Tso et al., 1995, Preparation of a bispecific F(ab')2 targeted to the human IL-2 receptor, J. Hematother. 4 (5): 389-94; Atwell et al., 1996, Design and expression of a stable bispecific scFv dimer with affinity for both glycophorin and N9 neuraminidase, Mol. Immunol. 33 (17-18): 1301-12; deKruif et al., 1996, Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library, J. Biol. Chem. 271 (13): 7630-34; Kipriyanov et al., 1998, Bispecific CD3 xCD19 diabody for T cell-mediated lysis of malignant human B cells, Int. J. Cancer 77 (5): 763-72; Muller et al., 1998, A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett. 432 (1-2): 45-49; Carter 2001, Bispecific human IgG by design, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 7-15; (Fell et al., 1991, Genetic construction and characterization of a fusion protein consisting of a chimeric F(ab') with specificity for carcinomas and human IL-2, J. Immunol. 146 (7): 2446-52; Iliades et al., 1997, Triabodies: single chain Fv fragments without a linker form trivalent trimers, FEBS Lett.409 (3): 437-41; Hudson and Kortt, 1999, High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89; Schoonjans et al., 2000, Efficient heterodimerization of recombinant bi-and trispecific antibodies, Bioseparation 9 (3): 179-83;Schoonjans et al., 2000, Fab chains as an efficient heterodimerization scaffold for the production of recombinant bispecific and trispecific antibody derivatives, J. Immunol. 165 (12): 7050-57);
(iv) 부가된 기능이 존재하거나 존재하지 않는 모노-, 바이-, 또는 트리-특이적, 테트라-특이적 항체인 4가 항체, 예를 들면 테트라항체, Ig-G 결합 유도체 -scFv 융합체 또는 IgG-scFv 융합체(Pack et al., 1995, Tetravalent miniantibodies with high avidity assembling in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 246(1) : 28-34, Coloma and Morrison, 1997, Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies, Nat. Biotechnol. 15 (2): 159-63; Alt et al., 1999, Novel tetravalent and bispecificIgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gammal Fc or CH3 region, FEBS Lett. 454 (1-2): 90-4; Le Gall et al., 1999, Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19 : effect of valency on cell binding, FEBS Lett. 453 (1-2): 164-68; Santos et al., 1999, Generation and characterization of a single gene-encoded single-chain-tetravalent antitumor antibody, Clin. Cancer Res. 5 (10Suppl) :3118s-3123s ;Goel et al., 2000, Genetically engineered tetravalent single-chain Fv of the pancarcinoma monoclonal antibody CC49: improved biodistribution and potential for therapeutic application, Cancer Res. 60 (24): 6964-71; Todorovska et al., 2001, Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 47-66);
(v) scFv 및 IgG의 결합 유도체의 융합체(참조: Huston et al., 1991, Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins, Methods Enzymol. 203: 46-88); 사이토킨 및 IgG의 결합 유도체의 융합체(사이토킨은 예로써 BCDF(B-세포 증식 인자), BCGF(B-세포 성장 인자), 모토제닉(motogenic) 사이토킨, 화학주성 사이토킨이나 케모킨, CSF(콜로니 자극 인자), 혈관신생 인자, TRF (T-세포 증식 인자), ADF(성인 T-세포 백혈병-유래된 인자), PD-ECGF(혈소판-유래된 내피 세포 성장 인자), 뉴우로킨(neuroleukin), 인터루킨, 림포카인, 모노킨( monokine), 인터페론 등)(참조: Penichet and Morrison, 2001, Antibody-cytokine fusion proteins for the therapy of cancer, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 91-101; Penichet et al., 1998, An IgG3-IL-2 fusion protein recognizing a murine B cell lymphoma exhibits effective tumor imaging and antitumor activity, J. Interferon Cytokine Res. 18 (8): 597-607; Fell et al., 1991, Genetic construction and characterization of a fusion protein consisting of a chimeric F(ab') with specificity for carcinomas and human IL-2, J. Immunol. 146 (7): 2446-52); scFv 및 루이신 지퍼의 융합체(de Kruif and Logtenberg,1996, Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library, J. Biol. Chem. 271 (13): 7630-34; see also Section 5.5. 3); scFv 및 Rop 단백질의 융합체(참조: Huston et al., 1991, Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins, Methods Enzymol. 203: 46-88; see also Section 5.5. 4).
이디오토프/항-이디오토프 상호작용을 보이는 결합 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 이디오토프/항-이디오토프 상호작용은 본 발명에 따른 나노구조의 구성을 위한 결합 요소를 설계하는데 이용된다. 항체는 거의 모든 항체를 인식할 수 있기 때문에, 다른 항체에 포함된 다른 항원 결정부위를 인식하는 능력을 갖는다. 항체에서 잠재적 항원 결정부위로부터 발생하는 면역 반응은 "이디오토픽(idiotopic)"이라고 한다(Jerne, 1974, Towards a network theory of the immune system, Ann. Immunol. (Paris)125C (1-2): 373-89; Davie et al., 1986, Structural correlates of idiotopes, Annu. Rev. Immunol. 4: 147-65). 이디오토프는 특정 항체 또는 항체 군에 독특한 항원 결정부위이다. 이디오토프를 보유하는 항체는 이디오토프를 항원으로 인식하는 항체와 반응할 수 있고, 따라서 "항-이디오토픽" 항체라 한다. 대부분의 경우에, 이디오토프는 면역학적, 구조적 기술에 의해 특정 mAb의 CDR과 부분적으로 또는 완전히 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 2). 이디오토픽 항체는 특정 항원을 지향하는 만큼 또는 이보다 높은 친화성으로 항-이디오토픽 항체를 지향하는 것으로 알려져 있다(Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J.Mol. Biol. 264(1) : 137-51).
일부 경우에, CDR 항-이디오토프는 외부 항원의 "내부-이미지"의 구조적 형태를 취한다(Bentley et al., 1990, Three-dimensional structure of an idiotope-anti-idiotope complex, Nature 348 (6298): 254-57; Ban et al., 1994, Crystal structure of an idiotope-anti-idiotope Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5): 1604-08; Poljak, 1994, An idiotope--anti-idiotope complex and the structural basis of molecular mimicking, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5): 1599-1600; Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) :137-51 ; Iliades et al., 1998, Single-chain Fv of anti-idiotype 11-1G10 antibody interacts with antibody NC41 single-chain Fv with a higher affinity than the affinity for the interaction of the parent Fab fragments, J. Protein Chem. 17 (3): 245-54). 특정 구체예에서, 항-이디오토픽 항체를 지향하는 만큼 또는 이보다 높은 친화성으로 항원을 지향하는 이디오토픽 항체가 사용된다(Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) : 137-51).
가령, 목적 펩티드에 결합하고 상기 펩티드가 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하는 항체를 사용하여 상기 펩티드 수용체를 "모방"하고 상기 펩티드에 결합하는 항-이디오토프 항체를 발생시킬 수 있다. 항-이디오토프 항체는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다(참조: Greenspan and Bona, 1993,Idiotypes: structure and immunogenicity, FASEB J. 7 (5): 437-44; Nissinoff, 1991, Idiotypes: concepts and applications, J. Immunol. 147 (8):2429-38).
본 발명의 결합 요소 조성물과 방법에 유용한 이디오토프/항-이디오토프 결합쌍의 무제한적 실례는 하기 표 1에 제시한다.
표 1
특정 구체예에서, 특이적 이디오토프/항-이디오토프 분자간 상호작용은 나노구조의 단계적 어셈블리에서 어셈블리 단위를 서로 결합시키는 결합 요소로 이용된다(도 1). 각 유래된 어셈블리 단위는 비-교차 반응하는 2개의 특이적 이디오토프/항-이디오토프 결합 표면을 보유하도록 설계된다. 이는 어셈블리 단위의 단계적 어셈블리가 다양한 기능 요소를 포함하는 복합 나노구조를 형성하게 하는 시스템을 창조하는 수단을 제공한다. 다중 결합쌍은 파아지 디스플레이의 표준 방법으로 만들 수 있다(Winter et al., 1994, Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol. 12:433-55 ; Viti et al., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480-505). 게다가, 항체와 항체 유도체의 3차원 구조가 특성화되어 있고(참조: Braden et al,, 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) : 137-51; Ban et al., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5): 1604-08; Perisic et al. 1994, Crystal structure of a diabody, a bivalent antibody fragment, Structure 2 (12): 1217-26; Harris et al., 1998, Crystallographic structure of an intact IgGl monoclonal antibody, J. Mol. Biol. 275 (5): 861-72; Pei et al., 1997, The 2.0-A resolution crystal structure of a trimeric antibody fragment with noncognate VH~VL domain pairs shows arearrangement of VH CDR3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (18): 9637-42), 부가적 기능 요소를 조작하는 위치는 현재 가용한 X-레이 좌표의 시각 검사로 확인할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체-유래된 어셈블리 단위의 CDR 도메인중 하나(즉, 결합 요소중 하나)는 이디오토프로서 조작될 수 있다. 다른 CDR은 비-상보성 항-이디오토프 결합 요소로서 조작될 수 있다. 결합 요소가 서로 상이하고 비-반응성이기 때문에, 이런 설계는 단백질 성분의 자가-중합화를 예방한다. 이런 결합 요소는 분자생물학과 파아지 디스플레이 기술의 조합으로 만들 수 있다(Winter et al., 1994, Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. hnmunol. 12:433-55 ; Viti et al., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480-505). 생성된 항체-유래된 어셈블리 단위는 이디오토픽 CDR이나 결합 요소 및 비-상보성 CDR 결합 요소를 보유하게 된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 차기 추가 사이클에 결합되는 어셈블리 단위는 이디오토프인 결합 요소 및 비-상보성 항-이디오토프인 결합 요소를 이용하여 유사한 방식으로 설계할 수 있다. 하지만, 이런 어셈블리 단위의 CDR 하나는 결합 요소로 기능하는 이전 CDR 성분중 하나와 결합하도록 조작할 수 있다. 이런 이유로, 특정 구체예에서, 2개의 인접한 어셈블리 단위의 CDR이 상보성 이디오토프/항-이디오토프 상호작용을 보유하도록 설계할 수 있다. 이런 설계의 어셈블리 단위를 이용하면, 연결된 어셈블리 단위와 전체적으로 단계적 어셈블리의 정의된 방향이나 배향, 다시 말하면 각 어셈블리 단위의 벡터 추가가 가능하다. 다이어바디의 CDR이 기하학적으로 대칭되기 때문에, 어셈블리 단위는 공지된 배향과 방향으로 개수물질 도는 나노구조 중간물질에 추가될 수 있다.
2개의 비-상보성 이디오토프로 구성되는 결합 요소
특정 구체예에서, 다이어바디 단위를 포함하는 어셈블리 단위를 제조하는데, 여기서 비-상보성 결합 요소는 2개의 비-상보성 이디오토프로 구성된다.
다이어바디, 결합 유도체 도는 이들의 결합 단편은 2개의 CDR중 하나만 이용되도록 하는 방식으로 나노구조에 통합될 수 있다. 특정 구체예에서, CDR 자체가 결합 요소로 기능하고, 2개의 CDR 사이의 다이어바디의 본체는 구조 요소로 기능한다.
이중특이적 다이어바디는 2개의 비-대합된 scFv 단편으로부터 유래된다. 하이브리드 단편의 첫 번째 부분은 하나의 Fv 항체로부터 VH 코딩 영역을 보유하고, 두 번째 부분은 Fv 항체로부터 VL 코딩 영역을 보유한다. 생성된 VH VL 하이브리드 단편은 짧은 Gly4Ser 링커로 결합시킨다. 2번째 하이브리드 단편은 짧은 Gly4Ser 링커에 의해 서로 결합되는 유사하지만 마주보는 코딩 영역쌍의 연쇄를 보유한다(도 2와 3). 일단의 하이브리드 scFv 단편은 VH와 VL 도메인 사이에 분자간 상호작용에 의해 쌍을 이룬다.
도 4에 예시된 특정 구체예에서, 제 1 어셈블리 단위("Diabody Unit1")를 만드는데 이용된 유전자는 라이소자임 동위원소 항체 D1.3(도 4A에서 VHA와 VLA로 표시됨)(Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) :137-51) 및 고양이 감염성 복막염 바이러스-중화 항체 730.1.4(도 4A에서 VHB와 VLB로 표시됨)(Ban etal., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5):1 604-08)로부터 유래된다. 하이브리드 VHA와 VLB 단위 및 하이브리드 VHB와 VLA 단위를 연결하는 링커 서열은 Huston et al.(1988, Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (16):5879-83)에 기초한다. Diabody Unit1의 구조체는 도 4A에 A x B로 표시된다. 프로모터(p), 리보솜 결합 부위(rbs), pelB 리더(pelB), HSV와 히스티딘(his) 태그, 종결 코돈(Stop)의 위치 역시 도 4에 표시한다. 다이어바디를 조작하는데 이용되는 벡터 시스템은 pET25b (Novagen)인데, 이는 T7 프로모터, 리보솜 결합 부위, pelB 리더 서열, HSV, His 태그 서열을 보유한다.
도 4B에서는 다이어바디를 포함하는 두 번째 어셈블리 단위(Diabody Unit 2)를 도시하는데, 여기서 비-상보성 결합 요소는 2개의 비-상보성 항-이디오토프를 보유하도록 설계된다. 두 번째 어셈블리 단위를 만드는데 유전자는 라이소자임 동위원소 항체 E5.2(도 4B에서 VHA'와 VLA'로 표시됨)(Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) :137-51) 및 고양이 감염성 복막염 바이러스-중화 항체 490.5.3(도 4B에서 VHB'와 VLB'로 표시됨)(Ban et al., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5):1 604-08)으로부터 유래된다. Diabody Unit1의 구조체는 A' x B'로 표시된다. 이들 2가지 전형적인 어셈블리 단위는 개시 단위와 함께, 단계적 어셈블리의 방법으로 나노구조를 제조하는데 이용될 수 있다.
펩티드 에피토프로 구성되는 결합 요소
특정 구체예에서, 결합 요소는 펩티드 에피토프로 구성된다. 펩티드 에피토프는 항체 또는 항체 결합 단편과 상보성 쌍을 형성하는 결합 요소로 기능하는 어셈블리 단위에 조작될 수 있는데, 이의 CDR은 펩티드 에피토프와 특이적으로 결합한다. 펩티드 에피토프는 앞서 기술된 어셈블리 단위 내에 포함된 다중 정의도니 영역으로 절단접합될 수 있다. 펩티드 에피토프는 펩티드 에피토프가 인접한 나노구조의 어셈블리 단위를 서로 교차-결합시키는데 사용되는 구체예를 비롯한 다양한 구체예에서 결합 요소로 특히 선호된다. 이런 이유로, 펩티드 에피토프는 어셈블리 단위에 다능성을 제공한다.
가령, 특정 구체예에서 펩티드 에피토프는 이미-존재하는 분지로부터 나노구조의 새로운 분지의 조립을 위한 개시점이 되는 결합 요소로 기능할 수 있다. 이런 분지화(branching)는 1차원, 2차원 또는 3차원 구조를 만드는데 이용될 수 있다. 이는 단순한 1차원 구조 이상으로 확대하거나 또는 1차원 구조에 기능 단위를 부착하는 데에도 이용될 수 있다. 대안으로, 이런 결합 요소는 개별적으로 제조된 나노구조 서브-어셈블리를 나노구조 중간물질에 추가하기 위한 결합 부위로 기능할 수 있다. 다른 구체예에서, 이들은 결합된 기능 요소를 갖는 항체에 대한 결합 부위로 기능할 수 있다.
특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 펩티드 에피토프 결합 요소를 포함하는 항체 단편으로 구성된다. Fab 단편 내에 내재된 융통성은 단계적 어셈블리에서 나노구조의 어셈블리 단위간 다양한 가교-결합 구조를 가능하게 하는 결합 요소의 삽입에 유익하게 이용된다. 한 구체예에서, 단계적 어셈블리에 필요한 Fab 단편에서 부가적인 분자간 결합 부위를 통합하기 위하여 C-말단 원부 또는 β-회전 영역은 펩티드 에피토프를 보유하도록 조작한다. 전형적인 펩티드 에피토프는 표 2에 제시한다.
전형적인 어셈블리 단위는 폴리펩티드의 C-말단 도메인이 전체 분자에 특정한 결합 특성을 공여하는 서열, 예를 들면 비오틴을 인식하는 아비딘으로부터 유래도니 서열, 스타필로코커스 A 단백질을 인식하는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 서열, 개별 Fab 경쇄 대응물이 부착하고 항원-결합 부위를 형성하는 단클론 항체의 중쇄의 Fab 부분으로부터 유래된 서열, 특정 항체를 인식하는 면역활성 서열, 또는 특정 금속 이온에 결합하는 서열을 보유하도록 변형된 박테리아파아지 T4 꼬리 섬유 단백질 헤37의 변이체이다. 이들 리간드는 정제 및/또는 조립을 촉진하기 위하여 고정될 수 있다.
표 2
한 구체예에서, 펩티드 에피토프는 단편에 포함된 정의된 β-회전 모티프를 직접 대체할 수 있다. 대안으로, 펩티드 에피토프는 분자 생물학의 표준 방법으로 CH1 중쇄의 C-말단 아미노산에 연결할 수 있다(Wallace et al., 2001, Exogenous antigen targeted to FcgammaRI on myeloid cells is presented in association with MHC classI,J. Immunol. Methods 248 (1-2): 183-94). 표 3에서는 결합 요소또는 기능 요소의 삽입에 적합한 IgG과 IgG 유도체에 포함된 동정된 펩티드 영역의 실례를 제시한다.
표 3
다른 구체예에서, 생성 Fab 단편은 분자의 N-말단 근부에 항원 결합 도메인을 보유한다. Fab 단편은 또한, 정의된 β-회전 모티프를 대체하는 Fab 단편에서 한 위치에 삽입되거나 Fab 단편의 C-말단 원부에 직접적으로 결합된 펩티드 에피토프인 결합 요소를 보유한다. 따라서, Fab 단편에 융합된 펩티드 에피토프는 동족체 면역공액된 기능 부분의 인식과 결합을 통하여 부착점으로 기능할 수 있는 고도 특이적 결합 요소로 작용한다.
항체 구조 요소
항체는 대략 220개 아미노산의 경쇄 및 450-575 아미노산의 중쇄를 보유하는폴리펩티드 사슬로 구성되는 다가 분자이다. 원형 IgG 분자의 평균 분자량은 152-196 kD이다. 항체에서 실시된 구조 연구에서, 경쇄와 중쇄는 "면역글로불린 폴드"라고 하는 특징적인 도메인을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 면역글로불린 폴드는 이황화 결합에 의해 서로 결합된 2층 역평행 β-시트로 구성되는 원통형 샌드위치로 정의된다. 항체에서 우세한 2차 구조는 α-나선의 짧은 스트레치를 갖는 역평행 β-시트이다(참조: Padlan, 1994, Anatomy of the antibody molecule, Mol. Immunol. 31 (3): 169-217; Padlan, 1996, X-ray crystallography of antibodies, Adv. Protein Chem. 49: 57-133; and references cited therein.).
경쇄는 2개의 면역글로불린 도메인[항체마다 상이한 N-말단 부분에 하나(VL); 상대적으로 일정한 C-말단 부부에 하나(CL)]을 보유한다. 중쇄는 면역글로불린의 종류에 따라 4개 또는 5개 면역글로불린 도메인을 보유한다. N-말단 도메인은 가변적이고(VH) 다른 원부 도메인은 일정하다(CH1, CH2, CH3, 일부 경우에 CH4). 경쇄와 중쇄의 단위는 이황화 결합 및 다른 비-공유 상호작용으로 결합하여 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성되는 특징적인 Y-형 이량체를 형성한다. VL 사슬과 VH 사슬을 보유하는 항체 단편은 Fv 단편이라 한다. 전체 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역과 첫 번째 불변 도메인(CH1)을 보유하는 항체 단편은 Fab 단편이라 한다. Fab에서 가변 도메인과 불면 도메인의 상호작용은 강하지 않기 때문에, 분자의 전체 구조에서 어느 정도의 유연성과 위치 변이성이 허용된다. Fab 가변 도메인과 Fab 불면 도메인 사이에 각도에서 상당한 편차(127-176ㅀ)가 존재할 수 있다. 이런 각도는 Fab "엘보우" 또는 "벤드(bend)"라고 한다(Padlan, 1994, Anatomy of theantibody molecule. Mol. Immunol. 31 (3): 169-217).
이들 두 Fab 팔의 N-말단 영역은 항원에 결합한다(Mian et al.,1991, Structure, function and properties of antibody binding sites, J. Mol. Biol. 217(1) :133-51 ; Wilson et al., 1994, Structure of anti-peptide antibody complexes, Res. Immunol. 145(1) : 73-8; Wilson et al., 1994, Antibody-antigen interactions: new structures and new conformational changes, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 (6): 857-67). 이들 Fab 팔은 한 유연성 폴리펩티드에 의해 Fc 단편이라고 하는 제 3 단편에 연결되는데, 상기 제 3 단편은 항원을 제거하고 항원 결합 부위를 이량화하는 주효체 기능을 촉발하는 역할을 한다.
IgG 항체 분자의 Fc 부분은 2개의 불변 도메인 CH2와 CH3으로 구성된다. Fab와 Fc 단편을 연결하는 폴리펩티드 분절은 힌지(hinge)로 정의되고 항체 종류와 아이소타입에 따라 다양한 길이와 유연성을 보유한다. 유연한 힌지 영역은 항체의 Fc와 Fab 단편간 자연적 경계를 제공한다. 원형 IgG 분자에 포함된 힌지 및 Fab 엘보우 또는 벤드는 2개의 항원 결합 부위 사이에 현저한 유연성을 제공하고, 따라서 다수의 가교 결합 구조를 가능하게 한다.
고유와 재조합 항체 단편을 구성하는 단백질은 단계적 어셈블리에 의해 조립되는 나노구조의 구조 요소의 후보이다. 본 발명의 단계적 어셈블리에 사용되는 항체에는 IgG 단클론, 인간화 또는 키메라 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 단계적 어셈블리에 사용되는 항체의 결합 유도체 또는 결합단편에는 일량체((scFv) 단편), 이량체((scFv)2또는 다이어바디), 삼량체((scFv)3또는 트라이어바디), 사량체((scFv)4또는 테트라바디) 단쇄 항체를 비롯한 단쇄 항체(scFv); Fab 단편; F(ab')2단편; Fab 발현 라이브러리로 생성된 단편(Huse et al., 1989, Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda, Science, 246, 1275-81)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
단클론 항체로 구성되는 구조 요소
단클론 항체(mAbs), 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편은 본 발명의 방법에 따라 구조 요소로 이용될 수 있다. mAb는 특정 항원을 지향하는 항체의 상동성 개체군이다. 목적 항원에 대한 mAb는 항체 분자를 생산하는 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 만들 수 있다. 여기에는 Kohler와 Milstein(1975, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256: 495-97; Voet and Voet, 1990, Biochemistry, John Wiley and Sons, Inc. , Chapter 34)에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 기술; 사람 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Kozbor et al., U.S. Patent No. 4,693, 975, entitled "Human hybridroma [sic] fusion partner for production of human monoclonal antibodies," issued September 15,1987); EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96; Roder et al., 1986, The EBV-hybridomatechnique, Methods Enzymol.121 : 140-67) 등이 포함된다. 이런 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 아종을 비롯한 임의의 면역글로불린 종이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 mAb는 당분야에 공지된 통상적인 기술로 합성할 수 있다. 가령, 사람 단클론 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술로 만들 수 있다(Teng et al., 1983, Construction and testing of mouse--human heteromyelomas for human monoclonal antibody production, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 : 7308-12; Cole et al., 1984, Human monoclonal antibodies, Mol. Cell. Biochem. 62 (2): 109-20; Olsson et al. , 1982,hnmunochemical Techniques, Meth. Enzymol. 92: 3-16).
대조적으로, 다클론 항체는 본 발명에서 구성성분으로 사용될 수 있다. 다클론 항체는 서로 다른 정확한 특이성의 분자가 다수 존재하는 항체 개체군을 의미한다. 이들은 특정 항원에 결합하지만, 나노구조의 정확한 어셈블리와 불일치하는 상이한 결합 구조로 항원의 상이한 부분과도 결합한다.
다중특이적 항체로 구성되는 구조 요소
다중특이적 항체, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에서 구조 요소로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "특이적"또는 "특이성"은 별개의 항원-인식 부위에서 정의된 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 능력을 의미한다. 따라서, 이중특이적 항체는 서로 다른 항원을 인식할 수 있는 2개의 상이한 항원 인식 부위를 보유한다. 다중특이적 항체는 상이한 연결 요소, 즉 항원-인식 부위의 작용을 통하여 2개이상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 능력을갖는다.
특정 구체예에서, 상동성 이중특이적 또는 다중특이적 mAB는 단클론 항체의 생산을 위하여 앞서 기술된 목적 항원에 대항하여 발생된 림프구와 골수종 세포를 융합시켜 만들어진 림프구 클론의 불멸화를 통하여 구조 요소로 만들어 질 수 있다. 이런 방법으로, 다중특이적 mAb는 거의 무제한으로 생산할 수 있다. 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 선택된 생물학적 기질을 특이적으로 표적하고 결합하는 다중특이적 mAb를 만들 수 있다(참조: Colcher et al., 1999, Single-chain antibodies in pancreatic cancer, Ann. NY Acad. Sci. 880: 263-80; Hudson, 1999, Recombinant antibody constructs in cancer therapy, Curr. Opin. Immunol. 11 (5): 548-57; Kipriyanov et al., 1999, Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen bindingandpharmacokinetics, J. Mol. Biol. 293(1) : 41-56; Segal et al., 1999, Bispecific antibodies in cancer therapy, Curr. Opin. Immunol. 11 (5): 558-62; Trail et al., 1999, Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of cancer, Curr. Opin. Immunol. 11 (5): 584-88; Hudson, 2000, Recombinant antibodies: a novel approach to cancer diagnosis and therapy, Expert Opin. Investig. Drugs 9 (6): 1231-42).
특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 구조 요소로 사용되는 다중특이적 mAb는 이중특이적 및/또는 2가 mAb이다. 이중특이적 항체는 상이한 항원-인식 부위에 포함된 서로 다른 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 갖는다. 2가 항체는 2가지 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 갖는다.
이중특이적 항체는 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다(참조: Weiner et al., 1995, Bispecific monoclonal antibody therapy of B-cell malignancy, Leuk. Lymphoma 16 (3-4): 199-207; Helfrich et al., 1998, Construction and characterization of a bispecific diabody for retargeting T cells to human carcinomas, Int. J. Cancer 76 (2): 232-39; Arndt et al., 1999, A bispecific diabody that mediates natural killer cell cytotoxicity against xenotransplanted human Hodgkin's tumors, Blood 94 (8): 2562-8 ; Kipriyanov et al., 1999, Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics, J. Mol. Biol. 293(1) : 41-56; Sundarapandiyan et al 2001, Bispecific antibody-mediated destruction of Hodgkin's lymphoma cells, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 113-23).
다가 항체와 다중특이적 항체를 생산하는 기술은 당분야에 공지되어 있다(참조: Pluckthun et al., 1997, New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments,Immunotechnology 3 (2): 83-105; Santos et al., 1998, Development of more efficacious antibodies for medical therapy and diagnosis, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 60: 169-94 ; Alt et al., 1999, Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gammal Fc or CH3 region, FEBS Lett. 454 (1-2): 90-94; Hudson et al., 1999, High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89; Tomlinson etal., 2000, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol. 326: 461-79; Todorovska et al., 2001, Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods 248 (1-2): 47-66). 가령, 공지된 특이성의 항체를 인코드하는 유전자는 하이브리도마 세포주로부터 구제되고, 재조합 DNA 기술을 이용하여 재정렬된 VL과 VH 융전자를 클로닝하는 출발 물질을 제공할 수 있다(Ward et al., 1989, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli, Nature 341 (6242): 544-46; Sheets et al., 1998, Efficient construction of a largenonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-62). 보편적 DNA 프라이머는 표적 V-도메인 유전자에 어닐링되도록 설계하고 중합효소 연쇄 반응을 통하여 증폭할 수 있다. 이들 프라이머 내에서 제한 부위의 설계를 통하여, 생성된 증폭 DNA 산물은 박테리아, 진균, 식물, 곤충 세포를 비롯한 서로 다른 숙주 범위에서 발현을 위하여 직접 클론할 수 있다(Tomlinson et al., 2000, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol. 326: 461-79). 하이브리도마 세포가 아닌 이들 숙주 세포가 본 발명의 방법에서 재조합 조작된 항체의 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 구조 요소는 다이어바디 단편으로 구성된다. 다이어바디는 2개의 CDR을 보유하고 2가지 고도 특이적 비-공유 상호작용을 할 수 있다. 다이어바디, 결합 유도체 또는 이의 결합 단편은 2개의 CDR중 하나만 사용되도록 하는 방식으로 나노구조에 통합될 수 있다. 특정 구체예에서, CDR 자체가 결합 요소로 기능하고, 2개의 CDR 사이에 다이어바디의 본체가 구조 요소로 기능한다.
대장균(E. coli)으로부터 다이어바디 단편의 발현, 정제, 특성화에 이용되는 방법은 당분야에 공지되어 있다(Poljak, 1994, An idiotope--anti-idiotope complex and the structural basis of molecular mimicking, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (5): 1599-600; Zhu et al., 1996, High level secretion of a humanized bispecific diabody from Escherichia coli, Biotechnology (NY) 14 (2): 192-96; Todorovska et al., 2001, Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 47-66). 다이어바디 단편으로 구성되는 구조 요소의 실례는 도 4에 예시한다. 도 4에 제시된 다이어바디 발현 카세트는 다이어바디 단편을 코딩하는 VH 도메인 유전자의 N-말단에 절단접합된 pelB 신호 서열이 표적되고 대장균(E. coli) 세포질 주위 공간으로 분비되도록 설계하는데, 여기서 산화 환경은 다이어바디의 적절한 폴딩을 가능하게 한다. 유도이후, 과다발현된 다이어바디 단편은 당분야에 공지된 확립된 프로토콜에 따라 대장균(E. coli) 세포질 주위로부터 수확한다.
본 발명의 바람직한 구체예(도 4)에서, 다이어바디는 VL 도메인의 C-말단에 헥사히스티딘 태그(His6)를 부가하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 수지를 이용한 정제를 용이하게 한다(Scopes, 1994, Protein Purification, Principles andPractice, Third Edition, Springer-Verlag, London, pp. 183-85; Scopes, 1994 Protein Purification: Principles and practice (Springer Advanced texts in Chemistry), Third ed., London). 가령, 다이어바디 어셈블리 단위-1의 과다발현(도 4A)은 2(VHA x VLBHis6), 2(VHB x VLA), (VHB x VLA, VHA x VLBHis6)를 비롯한 혼합된 종을 포함한다. His6태그의 개수는 혼합물에 포함된 각 단백질 단위가 용리되는 이미다졸 농도(20-250 mM 농도차)를 결정한다. 헥사히스티딘 태그가 없는 것들은 칼럼 수지에 친화성을 거의 보이지 않는다. 일반적으로, 1개의 헥사티딘 태그를 보유하는 것들은 20-40 mM 이미다졸 사이에 용리되고(이중특이적 다이어바디) 2개의 헥사히스티딘 태그를 보유하는 것들은 50-100 mM 이미다졸 사이에 용리된다. 용리 피크는 UV 흡수도로 감지하고 SDS-PAGE, 고유-PAGE 또는 ELISA 분석으로 검증한다. 앞서 기술된 정제 절차가 원치않는 비-이중특이적 다이어바디 부산물의 분리를 억제하긴 하지만, 하기에 기술된 바와 같이 목적하는 분리된 다이어바디가 기능적 이중특이성을 갖도록 담보하는 방법을 이용한다.
도 4A에서는 A x B 다이어바디를 도시하는데, 여기서 A의 VH와 VL 도메인은 아이소자임 이디오토픽 항체(D1.3)를 정의하고 B의 VH와 VL 도메인은 바이러스 중화 이디오토픽 항체(730.1.4)를 정의한다. 원하는 다이어바디 산물의 정제를 촉진하기 위하여, VHA와 VLB를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하고 VHB와 VLA를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하지 않는다. 도 4B에서는 B' x A' 다이어바디를 도시하는데, 여기서 B'의 VH와 VL 도메인은 바이러스 중화이디오토픽 항체(409.5.3)를 정의하고 A'의 VH와 VL 도메인은 아이소자임 이디오토픽 항체(E5.2)를 정의한다. 원하는 다이어바디 산물의 정제를 촉진하기 위하여, VHB'와 VLA'를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하고 VHA'와 VLB'를 인코드하는 유전자는 헥사히스티딘 태그를 보유하지 않는다.
특정 구체예에서, 샌드위치 ELISA 또는 BIAcore 프로토콜을 실시하여 양 항원-결합 부위(이중특이성)의 동시와 이중 점유 및 평형 상수를 결정한다(Abraham et al., 1996, Determination of binding constants of diabodies directed against prostate-specific antigen using electrochemiluminescence-based immunoassays, J. Mol. Recognit. 9 (5-6): 456-61; McGuinness et al., 1996, Phage diabody repertoires for selection of large numbers of bispecific antibody fragments, Nat. Biotechnol. 14 (9): 1149-54; McCall et al., 2001, Increasing the affinity for tumor antigen enhances bispecific antibody cytotoxicity, J. Immunol. 166 (10): 6112-17). 이디오타입/항-이디오타입 결합 상수를 BIAcore 기술로 측정하는 특정 구체예에서, 항체중 하나는 액체상에 용해되고, 다른 항체는 고체상에 결합된다. 이런 기술의 실시는 분리 상수(Kd)의 측정을 위한 결합과 분리 속도(각각, kon과 koff)의 측정을 가능하게 한다(Goldbaum et al., 1997, Characterization of anti-anti-idiotypic antibodies that bind antigen and an anti-idiotype, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (16): 8697-701). 재조합 항원을 요하지 않지만 이중특이성을 감지할 수 있는 다른 프로토콜을 또한 이용할수 있는데, 여기에는 Holliger et al. (1997, Retargeting serum immunoglobulin with bispecific diabodies, Nat. Biotechnol. 15 (7): 632-36)에 기술된 로세팅 분석(rosetting assay)이 포함된다.
특정 구체예에서, 다이어바디는 결합 요소, 구조 요소 또는 기능 요소의 삽입을 위한 하나이상의 부위를 보유한다. 표 4에서는 결합, 구조 또는 기능 요소의 삽입에 이용될 수 있는 다이어바디 단위에 포함된 펩티드 영역을 도시한다. 펩티드 영역은 목적하는 단백질, 예를 들면 항체, 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편의 일부분이다. 적절하게는, 펩티드 영역은 목적하는 단백질의 표면에 노출되고 부가적인 펩티드의 삽입, 서열의 변형 또는 둘 모두를 통하여 재-조작될 수 있다. 표 4에서는 VH-VL 가변 도메인 연쇄(pdb entry 1LMK)를 갖는 다이어바디의 표면에 위치된 β-회전으로 확인된 아미노산을 요약한다. 잔기 영역은 원자 좌표의 분석으로 다이어바디 단편 내에 정의하고 entry 1LMK pdb하에 기탁된 잔기에 따라 넘버링(numbering)한다.
표 4
특정 구체예에서, 결합 부위는 다이어바디에 결합 요소로 부가되어 반대로 지향된 CDR에 의해 형성된 2개의 결합 요소이외에, 구조 분지, 포크, T-접합 또는 다차원 구조 결합 부위를 가능하게 한다. 단백질에서 표면 루프의 서열 변형은 단백질의 전체 폴딩에 거의 영향을 주지 않는 것으로 보이고, β-회전 부위에 변이체를 삽입하는 것이 가능하다. 표면 루프는 서열이 단백질 구조를 가장 적게 파괴하면서 서열이 단백질이 부가될 수 있는 위치이다.
다이어바디 단위 내에 특정 부위는 삽입을 위하여 정확하게 정의되었다. 가령, 특정 구체예에서 결합 요소는 내부에 절단접합되거나 표 4에 개시된 바와 같이 β-회전 잔기를 대체한다. 다이어바디의 전반적인 3차원 구조가 공지되어 있고 유사한 서열로 구성된 다이어바디의 3차원 구조를 상동성-설계하는 것이 가능하기 때문에(Guex and Peitsch, 1997, SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling, Electrophoresis 18: 2714-23;Guex and Peitsch, 1999, Molecular modelling of proteins, Immunology News 6: 132-34 ; Guex et al., 1999, Protein modelling for all, TIBS 24: 364-67), 공지된 구조의 다이어바디에 유사한 아미노산 서열의 다이어바디의 표면에 위치한 β-회전은 서열 비교(예로써 BLAST, Altschul et al, 1997, Gapped BLAST, PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)하고, 후속으로 유사한 서열로 구성된 단백질의 x-레이 좌표의 시각 검사로 용이하게 확인된다.
한 구체예에서, 다이어바디의 3차원 구조의 시각 검사는 Silicon Graphics Workstation에서 작동된 분자 가시화 패키지 QUANTA(Accelrys Inc., San Diego, CA)로 실시한다. 다이어바디 분자의 원자의 3차원 위치를 정의하는 좌표는 PDB entry 1LMK에 포함된다. 이런 분석 직후에, 표 4에 도시된 잔기를 보유하는 표면 루프가 확인되는데, 이들은 HIV-1 V3 루프 항원과 같은 펩티드의 삽입을 수용할 가능성이 매우 높은 부위이다. 상기 다이어바디 분자의 표면 루프에 포함된 모든 아미노산은 상기 정보로부터 결정될 수 잇고, 이들 표면 루프의 상대적 공간 위치 역시 결정된다. 조작되는 면역글로불린의 3차원 구조에 의해 제공되는 정보(X-레이 결정학 또는 상동성 구조에 기초한 상동성 모델링으로부터 유래되는 지에 상관없이)는 표면 루프를 구성하는 아미노산에 상응하는 목적 단백질에서 모든 아미노산의 동정을 가능하게 한다.
특정 구체예에서, H-ras 단백질로부터 유래된 펩티드 에피토프를 인코드하는 DNA는 X-레이 결정학에 의한 측정에서 3차원 원자 좌표의 시각 조사로 정의된 부위에서 다이어바디 어셈블리 단위 코딩서열로 삽입된다. H-ras 에피토프는 양 측면에 4개의 글리신이 위치하여 동족체 항체 결합에 대한 유연성과 접근성을 제공한다.
다이어바디 어셈블리 단위/ras 펩티드 단백질 융합체(Brasx A로 표시됨)가 발현되고 정제되면, ELISA 또는 BIAcore 분석과 같은 방법으로 다이어바디 결합가(valency)와 기능의 유지 및 적절한 항체에 의한 에피토프 인식을 특성화한다.
기능 요소, 예를 들면 효소, 독소, 항원 펩티드는 scFv 단편의 말단에 성공적으로 절단접합되어 다양한 다중기능 항체가 산출되었다(Chaudhary et al., 1989, A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin, Nature 339 (6223): 394-97; Suzuki et al., 1997, Construction, bacterial expression, and characterization of hapten-specific single-chain Fv and alkaline phosphatase fusion protein, J. Biochem. (Tokyo) 122 (2):322-29 ; Williams et al., 2001, Numerical selection of optimal tumor imaging agents with application to engineered antibodies, Cancer Biother. Radiopharm. 16 (1) : 25-35). 단백질 또는 펩티드로 구성되는 기능 요소는 분자생물학 방법 및 적절한 숙주에서 단백질의 발현을 이용하여 어셈블리 단위의 단백질성 부분으로 직접 융합시킬 수 있다.
Fab 또는 F(ab') 2 항체 단편으로 구성되는 구조 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 나노구조의 단계적 어셈블리에 대한 구조 요소는 항체 단편으로 구성된다. 이런 단편에는 Fab 단편, 또는 F(ab')2단편 등이 포함되는데, 이들은 IgG 항체 분자를 펩신으로 절단하고 Fc 부분을 분리시켜 만들 수 있다. 펩신 절단이후, 생성된 F(ab')2단편 사이에 이황화 결합이 환원되고 단일 Fab 단편이 만들어진다.
Fab 단편은 분자의 N-말단에 1가 단일특이적 CDR을 보유하는 신장된 비행성 모양 분자이다. 특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 Fab 단편의 C 말단 부분에서 펩티드 에피토프를 삽입하여 Fab 단편으로 조적된다. 결과적으로, Fab 단편의 C-말단에 융합된 펩티드는 다른 조작된 Fab에 대한 표적으로 기능하고, 단계적 어셈블리로 구성된 나노구조에서 인접한 Fab간 매우 특이적이고 단단한 상호작용을 제공한다. Fab 단편은 크기, 형상, 구조(도 6)가 구조 요소로서 적합한데, 그 이유는 Fab 단편이 구조 측면에서 자연 발생 결합 요소를 포함하기 때문이다. 전자 현미경과 X-레이 구조 연구에서, Fab 단편의 근부가 빈번하게 원부와 선형적으로 반대에 위치하는 것으로 밝혀졌다(Fischmann et al., 1991, Crystallographic refinement of the three-dimensional structure of the FabDl. 3-lysozyme complex at 2.5A resolution, J. Bio. Chem 266: 12915-20; Ban et al., 1994, Crystal structure of an idiotype-anti-idiotype Fab complex, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 (5): 1604-8; Padlan, 1996, X-ray crystallography of antibodies, Adv. Protein Chem. 49: 57-133; Harris, Skaletsky et al., 1998). 단편의 중간에 위치하는 유동성 엘보우 벤드는 대안적 결합 구조를 가능하게 한다(Roux et al., 1997, Flexibility of human IgG subclasses, J. Immunol. 159 (7): 3372-82 ; Roux etal., 1998, Comparisons of the ability of human IgG3 hinge mutants, IgM, IgE, and IgA2, to form small immune complexes: a role for flexibility and geometry, J. Immunol. 161 (8): 4083-90). 대안으로, 원하는 특이성으로 단클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있는 Fab 발현 라이브러리를 작제할 수 있다(Huse et al., 1989, Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda, Science,246,1275-81).
단쇄 항체 단편(scFv)으로 구성되는 구조 요소
본 발명의 방법에 따라, 특정 구체예에서 나노구조의 단계적 어셈블리에 단쇄 scFv 단편으로 구성되는 구조 요소가 사용될 수 있다. scFv 항체는 Fv 가변 중쇄(VH)의 카르복시 말단을 Fv 가변 경쇄(VL) 등의 아미노 말단에 연결하는 융합 단백질로 구성된다(Freund et al., 1994, Structural and dynamic properties of the Fv fragment and the single-chain Fv fragment of an antibody in solution investigated by heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy, Biochemistry 33 (11):3296-303 ; Hudson et al., 1999, High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89; Le Gall et al., 1999, Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD 19 : effect of valency on cell binding, FEBS Lett 453 (1-2): 164-68; Worn et al., 2001, Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments, J. Mol. Biol. 305 (5): 989-1010).
단쇄 항체 역시 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 사용되는 구조 요소로 사용될 수 있다. 단쇄 항체는 예로써 Ladner(U. S. Patent No. 4,946, 778, entitled "Single polypeptide chain binding molecules," issued August 7,1990) ; Bird(1988, Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242 (4877): 423-26); Huston et al. (1988, Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83), or Ward et al.,(1989, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli, Nature334 : 544-46)의 방법으로 만들 수 있다.
scFv 단편은 Fab 단편으로 시각화될 수 있고 엘보우-벤드에서 절반으로 절단되며 말단 불변 경쇄와 중쇄 도메인이 상실된 Fab 단편의 하위구조이다(Freund et al., 1994, Structural and dynamic properties of the Fv fragment and the single-chain Fv fragment of an antibody in solution investigated by heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy, Biochemistry 33 (11): 3296-303; Malby et al., 1998, Three-dimensional structures of single-chain Fv-neuraminidase complexes, J. Mol. Biol. 279 (4): 901-10)(도 2). scFv는 Fa 단편에서처럼 신장된 비행선 형상이 아닌 좀더 작고 구형이다. Fab 단편의 대략 절반 크기인 scFv 단편은 분자의 N-말단 부분에서 기능적 1가/단일특이적 CDR을 여전히 보유한다. scFv는 대장균(E. coli)에서 발현될 수 있는 최소 항원 결합 모티프를 대표한다.
일반적으로, scFv 단편은 1가이고 원형 항체의 Fv 부분에서 발견되는 것과 유사한 3차와 4차 구조를 유지한다(도 5와 2)(Boulot et al., 1990, Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the bacterially expressed Fv from the monoclonal anti-lysozyme antibody D1.3 and of its complex with the antigen, lysozyme, J. Mol. Biol. 213 (4): 617-19; Braden et al., 1996, Crystal structure of an Fv-Fv idiotope-anti-idiotope complex at 1.9A resolution, J. Mol. Biol. 264(1) : 137-51; Fuchs et al., 1997, Primary structure and functional scFv antibody expression of an antibody against the human protooncogene c-myc, Hybridoma 16 (3): 227-33; Hoedemaeker et al., 1997, A single chain Fv fragment of P-glycoprotein-specific monoclonal antibody C219. Design, expression, and crystal structure at 2.4A resolution, J. Biol. Chem. 272 (47):29784-89 ; Malby et al., 1998, Three-dimensional structures of single-chain Fv-neuraminidase complexes, J. Mol. Biol. 279 (4): 901-10). 선택적으로 15개 아미노산 길이의 Gly/Ser 펩티드 링커는 2개의 가변 단편을 결합하고 VH과 VL 도메인 사이에 긍정적인 상호작용을 유지하는데 사용될 수 있다(Perisic et al. 1994, Crystal structure of a diabody, a bivalent antibody fragment, Structure 2 (12): 1217-26; Takemura et al., 2000, Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system, Protein Eng. 13 (8): 583-88 ; Worn et al., 2001, Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments, J. Mol. Biol. 305 (5): 989-1010). 이들Gly/Ser 링커는 유연성과 프로테아제 저항성을 제공하는데 사용할 수 있다. 더 나아가, scFv 항체 단편은 항원 인식과 결합의 측면에서 원형 항체와 유사한 기능을 갖는다.
scFv 단편은 작은 크기 및 CDR의 상대적 위치로 인하여, 나노구조의 제조를 위한 본 발명의 어셈블리 단위에 통합될 수 있는 단백질 성분으로 적합하다. Fab 단편에 비하여 scFv의 한가지 장점은 scFv를 조작하고 생산하는 기술이 좀더 진보되어 있다는 점이다(참조: Ward, 1993, Antibody engineering using Escherichia coli as host, Adv. Pharmacol. 24: 1-20; Luo et al., 1996, Construction and expression of bi-functional proteins of single-chain Fv with effector domains, J. Biochem. (Tokyo) 120 (2): 229-32; Wu et al., 2000, Designer genes: recombinant antibody fragments for biological imaging, Q. J. Nucl. Med. 44 (3): 268-83 ; Worn et al., 2001, Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments, J. Mol. Biol. 305 (5): 989-1010). 이들 공지된 방법을 이용하여, CDR을 만들고 나노구조의 스태그된 어셈블리에 유용한 어셈블리 단위로 통합되는 단백질 성분으로 사용되는 기능 요소가 scFv에 추가될 수 있다.
다른 구체예에서, 유사한 전략을 이용하여 Fab 단편에서 앞서 기술된 바와 같이 scFv에 부가적인 분자간 결합 부위를 통합한다. C-말단 원부 또는 β-회전 영역은 표 2에 제시된 바와 같은 정의된 펩티드 에피토프로 대체될 수 있다. 이들 펩티드 에피토프는 당분야에 공지된 재조합 DNA 절차를 이용한 적절한 인코딩 DNA 서열의 조작으로, 정의된 β-회전 모티프를 대체하거나 VH 또는 VL 중쇄(연결된 중쇄와 경쇄 가변 도메인의 순서에 따라)에 직접 연결할 수 있다. 생성된 scFv 단편은 scFv 단편의 일부분에 항원 결합 인식부위 및 정의된 β-회전 모티프를 대체하거나 scFv 단편의 C-말단 부분에 연결되는 펩티드 에피토프인 결합 요소를 보유한다. 따라서, 융합된 펩티드 에피토프는 단계적 어셈블리에서 scFv를 포함하는 인접한 어셈블리 단위 사이에 결합쌍의 형성에서 고도로 특이적인 결합 요소로 기능하게 된다.
이중특이적 IgG, 키메라 IgG 또는 이중특이적 이종이량체 F(ab') 2 항체 단편으로 구성되는 구조 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 구조 요소는 이중특이적 IgG, 키메라 IgG 또는 이중특이적 이종이량체 F(ab')2항체 단편과 같은 항체 단편으로 구성된다. 자연 발생 IgG 분자는 설계에서 2가이지만 이들의 CDR이 동일하기 때문에 단일특이적인 반면, 예로써 Suresh et al.(1986, Bispecific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas, Methods Enzymol. 121: 210-28); Holliger et al. (1993, Engineering bispecific antibodies, Curr. Opin. Biotechnol. 4 (4): 446-49); Hayden et al. (1997, Antibody engineering, Curr. Opin. Immunol. 9 (2): 201-12); Carter (2001, Bispecific human IgG by design, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 7-15)의 방법을 이용하여 하이브리도마 기술로 만들어진 것과 같은 IgG 분자는 2가 또는 이중특이적으로 만들어 질 수 있다.
이중특이적 IgG는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 화학적 결합 방법으로 또는 하이브리드 하이브리도마 세포주의 개발(하이브리드 하이브리도마 기술)을 통하여 만들 수 있다(Milstein et al., 1983, Hybrid hybridomas and their use inimmunohistochemistry, Nature 305 (5934): 537-40)(도 7).
이중특이적 항체를 수득하는데 이용되는 다른 방법은 IgG을 제한적인 단백분해 절단에 노출시키는 것인데, 여기서 2개의 동일한 Fab 단편이 힌지 폴리펩티드의 절단직후에 Fc 단편으로부터 분리된다(도 8). 이들 단일 1가 Fab 단편은 단독으로 사용되거나, 개별 기원의 Fab 단편과 화학적으로 서로 결합되어(힌지 시스테인에서) 이중특이적 이종이량체 F(ab')2를 형성할 수 있다. 화학적으로 결합된 이중특이적 F(ab')2단편은 여러 소규모 임상 시험에서 연구되고 평가되었다(Hudson, 1999, Recombinant antibody constructs in cancer therapy, Curr. Opin. Immunol.11 (5):548-57 ; Segal et al., 1999, Bispecific antibodies in cancer therapy, Curr. Opin. Immunol. 11 (5):558-62). 이중특이적 항체의 이종이량체화가 조장되도록 중쇄의 Fc 부분을 조작하기 위한 여러 다른 합리적인 설계 전략이 개발되었다. 이들 전략에는 예로써 공간적 상보성 설계 돌연변이("knobs-into-holes" 이용 파아지 디스플레이 기술) 및 부가적인 사슬간 이황화 결합 및/또는 Fc 단편의 중쇄간 염-가교 상호작용의 설계 등이 포함될 수 있다(Carter 2001, Bispecific human IgG by design, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 7-15). 원하는 이중특이적 항체의 중쇄간 강화된 상보성으로 인하여, 이중특이적 항체는 본원에 개시된 나노구조의 단계적 어셈블리를 위한 구조 요소의 바람직한 공급원이다.
한 구체예에서, 이중특이적 항체는 Fc 이량체-형성 모티프를 다른 이량체화 모티프로 대체하여 만든다. 한가지 무제한적 구체예에서, Fos와 Jun 단백질에 발견되는 것과 같은 이종이량체를 형성할 수 있는 루이신 지퍼는 유전자 융합에 의해 IgG 분자의 2가지 서로 다른 Fab 부분에 연결된다. 적절한 세포주에서 개별적으로 발현되는 융합 IgG는 Fab-(지퍼)2동종이량체로 분리될 수 있다. 이후, 이형이량체 형성은 동종이량체의 힌지 영역 내에 이황화 결합의 환원으로 단량체 아단위를 분리시켜 달성한다.
생성된 단량체는 서로 혼합하고 산화 조건하에 위치시켜 다수 최종 산물로서 Fos-Jun 루이신 지퍼 모티프를 보유하는 이중특이적 이형이량체를 결과한다. 이런 기술를 변화시켜 이중특이적 Fab와 Fv 융합 단백질을 만들 수 있다(Kostelny et al., 1992, Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers, J. Immunol. 148 (5): 1547-53; Tso et al., 1995, Preparation of a bispecific F(ab')2 targeted to the human IL-2 receptor, J. Hematother. 4 (5):389-94 ; de Kruif et al., 1996, Leucine zipper, dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library, J. Biol. Chem. 271 (13): 7630-34). 이중특이적 이량체 형성을 조장하는데 이용되는 다른 다량체화 모티프에는 전사 인자 p53(Rheinnecker et al., 1996, Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumor-associated carbohydrate antigen, J. Immunol. 157 (7): 2989-97); 스트렙타비딘(Muller etal., 1998, A dimeric bispecific mini-antibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett. 432 (1-2): 45-49); 또는 나선-번들 모티프, 예를 들면 Rop(Pack et al. , 1993, Improved bivalent miniantibodies with identical avidity as whole antibodies produced by high cell density fermentation of Escherichia coli, Biotechnology 11: 1271-77; Dubel et al., 1995, Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single chainantibodies (scFv), J. Immun. Methods 178: 201-09) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(도 9). 이런 항체는 본 발명에서 동일하지 않고 서로 상호작용하지 않는 복수의 결합 요소의 공급원으로 유용하다.
앞서 기술된 방법은 이중특이적 항체의 생산과 분리가 가능하지만, 낮은 수율로 IgG 산물의 혼합물이나 화합물을 발생시킨다. 높은 품질, 함량, 순도의 다가 다중기능 항체는 재조합 항체 기술로 만들 수 있다(참조: Morrison et al., 1989, Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol. 44: 65-92; Shin et al., 1993, Hybrid antibodies, Int. Rev. hnmunol. 10 (2-3): 177-86; Sensel et al., 1997, Engineering novel antibody molecules, Chem. Immunol. 65: 129-58; Hudson et al., 1998, Recombinant antibody fragments, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (4): 395-402).
본 발명의 다른 구체예에서, 사람, 인간화 또는 키메라(예, 사람-생쥐 또는 사람-다른 종) 단클론 항체(mAb), 결합 유도체 또는 이들의 결합 단편이 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에서 구조 요소로 사용될 수 있다. 인간화 항체는 비-사람 종으로부터 하나이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자로부터 골격 영역을 보유하는 비-사람 종 유래의 항체 분자이다. 인간화 항체는 "키메라 항체"라고도 한다. 인간화 또는 키메라 항체는 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다(참조: Queen, U. S. Patent No. 5,585, 089, entitled "Humanized immunoglobulins," issued December 17,1996).
키메라 항체는 본 발명의 방법에 따라 구조 요소로 사용될 수 있다. 키메라 항체는 서로 다른 부분이 서로 다른 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들면 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 주효체 또는 불변 영역을 보유하는 분자이다. 적절한 항원 특이성의 생쥐 항체 분자로부터 유전자를 적절한 생물학적 또는 주효체 활성의 사람 항체 분자로부터 유전자와 절단접합시킴으로써 키메라 항체를 생산하는 기술이 개발되었다(Morrison et al., 1984, kimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55; Neuberger et al., 1984, Recombinant antibodies possessing novel effector functions, Nature, 312,604-08 ; Takeda et al., 1985, Construction of chimeric processed immunoglobulin genes containing mouse variable and human constant region sequences, Nature 314: 452-54).
다이어바디 또는 다량체 scFv 단편으로 구성되는 구조 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 구조 요소는 다이어바디 또는 다량체 scFv 단편으로 구성된다. scFv 단편, 특히 짧은 펩티드 링커, 예를 들면 3, 4 또는 5개 아미노산 잔기를 갖는 scFv 단편은 용액에서 단량체보다는 이량체((scFv2) 또는 다이어바디)를 형성한다(Dolezal et al., 2000, ScFv multimers of the anti-neuraminidase antibody NC10 : shortening of the linker in single-chain Fv fragment assembled in V (L) to V (H) orientation drives the formation of dimers, trimers, tetramers and higher molecular mass multimers, Protein Eng. 13 (8): 565-74). 안정적인 이량체 다이어바디 단편을 형성하기 위하여 사슬내 도메인 상호작용보다는 사슬간 도메인 상호작용이 발생한다(Holliger et al., 1993, Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (14): 6444-48). 짧은 펩티드 링커는 사슬내 도메인 쌍을 예방하고, 따라서 다이어바디 단편 형성을 결과하는 사슬간 상호작용의 형성을 가능하게 한다(Perisic et al. 1994, Crystal structure of a diabody, a bivalent antibody fragment, Structure 2 (12): 1217-26).
특정 구체예에서, 다이어바디는 1차, 2차, 3차 나노구조의 단계적 어셈블리에 대한 구조 요소로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "다이어바디"는 이량체 단쇄 가변 항체 단편(scFv)을 의미한다. 앞서 기술한 바와 같이, scFv 단편은 Fv 가변 중쇄의 카르복시 말단을 Fv 가변 경쇄의 아미노 말단에 연결시킨 융합 펩티드(VH-VL) 또는 다른 융합 펩티드(즉, VL-VH)로 구성된다(Pluckthun et al., 1997, New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments, Immunotechnology 3 (2): 83-105; Hudson, 1998, Recombinant antibody fragments, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (4): 395-402; Kipriyanov et al., 1999,Generation of recombinant antibodies, Mol. Biotechnol. 12 (2): 173-201).
특정 구체예에서, 다이어바디 또는 다량체 단편은 열안정하다(참조: Jermutus et al., 2001, Tailoring in vitro evolution for protein affinity or stability, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(1) : 75-80; Worn et al., 2001, Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments, J. Mol. Biol. 305 (5): 989-1010). 열안정성은 1차, 2차, 3차 나노구조의 스태그된 어셈블리에 이용되는 구조 요소에 유용한 특성이다.
1가 scFv 단편과 달리, 다이어바디는 대략 170ㅀ 가성-2배 대칭축(인터페이스에 평행)에 의해 연결된 서로 반대 방향의 2개의 독립된 항원-결합 부위로 구성되는 "2-본체"를 보유하는 2가 분자이다(Perisic et al., 1994, Crystal structure of a diabody, a bivalent antibody fragment, Structure 2 (12): 1217-26; Poljak, 1994, Production and structure of diabodies Structure 2: 1121-23; Hudson et al., 1999, High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies,J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89)(도 2).
단일특이적 다이어바디는 동일한 리간드/합텐에 특이성을 갖는 2개의 동일한 항원-결합 부위를 보유한다. 이중특이적 다이어바디는 서로 다른 리간드/합텐에 특이적 2개의 항원-결합 부위를 보유한다; 다시 말하면, 이중특이적 항체는 서로 다른 비-대합된 scFv 단편으로부터 유래된다. 제 1 하이브리드 단편은 제 1 Fv 항체의 VH 코딩 영역을 보유하고, VL 코딩 영역은 제 2 Fv 항체로부터 유래된다. 생성된 VH-VL 하이브리드 단편은 짧은 Gly/Ser 링커에 의해 서로 연결된다. 제 2 하이브리드 단편은 제 1 Fv 항체의 VL 코딩 영역을 보유하고, VH 코딩 영역은 제 2 Fv 항체로부터 유래된다.
이중특이적 링커의 사용은 각 리간드에 대하여 이중특이적 친화성을 보이는 이중특이적 항체 단편의 창조를 가능하게 한다(Poljak, 1994, An idiotope-anti-idiotope complex and the structural basis of molecular mimicking, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 (5): 1599-1600; Kipriyanov et al., 1998, Bispecific CD3 xCD19 diabody for T cell-mediated lysis of malignant human B cells, Int. J. Cancer 77 (5): 763-72; Arndt et al., 1999, A bispecific diabody that mediates natural killer cell cytotoxicity against xenotransplanted human Hodgkin's tumors, Blood 94 (8): 2562-68 ; Takemura et al., 2000, Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system, Protein Eng. 13 (8): 583-88). 특정 이중특이적 다이어바디는 전체 IgG에서 나타나는 것과 유사한 리간드/합텐에 대한 친화성을 보인다(Holliger et al., 1993, Engineering bispecific antibodies, Curr. Opin. Biotechnol. 4 (4): 446-49; Yagi et al., 1994, Superantigen-like properties of an antibody bispecific for MHC class II molecules and the V beta domain of the T cell antigen receptor, J. hnmunol. 152 (8): 3833-41).
다이어바디는 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 사용하기 적합한 여러 특성을 보인다: (1) 이들은 반대 방향으로 항원 결합 부위를 보유하는 구조이다; (ii) 이들의 항원-결합 부위의 기하학적 대치는 나노구조의 선형 나노구조 또는 선형 신장을 구축하는 잠재력을 최적화시킨다; (iii)이들은 잘-정의된 크기, 형상, 구조, 화학량론을 갖는다; (iv) 이들은 구조적 경직성 및 잘-정의된 인식과 결합 특성을 보유한다; (v) 광범위한 범위의 유기와 무기 부분에 대하여 특이성을 보이는 결합 모티프가 확인되고 다이어바디 구조에 통합될 수 있다; (vi) 이들의 X-레이 구조가 확인되었고(도 2) 기능기 또는 결합 부위를 추가할 수 있는 위치를 확인하는 청사진으로 기능할 수 있다; (vii) 다이어바디는 서로 강한 분자간 결합을 형성한다; (viii) 분자간 결합이 매우 특이적이다; (ix) 면역글로불린 폴드가 구조 단백질 코어(구조 요소) 및 단백질의 서로 다른 표면간 안정적인 공간적 상관관계를 제공한다; (x) 부가적인 결합 부위가 삽입되는 루프가 다이어바디의 3차원 구조의 검사를 통하여 용이하게 확인된다(Zhu et al., 1996, High level secretion of a humanized bispecific diabody from Escherichia coli, Biotechnology (NY) 14 (2): 192-96; Hudson et al., 1999, High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89). 이를 종합하면, 이들 특성은 복잡한 다차원 나노구조를 구축하는 구조 요소로서 다이어바디를 이용할 때의 이점이다.
scFv 단편은 다가 다량체로 결합될 수도 있다(Hudson et al., 1999, High avidity scFv multimers ; diabodies and triabodies, J. Immunol. Methods 231 (1-2): 177-89; Power et al., 2000, Synthesis of high avidity antibody fragments (scFv multimers) for cancer imaging, J. Immunol. Methods 242 (1-2): 193-204; Todorovska et al.,2001, Design and application of diabodies,triabodies and tetrabodies for cancer targeting, J. Immunol. Methods248 (1-2): 47-66)(도 3). 다량체 형성은 가변 도메인(V-도메인)을 서로 결합시키는데 이용되는 링커의 길이 및 V-도메인 조성과 배향(VH-VL vs. VL-VH)에 좌우된다. 링커 길이를 3개 잔기 미만으로 줄이면, 일반적으로 삼량체 또는 트라이어바디, 예를 들면 (scFv)3이 형성된다. 테트라바디, 예를 들면 (scFv)4의 형성 역시 적어도 2가지 경우에서 보고되었는데, 여기서 링커 길이는 0 잔기이고 V-도메인 배향이 VL-VH이었다(Todorovska et al., 2001, Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting, J. Immunol. Methods 248 (1-2): 47-66).
항체 가변 도메인은 단계적 어셈블리에 대한 어셈블리 단위에서 구조 요소 및 결합 요소 모두를 기능적으로 포함한다. 구조 요소에서처럼, 결합 요소의 범위가 항상 완벽하게 정의되지는 않는다. 가령, 항체 가변 도메인의 β-시트 구조는 CDR 및 분자의 다른 부분 사이의 기하학적 상관관계를 유지한다. 또한, 결합쌍의 상보적 대응물의 결합 친화성과 특이성을 제공하는 CDR 루프간 구조적 상관관계를 유지하는 것도 중요하다. 결과적으로, 항체 가변 도메인은 어셈블리 단위에 구조 요소와 결합 요소 모두를 기능적으로 포함한다. 따라서, 항체 분자와 항체의 결합 단편이 결합 요소로서 선호되긴 하지만, 많은 구체예 및 전술한 바와 같이 어셈블리 단위에 대한 구조 골격를 또한 제공한다.
항체 기능 요소
항체 어셈블리 단위는 기능 요소로 항체를 보유한다. 결합 요소 또는 구조요소로 포함되지 않는 앞서 기술된 항체, 결합 단편, 결합 유도체는 다른 부분의 부위 특이적 부착에 대한 기능 요소로 기능할 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서 2개 이상의 결합 요소를 보유하는 어셈블리 단위를 이용하여 나노구조를 구축할 수 있다. 부가적인 결합 요소는 (i) 기능 요소 또는 기능 부분(상기 표 4)의 부가 또는 삽입을 위한 부착점; (ii) 고체 기질에서 개시물질의 부착점; (iii) 서브어셈블리에 대한 부착점으로 이용될 수 있다.
다른 요소
본 발명의 특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 구조 요소를 포함한다. 일반적으로, 구조 요소는 경직된 구조(하지만, 특정 구체예에서 구조 요소는 경직되지 않는다)를 갖는다. 적절하게는, 구조 요소는 적어도 50개 아미노산, 일반적으로 200개 정도의 아미노산으로 구성되는 공지된 크기와 구조의 정의된 펩티드, 단백질 또는 단백질 단편이다. 펩티드, 단백질, 단백질 단편이 선호되는데, 그 이유는 자연-발생 펩티드, 단백질, 단백질 단편은 단백질의 서로 다른 표면 사이와 표면간 안정적인 공간적 상관관계를 제공하는 구조 코어를 갖는 잘-정의된 구조이기 때문이다. 이런 특성은 구조 요소가 어셈블리 단위의 결합 요소와 기능 요소간 사전-정의된 기하학적 상관관계 및 어셈블리 단위의 화학량론을 유지할 수 있도록 한다.
구조 요소로서 단백질의 사용은 무기 나노입자와 같은 다른 선택물질보다 분명한 이점을 갖는다. 대부분의 무기 나노입자 개체군은 이질성이기 때문에, 나노구조의 어셈블리를 위한 골격으로는 매력이 없다. 대부분 개체군에서, 각 무기 나노입자는 각면과 결정면 사이에 상이한 기하학적 상관관계 및 결함과 불순물을 보유하는 서로 다른 원자로 구성된다. 대조적으로, 유사한 크기의 단백질 개체군은 매우 동일하고, 각 단백질은 동일한 개수의 아미노산으로 구성되고, 각 아미노산은 거의 동일한 방식으로 정렬되고 열 변동 효과를 통해서만 배열이 달라진다. 결과적으로, 서로 상호작용하도록 설계된 2개의 단백질은 항상 동일한 결합 구조로만 상호작용하여, 예측가능한 결합구조와 화학량론의 복합체를 형성한다. 이런 특성은 나노구조의 대규모 평행 "상향식"어셈블리에 필수적이다.
구조 요소는 나노구조의 결합 요소와 기능 요소간 기하학적 상관관계를 유지하는데 이용될 수 있다. 이와 같이, 경직된 구조 요소는 본원에 기술된 단계적 구조 요소를 이용한 나노구조의 구축에 선호된다. 이런 경직성은 많은 단백질에서 전형적이고, 단백질을 구성하는 2차 구조 요소의 특성, 예를 들면 α-나선과 β-시트를 통하여 단백질에 공여된다.
구조 요소는 3차원 구조가 공지되어 있거나ab initio설계된 단백질, 단백질 단편 또는 펩티드의 구조에 기초할 수 있다. 어셈블리 단위에 구조 요소로 사용될 수 있는 단백질 또는 단백질 단편의 예에는 항체 도메인, 다이아바디, 단쇄 항체 가변 도메인, 박테리아 필린(pilin)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 구조 요소, 결합 요소, 기능 요소는 잘-정의되어 있고 예로써 글리신 링커에 의해 분리된다. 다른 구체예에서, 결합 요소는 구조 요소의 내부인 펩티드 또는 단백질 분절을 포함하거나 상보성 결정 영역(CDR)의 경우에서처럼 구조 요소의 말단에서 다중 루프로 구성된다(Kabat et al., 1983, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and HumanServices). CDR은 항체의 가변 도메인의 내부인 결합 요소이다. 가변 도메인은 구조 요소를 대표하고, 구조 요소 및 결합 요소를 구성하는 CDR간 경계는 구조적으로 항상 완전하게 명백하지는 않다(많은 항체 서열의 비교에 기초하여 기존 문헌에서 잘-정의되어 있긴 하지만). 구조 요소와 결합 요소간 잘-정의된 경계가 항상 존재하는 것은 아니고, 이들 도메인 사이의 경계는 개별 유용성에 기초하여 잘-정의되어 있긴 하지만 공간적으로 명확하지 않다.
본 발명의 구조 요소는 결합 요소, 기능 요소 및/또는 유연성 도메인(예, 트리-, 테트라- 또는 펜타글리신)을 통합하도록 후속으로 변형되어 유용한 어셈블리 단위를 제공하는 자연-발생 단백질의 코어 구조 요소를 포함한다. 결과적으로, 특정 구체예에서 현재 단백질의 구조를 분석하여, 상기 단백질 또는 단백질 일부의 경직된 구조에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 변형될 수 있는 단백질 부분 또는 이의 일부를 확인한다.
가령, 특정 구체예에서 단백질 또는 구조 요소의 표면 루프 영역의 아미노산 서열은 단백질의 전체 폴딩에 대한 영향없이 변화된다. 일반적으로, 단백질의 표면 루프의 아미노산 서열은 결합 요소, 기능 요소 및/또는 유연성 도메인의 부가적인 아미노산 서열이 단백질 구조를 가장 적게 파괴하면서 삽입되는 아미노산 위치로서 선호된다. 단백질에서 표면 루프의 위치 결정은 3차원 원자 좌표가 이용가능하면 공지된 단백질 시각화 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 RASMOL(Sayle et al., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci. (TIBS) 20 (9): 374-376; Saqi et al., 1994, PdbMotif-a tool for the automaticidentification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl. Biosci. 10 (5): 545-46)를 이용한 단백질 또는 이의 상동체의 3차원 구조의 검사로 실시한다. 이런 방식으로, 표면 루프에 포함된 아미노산 및 이들 표면 루프의 상대적 공간적 위치를 결정할 수 있다.
조작되는 단백질의 3차원 구조가 미지이지만 가까운 상동체가 알려져 있는 경우(가령, 필연적으로 모든 항체 분자에서처럼), 목적 분자 또는 이의 일부의 아미노산 서열은 3차원 구조가 알려져 있는 분자의 아미노산 서열로 정렬할 수 있다. 이런 비교[가령, BLAST(Altschul et al., 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) 또는 LALIGN(Huang and Miller, 1991, A time efficient, linear-space local similarity algorithm, Adv. Appl. Math. 12: 337-357)를 이용하여]는 공지된 3차 구조의 단백질에서 표면 루프(β-회전)을 구성하는 아미노산에 상응하는 목적 단백질에서 모든 아미노산의 확인을 가능하게 한다. 둘 분자간에 높은 서열 상동성이 존재하는 영역에서, 이런 확인은 높은 수준의 확실성으로 실시된다. 일단 추정 루프가 본원에 개시된 방법에 따라 확인되고 변형되면, 생성 구조체는 예측된 특성을 갖는 지를 검사한다. 이런 분석은 루프의 확인이 고도로 신뢰되는 경우, 예를 들면 결정이 공지된 단백질 구조에 기초한 경우에도 실시된다.
항체-유래된 도메인 이외에, 루이신 지퍼-형 꼬인 나선으로 구성되는 구조 요소 역시 본 발명의 나노구조에서 어셈블리 단위로 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법을 이용한 나노구조의 구축에 사용되는 루아신 지퍼-형 꼬인 나선으로 구성되는 구조 요소를 포괄한다. 루이신 지퍼는 루이신 지퍼 도메인의 정확한 서열(Harbury et al., 1993, A switch between two-, three-, and four-strandedcoiled coils in GCN4 leucine zipper mutants, Science 262: 1401-07)에 따라 단백질 또는 단백질 단량체의 이량체, 삼량체, 사량체 구조로의 올리고머화에 관여하는 잘-알려진 α-나선 단백질 구조이다(Oas et al., 1994, Springs and hinges: dynamic coiled coils and discontinuities, TIBS 19 : 51-54; Branden et al., 1999, Introduction to Protein Structure 2nd ed., Garland Publishing, Inc., New York). 간단하게 하기 위하여 이량체만 개시하지만, 삼량체와 사량체 단위 역시 본원에 개시된 방법에 따른 나노구조의 단계적 어셈블리에 사용되는 어셈블리 단위의 구성에 사용될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 특정 구체예에서, 삼량체와 사량체 단위는 적절한 활성을 위한 2개 이상의 화학적 부분을 요구하는 기능 요소의 통합, 예를 들면 금 입자의 결합을 위한 2개의 시스테인 통합에 특히 유용하다.
예로써 항체-유래된 도메인에 연결된 4개의 나선 번들로 구성되는 구조 요소 역시 본 발명의 나노구조에서 어셈블리 단위에 사용될 수 있다. 루이신 지퍼의 설계와 구조는 어셈블리 단위의 구조 요소의 구성에 유용한 한가지 유형의 꼬인 나선 올리고머화 펩티드를 대표한다. 다른 타입은 4개-나선 번들인데, 이의 무제한적 실례는 도 10에 도시한다. 나선을 결합시켜 어셈블리 단위를 형성하는 하나이상의 루프 분절(즉, 비-나선 분절)이 존재하기 때문에, 이런 구조는 "나선-루프-나선"구조라고 한다. 루프 구획은 나선을 서로 근접하게, 따라서 기능적으로 높은 농도로 유지시킴으로써 전체 구조의 안정화에 기여한다. 나선-루프-나선 단백질의 예에는 박테리아 Rop 단백질(2개의 나선-루프-나선 분자를 보유하는 동종이량체)(Lassalle et al., 1998, Dimer-to-tetramer transformation: loop excision dramatically alters structure and stability of the ROP four alpha-helix bundle protein, J. Mol. Biol. 279 (4): 987-1000); 진핵 사이토크롬 b562(단일 나선-루프-나선-루프-나선-루프-나선 구조)(Lederer et al., 1981, Improvement of the 2.5 A resolution model of cytochrome b562 byredetermining the primary structure and using molecular graphics, J. Mol. Biol. 148 (4): 427-48); Max(Lavigne et al., 1998, Insights into the mechanism of heterodimerization from the 1H-NMR solution structure of thec-Myc- Max heterodimeric leucine zipper, J. Mol. Biol. 281(1) : 165-81); MyoD DNA-결합 도메인(Ma et al., 1994, Crystal structure of MyoDbHLH domain-DNA complex: perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation, Cell 77 (3): 451-59); USF1 과 USF2 DNA-결합 도메인(Ferre-D'Amare et al., 1994, Structure and function of the b/HLH/Z domain of USF, EMBO J. 13(1) : 180-9; Kurschner et al., 1997, USF2/FIP associates with the b-Zip transcription factor, c-Maf, via its bHLH domain and inhibits c-Maf DNA binding activity, Biochem. Biophys. Res. Commun. 231 (2): 333-39); Mit-f 전사 인자 DNA-결합 도메인(Rehli et al., 1999, Cloning and characterization of the murine genes for bHLH-ZIP transcription factors TFEC and TFEB reveal a common gene organization for all MiT subfamilymembers, Genomics 56(1) : 111-20) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
Rop 단백질의 양 나선 영역과 루프 영역은 Rop 단백질 또는 이의 단편이 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에서 어셈블리 단위의 구성에서 구조 요소로 이용될 수 있음을 시사하는 특성을 보인다. 한 구체예에서, Munson et al.(1996, What makes a protein a protein? Hydrophobic core designs that specify stability and structural properties, Protein Science 5: 1584-93)의 방법으로ㅇRop 단백질의 Rob 단백질의 나선 영역에서 a와 d 잔기를 돌연변이시켜 증가되거나 감소된 열 안정성을 갖는 변이체 폴리펩티드를 만들었다.
본 발명의 한 측면에서, 기능 요소에는 금속 또는 산화 금속 나노입자(Argonide Corporation, Sanford, FL; NanoEnergy Corporation, Longmont, CO; Nanophase Technologies Corporation, Romeoville, IL ; Nanotechnologies, Austin, TX; TAL Materials,Inc., Ann Arbor, MI); 금 또는 금-피복된 나노입자(Nanoprobes,Inc., Yaphank, NY; Nanospectra LLC, Houston TX); 면역-접합체(Nanoprobes, Inc. , Yaphank, NY); 비-금속성 나노입자(Nanotechnologies, Austin, TX); 세라믹 나노섬유(Argonide Corporation, Sanford, FL); 플리렌(fullerenes) 또는 나노튜브(탄소 나노튜브)(Materials and Electrochemical Research Corpor- ation, Tucson, AZ; Nanolab, Brighton MA; Nanosys,Inc., Cambridge MA; Carbon Nano- technologies Incorporated, Houston, TX); 나노결정(NanoGram Corporation, Fremont, CA; Quantum Dot Corporation, Hayward CA);실리콘이나 실리케이트 나노결정 또는 분말(MTI Corporation, Richmond, CA); 나노와어어(Nanosys, Inc. , Cambridge MA); 퀀텀 도트(Quantum Dot Corporation, Hayward CA; Nanosys, Inc. , Cambridge MA)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
기능 요소에는 임의 당분야에 공지된 감지가능한 표식이 포함될 수 있는데, 예를 들면,32P,35S,3H 및 이와 유사한 종과 같은 방사능 라벨; 발색단; 형광단: 화학발광 분자; 효소 표식 등을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서 기능 요소는 형광단이다.
라벨로 선택할 수 있는 예시적인 형광단 분자를 하기 표 5에서 제공한다.
표 5
기능 요소로 이용할 수 있는 형광단 부분
4-아세타아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산
아크리딘 및 유도체:
아크리딘
아크리딘 이소사아네이트
5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)
4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈리미드-3,5디설포네이트
(Lucifer Yellow VS)-(4-아닐노-1-나프틸)멜레이미드
안트라닐아미드
Brilliant Yellow
코우마린 및 유도체:
코우마린
7-아미노-4-메틸코우마린(AMC, Coumarin 120)
7-아미노-4-트리플로오르메틸코우마린(Coumarin 151)
Cy3
Cy5
시아노신
4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI)
5',5"-디브로모피로갈롤-설폰네프탈렌(Bromopyrogallol Red)
7-디에틸아미노-3-(4'-이소사아나토페닐)-4-메틸코우마린
디에틸렌트리아민 펜타아세테이트
4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산
4,4'-디이소티오사아나토스틸벤-2,2'-디설폰산
5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드)
4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL)
4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소시아네이트(DABITC)
에오신 및 유도체:
에오신
에오신 이소티오시아네이트
에리트로신 및 유도체:
에리트로신 B
에리트로신 이소티오시아네이트
에티디움 플로오르레신 및 유도체:
5-카르복시플로오레신(FAM)
5-(4,6-디클로로트리아진-2-yl)아미노플로로레신(DTAF)
2'7'-디메톡시-4'5'-디클로오르-6-카르복시플로로레신(JOE)
플로오르레신
플로오르레신 이소티오시아네이트
QFITC(XRITC)
플로오레스카민
IR144
IR1446
Malachite Green 이소티오시아네이트
4-메틸움벨리페론
오르소 크레소프탈렌
니트로티로신
파라로사니린
Phenol Red
B-피코에리트린
o-프탈디알레히드
피렌 및 유도체
피렌
피렌 부티레이트
숙시니미딜 1-피렌 부티레이트
Reactive Red 4(CibacronRBrilliant Red 3B-A)
로다민 및 유도체
6-카르복시-X-로다민(ROX)
6-카르복시로다민(R6G)
리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드
로다민(Rhod)
로다민 B
로다민 110
로다민 123
로다민 X 이소티오시아네이트
설포로다민 B
설포로다민 101
설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red)
N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA)
테트라메틸 로다민
테트라메틸 로다민 오시티오시아테이트(TRITC)
리보플라빈
로졸산
테르비움 킬레이트 유도체
다른 구체예에서, 기능 요소는 루미놀(Amersham Biosciences), BOLD APB(Intergen), Lumigen APS(Lumigen) 등과 같은 화학발광 기질이다.
또 다른 구체예에서, 기능 요소는 효소이다. 효소는 일부 구체예에서, 효소 알칼린 포스파타제, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈랄토시다제 등과 같이 특정 화학반응이 수행될 때 검출가능한 신호를 만들 수 있다.
또 다른 구체예에서, 기능 요소는 합텐(hapten)이나 항원(가령, ras)이다. 또 다른 구체예에서, 라벨된 항-디곡시제닌이 결합할 수 있는 디곡시제닌(digoxygenin)이나, 라벨된 아비진 분자 또는 스트렙타비딘이 결합할 수 있는 분자가 기능 요소가 된다.
또 다른 구체예에서, 기능 요소는 땅콩 렉틴이나 콩 아글루티닌같은 렉틴(lectin)이다. 또 다른 구체예에서, 기능 요소는 슈도모나스 익소탁신(Pseudomonasexotoxin)(Chaudhary et al., 1989, A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonasexotoxin, Nature 339 (6223): 394-97). 같은 독소이다.
펩티드, 단백질, 단백질 도메인들은 융합 단백질을 생성하기 위해 당 분야에 잘 알려진 분자 생물학의 기구들을 이용하여 단백질형 어셈블리 단위에 첨가될 수있는데 이때, 융합단백질에는 기능 요소가 단백질의 N-말단, 단백질의 C-말단에 도입되거나 단백질의 폴딩을 방해하지 않도록 하는 방식으로 단백질 내의 고리에 도입되어 있다. 비-펩티드 기능 요소는 기능 요소에 특이성을 나타내는 펩티드 또는 단백질 부분에 결합되거나 어셈블리 단위의 단백질 부분에 도입되어 어셈블리 단위에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 전체 항체 가변 도메인(가령, 단일-체인 가변 도메인)이 어셈블리 단위에 결합되어(가령, 결합 요소나 구조 요소에 결합되어), 기능 요소에 대한 친화성 표적으로 기능할 수 있다. 본 구체예에서, 전체 항체 가변 도메인이 결합 요소나 구조 요소의 표면 고리에 삽입되는데, 가변 도메인 서열의 각 변에 유연한 부분(가령, 폴리글리신 펩티이드 서열)이 추가되는 것이 바람직하다. 이 폴리글리신 링커는 재조합 융합 단백질의 합성 후 고유 단백질의 폴딩(접힙을 촉진시키는 유연한 스페이서로 기능할 것이다. 항체 도메인은 기능 요소에 대한 결합 특이성에 따라 선택되며, 이는 단백질이나 펩티드, 또는 무기질 물질일 수 있다.
발명의 또 다른 구체예에서, 기능 요소는 바람직한 광학적 성질을 가진 퀀텀 도트(반도체 나노결정, 가령, 미국, 캘리포니아 Hayward 소재 Quantum Dot Corporation 사 제품인 QDOT)일 수 있다. 퀀텀 도트는 특정 클래스의 퀀텀 도트에 대한 특이성을 가진 펩티이드를 통해 나노구조에 결합될 수 있다. 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 종류의 퀀텀 도트에 대해 친화성 요건을 가진 이러한 펩티드 식별 방법은 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용한다. 예를 들어, 이러한 펩티드는 친화성 정제 방법을 이용하여 파아지(phage)-디스플레이 펩티드의 대형 라이브러리로부터 선택된다. 적절한 정제 방법으로는 바이오패닝(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405 (6787): 665-68) 과 친화성 칼럼 크로마토그래피가 있다. 각각의 경우에, 표적 퀀텀 도트들의 이동성이 제한되고, 재조합 파아지디스플레이 라이브러리가 고착된 퀀텀 도트에 대하여 배양한다. 바이오패닝을 여러 번 실행하고, 퀀텀 도트에 대한 파아지디스플레이 진화성을 표준 방법에 의해 확인하고, 펩티드의 특이성은 표준 ELISA 방법을 이용하여 테스트한다.
일반적으로, 친화성 정제는 여러 친화성 정제 단계를 이용한 반복 과정이다. 친화성 정제는 특정 금속 및 반도체에 대한 친화성을 가진 펩티드를 식별하는 데 사용될 수 있다(Belcher, 2001, Evolving Biomolecular Control of Semiconductor and Magnetic Nanostructure, presentation at Nanoscience: UnderlyingPhysical Concepts and Properties, National Academy of Sciences, Washington, D. C. , May 18-20,2001 ; Belcher et al., 2001, Abstracts of Papers, 222nd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States, August 26-30,2001, American Chemical Society, Washington, D. C.).
대안으로 파아지-디스플레이 단일 체인 가변 도메인의 라이브러리들을 이용하여, 동일 종류의 선택 과정을 실행하는 것이다. 따라서 일부 구체예에서는, 기능 요소는 결합 요소들을 이용하여 나노구조에 결합되고, 이에 의해, 바람직한 성질을 가진 비-단백질형 나노입자가 나노구조에 부착된다. 이러한 결합 요소는 친화력에의해 선택된 펩티드로부터, 또는 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역으로부터 도출된다.
나노결정(단일 나노입자)들과 나노입자들의 어셈블리들의 전자적 성질을 비교하는 데 통상적으로 사용되는 전자적 및 광자적 요소들에 대한 통상적인 테스트들은 여기서 소개된 방법과 조성을 이용하여 제작되는 나노구조들의 분석을 위해 사용된다(Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30:545-610).
일부 구체예에서, 고유하면서도 조정가능한 반도체 나노결정들의 성질들에 의해, 이 물질들을 광전도 나노디바이스 및 발광 다이오드를 포함하는 나노디바이스에 사용하는 것이 바람직하다. 개별 나노구조의 전기적 성질은 측정이 어려워, 이 나노구조들의 성질들의 척도로서 광전도도가 이용된다. 광전도도(photoconductivity)는 반도체 및 유기질 고체의 성질 분석에 사용되는 잘 알려진 현상이다. 광전도도는 절연 유기질 고체에서 분자와 약하게 상호 작용하는 분자들 사이에서 전자를 이동시키는 데 사용되고 있다.
광전류 스펙트럼 응답들이 나노구조의 나노결정들의 흡수 스펙트럼을 매핑하는 데 사용될 수 있고, 개별 나노결정들의 광전류 스펙트럼 응답들에 대해 비교될 수 있다(see, e. g., Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610). 추가적으로, 광학적 및 광형광 스펙트럼이 나노구조의 광학적 성질을 연구하는 데 사용될 수 있다(Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610).
나노결정들 어레이의 형성에 대하여 가해진 제어가 클수록, 생성될 광학적, 전기적, 자기적 현상의 어레이의 폭이 넓어진다. 나노구조 어셈블리에 나노입자들이 3차원의 정확도로 통합되면, 여기서 형성된 고체들의 성질을 3차원적으로 제어하는 것이 가능하며, 따라서, 나노디바이스의 설계에 유용한 이방성 성질들의 호스트를 불러일으킬 수 있다. 이 어셈블리들의 성질을 특성화하는 일상적인 테스트 및 방법들은 당 분야에 잘 알려져 있다(see, e.g., Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Sci. 30: 545-610).
가령, 단백질과 퀀텀 도트의 결합으로 만들어진 바이오센서가 상용화되어 있다(Alivisatos et al., 1996, Organization of'nanocrystal molecules'using DNA, Nature 382: 609-11; Weiss et al., U.S. Patent No. 6,207, 392 entitled"Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process formaking and using such probes, "issued March 27, 2001). 퀀텀 도트를 고도로 발전된 생물학적 분자(가령, 표준 스트랜디드 DNA나 항체 분자)와 결합시키는 능력은 분자의 표적에 대한 스펙트럼 핑거프린트를 제공한다. 여러 다른 크기의 퀀텀 도트들을 이용함으로서(이들은 각각 다른 스펙트럼 성질들을 가지게 됨), 서로 다른 세부사항을 가진 분자에 결합된 각각이 동시에 여러 가지 성분들을 감지할수 있다.
금속이나 반도체의 나노결정들과 퀀텀 도트같은 무기질 구조는 조합된 나노구조의 브랜치-말단들로 나노구조의 단계적-어셈블리에 사용될 수 있다. 이러한 무기질 구조가 추가될 경우, 추가적인 그룹들이 부착될 수 없다. 왜냐하면, 이들은 나노구조에 인공적으로 처리된 어떤 결합 부위 세트들에 대한 중간물질 화학구조를 가지기 때문이다. 이는 단계적 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조를 생성하기 위해 어셈블리 단위들이 추가되는 시퀀스에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 나노결정이 나노구조에 추가될 경우, 일반적으로, 상기 나노결정 종류를 인식하고 결합하는 결합 요소들로 추가 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직하지 않다. 왜냐하면, 나노결정에 대해 이러한 어셈블리 단위들의 위치 설정을 제어하는 것은 일반적으로 가능하지 않기 때문이다. 따라서, 나노결정을 마지막으로 추가해야 하며, 또는, 특정 종류의 나노결정을 결합시키는 모든 어셈블리 단위들이 추가된 후에 나노결정들을 추가하는 것이 바람직하다. 적절한 구체예에서, 나노결정들은 매트릭스에 결합은 되어 있으나 충분히 이격되어 있는 나노구조에 추가되어, 각각의 나노결정들이 단일 나노구조에 결합될 수 있고, 따라서, 나노구조들의 다중 교차-결합을 방지할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작되는 견고한 나노구조는 나노구조 레버 아암(arm)의 단부에 한 요소로 부착되는 한 개의 자성 나노입자를 포함한다. 이는 로컬 지가장의 매우 민감한 센서로 작용한다. 자기장의 존재는 자기적 나노입자의 위치를 변화시키는 기능을 하여, 나노구조 레버 아암을부착된 고체 기질에 대해 구부러지게 한다. 레버 아암의 위치는, 일부 구체예에서, 나노구조 레버 아암을 따르는 다른 위치들에 대해 요소로 부착되는 광학적 나노입자들의 위치 변화를 통해 감지될 수 있다. 이 레버 아암의 움직임 정도는 자기장을 측정함으로서 표현될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작된 나노구조들은 전용화된 요소들 없이도 바람직한 성질들을 가진다. 이러한 구체예에서, 단계적 어셈블리 과정은 2차원 또는 3차원적 나노구조를 제공하며, 이때, 나노미터 스케일의 정밀하고 미세하게 형성된 구멍들(pores)을 가진다. 이 구멍들은 미세유체 시스템내 입자들을 필터링하는 데 사용될 수 있다. 본 구체예의 추가 특징에서, 나노구조는 나노구조의 분리 성질을 향상시키는 요소들도 포함하고, 이렇게 잘 형성된 구멍들도 포함하도록 형성되어, 분자의 친수성이나 소수성 성질, 또는 전하들에 대해, 그리고 크기를 바탕으로 한 이격을 가능하게 한다. 이러한 나노구조들은 매우 균일한 패킹 물질과 상기 물질에 기초하여 HPLC 분리에 사용될 수 있다. 이러한 요소들의 예는 요망 크로마토그래피 분리용으로 사용되는 pH에서 양이나 음으로 대전된 한 개 이상의 측쇄들을 포함하는 펩티드 서열을, 그리고 소수성이나 친지방성 측쇄를 가진 한 개 이상의 아미노산을 가진 펩티드 서열을 포함한다.
정션(Junctions)들은 실리콘 기반 전자 칩 등의 마이크로전자 회로에서 "스위치 포인트"로 기능할 수 있는 구조물이다. 일부 구체예에서, 다가 항체(multivalent antibody)나 결합 유도체, 또는 그 결합 단편들이 나노구조로 사용되어, 본 발명의 방법을 이용하여 나노구조에 삽입된다. 이 나노구조 정션들을 포함하는 생물전자학적 및 생물연산학적 디바이스의 예로는 퀀텀 셀룰러 오토마타(QCA)가 있다.
항체 생산
일반적인 항체 생산 방법은 당분야에 공지되어 있다. 이들 방법은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법과 어셈블리 단위에 사용되는 구조 요소와 결합 요소를 생산하는데 이용된다(참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
목적 항원에 대한 항체의 분자 클론은 당분야에 공지된 기술로 만들 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 단클론 항체 분자, 또는 이의 항원 결합 영역을 인코드하는 핵산 서열을 작제할 수 있다(참조: Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Chapters 1,2,3,5,6,8,9,10, 13,14,15 and 18, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Chapters 1,2,3,5,6,8,10,11, 12,15,16,19,20 and 24, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.; Current Protocols in Immunology, Chapters 2,8,9,10,17 and 18, John Wiley & Sons, 2001, Editors John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H.Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, Series Editor: Richard Coico).
항체는 박테리아 세포질로의 분비에 의해 박테리아 세포내에서 세포외에서 발현될 수 있다(Tomlinson and Holliger, 2000, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol. 326: 461-79).하지만, 재조합 항체의 세포내 발현은 아마도 박테리아 세포질의 비-환원 환경으로 인하여 봉입체(inclusion body)로 불리는 단백질의 불용성 응집체를 빈번하게 형성하는데, 이는 항체 도메인간 이황화 결합 형성을 저해한다. 강한 변성제로 봉입체를 가용화하고, 이후 재생 조건에 노출시켜 당분야에 공지된 방법으로 이들 항체를 기능 단백질로 재폴딩할 수 있다.
재생 과정을 회피하기 위하여, 박테리아-유래된 세포질 신호 서열에 대한 코딩 서열은 항체를 인코드하는 유전자의 N-말단 부분에서 절단접합하여 재조합 단백질을 박테리아 세포질로 지향시킨다. 세포질 공간의 산화 환경은 이황화 결합 형성을 비롯한 항체 도메인의 적절한 폴딩을 유도한다. 기능 항체를 우수한 수율로 생산하는 있어 이들 방법의 성공은 항체 유형, 유도, 과다생산 방법에 좌우될 수 있다(참조: Ward, 1992, Antibody engineering: the use of Escherichia coli as an expression host, FASEB J. 6 (7): 2422-27; Ward, 1993, Antibody engineering using Escherichia coli as host, Adv. Pharmacol. 24: 1-20; Zhu et al., 1996, High level secretion of a humanized bispecific diabody from Escherichia coli, Biotechnology (NY) 14 (2): 192-96; Sheets et al., 1998, Efficient construction of a largenonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-62; Tomlinson et al., 2000, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol. 326: 461-79).
항체 분자는 당분야에 공지된 기술, 예를 들면 면역흡수 또는 면역친화성 크로마토그래피, 크로마토그래피 방법, 예를 들면 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), 또는 이들의 조합으로 정제할 수 있다.
나노구조의 단계적 어셈블리
항체 어셈블리 단위들은 단계적 어셈블리에 의해 나노구조를 형성하도록 조합될 수 있다. 단계적 어셈블리에 의하면, 유기질 및 무기질 부분들이 기설계된 3차원 구조에 정확하고 정밀하게 위치하는, 복합적이고 비-주기적인 다-차원 나노구조들의 대량 병렬 합성이 가능하다. 단계적 어셈블리에서, 일련의 어셈블리 단위들이 개시 단위이나 나노구조 중간매개물에 예정된 순서로 추가된다. 다량의 동일한 개시 물질들이 사용되기 때문에, 그리고 서브단위들이 모든 개시물/중간매개물에 동시에 추가되기 때문에, 단계적 어셈블리는 여러 개의 동일한 나노구조를 대량 병렬 방식으로 제작한다. 적절한 구체예에서, 개시 단위들은 고체 기질에 결합된다. 추가 어셈블리 단위들은 고상 폴리머 합성에 친숙한 과정으로 순차적으로 추가된다. 조합될 때 개시 단위에 형성되는 조합 어셈블리 단위를 포함하는 나노구조의 중간 스테이지는 나노구조 중간물 또는 단순히 나노구조로 설명된다. 각각의 어셈블리 단위를 조합 진행 중인 나노구조 중간물질에 추가하는 것은 앞서 추가한 어셈블리 단위에 의해 제시되는 결합형 요소의 성질에 따라 좌우되며, 순차적으로 추가되는 어셈블리 단위에 대하여서는 관계가 없다. 따라서, 어셈블리 단위는 조합진행중인 나노구조 중간물에 노출된 결합형 요소들에만 결합될 수 있다. 즉, 추가된 어셈블리 단위는 자체적으로 상호작용하거나 중합되지 않는다.
단일 어셈블리 단위의 결합 요소들이 비-상보적이고 서로 상호작용하지 않기 때문에, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 이량체나 폴리머를 형성하지 않는다. 추가될 어셈블리 단위들은 중간매개물과의 반응을 완료시키기 위해, 개시 단위나 나노구조 중간물질에 대해 과량으로 제공되는 것이 바람직하다. 단계적 어셈블리 과정 중 결합되지 않은 어셈블리 단위들을 제거하는 것은 고상 기질에 결합된 개시물을 이용하여 스테이지형 어셈블리를 실행함으로서 촉진된다. 그래서, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 어셈블리 과정의 각 사이클에서 세정되어 없어질 수 있다.
이 기법은 비교적 적은 비-교차 반응, 상보적 결합 쌍들을 이용하여 복합 나노구조의 조합을 제공한다. 몇가지 결합쌍들만이 필요하다. 왜냐하면, 제한된 수의 결합 요소들만이 어셈블리 과정 중 한 단계에서 어셈블리 중간매개물의 표면에 노출될 것이기 때문이다. 상보 결합 요소들을 가진 어셈블리 단위들이 추가되어, 나노구조 중간물에 대해 배양한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 어셈블리 사이클 중 나노구조 중간물질에 부착될 수 있다. 과량의 어셈블리 단위들을 씻어내고, 어셈블리 과정의 차후 단계 중 다른 어셈블리 단위들과의 불필요한 상호작용을 방지할 수 있다. 나노구조에서의 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해 독자적으로 결정될 수 있고, 개별적인 요소들이 어떤 바람직한 위치에 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 단계적 어셈블리 방법은 복합 나노구조들의 대량 병렬 제작을 가능하게 하며, 여러 다른 복합 나노구조들이 수직구조 방식으로 선순위 구조로 추가적으로 자체 조합될 수 있다.
도 11은 발명의 단계적 어셈블리 방법을 한 차원으로 표현하는 구체예를 도시한다. 단계 1에서, 개시 단위가 고체 기질에 고착된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시물질에 추가되고, 결과적으로 두 단위로 구성되는 나노구조 중간물이 형성된다. 단일 어셈블리 단위만이 본 단계에서 추가된다. 왜냐하면, 두 번째 어셈블리 단위는 자체적으로 상호작용(즉, 중합화)될 수 없기 때문이다.
개시 단위 또는 캡핑 단위(capping unit)를 포함한 단계적 어셈블리 중 차후 추가된 어셈블리 단위는, 추가된 기능 요소를 지닐 수 있고, 또는 앞서 추가된 단위로부터 길이가 다른 구조 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어 도 11의 단계 3에서, 한 개의 기능 요소를 포함하는 제 3 어셈블리 단위가 추가된다. 단계 4와 5에서, 추가적인 어셈블리 단위들이 추가되며, 이때, 각각의 단위는 원하는 기능 그룹을 가진다. 따라서, 도 11에 도시되는 단계적 어셈블리의 구체예에서, 제 3, 4, 5 어셈블리 단위 각각은 고유한 기능 요소(도면의 어셈블리 단위 상부로부터 튀어나온 기하학적 형태에 의해 표시됨)를 지닌다.
도 11에 도시되는 단계적 어셈블리의 구체예는 단 두 개의 비-교차 반응성, 상보 결합쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 자체-조합은 단계 5 말미에서 나타나는 바와 같이, 네 개의 비-교차 작용 상보적 결합형 쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 크기가 증가함에 따라, 요구되는 결합쌍들의 이러한 숫자 측면에서의 비교적 온건함이 점차 커지게 된다. 예를 들어, 도 11에 도시되는 다섯 개의 단계들을 확장함으로서 조합되는 N개 단위들의 선형 구조의 경우, 단계적 어셈블리는 여전히 두 개에 불과한 비-교차 반응 상보적 결합형 쌍들만을 필요로 한다. 반면에, 자체-어셈블리는 N-1개를 필요로 한다.
제작되는 나노구조의 수는 매트릭스에 결합된 개시물의 수에 의해 결정되며, 각각의 1차원 나노구조의 길이는 실행된 어셈블리 주기 수의 함수이다. 한 개 이상의 기능 요소들을 가진 어셈블리 단위가 사용될 경우, 어셈블리의 순서는 각각의 기능 요소들이 다른 기능 요소들에 대해 가지는 상대적 공간 관계를 규정할 것이다.
본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 각각의 단계 이후, 과량의 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 제거 단계, 가령, 세정 단계에 의해 부착된 나노구조 중간물질로부터 제거된다. 기판에 결합된 나노구조 중간물질은 적절한 용매(가령, 수용액이나 완충액)로 세정될 수 있다. 용매는 상보적 결합 요소의 구체적인 상호작용을 붕괴시키지 않으면서 비-특정 상호작용에 의해 유지되는 서브단위들을 제거할 수 있다. 적절한 용매는 pH, 염 농도, 화학 조성 등에 따라 변할 수 있다.
나노구조 중간물질을 세정하는 데 사용되는 완충액은Current Protocols in Immunology에 기술된 바와 같이 ELISA 프로토콜로 구현되는 세정 단계에 사용되는 완충액일 수 있다(Chapter 2, Antibody Detection and Preparation, Section 2.1"Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, "John Wiley & Sons, 2001, Editors John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, Series Editor: Richard Coico).
다른 구체예에서, 조합된 나노구조는 "캡핑 단위(capping unit)"을 추가함으로서 "캡핑(capped)"된다. 이는 단일 결합 요소를 지니는 어셈블리 단위이다. 더욱이, 개시 단위가 갈라질 수 있는 결합을 통해 고체 기질에 부착된 경우, 나노구조는 고체 기질로부터 제거되어 분리될 수 있다. 그러나, 일부 구체예에서는 완성된 나노디바이스가 고체 기질에 부착된 상태로 기능적일 것이며, 제거될 필요는 없을 것이다.
어셈블리 단위들을 추가하는 상술한 단계들은 최종 나노구조가 조합될 때까지 반복적인 방식으로 반복될 수 있다. 이후, 개시 단위 내의 지정된 방출 부분(가령, 프로테아제 부위)에서, 매트릭스로부터 제 1 어셈블리 단위를 고착시킨 결합을 파괴함으로서, 또는, 방출을 위한 지정된 공정(가령, pH 저하)을 이용함으로서, 완성형 나노구조가 방출될 수 있다. 도 11 및 12에 도시되는 단계적 어셈블리의 과정은 단계적 어셈블리용으로 제시된 가장 단순한 구체예 중 하나이다. 또 다른 구체예에서, 추가적인 결합 요소들을 구비한 어셈블리 단위들이 한 개 이상의 복합 어셈블리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 어셈블리 단위들은 개별적으로 추가될 수 있고, 또는, 서브어셈블리로 추가될 수도 있다(도 12). 그 결과, 원하는 설계 매개변수들을 충족시키도록 서로 공간적으로 분포된 기능 요소들을 가진 최종 나노구조가 완성된다. 본 명세서에 기재된 성분 및 방법들은 이 복합 나노구조를, 또는, 한 개 또는 다수의 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 형성되는 복합 나노디바이스를, 더 큰 구조물로 조합하기 위한 어셈블리 수단을 제공한다. 다차원 나노구조의 제작은 추가적 결합 요소들을 지닌 정확하게 분포된 어셈블리 단위들을 개별적인 1차원 나노구조에 통합함으로서(일례에 불과함) 달성될 수 있다. 이때, 상기 추가적인 결합 요소들은 개별 나노구조들을 함께 부착하기 위한 적절한 교차 결합 물질에 의해 인식되어 결합된다. 일부 적절한 구체예에서, 이러한 교차 결합은 항체일 수도 있고, 결합 파생물일 수도 있으며, 그 결합 단편일 수도 있다.
발명의 단계적 어셈블리 방법의 일부 구체예에서, 개시 단위는 고체 기질에 고착된다. 이러한 고착은 임의적이지 않다. 단지, 매트릭스나 기질에 개시 단위의 특정 요소를 결합시키는 것을 포함한다. 단계적 어셈블리 과정은 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 개시 단위에 방해없는 결합 요소를 필요로 하는 벡터형 공정이다. 개시 단위를 기질에 임의적으로 결합시키는 것은, 일부 예에서, 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 필요한 결합 요소의 방해를 야기할 것이다. 따라서, 나노구조가 조합될 개시 단위의 수를 줄일 수 있다.
본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 다른 구체예에서, 개시 단위는 고상 기판에 고착되지 않는다. 이 경우에, 고착되지 않은 개시 단위에 구성된 나노구조에 대해 제거 단계(가령, 세정 단계)가 실행될 수 있다. 1) 개시 단위에 자기적 나노입자를 부착시켜서, 자기장을 가함으로서 비-결합 어셈블리 단위으로부터 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 2) 원심분리, 침전, 또는 여과에 의해 비결합어셈블리 단위으로부터 대형 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 또는 3) 나노구조 중간물이나 조합된 나노구조가 파괴적 처리(가령, 프로테아제 처리나 화학적 저하)에 내성이 클 경우, 비결합 조합 단위들을 선택적으로 파괴시킨다.
단백질은 우수한 결합 성질을 가지고 있고, 단백질의 분자간 상호작용을 조작하는 기술도 당 분야에 잘 알려져 있다(Hayashi et al., 1995, A single expression system for the display, purification and conjugation of single-chain antibodies, Gene 160(1) : 129-30; Hayden et al., 1997, Antibodyengineering, Curr. Opin.. Immunol. 9 (2): 201-12; Jung et al., 1999, Selection for improved protein stability by phage display, J. Mol. Biol.294(1) : 163-80, Viti et al., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480- 505; Winter et al., 1994, Making antibodies by phage display technology, Annu. Rev. Immunol. 12:433-55). 그러나 나노구조의 스테이지형 어셈블리가 특정 인지 성질을 가진 생물학적 분자, 가령, 단백질이나 핵산처럼 생물학적 분자로 주로 구성된 성분들에 굳이 제한될 필요는 없다. 스테이지형 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조들의 여러 일부 구체예에서는 무기질 원자나 분자들의 광학적, 자기적, 또는 전기적 성질이 요구될 것이다.
단백질로 구성되지 않은 성분들이 활용되는 본 발명에 따른 구체예도 여러 존재한다. 다른 구체예에서는, 유기질 분자 및 무기질 분자들로 구성된 나노구조를 형성하기 위해 단백질이나 핵산의 분자 상호작용 성질을 이용하는 것이 가능할 수 있다.
특정 구체예에서, 발명의 단계적 어셈블리 방법들을 이용하여 나노구조로 조합된 성분들에 무기질 나노입자들이 추가된다. 이는 무기질 입자들에 대한 결합을 위해 특별히 선택된 결합 요소들을 이용하여 이행될 수 있다. 예를 들어, Whaley 등은 반도체 결합 표면에 특별하게 결합하는 펩티드들을 식별해낸 바 있다(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405: 665-68). 한 구체예에서, 이 펩티드들은 표준 클로닝 기술을 이용하여 여기서 소개된 단백질 성분들에 삽입된다. 단백질 구조물의 단계적 어셈블리는 견고한 3차원 배열로 이 결합 부위들을 분포시키는 분포 수단을 제공한다.
특정 종류의 무기질 나노입자에 대한 결합 부위들이 모두 제자리에 위치할 경우, 단백질형 어셈블리 단위들을 추가하는 데 사용된 것과 유사한 단계적 어셈블리의 사이클을 이용하여 무기질 나노입자들이 추가될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 나노구조 중간물을 배양하는 용액 조건들을 조정하는 것이 일부 구체예에서 필요할 수 있다. 이에 의해, 무기질 나노입자의 용해도(solubility)를 제공할 수 있다. 무기질 입자가 나노구조 중간물에 추가되면, 무기질 나노입자의 어떤 오염에 내재된 마이크로헤테로성질 때문에, 무기질 입자에 추가적인 단위들을 제어 방식으로 추가하는 것이 불가능할 수 있다. 이 헤테로 성질은 추가적인 상호작용의 형태 및 화학성질을 제거 불가능하게 만든다.
도 13은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기질 요소들을 추가하는 도면이다. 단계 1에서, 개시 단위가 고체 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시 단위에 특별히 결합된다. 단계 3에서, 추가적인 어셈블리 단위가 결합 진행 나노구조에 결합된다. 이 어셈블리 단위는 특정 무기질 요소에 대해 특정한 가공 결합 부위를 포함한다. 단계 4에서, 무기질 요소(양방향 빗금 타원으로 도면에 표시)가 나노구조에 추가되고, 가공 결합 부위에 의해 결합된다. 단계 5는 제 2 종류의 무기질 요소에 특정하도록 가공된 결합 부위로 또 다른 어셈블리 단위를 추가하고, 상기 제 2 무기질 요소(빗금 다이아몬드로 도면에 표시)가 단계 6에서 추가된다.
어셈블리 단위들이 추가되는 순서는 어셈블리 공정에 사용되는 교차-반응 결합 요소 쌍들의 수를 최소화할 필요성과, 프로덕트 나노구조의 요망 구조 및 활성에 따라 결정된다. 따라서, 어셈블리의 순서를 결정하는 것은 단계적 어셈블리에 의해 제작될 나노구조의 설계의 일체형 부분이다. 결합 요소들은 요망 나노구조의 단계적 어셈블리를 가능하도록 설계에 의해 선택된다. 결합 요소의 선택이 나노구조에 통합되기 위한 요소에 독립적이기 때문에, 요망 공간 방위로 요소들의 위치설정을 제공하도록, 필요한 요소 및 결합 요소들로 어셈블리 단위를 제작할 수 있도록 결합 요소들이 배치되고 짝지워져야 한다.
가령, 세 개의 결합쌍을 구성하는 6개의 결합 요소들을 이용하여 설계된, 두 개의 결합 요소들을 포함하는 어셈블리 단위들은 상호작용하지 않는 18쌍의 결합 요소들 중 일부를 포함할 수 있다. 결합 요소들의 쌍은 21개까지 가능하지만, 21개 중 3개의 쌍은 서로 상호작용하고(가령, A-A'), 어셈블리 단위에서의 이들의 이용은 서로 동일한 어셈블리 단위들의 자체상관을 이끈다. 아래 설명되는 예에서, 결합 요소들은 A, A', B, B', C, C'로 표시되고, 이때, A와 A', B와 B', C와 C'은 결합 요소들의 상보 쌍(결합쌍)들이다. 즉, 이들은 서로 특정하게 결합하지만, 나머지 네 결합 요소들과는 결합하지 않는다. 6개의 대표 어셈블리 단위들은 각각 두 개의 결합 요소들을 포함하며, 각각의 결합 요소는 동일하지 않으면서 보완형이 아닌 결합 요소들을 포함한다. 이들이 아래에 도시된다. 본 설명에서, 각각의 어셈블리 단위는 고유 요소를 추가로 포함하며(6개 한 세트 중 하나), F1에서 F6까지로표현된다. 6개의 어셈블리 단위들이 아래와 같이 표시될 수 있다.
A-F1-B
B'-F2-A'
B'-F3-C'
C-F4-B
B'-F5-A'
A-F6-C'
여기서 공개된 방법들에 따른 스테이지형 어셈블리는 다음의 선형 나노구조를 조합하는 데 사용될 수 있으며, 각각의 어셈블리 단위의 순서 및 상대적 벡터 방향은 요소들의 순서에 독립적이다. 기호 ●는 개시물이 부착된 고체 기질을 표시하며, 더블콜론(::)은 어셈블리 단위들의 특정 상호작용을 표시한다.
본 도해로부터 명백히 드러나는 바와 같이, 다수의 고유 어셈블리 단위들이 소수의 상보적 결합 요소들을 이용하여 만들어질 수 있다. 더욱이, 다수의 고유 복합 나노구조들의 제작에 소수의 상보 결합 요소들만이 필요하다. 왜냐하면, 각각의 단계적 어셈블리 사이클에 한 종류의 어셈블리 단위만이 추가되며, 따라서, 결합요소들이 완성 나노구조 내 한 어셈블리 단위의 위치를 모호하게 하지 않으면서 반복적으로 사용될 수 있다.
앞서 도시된 각 경우에서, 두 개나 세 개의 결합쌍들만이 사용되었다. 이 구조물의 자체-어셈블리는 7개의 비-교차반응 결합쌍들의 이용을 필요로 한다. 이 선형 구조물의 수가 N개의 단위에 해당하고 단계적 어셈블리를 이용하여 선형 구조물이 조합될 경우, 이들은 두 개나 세 개의 결합쌍들만을 필요로 할 것이다. 그러나, 자체-어셈블리의 경우엔, (N-1)개의 비-교차반응, 보완형 결합쌍들을 필요로 할 것이다.
발명의 또 다른 측면에 따르면, 상술한 한 어셈블리 단위의 두 결합 요소의 위치를 상호 교환함으로서, 부착된 요소의 공간 위치 및 방향이 나노구조의 전체 구조 내에서 변경될 것이다. 발명의 본 태양은 여기서 공개되는 바와 같이 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 제공되는 설계 유연성의 또 다른 태양을 설명한다.
각각의 어셈블리 단위를 개시물이나 나노구조 중간물질에 부착하는 것은 개시물이나 나노구조 중간물질이 지닌 한 개 이상의 비-결합 상보 결합 요소들과 어셈블리 단위의 한 개의 결합 요소들 간의 특정 결합쌍 상호작용에 의해 중재된다. 여러 구체예에서, 단 한 개의 비결합형 상보 결합 요소만이 개시물이나 나노구조 중간물에 존재할 것이다. 그러나 또 다른 구체예에서는 동일한 결합 요소들을 포함하는 어셈블리 중간물 상의 여러 부위에 여러 동일한 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 본 구체예의 경우에, 단계적 어셈블리는 어셈블리 단위들의 병렬 추가에 의해 진행되지만, 단일 단위만이 중간물의 한 부위에 부착될 것이며, 연루된 모든 부위에서의 어셈블리는 지정된 벡터 방식으로 발생할 것이다.
나노구조의 구조적 통합성은 단계적 어셈블리 과정 전반에 걸쳐 매우 중요하며, 이 어셈블리 단위들은 비-공유적 상호작용에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 예를 들자면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간에 발생하는 상호작용이다. 구체적인 상호작용은 전체 단계적 어셈블리 공정에서 상호작용을 안정되게 유지하는 데 충분하도록 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간의 복합성에 대한 안정성을 제공하기 위해 적절한 친화성을 나타내야만 한다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 적절한 세부사항을 보여야 한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 이와 상호 작용하도록 설계된 결합 요소들과만 안정된 상호작용을 형성할 수 있어야 한다. 단계적 어셈블리 과정 중 요소들 사이에서 발생하는 상호작용은 "비가역적"인 것이 바람직하다. 이 요건에 부합하는 결합 상수는 명백하게 규정할 수 없다. 왜냐하면 "비가역적"이라는 것은 "운동학적"개념이고, 결합 상수(binding constant)는 평형 성질을 기반으로 하고 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 10-7또는 그 이하의 Kd와의 상호작용(전형적인 다이아바디-에피토프(diabody-epitope)의 Kd와 유사하면서도 높은 친화성)은 원하는 시간 상에서 즉, 나노구조의 단계적 어셈블리 중, "비가역적"으로 기능할 것이다.
분자간 상호작용이 나노구조 이용의 시간스케일에서 "비가역적"으로 기능할 필요는 없다. 일부 구체예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 제작되는나노구조들은 그후, 화학적 고착(가령, 파라포름알데히드나 글루타르알데히드를 이용한 고착)에 의해 또는 교차 결합에 의해 안정화된다. 두 단백질을 교차 결합하는 가장 대중적인 기법들은 제 2 어셈블리 단위의 티올 그룹에 제 1 어셈블리 단위의 아민 그룹을 간접적으로 연결하는 과정을 포함한다(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Eighth Edition, Chapter 2, Molecular Probes,Inc. , Eugene, OR; Loster et al., 1997, Analysis of protein aggregates by combination of cross-linking reactions and chromatographic separations, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.Appl. 699 (1-2): 439-61; Phizicky et al., 1995, Protein-protein interactions: methods for detection and analysis, Microbiol. Rev. 59(1) : 94-123).
발명의 일부 구체예에서, 단계적 어셈블리 방법에 의한 나노구조 제작은 어셈블리 단위들 간의 비-공유 상호작용을 이용하여, 비교적 견고한, 그리고 안정한 어셈블리 단위들을 결합하는 과정을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 유용한 어셈블리 단위들에 통합되는 결합 요소들은, 안정하고 견고한 결합쌍들을 형성하기 위해 제 2 결합 요소와의 상호작용 이전에, 무질서할 수 있다. 즉, 안정하거나 견고하지 않을 수 있다. 따라서 발명의 일부 구체예에서는, 개별 적인 어셈블리 단위들이 조합 전에 불안정하고 유연한 도메인을 포함할 수 있으며, 조합 이후, 보다 견고해질 것이다. 선호되는 구체예에서, 본원의 조성과 방법을 이용하여 제작되는 나노구조는 견고한 구조물이다.
발명의 방법에 따르면, 나노구조의 견고성 분석과, 결함의 식별은 전자현미경같이 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 실행된다.
또 다른 구체예에서, 고체 표면에 직접 완성 나노구조의 한 단부를 부착함으로서, 즉, 유연한 고정물 없이, 구조적 견고성이 테스트될 수 있다. 그후 나노구조의 다른 한 단부는 핵력 현미경(AFM) 팁에 부착된다. 이는 이동가능하다. 움직이려 시도할 때 팁에 힘이 가해진다. 나노구조가 유연할 경우, 나노구조의 편향에 의해 허용되는 팁 움직임과 공급된 힘간의 비례에 가까운 관계가 나타날 것이다. 이와는 대조적으로, 나노구조가 견고할 경우, 견고한 나노구조가 파괴되는 지점까지, 공급힘의 레벨이 증가함에 따라 나노구조의 편향이나 팁 움직임이 거의 없을 것이다. 이 지점에서, 어떤 추가적인 힘이 공급되지 않더라도 핵력 팁의 큰 움직임이 존재할 것이다. 두 단부의 부착 포인트들이 나노구조보다 강하다면, 이 방법은 유용한 견고성 측정을 제공할 것이다.
본 발명에 따르면, 나노구조의 각각의 위치는 모든 다른 위치로부터 구분할 수 있다. 왜냐하면, 각각의 어셈블리 단위가 그 이웃과 밀접하게, 구체적으로, 그리고 독자적으로 상호 작용하도록 설계될 수 있기 때문이다. 각각의 어셈블리 단위는 나노구조 내에 그 위치로 구분되는 특성이나 활성을 가질 수 있다. 나노구조 내 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해, 그리고, 요망 위치에 추가되는 요소나 각각의 어셈블리 단위의 성질을 통해 독자적으로 규정된다. 추가적으로, 본원에서 소개되는 단계적 어셈블리 방법 및 어셈블리 단위들은 제대로 형성된 크기, 형태, 기능의 복합 나노구조의 구성을 위해 대형으로, 대량 병렬 행태로, 그리고 자동화전 제작 공정으로 수정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성들은 본원에서 이용되는 어셈블리 단위들의 구성에 사용되는 단백질들이 가질 수 있는 정확한 치수, 균일성, 그리고 공간적 형태의 다양성을 특징으로 한다. 더욱이, 아래 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 유전적 공정 기술이 여기서 소개된 발명의 방법에 사용되는 생물학적 물질의 성질을 수정하고 맞추는데 사용될 수 있기 때문에, 그리고 다량의 이러한 물질을 미세 유기구조 형태로 합성하는 데 사용될 수 있기 때문에, 장점을 가진다.
개시물질 어셈블리 단위
발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 형성되는 나노구조에 통합된 제 1 어셈블리 단위가 개시물질 어셈블리 단위이다. 개시물질 어셈블리 단위는 일부 구체예에서, 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 고체 기질이나 그 외 다른 매트릭스에 부착될 수 있다. 개시물질 어셈블리 단위는 "개시 단위"이라고도 알려져 있다.
나노구조의 단계적 어셈블리는 선택된 어셈블리 단위를 개시 단위에 비-공유의 벡터 방식으로 추가함으로서 시작된다. 발명의 방법에 따르면, 어셈블리 단위이, 1) 개시 단위의 배양에 의해, 개시 단위에 추가된다. 일부 구체예에서, 개시 단위는 추가될 다음 어셈블리 단위를 포함하는 솔루션에서, 매트릭스나 기질에 고착된다. 배양 단계에 이어 2) 제거 단계, 가령 세정 단계가 이어진다. 이 단계에서는 과량의 어셈블리 단위들이 개시 단위로부터 제거된다.
어셈블리 단위들은 특정한, 비-공유 결합 형성을 통해 개시 단위에 결합된다. 다음 어셈블리 단위의 결합 요소들이 선택되어, 개시 단위의 지정 부위에만 부착되게 된다. 한 개의 어셈블리 단위만이 제 1 단계 어셈블리 사이클 동안 개시 단위의 표적 결합 요소에 추가될 수 있고, 표적 개시 단위에 대한 어셈블리 단위의 결합은 벡터 방식이다. 단계적 어셈블리는 나노구조의 요망 설계에 따라 모든 요망 어셈블리 단위들이 나노구조에 통합될 때까지 단계 1, 2를 반복한다.
발명의 단계적 어셈블리 방법의 선호되는 구체예에서, 개시 단위는 기판에 고착되고, 추가적인 단위들은 고체 상태 폴리머 합성과 유사한 과정으로 순차적으로 추가된다.
개시 단위는 어셈블리 단위의 기준이고, 발명의 어셈블리 단위에 포함되는 것으로 앞서 설명한 여러 구조적, 결합형, 기능적 요소들을 포함할 수 있다. 따라서 개시 단위는 다음의 분자, 또는 결합 파생물, 또는 그 결합 단편들 중 어느 것도 포함할 수 있다. 그 예로는, 모노클로널 항체, 다중 특이적 항체, Fab나 F(ab')2, 단편, 단일-체인 항체 단편(scFv), 이중특이적, 키메라/이중특이적 이형이량체 F(ab')2, 다이아바디 또는 다량체 scFv 단편, 세균성 필린 단백질, 루이신 지퍼-형 코일, 4-나선 번들, 펩티드 에피토프, PNA, 또는 다른 종류의 어셈블리 단위가 있다.
일부 구체예에서, 발명은 한 개 이상의 결합 요소를 포함하는 개시물질 어셈블리 단위를 제공한다. 다른 구체예에서, 발명은 두 개 이상의 결합 요소를 가진 개시물질 어셈블리 단위를 제공한다.
개시 단위는 여러 방식으로 매트릭스에 고착될 수 있다. 고착 방법의 선택은 개시 단위 종류, 최종 나노구조가 매트릭스로부터 제거되어야 하는 지 여부, 최종나노구조의 화학 구조 등을 포함한 여러 설계 인자들에 의해 결정될 것이다. 잠재적 고착 방법은, 개시물질 에피토프에 대한 항체 결합, His 태그 개시물질, 매트릭스 결합 도메인을 지닌 개시 단위, 항체나 항체-파생 개시 단위용 항체 결합 단백질(가령, 단백질 A나 단백질 G), 바이오티닐레이티드 개시물질의 스트렙타비딘 결합, PNA 고착, 개시물의 매트릭스에 대한 특이적 공유 결합에 의한 부착 등을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 개시 단위는 고체 기질에 고착된다. 개시 단위는 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 통상적으로 사용되는 방법들을 이용하여 고체 기질에 고착될 수 있다. 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 알려진 기술은 수없이 많다. 이 방법들로는, 플라스틱 ELISA 플레이트에 대한 비-특정 흡착, 단백질의 바이오티닐레이션, 후속으로 플라스틱 기질에 앞서 흡착된 스트렙타비딘이나 아비딘에 결합함으로서 고착하는 방법이 있다(Sparkset al., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory manual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53). ELISA 미량적정 플레이트에 추가하여, 단백질은 Sepharose(Dedman et al., 1993, Selection of target biological modifiers from a bacteriophage library of random peptides: the identification of novel calmodulin regulatory peptides, J. Biol. Chem. 268; 23025-30)나 상자성 비드(Sparks et al., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratorymanual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53)같은 다른 고체 지지물에 고착될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 방법은 알데히드를 함유한 고체 지지물에 아민-함유 생물학적 분자를 환원식 아미노화함으로서 고착을 시킬 수 있다(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, p. 186). 또한, 어느 단부에 이미도에스테트 그룹을 가진 동종 이가기능성 교차 결합 물질, 디메틸 피멜리미데이트(DMP)(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, pp. 205-06)를 이용함으로서 고착을 행할 수 있다. 결합 단백질 A를 함유한 불용성 지지물에 항체 분자를 고착화시키는데 이 시약을 사용되고 있다(Schneider et al., 1982, A one-step purification of membrane proteins using a high efficiency immunomatrix, J. Biol. Chem. 257, 10766-69).
특정 구체예에서, 고착된 항원/합텐(hapten)을 인지하고 결합하는 고착 도메인(T)과, 추가적인 어셈블리 단위가 단계적 어셈블리에 순차적으로 추가되는 대응 도메인(A)을 포함하는 다이아바디가 개시 단위이다. 항체 8F5는 사람의 리노바이러스(rhinovirus)(Serotype 2) 바이러스성 캡시드 단백질 Vp2로부터 도출된 항원 펩티드 VKAETRLNPDLQPTE(SEQ ID NO: 159)에 대한 매개물로서, T 도메인으로 사용된다(Tormo et al., 1994, Crystal structure of a human rhinovirus neutralizing antibody complexed with a peptide derived from viral capsid protein VP2, EMBO J. 13 (10): 2247-56). 도메인은 Diabody Unit 1에 대하여 앞서 설명한 동일한 리소자임 항-이디오타입 항체(E5.2)이다. 완성된 개시물질 어셈블리 단위는 따라서대응 CDR로 8F5x730.1.4(T x A)를 지닌다. 개시 단위는 다이아바디를 포함하는 구조적 요소들과 결합 요소들을 특성으로 하기 위해 앞서 설명한 방법을 이용하여 기능적으로 구축된다.
개시 단위를 고체 지지물 매트릭스에 고착시키기 위해 Factor Xa 시퀀스, IEGR의 N-말단에서, 그리고 Factor Xa 시퀀스와 항원 펩티드 시퀀스 사이에서 절단접합된 짧고 유연한 링커를 통해 리노바이러스 항원 펩티드가 프로테아제 인지 펩티드에 융합될 수 있다(Nagai and Thogersen, 1984, Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli, Nature309 (5971): 810-12). 이런 융합 펩티드는 CH-Sepharose 4B(Pharmacia)에 공유 방식으로 링크될 수 있다. 이는 6-탄소 길이 스페이서 아암을 가지면서 주요 아민을 통한 결합을 가능하게 하는 세파로제 파생물이다. 대안으로, 카르복실 그룹을 통한 공유 부착을 위해 사파로제 파생물이 사용될 수 있다. 공유 방식으로 부착된 융합 단백질은 개시 단위(TxA)의 고착 도메인 "8F5"에 대한 인식 에피토프로 기능할 것이다.
개시물질이 고착되면, 추가적인 다이아바디 단위들이 결합 도메인 A'로붙 한 방향으로 스테이지 어셈블리에서 추가적으로 추가될 수 있다. 단계적 어셈블리가 완료되면, 나노구조는 지지체 매트릭스에 가교-결합될 수 있고, 또는, 프로테아제 Factor Xa의 추가에 따라 매트릭스로부터 분리된다. 프로테아제는 공유 부착된 항원/Factor Xa 융합 펩티드를 절단하여, 지지 매트릭스로부터 나노구조를 분리할 것이다. 왜냐하면, 설계에 의해, 설계된 단백질 어셈블리 단위 내에 어떤 Factor Xa인식 부위도 존재하지 않기 때문이다.
Factor Xa의 추가를 필요로 하지 않는 고체 지지 매트릭스로부터 펩티드 융합을 갈라내는 대안의 전략이 또한 구현될 수 있다. 이 방법은 세파로제 매트릭스에 부착되는 갈라지는 스페이서 아암을 이용한다. 이 항원 펩티드는 페닐-에스테르 연결을 통해 매트릭스에 공유 방식으로 부착된다. 고착된 항체가 개시물질 어셈블리 단위를 결합시키면, 개시물질 어셈블리 단위는 지지 매트릭스에 고착된 상태를 유지한다. 이후, 개시 단위/항원 복합체(및 관련 나노구조)가 지지 매트릭스로부터 분리되는 지점인 pH 7.4에서 이미다졸레글리신(imidazoleglycine) 완충액으로 스페이서 아암이 화학적으로 절단된다.
결합 요소들의 특성화 방법
항체-페이지-디스플레이 기술에 의한 결합 요소 상호작용 식별 방법
발명의 일부 구체예에서, 발명의 방법에 사용하기 적합한 결합 요소들이 가려지고, 이들간 상호작용은 항체-파아지-디스플레이(anitbody-phage-display) 기술을 이용하여 식별된다. 재조합형 항체, 결합 유도체, 또는 그 결합 단편들의 생성을 위한 파아지 디스플레이 기술은 유기질 및 무기질의 다양한 항원의 폭넓은 범위(가령, 단백질, 펩티드, 핵산, 설탕, 반도체 표면 등등)에 대해 결합할 수 있는 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다. 파아지 디스플레이 기술 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(Marks et al., 1991, By-passing immunization: human antibodies from V-gene libraries displayed on phage, J. Mol. Biol. 222: 581-97; Nissimet al., 1994, Antibody fragments from a"single pot"phage display library asimmunochemical reagents, EMBO J. 13: 692-98; De Wildt et al., 1996, Characterization of human variable domain antibody fragments against the Ul RNA-associated A protein, selected from a synthetic and patient derived combinatorial V gene library, Eur. J. Immunol. 26: 629-39; De Wildt et al., 1997, A new method for analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B-cells, J. Immunol. Methods. 207: 61-67; Willems et al., 1998, Specific detection of myeloma plasma cells using anti-idiotypic single chain antibody fragments selected from a phage display library, Leukemia 12: 1295-1302; van Kuppevelt et al., 1998, Generation and application of type-specific anti-heparin sulfate antibodies using phage display technology, further evidence for heparin sulfate heterogeneity in the kidney, J. Biol. Chem. 273: 12960-66; Hoet et al., 1998, Human monoclonal autoantibody fragments from combinatorial antibody libraries directed to theUlsnRNP associatedU1C protein, epitope mapping, immunolocalization and V-gene usage, Mol. Immunol. 35: 1045-55).
재조합 항체 기술이 하이브리도마 세포로부터 공지된 특수성으로 항체를 분리할 수 있지만, 이것이 특정 mAb들의 신속하게 만들어지지는 않는다. 개별적인 면역화에 이어, 세포 융합에 의해 하이브리도마를 발생시키는 것이 각각의 mAb를 발생시키는 데 필요하다. 이는 시간 소모가 크고 노동집약적인 일이다.
적절한 구체예에서, 항체-파아지-디스플레이 기술은 이와 같은 한계상항을극복하는 데 사용되어, 관심대상인 특정 항원들을 인지하는 mAb들이 보다 효과적으로 발생될 수 있다(참조: Winter et al., 1994, Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55 ; Hayashi et al., 1995, A single expression system for the display, purification and conjugation of single-chain antibodies, Gene 160(1) : 129-30; McGuinness et al., 1996, Phage diabody repertoires for selection of large numbers of bispecific antibody fragments, Nat. Biotechnol. 14 (9): 1149-54; Jung et al., 1999, Selection for improved protein stability by phage display, J. Mol. Biol. 294(1) : 163-80; Viti et al., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480-505). 일반적으로, 항체-파아지-디스플레이 기술에서, VL과 VH유전자의 Fv나 Fab 항체-결합 부분은 사람의 비장이나 사람의 주변 혈액 림프구 세포로부터 도출한 cDNA로부터 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭에 의해 "작제"된다. 이 구조된 VL과 VH유전자 레퍼토리(DNA 서열)는 함께 절단접합되어 박테리오파아지의 소량의 피복 단백질(minor coat protein)(가령, M13이나 fd, 또는 그 결합 파생물)에 삽입된다. 따라서, 융합 박테리오파아지 피복 단백질을 생성할 수 있다(Chang et al.,1991, Expression of antibody Fab domains on bacteriophage surfaces. Potential use for antibody selection, J. Immunol. 147 (10): 3610-14; Kipriyanov and Little, 1999, Generation of recombinant antibodies, Mol. Biotechnol. 12 (2): 173-201). 생성된 박테리오파아지는 파아지 게놈에 통합된 항체 VL과 VH를 인코딩하는 유전체 단편의 사본과 파아지 단백질 피복의 외부 표면에 융합되는 기능적 항체를 지닌다.
이 방법들을 이용하여, 관심대상인 특정 항원을 향해 친화성을 가진 박테리오 파아지 디스플레이 항체는, 표적 에피토프나 항원에 디스플레이되는 항체를 지닌 다량의 재조합 박테리오파아지가 결합함으로서 친화력 크로마토그래피에 의해 분리 수 있다. 이는 고체 표면이나 매트릭스에 고착된다. 결합, 결합안된 또는 약하게 결합된 파아지 입자 제거, 그리고 파아지 복제 도출의 반복되는 주기들은 요망하는 VL및 VH유전자 단편을 지닌 박테리오파아지를 상당량 증가시켜 생산한다.
관심대상인 항원들로는 펩티드, 단백질, 면역글로불린 일정 영역, CDR, 그 외 다른 분자, 합텐, 소분자, 무기질 입자 및 표면 등이 있다.
정제되면, 링크된 VL과 VH유전자 단편이 당 분야에 잘 알려진 표준 DNA 분자 기술에 의해 박테리오파아지 게놈으로부터 구조될 수 있고, 클로닝되어 표현될 수 있다. 이 방법에 의해 생성되는 항체들의 수는 어떤 표적 분자를 향해서도 항원성을 위해 스크린될 수 있는 다양한 항체 라이브러리를 생성하도록 최적의 방법을 제공하며, 유전자 레퍼토리의 크기 및 다양성에 직접 상관된다. 항체-파아지-디스플레이 기술에 의해 생성된 mAb는 피코몰 범위에서 나노몰 범위로 항원을 향한 특정 결합을 보여준다(Sheets et al., 1998, Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity humansingle-chain antibodies to protein antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-62).
발명의 방법에 유용한 항체, 결합 파생물, 또는 그 결합 단편은 상술한 구성의 항체나 단편 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 선택될 수 있다. 이러한 접근법은, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 항체나 단편들의 식별을 크게 증가시킬 수 있도록, 고도의 복잡도(가령, 109)를 가지는 라이브러리를 효율적으로 스크리닝하는 방법을 제공하는 장점을 가진다.
일부 구체예에서, 발명의 단계적 어셈블리 방법에 사용하기 위한 항체를 생성하기 위해, 면역글로불린 레퍼토리를 클로닝하는 방법("레퍼토리 클로닝")이 사용된다. 레퍼토리 클로닝은 항체생성 동물을 필요로 하지 않으면서 어떤 종류의 항체에도 사용될 수 있다. 면역글로불린 레퍼토리를 클로닝하는 방법은 당 분야에 레퍼토리 클로닝으로 잘 알려져 있고, 시험관 내에서 전체적으로 실행된다. 일반적으로, 레퍼토리 클로닝을 실행하기 위해, 메신저 RNA(mRNA)가 주변 혈액으로부터 얻은 B 림프구로부터 추출된다. mRNA는 역전사효소 및 표준 프로토콜을 이용하여 cDNA 합성을 위한 템플릿으로 작용한다(see, e. g. , Clinical Gene Analysis and Manipulation, Tools, Techniques and Troubleshooting, Sections IA, IC, IIA, IIB,IIC and IXIA, Editors Janusz A. Z. Jankowski, Julia M. Polak, Cambridge University Press 2001; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Chapters 7,11, 14 and 18, Cold Spring HarborLaboratory Press, N. Y.; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Chapters 3,4, 11,15 and 24, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). 면역글로불린 cDNA는 dDNA의 이러한 복합 혼합물로부터, 적절한 프라이머를 이용하여, PCR에 의해 특이적으로 증폭된다. 바람직한 결합 성질을 가진 면역글로불린 단편을 만들기 위해, 유전자 인코딩 항체 라이트(L) 및 헤비(H) 체인으로부터 PCR 프로덕트를 얻는다. 이 프로덕트는 파아지미드 벡터(phagemid vector)로 삽입된다. 파아지 피복 단백질과의 융합으로 박테리오파아지 게놈에 통합된 클로닝된 유전자나 유전자 단편은 박테리오파아지의 표면에 실리는 하이브리드 scFv 면역글로불린 분자의 합성을 이끄는 적절한 박테리아 호스트로 표현된다. 따라서, 박테리오파아지 수치는 레퍼토리에 포함된 모든 세부사항과 면역글로불린의 혼합물을 나타낸다.
이러한 개체군으로부터 반복적인 항원 면역흡수 과정과 파아지 증폭에 의해 항원 특이성 면역글로불린을 선택한다. 여러 차례 선별과정을 통하여 관심 대상이 되는 항원에만 남을 것이고, 남은 파아지를 새로운 벡터 및/또는 호스트로 도입하여, 추가 조작을 하거나 용해가능한 형태의 다량으로 파아지-인코드된 단백질로 발현시키는데 이용한다.
항체 파아지 디스플레이 라이브러리는 상기 설명된 바와 같이 단계적으로 어셈블리되는 나노구조에 이용하기 위해 어셈블리 단위 구성시에 결합 요소로 이용할 수 있는 항체의 에피토프-결합 부분의 분리, 정제, 및 개량에 이용될 수 있다.
X-RAY 결정학을 이용하여 결합 요소를 특성화하는 방법
많은 경우에, 단백질사이의 분자 인식 혹은 단백질과 펩티드 사이의 분자 인식은 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 일면에서, 결합 요소들의 상호 작용을 한정하고 결합쌍을 형성하는데 중요한 상기 단백질-단백질 작용은 당 분야에 흔히 알려진 X-레이 결정학적 방법을 이용하여 확인한다. 이러한 특징은 당 분야의 기술자들이 본 발명의 구성 및 방법에 유용한 결합쌍 상호작용을 인식할 수 있게 한다.
결합 요소의 특이성 및 친화성을 특성화하는 방법
두 개의 상보적 결합 성분들이 특이성으로 상호작용한다는 것을 입증하는 방법은 예를 들어, ELISA 분석, 분석적 한외원심분리(ultracentrifugation), 또는 BIAcore 방법론(1996, Abraham et al, "Determination of binding constants of diabodies directed against prostate-specific antigen using electrochemiluminescence-based immunoassays", J. Mol. Recognit.9(5-6):456-61; Atwell et al, 1996, Design and expression of a stable bispecific scFv dimer with affinity for both glycophorin and N9 neuraminidase, Mol.Immunal.33(17-18):1301-12; Muller외.1998); A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett.432(1-2):45-49), 또는 다른 공지된 유사한 방법 등을 사용하여 이루어질 수 있고, 이들은 분자간 결합 작용의 강도를 입증하고 측정하는데 적합하다.
구조 요소, 결합 요소 및 기능 요소의 고안 및 제작
매우 균질한 재질의 공지 결정 구조에 근거하여 상동성 모델링을 통하여 확인된 결정 구조에서 나타난 것과 같이, 본 발명의 구조 요소, 결합 요소 및 기능요소들의 고안 및 그 성분들을 포함하는 어셈블리 단위의 디자인은 원하는 결합 작용에서 이들 구조를 분석 및 결정하여 실행할 수 있다. 한 가지 이상의 기능 요소를 포함하는 유용한 어셈블리 단위 고안은 다음의 단계 전부 또는 일부를 포함하나 이에 국한되지 않은 일련의 결정 및 분석이 관련된다.
(ⅰ) 나노구조의 원하는 전체 기능에 근거하여 결합될 기능 성분들을 선택하고;
(ⅱ) 표적 기능, 특히 기능 요소들의 상대적 위치 결정에 근거하여 원하는 구조를 선택하며;
(ⅲ) 원하는 나노구조 속으로 결합되는 기능적 나노 입자들에 대하여 특이성을 갖는 펩티드 또는 단백질을 가령, 조합 라이브러리로부터 선택, 식별, 또는 결정을 통해 결합 성분들을 선택하고,
(ⅳ) 양자 도트(quantum dots)와 같은 나노 입자들을 포함하는 기능 요소들 사이의 필수적 분리에 근거하여, 정확한 구조 및 화학량론을 갖는 결합 요소들을 통합하기 위한 위치 및 정확한 치수를 갖는 적절한 단단한 구조를 제공하도록 구조요소들을 선택하며,
(ⅴ) 상기 어셈블리 단위의 구조적 성분 및 결합 성분들의 폴딩(folding)이 붕괴(가령, β-회전에서의 통합으로 인해)되지 않도록 상기 단계(ⅲ)로부터 및 상기 단계(ⅳ)에서 선택된 구소 요소와 펩티드나 단백질 결합 요소를 결합시키는 융합 단백질을 디자인하고,
(ⅵ) 상기 나노구조의 전체 디자인에서 상기 생성된 융합 단백질을 컴퓨터모델링하고, 기능적 규격에서 필요로 하는 구조적 치수들을 최적화하도록 디자인을 정제하며, 또는
(ⅶ) 단계적으로 어셈블리되는 어셈블리 순서를 정한다.
구조적 성분 단백질의 변경에는 단백질의 아미노산 서열의 삽입, 결손, 또는 변형이 있다. 많은 경우, 본래의 단백질에 존재하지 않던 결합 요소들을 추가하기 위하여 삽입 또는 대체 등의 변경이 이루어진다. 삽입 돌연변이가 성공적인가를 결정하는 통상적 시험으로는 원이색성(CD, circular dichroism) 스펙트럼을 사용한다. 생성된 융합 돌연변이 단백질의 CD 스펙트럼은 고유 단백질의 CD와 비교될 수 있다.
만일 상기 삽입된 것이 작으면(가령, 짧은 펩티드), 적절히 폴딩된 삽입 돌연변이체의 스펙트럼은 고유 단백질의 스펙트럼과 매우 유사하게 될 것이다. 만일 상기 삽입이 전체적 단백질 영역(가령, 단일 사슬 변수 영역)에서 일어났다면, 상기 융합 단백질의 CD 스펙트럼은 각 소자의 CD 스펙트럼의 합계와 같게 될 것이다(예를 들면, 고유 단백질과 기능 요소를 포함하는 고유 단백질 및 융합 단백질의 것). 융합 단백질의 두 가지 성분이 정확하게 폴딩되었는 지를 검사에 이와 같은 합치 결과를 이용할 수 있다.
적절하게는, 융합 단백질이 성공적으로 만들어졌는지를 테스트한다. 예를 들어, 표적의 모든 부분에 융합 단백질이 결합되는 지를 분석하고, 모든 결합쌍과 성공적으로 상호작용하는지를 분석한다. 적절한 ELISA 분석; 적어도 한가지 ELISA를 실행하여 나노구조를 만드는데 요구되는 결합쌍 각각에 대해 변형 단백질의 친화성및 특이성을 테스트한다.
단계적으로 어셈블리하는 방법과 이로부터 구성된 나노구조의 용도.
본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법 및 어셈블리 단위는 수많은 나노구조를 만드는데 이용할 수 있다. 이와 같은 나노구조의 용도는 명백한데, 예를 들면, 잘 배열된 1차, 2차, 3차원적 섬유, 우리 및 고형물 특히 다른 물질과 연합을 허용하는 특수 부착 부위와 같은 고도의 규칙성을 요하는 부분에 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법에 의해 구성되는 나노구조는 1차원 구조이다. 예를 들면, 단계적으로 어셈블리된 나노구조를 에어로겔, 종이, 플라스틱, 시멘트 등의 다른 물질을 보강하는데 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되어 구성된 나노구조는 긴 1차원적인 섬유 형태로 종이, 시멘트, 플라스틱에 결합되어 제조과정 동안 추가 습식 및 건식 인장 강도를 제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 확인 및 인지 목적에 이용할 수 있는 패턴을 가진 또는 표식이 된 섬유가 될 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조에는 형광 염료, 퀀텀 도트, 또는 효소와 같은 기능 요소를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 특정 나노구조를 위조 방지 표식으로 종이 및 섬유에 심을 수도 있다. 이와 같은 경우에, 간단한 색을 연결한 항체 반응(시판되는 키트이용)을 이용하여 물질의 원료를 증명할 수 있다. 또는 이와 같은 나노구조를 종이 또는 섬유에 결합전 또는 결합 후에 염료, 잉크 또는 다른 물질에 결합시켜 다른 방식으로 이들의 외양 또는 성질을 변형시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 제조하는 동안에 잉크 또는 염료에 결합시켜 용해도 또는 혼화성을 증가시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조에는 원하는 위치에 한 개 이상의 효소 또는 촉매 요소를 보유한다. 나노구조는 효소적 또는 촉매 반응에 지지구조 또는 골격으로 작용하여 효과를 증가시킨다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조는 반응 "어셈블리 라인"을 제공하기 위해 원하는 반응 순서에 효소 또는 다른 촉매를 "얹거나" 위치시키는데 이용된다.
또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조를 어셈블리 지그(jig)로 이용한다. 두 개 또는 그 이상 성분 예를 들면 기능 단위가 나노구조에 결합되어, 공간적인 방향을 제공한다. 성분들이 결합하거나 융합되고, 나노구조로부터 생성된 융합 산물이 방출된다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 정의된 공간을 가지는 나노입자(예를 들면, 열적, 전자 또는 자성을 가지는 금속 또는 다른 입자)를 적하시키는 서포트 또는 프레임으로 이용할 수 있는 1차원, 2차원 또는 3차원 구조가 되고, 이를 나노와이어 또는 나노회로를 만드는데 이용할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되는 본 발명의 방법을 이용하여 정의된 크기 및 모양을 가지는 나노와이어를 작제하기 위해 1차원 나노구조(섬유)의 전극을 적게 플레이팅할 수 있다. 예를 들면 기능 요소로써 금속 입자를 포함하도록 작제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 기능 요소로 자성 입자를 포함하는 1차원 나노구조(섬유)를 외부 자장에 배열하여 나노구조안으로 이용되는 유속을 제어한다. 또 다른 구체예에서, 외부 자장을 이용하여 LCD-형 디스플레이에 이용할 수 있는 기능 요소로 광학 부분을 포함하는 나노구조(가령 섬유)를 배열 또는 해체할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 전자 현미경의 정확한 크기를 위한 크기 표준 또는 표식으로 이용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리하는 방법에 의해 직조되는 나노구조는 2차원 또는 3차원 구조이다. 예를 들면, 한 구체예에서, 나노구조는 일정한 구멍 크기를 가지는 그물로써 2차원 체 또는 필터로 사용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 분자 체 또는 필터로 이용할 수 있는 3차원 6각형 배열로 크기에 의해 입자를 선별적으로 분리하는 정확한 직경의 규칙적인 수직 포어를 제공한다. 이와 같은 필터는 용액의 멸균(예를 들면 미생물 또는 바이러스 제거) 또는 일련의 분자량을 걸러내는 필터로 사용할 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 구조 요소 또는 기능 요소와 같은 구멍의 성분을 변형시켜, 특이적인 표면 성질(가령, 친수성 또는 소수성, 특정 리간드에 결합하는 능력)을 제공할 수 있다. 이와 같은 여과 장치의 장점 중에는 균질하고 선형인 구멍과 매트릭스에 대한 구멍의 비율이 높다는 것이다.
당업자는 여기에서 설명하는 방법 및 어셈블리 단위를 이용하여 다양한 2차원 및 3차원 구조 예를 들면 다각 구조(8각형) 및 삼각형에서 만든 테트라헤드론, 이코사헤드론과 같은 개방 구조, 사각 및 직각에서 만든 상자 또는 큐브(예를 들면 11, 구체예 6에서 설명하는 큐브)를 만들 수 있다. 구조 요소들의 상이한 축상에서 조작할 수 있는 결합 및 기능 요소 형태에 의해서만 구조 범위가 제한된다.
한 구체예에서, 2차원 또는 3차원 나노구조를 이용하여 기능 단위로 광학, 전자, 자장, 촉매 또는 효소 부분을 포함하는 표면 코팅을 작제할 수 있다. 이와 같은 코팅을 광학 코팅에 이용할 수 있다. 이와 같은 광학 코팅을 이용하여 피복된 물질의 흡수성 또는 반사성을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 나노구조를 이용하여 작제된 표면 코팅을 전자 코팅으로 이용할 수 있는데, 예를 들면, 정전기 차단 또는 렌즈의 자체-먼지털이 표면(코팅이 광학적으로 깨끗한 경우)으로 이용할 수 있다. 컴퓨터 하드 드라이버의 표면상에 코팅과 같은 자성 코딩으로 이용할 수도 있다.
이와 같은 표면 코팅을 촉매 또는 효소 코팅에 이용할 수 있는데 예를 들면 표면 보호와 같은 것으로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 코팅은 항-산화제 코팅이다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여, 기능 요소로써 광학, 전자, 자성, 촉매 부분을 가지는 오픈 프레임워크 또는 골격을 작제할 수 있다. 이와 같은 골격을 이용하여 상기에서 설명한 것과 같은 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 부분에 서포트로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 이와 같은 골격은 분자의 두꺼운 또는 조밀한 코팅을 만들기 위해 배열된 기능 요소들을 포함하거나 원하는 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 성질을 가지는 가용성 미크론-크기 입자를 서포트하기 위해 배열된 기능 요소들을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 프레임워크 또는 골격으로 작용하여 그 위에 효소 또는 항체 결합 도메인이 연결되어 고밀도 다가 처리 부위를 제공하여 불용성 효소에 연결되어 용해시키고, 다양한 분자 종을 포집, 보호 또는 운반한다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 어드레스로 불러낼 수 있는 위치를 가지는 고밀도 컴퓨터 메모리를 작제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 인위적인 지오라이트(물에서 이온을 흡수할 수 있는 능력을 가진 천연 미네랄(수화 실리케이트)을 만들 수 있는데 이때 나노구조 고안으로 오픈 프레임워크를 통하여 반응물질의 이동을 매우 효율적으로 촉진시킨다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 신물질의 기초로 작용할 수 있는 오픈 프레임워크 또는 골격을 만들 수 있는데, 예를 들면, 프레임워크에는 강도, 밀도와 같은 독특한 성질을 보유하고, 다양한 환경에서 안정성 및 입자 포장성을 결정한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리 단위 되는 방법을 이용하여 계산적인 구조 예를 들면, 공간적으로 조직적인 배열을 이루는 퀀텀으로 구성된 컨텀 셀룰라 오토메타(QCA)를 작제할 수 있다. QCA 기술에서, 개별 전자의 위치에 의해 로직 상태가 인코드되고, 전압 수준에 의해서라기보다는 공간적으로 위치한 퀀텀 도트로 구성된 QCA 셀에 포함된다. 2진 정보 저장에 필수적인 모양에 따라 공간적으로 퀀텀 도트 입자를 배열하는 순서에 단계적인 어셈블리를 실행할 수 있다. 퀀텀 도트 셀룰라 오토메타를 위한 QCA 셀의 공간적 배치 및 구성을 위한 단계적인 어셈블리 단위를 이용하여 만들 수 있는 로직 장치의 예를 들면, QCA 와이어, QCA 언버터, 머조리티 게이트(majority gates), 풀 애더(full adders) (Amlani et al., 1999, Digital logic gate using quantum-dot cellular automata, Science 284 (5412): 289-91;Cowburn and Welland, 2000), Room temperature magnetic quantum cellular automata, Science 287 (5457): 1466-68; Orlov et al., 1997, Realization of a Functional Cell for Quantum-Dot Automata, Science 277: 928-32)등이 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 국한시키지는 않는다.
실시예 1: 펩티드 에피토프로 구성되는 결합 요소를 보유하는 나노구조의 단계적 어셈블리
본 실시예에서는 C-말단에 서로 다른 펩티드 에피토프가 융합된 1가 Fab 단편("Fab1"과 "Fab2")을 이용한 단계적 어셈블리를 개시한다(도 4).
Fab1의 CDR은 Fab2의 C-말단에 융합된 펩티드에 특이성을 갖는다. 유사하게, Fab2의 CDR은 Fab1의 C-말단에 융합된 펩티드에 특이성을 갖는다.
이들 두 결합쌍은 2개의 어셈블리 단위간 특이적 상호작용을 제공한다. 첫 번째 Fab는 표준 방법을 이용하여 고체 기질에 고정시킬 수 있다. 이후, 상기 표면은 Fab1에 대하여 특이성을 보이는 펩티드를 융합한 Fab2를 함유하는 용액과 함께 배양할 수 있다. 이런 배양은 Fab1의 사본 1개(고정됨)와 Fab2의 사본 1개로 구성되는 나노구조 중간물질의 형성을 결과한다. 이후, 상기 중간물질은 Fab1를 함유하는 용액에서 배양하여, Fab1의 사본 1개, 여기에 부착된 Fab2의 사본 1개, 순차적으로 여기에 부착된 Fab1의 사본 1개로 구성되는 중간물질을 형성한다. 그 다음, 이런 어셈블리 과정을 필요한 만큼 반복하여 원하는 크기의 선형 구조를 달성한다.
어셈블리 단위-1은 연결된 C-말단 펩티드 에피토프(펩티드 1)로 펩티드 2와 특이적으로 결합하는 CDR(CDR1)을 보유하는 항체 Fab 단편을 포함하는 1가 어셈블리 단위이다.
어셈블리 단위-2는 연결된 C-말단 펩티드 에피토프(펩티드 2)로 펩티드 1과 특이적으로 결합하는 CDR(CDR2)을 보유하는 항체 Fab 단편을 포함하는 1가 어셈블리 단위이다.
결합쌍:
결합쌍 1: 결합 요소 펩티드 1은 결합 요소 CDR2와 상호작용한다.
결합쌍 2: 결합 요소 펩티드 2는 결합 요소 CDR1과 상호작용한다.
단계적 어셈블리 단계 과정
단계 1 a) 어셈블리 단위-1 첨가
b) 세척
단계 2 a) 어셈블리 단위-2 첨가
b) 세척
단계 3 a) 단계 1 반복
단계 4 a) 단계 2 반복
실시예 2: 다중특이적 단백질 어셈블리를 이용한 단계적 어셈블리
본 실시예에서는 다중특이적 단백질 어셈블리 단위를 이용하는 본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 구체예를 개시한다. 다중특이적 단백질 어셈블리 단위의 순열과 조합은 예로써 2가와 4가 어셈블리 단위를 이용하는 도 14에 도시된 단계적 어셈블리를 비롯한 복잡한 1차원, 2차원, 3차원 거대분자 나노구조의 구축에 이용될 수 있다.
4개의 접점을 포함하는 나노구조의 단계적 어셈블리는 최소한 5개의 어셈블리 단위와 4개의 결합쌍을 요구한다. 필요한 5개의 어셈블리 단위는 4개의 이중특이적 어셈블리 단위와 1개의 사중특이적 어셈블리 단위이다. 본 실시예에서, 인접한 어셈블리 단위를 결합시키는데 이용되는 결합쌍은 이디오토프/항-이디오토프이다. 최소한 4개의 이런 이디오토프/항-이디오토프 결합쌍이 본 실시예에서 단계적 어셈블리에 요구된다.
(1) 어셈블리 단위
도 14에서:
어셈블리 단위-1은 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 A와 B를 포함하는 2가 단백질 어셈블리 단위이다.
어셈블리 단위-2는 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 B'와 A'를 포함하는 2가 단백질 단위이다.
어셈블리 단위-3은 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 B'와 A' 및 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 C와 D를 포함하는 4가 단백질 단위이다.
어셈블리 단위-4는 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 C'와 A를 포함하는 2가 어셈블리 단위이다.
어셈블리 단위-5는 상호작용하지 않는(이디오토프/항-이디오토프) 결합쌍 D'와 B'를 포함하는 2가 어셈블리 단위이다.
(b) 상보성 결합쌍
A는 상보성 결합쌍 1에서 A'와 상호작용한다.
B는 상보성 결합쌍 2에서 B'와 상호작용한다.
C는 상보성 결합쌍 3에서 C'와 상호작용한다.
D는 상보성 결합쌍 4에서 D'와 상호작용한다.
(c) 다중특이적 단백질 어셈블리 단위를 이용한 단계적 어셈블리에 대한 프로토콜
아래의 단계적 어셈블리 단계는 도 14에 예시한다. 생성된 나노구조는 도 14, 단계 11에 예시한다.
단계적 어셈블리 단계 과정
단계 1 a) 어셈블리 단위-1 첨가
b) 세척
단계 2 a) 어셈블리 단위-2 첨가
b) 세척
단계 3 a) 단계 1 반복
단계 4 a) 어셈블리 단위-3 첨가
b) 세척
단계 5 a) 단계 1 반복
단계 6 a) 어셈블리 단위-4 첨가
b) 세척
단계 7 a) 단계 2 반복
단계 8 a) 어셈블리 단위-5 첨가
b) 세척
단계 9 a) 단계 1 반복
단계 10 a) 단계 2 반복
단계 11 a) 단계 1 반복
실시예 3: 거대분자 나노구조 제작
거대분자 어셈블리를 만들기 위해, 본 발명의 단계적으로 어셈블리시키는 방법을 이용하여 두 가지 어셈블리된 나노구조 중간물질을 서로 결합시킨다. 이 실시예는 두 개 나노구조 중간물질에서 거대분자 나노구조를 제작하는 것을 설명한다.
도 15는 도 14에 예시된 단계적 어셈블리 프로토콜에서 만들어진 2가지 나노구조의 단계적 어셈블리 방법을 설명한다. 도 14의 단계 11에서는 나노구조 중간물질-1을 설명하고 있다. 도 14의 단계 8에서는 나노구조 중간물질-2를 설명하고 있다. 하기 단락 9.1의 프로토콜은 상보성 결합쌍의 결합에 의한 두 나노구조 중간물질의 추가를 기술한다.
상보성 결합쌍의 결합에 의한 2개의 나노구조 중간물질의 추가 프로토콜
아래의 단계적 어셈블리 단계는 도 15 예시한다. 생성된 나노구조는 도 15, 단계 5에 예시한다.
단계적 어셈블리단계 과정
단계 1 단락 8(실시예 3)에 기술된 단계적 어셈블리 프로토콜의 단계 1-11
단계 2 a) A' 캡핑 단위 추가b) 세척
단계 3 서포트 매트릭스에서 나노구조 중간물질-1 제거 및 분리
단계 4 단락 8(실시예 3)에 기술된 단계적 어셈블리 프로토콜의 단계1-8 실행, 나노구조 중간물질-2가 서포트 매트릭스에 부착됨
단계 5 a) 나노구조 중간물질-1 추가b) 세척
실시예 4: 2가 이중특이적 다이어바디 결합쌍의 자가-어셈블리와 단계적 어셈블리의 확인
자가-어셈블리의 확인
전술한 바와 같이, 단계적 어셈블리는 발현되고 정제된 2개의 비-교차-반응 다이어바디 어셈블리 단위를 이용하여 실시할 수 있다. 각 다이어바디 단위 단백질 단독의 용액은 투명하게 유지되는데, 그 이유는 단일 다이어바디 어셈블리 단위는 자가-중합화(즉, 자가-조립)되지 않기 때문이다.
하지만, 2개의 용액이 혼합되면 다이어바디 단위는 결합된 단위로 올리고머화될 수 있고 2개의 다이어바디 단위가 교대로 나타나는 긴 섬유를 형성한다(도 1). 이런 자가-어셈블리는 단순한 광 분산 또는 탁도 실험으로 눈으로 관찰가능하고, 음으로 염색된 중합체 막대의 전자 검경으로 용이하게 확인할 수 있다.
단계적 어셈블리의 확인
단계적 어셈블리는 개시물질을 세파로즈 고체 서포트 매트릭스에 고정시키고, 이후 매트릭스-결합된 개시물질을 다이어바디 어셈블리 단위-1과 접촉시켜 실시한다. 이후, 세척 단계를 실시하는데, 여기서 과량의 다이어바디 단위-1이 결합된 나노구조(개시 단위 및 결합된 다이어바디 단위-1을 보유)로부터 제거된다. 그 다음, 나노구조는 다이어바디 어셈블리 단위-2와 함께 배양하고, 후속으로 세척하고 예로써 여러 차례의 사이클을 통하여 다이어바디 어셈블리 단위-1의 추가 사본의 존재하에 배양한다(도 11). 전지 검경을 이용하여, 서로 다른 회수의 결합과 세척 사이클을 통하여 조립된 중합체의 길이와 결합구조를 결정한다. 이들 길이는 사이클 회수에 정확하게 비례한다.
실시예 5: 광 분산을 이용하여 편광 분석
본 실시예에서 이용된 다이아보디(diabodies)와 같은 거대분자 단량체의 중합정도는 빛 분산을 이용하여 분석할 수 있다. 광 분산 분광계 가령, DAWN-DSP 분광계(Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA)와 같은 광 분산 측정으로 평균 무게, 분자량, 입자 크기 모양, 입자-입자 쌍의 상관관계 결정에 대해 정보를 제공한다.
실시예 6: 당 구배 침전(gradient sedimentation)을 이용하여 분자량 결정(중합 정도)
길이가 다른 연결된 다이아보디(diabody)는 구역 한회여과에서 당 구배를 이용하여 상이한 속도로 침전한다. Svedberg 단위에서 중합 및 침전의 수준간 정량적인 상관관계를 계산할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 자가-어셈블리 효과를 특징짓고, 새로운 다이아보디 단위를 추가하는 각 단계에서 단계적으로 어셈블리되는 공정을 특징화시키는데 유익하다.
실시예 7: 전자 현미경을 이용한 막대의 형상과 길이
당 구배 분취 및 SDS-PAGE 분석 후에, 막대를 포함하는 부분적으로 정제된 분취물을 육안으로 볼 수 있다. 적절한 분취 시료를 EM 그리드(grid)에 두고, 착색 또는 그림자를 제공하여 이들의 모양을 결정하기 위해 전자현미경을 이용하여 큰 구조를 찾는다.
실시예 8: 3차원 입방체의 단계적 어셈블리
본 실시예에서는 조작된 트라이어바디와 다이어바디 단편으로부터 구조 요소를 포함하는 어셈블리 단위로부터 단계적 어셈블리로 3차원 입방 구조의 제조를 개시한다. 이런 어셈블리 단위의 결합 요소는 트라이어바디와 다이어바디의 다중특이적 결합 도메인이다.
트리아이바디는 3가이고 입방형 구조의 정점을 구성한다. 다이어바디는 2가인데, 본 실시예에서는 2개를 이용하여 입방 구조의 모서리를 구성하고 트라이어바디 사이의 공간에 걸쳐있다.
개시 단위의 경우에, 추가된 펩티드 에피토프는 고체 서포트에 고정화를 위한 트라이어바디 구조 요소 내에서 결합 요소로 처리된다(단계적 어셈블리에서 입방체의 제 1 정점으로 정의됨). 따라서, 트라이어바디 개시 단위의 결합 요소는 4개의 비-상보성 결합 요소를 포함하는데, 이중 3개는 트라이어바디의 삼중특이적 결합 도메인으로 구성되고 트라이어바디 구조 내에서 처리되는 펩티드 에피토프로부터 4번째 결합 요소는 고체 서포트 매트릭스와 특이적으로 상호작용하도록 설계된다. 개시 단위에 포함된 펩티드 에피토프는 개시 단위로부터 절단되고 3차원 나노입방체의 완전한 나노제조 직후에 고체 서포트 매트릭스로부터 나노구조에 결합될 수 있는 사전-정의된 분리 부분(예, 프로테아제 부위)을 보유하도록 처리할 수 있다. 트라이어바디의 3차원 구조가 잘 특성화되어 있기 때문에(Pei et al., 1997, The 2.0-A resolution crystal structure of a trimeric antibody fragment with noncognate VU VIL domain pairs shows a rearrangement of VH CDR3, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94 (18): 9637-42), 이용가능한 X-레이 좌표의 시각 검사로 전술한 바와 같이 부가적인 결합 요소를 처리하기 위한 단백질 구조 내에서 삽입점을 확인할 수 있다.
결합 요소로 3개의 삼중특이적 결합 도메인으로 구성되는 다른 트라이어바디는 다른 어셈블리 단위(입방체의 다른 7개 정점)를 구성한다. 다른 어셈블리 단위, 다시 말하면 결합 요소로서 2개의 이중특이적 결합 도메인으로 구성되는 다이어바디 단위는 입방체의 모서리를 형성한다(모서리는 입방체의 정의된 정점 사이에 벡터 격자로 정의될 수 있다). 입방체의 각 모서리는 2개의 다이어바디 어셈블리 단위로부터 제조된다. 본 실시예에서는 총 32개의 어셈블리 단위가 3차원 나노입방체의 나노제조에 필요하다: 8개의 트라이어바디(8개의 정점을 구성하는 1개의 개시 단위 및 7개의 어셈블리 단위) 및 24개의 다이어바디(모든 어셈블리 단위가 12개의 모서리를 구성한다). 나노입방체의 제조에 총 7개의 비-교차-반응 상보성 결합쌍이 요구된다.
트라이어바디는 3개의 각 정점에 1개의 결합 요소(CDR)를 보유하는 3차원 등변 삼각 프리즘-형상 단백질이다. 다른 한편, 다이어바디는 2개의 마주보는 결합 요소(CDR)를 보유하는 직사각형 프리즘-형상 단백질이다. 트라이어바디와 다이어바디로 구성되는 3차원(3-D) 입방체의 나노제조는 결합된 어셈블리 단위의 기하학적, 공간적 상관관계가 도 16에 도시된 3차원 입방체의 정의된 설계 시방서 이내에 존재할 것을 요한다.
결합된 트라이어바디와 Fab 단편의 특정 결합 구조와 공간적 배향은 물리적으로 특성화되었다(Lawrence et al., 1998, Orientation of antigen binding sites in dimeric and trimeric single chain Fv antibody fragments, FEBS Lett. 425 (3): 479-84). 트라이어바디의 정점에 결합된 3개의 Fab 팔은 동일한 평면에 존재하지 않고 한 방향으로 서로 각을 이루어 삼각대의 다리처럼 보인다(Lawrence et al., 1998, Orientation of antigen binding sites in dimeric and trimeric single chain Fv antibody fragments, FEBS Lett. 425 (3): 479-84). 트라이어바디에 결합된 인접한 Fab 팔 사이의 각도는 80-136ㅀ로 측정되었고(이는 입방체의 세 모서리와 결합된 정점의 형성을 위하여 요구되는 결합된 어셈블리 단위의 기하학적, 공간적 상관관계 이내에 속한다), 다이어바디와 Fab 단편 결합의 각도는 60-180ㅀ로 측정되었다(이는 2개의 인접한 다이어바디 요소의 결합 직후에 입방체의 한 모서리 형성을 위하여 요구되는 결합된 어셈블리 단위의 기하학적, 공간적 상관관계 이내에 속한다). 입방체의 평면각 사이의 각도는 90ㅀ로 정의되고, 입방체 각도 사이의 각도는 180ㅀ로 정의된다. 따라서, 트라이어바디를 입방체의 정점으로 이용하고 다이어바디를 모서리로 이용하면, 항체 단편 내에 내재된 제한적 구조 유연성과 관찰된 항체 단편의 기하학적, 공간적 결합의 특성을 고려할 때 본원에 개시된 3차원 입방체를 구성하는 것이 가능하다.
입방체는 7개의 비-교차-반응 상보성 결합 요소쌍을 먼저 확인함으로써 구성한다. 이런 구체예에서, 이디오토프/항-이디오토프 쌍은 앞서 개시된 표준 방법을 이용하여 구성한다. 이들 쌍의 요소인 14개의 결합 요소는 아래에 개시된 구조에 제시된 바와 같이 이중특이적 다이어바디와 삼중측이적 트라이어바디로 통합된다.도 16은 결합쌍이 문자로 표시되고(A는 A'에 상보적이다; B는 B'에 상보적이다); 어셈블리의 순서가 숫자로 표시된 입방 구조 어셈블리의 다이어그램이다. 제 1 단위는 개시 단위이고, 이는 숫자 'ㅇ1'로 표시되고 결합 요소 A, B, C를 포함한다. 제 2 단위('2')는 결합 요소 A'와 D를 포함한다. 단위 1이 고정된 표면이 요소 2를 함유하는 용액과 함께 배양되는 경우에, 상기 요소는 단위 1에서 상보성 결합 단위 A'에 부착되어 단위 1과 2로 구성되는 나노구조 중간물질을 형성한다. 과량의 어셈블리 단위 2를 세척한 이후, 상기 중간물질은 결합 요소 D'과 A를 포함하는 어셈블리 단위 3과 함께 배양한다. 상기 단위는 단위 2에서 상보성 결합 요소와 특이적으로 결합하여 단위 1, 2, 3으로 구성되는 나노구조 중간물질을 형성한다. 이후, 이런 과정은 전체 구조가 형성될 때까지 배양과 세척 단계를 교대하면서 반복적으로 실시한다. 32개의 어셈블리 단위가 추가될 수 있기 때문에, 어셈블리 과정에는 31 단계가 존재한다(단위 1의 고체 기질에 고정시키는 단계는 제외한다).
나노구조의 단계적 어셈블리를 계획하는데 핵심적인 요소는 각 단계이후에 결합 요소가 노출되게 되는 트랙킹(tracking)이다. 이런 나노입방 구조의 어셈블리에서, 아래의 결합 요소가 각 단계이후에 노출된다:
32번째 단위가 추가된 이후, 결합 요소는 노출되지 않는다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예에 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 내용 이외에 본 발명의 다양한 개변은 본 발명의 명세서로부터 당업자에게 자명하다. 이런 개변은 첨부된 특허청구범위의 범주에 속한다.
여기에 참조된 모든 참고문헌은 순전히 참고로 한다.
임의의 간행물에 대한 인용은 본 발명의 출원 시점 이전에 공개되었음을 의미할 뿐 본원 발명을 제한하지 않는다.
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Claims (35)

  1. 다음을 포함하는 나노구조의 단계적 어셈블리 방법 :
    (a) 하나 이상의 결합되지 않은 접합 요소를 포함하는 나노구조 중간체를 다수의 다른 접합 요소를 포함하는 어셈블리와 접촉시키는 단계, 여기서:
    (i) 상기 다수의 다른 접합 요소의 어느 접합요소도 스스로 또는 상기 복수의 다른 접합 요소와 상호작용하지 않으며, 그리고
    (ii) 상기 복수 접합요소의 단일 접합 요소 그리고 나노구조 중간체의 단일의 결합되지 않은 접합 요소는 상보적 접합 요소이며,
    이로써 어셈블리 단위는 나노구조 중간체에 비-공유 결합하여 수반되는 사이클에서 사용되는 새로운 나노구조 중간체를 형성하며 ;
    (b) 결합되지 않은 어셈블리 단위를 제거하는 단계; 그리고
    (c) 단계 (a) 및 (b)를 나노 구조를 형성하기에 충분한 횟수로 반복하는 단계,
    여기서 하나 이상의 사이클의 어셈블리 단위는 두개의 접합 요소, 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 구조적 요소 또는 기능적 요소를 포함함.
  2. 제 1항에 있어서, 나노구조 중간체는 표면-결합된 개시제 어셈블리 단위를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 캡핑 단위로 나노구조를 캡핑하는 부가적인 단계를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 구조적 요소 및 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 제 1 접합 요소를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 구조적 요소는 제 1 접합 요소 그리고 제 2 접합 요소에 공유 결합된 단계적 어셈블리 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 제 2 접합 요소는 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 항체 어셈블리는 기능적 요소를 더 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 기능적 요소는 광활성 분자(photoactive 분자), 포토닉(photonic) 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성(magnetic) 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어(nanowire), 퀀텀 도트(quantum dot), 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐(hapten), 항원, 바이오틴, 디곡시게닌(digoxygenin), 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 기능적 요소는 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 기능적 요소 그리고 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 접합 요소를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 기능적 요소는 광활성 분자(photoactive 분자), 포토닉(photonic) 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성(magnetic) 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어(nanowire), 퀀텀 도트(quantum dot), 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐(hapten), 항원, 바이오틴, 디곡시게닌(digoxygenin), 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 기능적 요소는 항체 또는 항체 단편 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상보적 접합요소의 특이적 비-공유 상호작용을 공유 결합(linkage)으로 전환시킴으로써, 그 결합이 안정화되는 포스트(post)-어셈블리 전환 단계를 더 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 IgG, IgM, IgE, IgA, 그리고 IgD 및 그들의 유도체 그리고 단편으로 구성된 그룹에서 선택되는 항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 키메릭 항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 다중 특이적항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 Fab 또는 F(ab')2항체 단편을 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 항체 어셈블리 단위는 Fab 또는 F(ab')2항체 단편을 포함하는 단계적 어셈블리 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상보적 접합 요소 쌍은 이디오토프(idiotope)/항-이디오토프(anti-idiotope) 상호작용을 나타내는 어셈블리 단위로부터 형성되는 단계적 어셈블리 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상보적 접합 요소 쌍은 항원/항체 상호작용을 나타내는 어셈블리 단위로부터 형성되는 단계적 어셈블리 방법.
  21. 어셈블리 단위 사이의 다수의 결합(linkages)을 형성하는 다수의 다른 접합 요소를 포함하는 어셈블리 단위의 다수의 종으로부터 형성되는 나노구조.
    여기서, 상기 어셈블리 단위는
    (a) 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 구조적 요소 또는 기능적 요소를 포함하는 제 1 어셈블리 단위를 포함하거나, 또는
    (b) 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 두 접합 요소를 갖는 제 1 어셈블리 단위를 포함함.
  22. 제 21항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 두 접합 요소를 갖는 나노구조.
  23. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 기능적 요소를 더 포함하는 나노구조.
  24. 제 23항에 있어서, 기능적 요소는 광활성 분자(photoactive 분자), 포토닉(photonic) 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성(magnetic) 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어(nanowire), 퀀텀 도트(quantum dot), 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐(hapten), 항원, 바이오틴, 디곡시게닌(digoxygenin), 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 나노구조.
  25. 제 24항에 있어서, 기능적 요소는 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체를 포함하는 나노구조.
  26. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위의 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체는 기능적 요소로서 존재하는 나노구조.
  27. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위의 항체 또는 항체 단편, 또는 그들의 결합 유도체는 구조적 요소로서 존재하는 나노구조.
  28. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 IgD 그리고 그들이 유도체 및 단편으로 구성된 그룹에서 선택되는 항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 나노구조.
  29. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 키메릭(chimeric) 항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 나노구조.
  30. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 다중 특이적 항체, 항체 결합 유도체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 나노구조.
  31. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 Fab 또는 F(ab')2항체 단편을 포함하는 나노구조.
  32. 제 22항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 Fab 또는 F(ab')2 항체 단편을 포함하는 나노구조.
  33. 제 22항에 있어서, 나노구조는 이디오토프(idiotope)/항-이디오토프(anti-idiotope) 상호작용을 나타내는 어셈블리 단위로부터 형성된 상보적 접합 요소 쌍에 의하여 연결된 두 어셈블리 단위를 포함하는 나노구조.
  34. 제 22항에 있어서, 나노구조는 항원/항체 상호작용을 나타내는 어셈블리 단위로부터 형성된 상보적 접합 요소에 의하여 연결된 두 어셈블리 단위를 포함하는 나노구조.
  35. 제 21항에 있어서, 나노구조 2차 또는 3차원인 나노구조.
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